Ces dernières années des études ont montré le rôle de la méthylation dans la régulation transcriptionnelle. Au cours de cette thèse, nous avons exposé des cellules hépatiques à plusieurs stimuli pour en évaluer l'effet au niveau du méthylome. Nous avons précisément étudié des facteurs clés dans le carcinome hépatocellulaire que sont le virus de l'hépatite B, le TGFbeta et au cours de la différenciation des hépatocytes. Au cours de ces expositions, nous avons observé que la méthylation était remanié spécifiquement dans certaines régions. En effet nous n'avons pas observé de nombreux changements dans les régions promotrices mais dans les régions intragéniques. Nous avons ensuite identifié l'impact des changements de méthylation dans ces régions. Nous avons ainsi pu observer qu'au cours de la différenciation hépatique une déméthylation du corps du gène HNF4A au sein d'un promoteur alternatif était corrélé à l'expression d'un autre isoforme de ce gène sous le contrôle de ce promoteur alternatif. Enfin nous avons utilisé l'outil d'édition CRISPR pour modifier les régions intragéniques. Nous avons ainsi inséré des mutations au sein d'un enhancer intronique du gène TRRAP. Nous avons alors observé que cette région semblait être nécessaire à la surexpression du gène au cours du traitement mais également au niveau de la réponse au TGFbeta. En conclusion nous avons identifié les régions intragéniques comme des régions épigénétiquement dynamiques en réponse aux facteurs environnementaux tels que l'inflammation et l'infection par HBV. Nous avons également identifié pour ces régions un potentiel rôle dans la régulation transcriptionnelle ainsi que dans les événements d'épissage alternatif / Hepatitis B virus (HBV) and chronic inflammation are well known risk factors for several chronic liver pathologies and cancer. We firstly studied the ability of HBV to modify the host methylome, using naturally infected primary human hepatocytes, and bead array. As a result, we identified non- random changes in gene expression and DNA methylation occurring specifically upon HBV infection. Moreover, a set of differentially methylated sites appeared early and were stable. These HBV-induced DNA methylation changes were defined by a specific chromatin context characterized by CpG-poor regions outside of gene promoters. During liver inJury, hepatic progenitor cells (HPC) are essential for tissue regeneration. Because of its role in determining cellular fate, DNA methylation may have an important role during the process of HPC differentiation. We therefore assessed DNA methylation during HPC differentiation. We found a progressive demethylation of HNF4A alternative promoter strongly associated with higher expression of another isoforms of HNF4A. Finally, TGFbeta is linked to a change in DNA methylation profiles. Using genome-wide strategy we observed a specific pattern of DNA methylation changes in response to TGFbeta treatment. Indeed, the observed changes were, as for HBV-induced changes, enriched in intragenic regions. In order to study the role of these regions, we used CRISPR/Cas 9 strategy on the intragenic enhancer of the TRRAP gene. This disruption was likely to suppress TGFbeta response at TRRAP expression level as well as the complete response to this cytokine. These data support a higher dynamicity of intragenic regions in response to the different stimuli we used at methylation level in liver cells. Moreover, these results support a role of intragenic methylation in cellular

A cascade of metabolomic studies have been developed in the recent decade. The application of metabolomics in the clinical field has been shown to be promising since even subtle physiological changes can be revealed by a metabolomic study which determines variations in the metabolome.Personalized clinical care is currently proposed for almost all the diseases, however, it is still difficultto be executed for the scarce of clinical biomarkers. This thesis work concerns the applications of both ¹H NMR-based and MS-based metabolomics in the determination of potential serumbiomarkers which help to improve personalized diagnosis and prognosis. It is composed by twoprincipal parts. The first part of the work aims to find out metabolite biomarkers predicting themortality of septic shock before clinical intervention and first 12 hours after hospitalization using NMR-based and LC-MS-based metabolomic methods respectively. The goal of the second part of the work is to seek potential biomarkers predicting the recurrence of HCC before and after RFA treatment. Our findings not only show that both the two applied techniques were useful for the discovery of novel clinical biomarkers, but also show that the two techniques are complementary / De nombreuses études métabolomiques a été développée au cours de la dernière dizaine année.L'application de la métabolomique dans le traitement clinique s'est révélée prometteuse puisque même des faibles modifications physiologiques peuvent être révélées par une étude métabolomique. Des soins cliniques personnalisés sont actuellement proposés pour presque toutes les maladies, mais il est encore difficile de les réaliser à cause du manque de biomarqueurs cliniques. Ce travail de thèse a pour le but de la détermination de biomarqueurs cliniques par la spectroscopie RMN et par la spectrométrie de masse. Il est composé de deux parties : la première partie du travail vise à déterminer les biomarqueurs des métabolites prédisant la mortalité du choc septique avant l'intervention clinique et les 12 premières heures après l'hospitalisation en utilisant respectivement des méthodes métaboliques basées sur la RMN et la LC-MS. L'objectif de la deuxième partie du travail est de rechercher des biomarqueurs potentiels prédisant la récidive du CHC avant et après le traitement RFA. Nos résultats montrent non seulement que les deux techniques appliquées ont été utiles pour la découverte de nouveaux biomarqueurs cliniques, maismontrent également que les deux techniques sont complémentaires.

Le foie est un organe qui exerce un rôle majeur dans le contrôle de l’homéostasie métabolique et énergétique de l’organisme en maintenant la glycémie à un taux constant. LKB1 est une sérine-thréonine kinase qui joue un rôle clef dans la physiologie cellulaire en couplant le contrôle du métabolisme au statut énergétique de la cellule. A l’aide de modèles murins ayant une délétion de LKB1 dans les hépatocytes adultes, nous avons identifié un rôle complexe pour LKB1 au sein de l’homéostasie énergétique. L’objectif de ma thèse était de caractériser ce phénotype et d’en comprendre les bases physiologiques. Nos résultats montrent une hyperglycémie à jeun chez les animaux mutants, associée à une perte de masse maigre (muscle), une accumulation du glycogène à jeun et une activation constitutive de la voie de l’insuline, qui, à long terme, conduit à une cachexie. Nos résultats suggèrent que Lkb1 hépatique exercerait un dialogue complexe avec la signalisation insuline dans le contrôle de la gluconéogenèse avec une dépendance énergétique aux acides aminés. Nous avons aussi montré qu’il existait un dialogue complexe entre LKB1 et la voie Wnt/β-caténine dans le foie. En effet, les carcinomes hépatocellulaires (CHC) mutés CTNNB1 ont des caractéristiques phénotypiques en termes de polarité et de métabolisme (absence de stéatose). Nous avons émis l’hypothèse que ce phénotype pouvait être secondaire à l’activation du gène suppresseur de tumeurs LKB1. Les mutations CTNNB1 sont en effet capable d’induire l’expression protéique de LKB1 dans les lignées hépatomateuses humaines, et les CHC mutés CTNNB1 présentent une expression protéique accrue de LKB1. De plus, dans deux modèles murins d’invalidation hépatospécifique de Lkb1, LKB1 est apparu comme requis pour l’activation du programme transcriptionnel de β-caténine mais de façon dépendante du stade de développement et du contexte nutritionnel. / The liver plays a major role in the control of both metabolic and energetic homeostasis in the body by maintaining glycemia. LKB1 is a serine-threonine kinase that plays a crucial role in cell physiology by controlling cell metabolism and cell energetic status. Using murine model with LKB1 hepatospecific deletion, we identified a complex role for LKB1 in energy homeostasis. The aim of my thesis was to characterize this phenotype and to understand its physiological basis. Our results show a hyperglycemia at fasted state in mutants animals, associated with a loss of dry mass, a glycogen accumulation and a constitutive activation of insulin signaling, which leads to a cachexia at long term. Our results suggest that hepatic Lkb1 is involved in a cross talk with insulin signaling in the control of neoglucogenesis with amino acid dependence. We also showed a cross talk between LKB1 and Wnt/β-catenin signaling in the liver. Indeed, CTNNB1-mutated hepatocellular carcinoma (HCC) have phenotypic features in terms of polarity and metabolism (lack of lipid accumulation). Our hypothesis is that this phenotype would be secondary to the activation of the tumour suppressor gene LKB1. CTNNB1 mutations induce LKB1 proteic expression in human hepatoma cell lines and CTNNB1-mutated HCC show an increased proteic LKB1 expression. In two murine models of Lkb1 hepatospecific invalidation, LKB1 seems to be necessary for the activation of the β-catenin transcriptional program in a way that is dependent on developpemental state and nutritional context.

La surcharge en fer est un facteur de risque démontré de carcinome hépatocellulaire (CHC). Les mutations du gène SLC40A1, codant pour la ferroportine (FPN), conduisent à des surcharges martiales majeures. Des cas isolés de sujets atteints de maladie ferroportine et de CHC ont été rapportés. Le but de cette étude est de préciser la fréquence des mutations du gène SLC40A1 chez les malades ayant une surcharge en fer hépatique majeure et un CHC. Tous les malades ayant un CHC, pris en charge consécutivement entre janvier 2009 et septembre 2010 (234 malades) ont été étudiés dans ce travail prospectif. Douze malades ayant un génotype HFE C282Y homozygote ont été exclus. 109 malades avaient des perturbations du bilan martial sérique (élévation de la ferritinémie ou du coefficient de saturation de la transferrine). Ces patients ont eu une détermination de la concentration hépatique en fer (CHF) par IRM ou méthode biochimique. Chez les 13 malades ayant une CHF > 100 μmol/g un séquençage a été réalisé des 8 exons, des leurs jonctions et de la région 5'UTR du gène SLC40A1 par la méthode Single Condition Amplification. Aucune altération de séquence majeure n'a été observée. Le polymorphisme c.44-24 G>C (IVS1) dont l'effet pathogène est controversé, est retrouvé chez tous ces patients à l'état homozygote ou hétérozygote. Il apparaît que les mutations du gène SLC40A1, ne sont qu'une cause marginale de CHC mais le rôle du polymorphisme c.44-24 G>C (IVS1) reste à préciser.

Dans le contexte général des thérapies minimalement invasives, les travaux de cette thèse portent sur le planning d'une thérapie interstitielle de tumeurs du foie par ultrasons haute intensité. Dans un premier temps, une caractérisation des structures anatomiques hépatiques à partir de données scanner X est proposée selon deux méthodes de segmentation basée sur le graph cut : l'une semi-interactive et rapide pour extraire le foie et les éventuelles tumeurs ; et l'autre automatique et spécifique à la segmentation de la vascularisation hépatique par l'introduction d'un a priori local de forme estimé à partir de moments géométriques 3D. La seconde partie de cette étude est consacrée à la modélisation des effets de la thérapie sur les tissus. Le modèle proposé offre la possibilité de simuler différents types de sonde composée d'une matrice d'éléments contrôlables en phase et intensité. La description de la vascularisation locale dans le milieu peut également être intégrée dans le modèle. Les travaux et résultats obtenus portent sur trois aspects et/ou applications de ce modèle : 1) une méthode pour accélérer la résolution de la BHTE sous certaines hypothèses, 2) des résultats préliminaires de modélisation d'une sonde 64 éléments à focalisation dynamique et 3) le design géométrique d'une sonde endocavitaire 256 éléments.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les formes réactives de l'oxygène (FRO) ont un rôle bien établi dans l'oncogénèse et le fonctionnement des cellules tumorales en augmentant les capacités de prolifération et d'invasion cellulaire. Les FRO présentent une moindre toxicité dans les cellules normales où le niveau de stress oxydant est bas et les systèmes d'oxydoréduction opérationnels. Une modulation pharmacologique de l'équilibre d'oxydoréduction permet d'améliorer l'efficacité des molécules cytotoxiques qui agissent sur les FRO. L'activité anti tumorale de la chimiothérapie étant médiée en partie par le stress oxydant, nous nous sommes dans un premier temps intéressé aux variations du stress oxydant lors d'un traitement par le sorafenib (Nexavar©), un inhibiteur de tyrosine kinases. Nous avons mis en évidence une activité anti tumorale du sorafenib liée à l'augmentation de la production d'anion superoxyde par les cellules. Ce phénomène nous a permis d'identifier un marqueur prédictif d'efficacité du sorafenib, le dosage des Produits d'Oxydation Avancée des Protéines (AOPP), dans le sérum des patients cirrhotiques développant un carcinome hépatocellulaire. Sachant que l'efficacité anti tumorale des chimiothérapies conventionnelles passe en partie par l'induction de FRO, nous nous sommes intéressés dans un deuxième temps au mangafodipir, un modulateur du stress oxydant, qui est connu pour augmenter l'index thérapeutique des agents cytotoxiques in vivo. Le mangafodipir diminue les effets toxiques du stress oxydatif dans des cellules non tumorales et potentialise l'activité anti tumorale de l'oxaliplatine. Ces données nous ont conduits à explorer in vivo et in vitro le mécanisme de la neurotoxicité induite par l'oxaliplatine et le rôle protecteur du mangafodipir. Nous avons ainsi observé dans un modèle murin que le mangafodipir prévient la neurotoxicité induite par l'oxaliplatine au niveau de la gaine de myéline. Nous avons confirmé ces résultats chez l'homme lors d'une étude de phase II. Compte tenu des taux plus élevés de FRO dans les cellules tumorales par rapport aux cellules normales, plusieurs stratégies ont été proposées pour cibler sélectivement les tumeurs sans endommager les tissus sains avec des modulateurs du stress oxydant. Notre troisième axe de travail a eu pour objectif d'identifier et de valider de nouvelles molécules liées à la modulation des FRO. Cette étude a été réalisée dans le cadre d'un projet du programme Européen Pierre et Marie Curie (International Training Network 7-FP7-2007-1-1-ITN201114), au sein du réseau REDCAT. Cette collaboration a permis de concevoir et de synthétiser de nouveaux agents thérapeutiques, les organochalcogenes. Nous avons mis en évidence in vitro et in vivo le potentiel anti tumoral de cette nouvelle classe thérapeutique et principalement celui du composé LAB027. Le LAB027 présente une activité anti tumorale seul ou associé à l'oxaliplatine. L'ensemble de ces travaux nous a permis d'envisager l'évaluation précoce de l'efficacité du sorafenib par un marqueur du stress oxydant, les AOPP, de mettre en évidence l'effet anti-neurotoxique d'un mimétique de la superoxyde dismutase, le mangafodipir et d'identifier une nouvelle classe médicamenteuse en oncologie, les organochalcogènes. Ces optimisations thérapeutiques permettent d'envisager une meilleure prise en charge des malades traités par chimiothérapie afin d'optimiser l'efficacité des traitements utilisés en oncologie.

Le virus de l'hépatite C (VHC) est une des causes majeures de carcinome hépatocellulaire (CHC), dont les traitements ont une efficacité modéré. La transplantation hépatique (TH) est l'option thérapeutique de choix mais est limitée, chez les patients chroniquement infectés par le VHC, par une réinfection systématique du greffon. Nous proposons d'utiliser des lymphocytes génétiquement modifiés (LGM) issus de donneurs sains qui ont fait leurs preuves pour le traitement d'hémopathies malignes et qui,exprimant un gène suicide, peuvent être éliminés en cas d'effets secondaires. Nous montrons maintenant que ces LGM présentent d'une part une activité anti-tumorale vis-à-vis du CHC, et d'autre part un effet anti-viral envers le VHC. L'objectif est la création d'une banque de LGM allogéniques prêts-à-l'emploi, avec des avantages en termes de coût, de logistique et de disponibilité immédiate par rapport aux approches classiques d'immunothérapies, autologues pour la plupart. Parallèlement, nous avons étudié in vivo l'effet anti-viral d'un anticorps monoclonal anti-claudin-1 dirigé contre un co-récepteur duVHC et inhibant l'entrée du VHC dans les hépatocytes humains. Grâce à un modèle d'infection par VHC de souris présentant un foie chimérique humanisé, nous montrons que cet anticorps permet de prévenir efficacement l'infection par le VHC. Nos résultats apportent les preuves de concept de l'utilisation de deux produits, anticorps anti-claudin-1 et LGM, pour la prévention de la réinfection du greffon hépatique par le VHC, les LGM pouvant également être envisagés en association avec les thérapies actuelles du CHC.

Le CHC est souvent diagnostiqué à un stade avancé, stade où les options thérapeutiques sont limitées et le plus souvent palliatives. A l'inverse, les patients diagnostiqués à un stade précoce sont candidats à des traitements curatifs tels que la résection chirurgicale, la radiofréquence et la transplantation hépatique. Le dépistage par échographie des cirrhotiques (surveillance tous les 6 mois) est recommandé par la grande majorité d'experts et les sociétés savantes afin de détecter et traiter le CHC à un stade précoce. Cependant, l'impact du dépistage sur la survie des patients reste controversé en raison des insuffisances méthodologiques des études l'ayant évalué. Parmi les incertitudes méthodologiques, le biais d'avance au diagnostic, qui correspond à un allongement du temps de suivi du à un dépistage plus précoce, n'a le plus souvent pas été pris en compte dans les études ayant évalué l'impact du dépistage. L'approche par modélisation est une option attractive pour l'évaluation du dépistage car la réalisation d'un essai randomisé contrôlé comparant les malades dépistés et non dépistés est irréalisable pour des raisons d'ordre éthique. Dans ce travail, nous avons développé un modèle de la progression du CHC de la date de diagnostic jusqu'au décès. Ce modèle prend en compte l'âge des patients, la connaissance du statut VHC et les principaux facteurs pronostiques du CHC sur cirrhose virale C compensée et décompensée. Il a été alimenté par plusieurs types de données pour fixer les probabilités de transitions dans le modèle, et valider les sorties du modèle. Dans un premier temps, afin d'éviter une surestimation du bénéfice du dépistage, il a été indispensable de calculer le biais d'avance au diagnostic et de l'intégrer dans le calcul de la survie des patients dépistés. Dans un deuxième temps le modèle a évalué l'impact du dépistage du CHC chez les patients ayant une cirrhose virale C compensée et connaissant leur statut VHC. Dans un contexte de cirrhose compensée avec un statut VHC-connu, notre étude montre que le dépistage du CHC réalisé dans la pratique courante (taux d'accès au dépistage = 57%, une efficacité du dépistage correspondant à 42% des patients diagnostiqués à un stade précoce) améliore la survie des patients, avec une augmentation de l'espérance de vie (EV) de 11 mois et une diminution de risque de décès à 5 ans de 6% par rapport à l'absence du dépistage (taux d'accès au dépistage = 0%, 19% des patients non dépistés pour le CHC sont diagnostiqués à un stade précoce). Elle souligne l'importance des deux variables, taux d'accès au dépistage et efficacité du dépistage, sur la survie des patients. Par rapport au dépistage réalisé dans la pratique courante : a) un scénario d'augmentation du taux d'accès au dépistage de 57% à 97% augmente l'EV de 7 mois et diminue le risque de décès à 5 ans de 5% ; b) un scénario d'augmentation de l'efficacité du dépistage de 42% à 87% (dépistage optimal) augmente l'EV de 14 mois et diminue le risque de décès à 5 ans de 9% ; c) un scénario combinant une augmentation de l'efficacité du dépistage à 87% et une augmentation du taux d'accès au dépistage à 97% augmente l'EV de 31 mois et diminue le risque de décès à 5 ans de 20%. Cette étude souligne la nécessité d'une application stricte des modalités de dépistage du CHC, afin d'optimiser son efficacité à diagnostiquer le CHC au stade précoce. Ce travail suggère que les experts devraient cibler leurs recommandations sur l'efficacité du dépistage. De telles recommandations pourraient conduire à discuter de l'expérience et de la qualification des opérateurs et de la qualité du parc des échographes utilisés pour homogénéiser la qualité du dépistage. Finalement, nous avons observé dans un travail préliminaire que le choix optimal de la méthode de correction pour le calcul du biais d'avance au diagnostic devrait prendre en compte la progression tumorale d'un stade asymptomatique vers un stade symptomatique qui diffère d'un cancer à l'autre.

Le virus de l'hépatite C (VHC) est l'un des principaux facteurs étiologiques du carcinome hépatocellulaire. Le traitement des hépatites virales C a été récemment amélioré grâce à une trithérapie (interféron, ribavirine et anti-protéase virale). Néanmoins l'importance des effets secondaires et l'émergence de mutants résistants nécessitent de découvrir de nouveaux antiviraux. Dans ce contexte, notre équipe a récemment découvert que les phosphatidylinositol 4-kinases de type III (PI4KIIIα et PI4KIIIβ) étaient indispensables à la propagation du virus dans une lignée hépatique humaine, et ce, à 2 étapes de son cycle biologique : l'entrée et la réplication. L'objectif du présent travail était de poursuivre la validation de ces nouvelles cibles thérapeutiques potentielles, en approfondissant nos connaissances sur la dépendance du virus à l'égard de ces kinases au cours de son entrée. Pour cela, nous avons utilisé le modèle des hépatocytes humains primaires, système in vitro plus proche du contexte physiologique que les modèles utilisés jusqu'à présent et qui étaient basés sur l'exploitation de lignées. Deux axes ont été développés : Vérification de l'importance de l'activité kinase des PI4KIIIs au cours de l'entrée du VHC dans les hépatocytes humains primaires, à travers une approche chimique ; Validation de l'implication de ces kinases et de leur activité enzymatique au cours de l'entrée virale grâce à une approche génétique basée sur l'ARN interférence et la restauration de phénotype. En parallèle, nous avons étudié l'expression de PI4KIIIα au cours de pathologies hépatiques. Nos résultats suggèrent une implication de PI4KIIIα au cours de l'entrée du VHC dans les hépatocytes humains primaires, mais restent à confirmer quant à l'implication de PI4KIIIβ. Par ailleurs, l'analyse de l'expression de PI4KIIIα dans le carcinome hépatocellulaire (CHC) conduit à proposer cette kinase comme un nouveau marqueur moléculaire, qui pourrait améliorer les modèles de pronostic déjà établis et pourrait conduire au développement de nouvelles approches thérapeutiques pour les patients atteints d'un CHC, quelque soit l'étiologie.