Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / Las células madre mesenquimáticas (MSC, del inglés, Mesenchymal Stem Cells) son células progenitoras adultas capaces de diferenciarse hacia células de tejidos mesodérmicos y que además poseen potencial de auto-renovación y morfología fibroblastoide. Como parte de su capacidad de diferenciación multilinaje, estudios recientes han demostrado que las MSC cuentan con la capacidad de diferenciarse in vitro hacia linaje celular germinal. El objetivo del presente estudio fue evaluar el potencial de diferenciación germinal de MSC derivadas de médula ósea fetales bovinas (MSC-MO) mediante exposición in vitro a los biofactores proteína morfogénica ósea 4 (BMP4), factor de crecimiento transformante β1 (TGFβ1) y ácido retinoico (AR). Las MSC-MO fueron aisladas mediante adherencia a placas de cultivo de plástico desde médula ósea de fetos bovinos (7-9 meses de gestación, n=14). El efecto dosis-respuesta fue analizado luego de 21 días de cultivo utilizando tres concentraciones de BMP4 (10, 50, 100 ng/mL), TGFβ1 (1, 10, 100 ng/mL) y AR (0,01; 0,1 y 1 μM). El efecto temporal fue analizado en los días 0, 7, 14 y 21 de cultivo utilizando 100 ng/mL de BMP4, 100 ng/mL de TGFβ1 o 0,1 μM de AR. Se analizaron los genes de pluripotencia OCT4, NANOG, genes germinales FRAGILIS, STELLA, VASA y genes germinales de macho DAZL, PIWIL2, STRA8 y el marcador de meiosis SCP3 mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). La expresión de Dazl, Nanog y Oct4 fue analizada mediante citometría de flujo. El tratamiento con AR y BMP4 aumentó la expresión génica de DAZL (P<0,05) a partir del día 7. Sin embargo, el aumento bajo el efecto de BMP4 fue transitorio. TGFβ1 no modificó la expresión de mRNA de DAZL. La suplementación con AR activó la expresión de mRNA de NANOG a partir del día 7 hasta el día 21 de exposición, pero no se observaron cambios de expresión bajo el efecto de BMP4 durante el período de cultivo. Los niveles de mRNA de OCT4 y de SCP3 no fueron modificados bajo el efecto de ninguno de los factores utilizados. En conclusión, AR fue el biofactor más efectivo en la diferenciación germinal de MSC-MO logrando el aumento de la expresión del gen germinal DAZL / Mesenchymal Stem Cells (MSC) are adult progenitor cells that possess self-renewal capacity and fibroblastoid morphology and are also capable of differentiating into cells of mesodermal tissues. In addition to the multilineage differentiation potential, recent studies have shown that MSCs can differentiate in vitro into germ cell lineage. The objective of the present study was to evaluate the potential for germ cell differentiation of MSCs derived from fetal bovine bone marrow (BM-MSC) by in vitro exposure to bioactive factors bone morhogenetic 4 (BMP4), transforming growth factor β1 (TGFβ1) and retinoic acid (RA). BM-MSC were isolated by adherence to plastic culture plates from bone marrow of bovine fetuses (7-9 months gestation, n = 14). The dose-response effect of each factor was analyzed using three concentrations of BMP4 (10, 50, 100 ng / mL), TGFβ1 (1, 10, 100 ng / mL) and RA (0.01, 0.1 and 1 μM), after 21 days of culture. The temporal effect was analyzed on days 0, 7, 14 and 21 of culture using 100 ng/mL of BMP4, 100 ng/mL of TGFβ1 o 0,1 μM of RA. The pluripotency genes OCT4, NANOG, germ cell genes FRAGILIS, STELLA, VASA and male germ cell genes DAZL, PIWIL2, STRA8 and the meiosis marker SCP3 were analyzed by quantitative PCR (Q-PCR). The expression of Dazl, Nanog and Oct4 was analyzed by flow cytometry. Treatment with AR and BMP4 increased DAZL gene expression (P <0.05) from day 7, however the increase under the effect of BMP4 was transient. TGFβ1 did not modify the expression of DAZL mRNA. Supplementation with RA activated NANOG mRNA expression from day 7 to day 21 of exposure, but no expression changes were observed under the effect of BMP4 during the culture period. OCT4 mRNA levels are not modified under the effect of any of the factors as well as the SCP3 meiosis marker. In conclusion, AR was the most effective biofactor in the germ differentiation of BM-MSC achieving increased expression of the DAZL germline gene / Financiamiento: Proyecto Fondecyt N° 1161251 y Programa de becas “Convocatoria Abierta 2013” – SENESCYT, Ecuador

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Animales y Veterinarias. / Las células madre mesenquimáticas (MSC) pueden ser candidatas adecuadas para la derivación de gametos in vitro debido a su abundancia y a su alto potencial de diferenciación. La diferenciación de las células germinales es un proceso complejo que requiere tanto de regulación endocrina y auto-paracrina en un entorno específico, como de interacciones directas celulares proporcionadas por las células somáticas del testículo. Las células de Sertoli (CS) juegan un papel esencial formando nichos para las células germinales y proporcionando factores esenciales para su diferenciación. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del co-cultivo de CS en la diferenciación de MSC derivadas de tejido adiposo (MSC-TA) y medula ósea (MSC-MO) fetales bovinas hacia linaje de células germinales. Las CS fueron aisladas desde parénquima de testículo de toro adulto y fueron caracterizadas mediante cuantificación de la expresión del biomarcador de CS, Wilms tumor 1 (WT1) y de los niveles de mRNA de Receptor de Andrógeno (AR) utilizando citometría de flujo (FC) y PCR cuantitativo (Q-PCR). Las MSC fueron aisladas desde tejido adiposo y médula ósea mediante adherencia al plástico y posteriormente fueron co-cultivadas sobre monocapas de CS durante 21 días. Muestras de cultivos celulares fueron obtenidas cada 7 días y analizadas para determinación de niveles de mRNA de genes endógenos β-ACTINA y GAPDH, genes de pluripotencia OCT4 y NANOG, genes germinales FRAGILIS, STELLA, VASA y genes germinales de macho DAZL, SRY, PIWIL2 y STRA8 mediante Q-PCR. Adicionalmente se evaluó la expresión de Dazl, Nanog y Oct4 mediante FC e IF. Una alta proporción (85,5%±5,5) de CS fueron positivas para WT1. Los niveles mRNA DAZL y PIWIL2 aumentaron el día 14 de diferenciación en co-cultivos de MSC-TA/CS en comparación con los monocultivos y co-cultivos de MSC-MO/CS. Los niveles de mRNA de NANOG fueron activados en MSC-MO y MSC-TA co-cultivadas con CS luego de 7 y 14 días de cultivo. Los niveles de mRNA de OCT4 aumentaron (P<0,05) el día 14 en los co-cultivos de MSC-MO/CS y de MSC-TA/CS en comparación con los monocultivos. Los niveles de mRNA de CD73 aumentaron (P<0,05) en los co-cultivos el día 21 en comparación con los monocultivos de MSC-MO y MSC-TA, mientras los niveles de mRNA de CD105 disminuyeron (P<0,05) en el co-cultivo de MSC-TA/CS al día 21en comparación con el monocultivos de MSC-TA. Adicionalmente, los niveles de mRNA de SCP3 disminuyeron (P<0,05) en los co-cultivos de MSC-MO/CS y de MSC-TA/CS el día 7 y 14 en comparación con el monocultivo de MSC-TA y no se detectó en el día 21. Los patrones de expresión génica en los co-cultivos sugieren que las MSC fetales bovinas poseen potencial de diferenciación germinal y que las MSC-TA fetales bovinas tienen mayor capacidad de diferenciación en comparación a las MSC-MO. Considerando la disminución en la expresión de SCP3 en los co-cultivos, estos resultados sugieren que las MSC alcanzaron un estado de diferenciación germinal premeiótico temprano / Mesenchymal stem cells (MSC) may be suitable candidates for in vitro gamete derivation due to their abundant source and wide differentiation potential. Germ cell differentiation requires endocrine and auto/paracrine regulation in a specific environment, as well as direct cell-to-cell interactions provided by the somatic cells of the testis. Sertoli cells (SC) play an essential role by forming niches and providing essential factors for germ cell differentiation. The aim of the present study was to evaluate the effect of co-culture of SC on the germ cell differentiation potential of bovine fetal MSC derived from adipose tissue (MSC-TA) and bone marrow (MSC-BM). Sertoli cells were isolated from bull testis parenchyma and characterized by quantification of biomarker wilms tumor 1 (WT1) expression and androgen receptor (AR) mRNA levels using flow-cytometry (FC) and quantitative-PCR (Q-PCR) analyses. bfMSC were isolated from adipose tissue and bone marrow and were co-cultured over monolayers of SC for 21 days. Cell culture samples were obtained every 7 days and analyzed for endogenous genes β-ACTIN y GAPDH, pluripotency genes OCT4 y NANOG, germinal genes FRAGILIS, STELLA, VASA and male germinal genes DAZL, SRY, PIWIL2 and STRA8 using Q-PCR. A high (P < 0.05) proportion of SC (85,5%±5,5) were positive for WT1 and expressed high levels of WT1 and AR mRNA levels. Levels of DAZL and PIWIL2 mRNA were up-regulated at day 14 of differentiation in bfMSC-SC co-cultures compared to monocultures and co-cultures of MSC-BM/CS. NANOG mRNA levels were activated in MSC-BM and MSC-TA co-cultured with SC at days 7 and 14 of culture. OCT4 mRNA levels increased (P <0.05) at day 14 in co-cultures of MSC-BM/CS and MSC-TA/CS compared to monocultures. CD73 mRNA levels increased (P <0.05) in the co-cultures at day 21. CD105 mRNA levels were decreased (P < 0.05) in the co-culture of MSC-TA/CS at day 21 of culture compared to monoculture of MSC-TA. SCP3 mRNA levels were down-regulated in the co-cultures of MSC-BM/CS and of MSC-TA/CS at 14 day compared to monoculture and were not detected at day 21. Thus, the gene expression patterns in MSC suggest that they have the potential for germinal differentiation and that bfMSC-TA have greater differentiation capacity towards germinal lineage in relation to MSC-BM. Moreover, reduction in SCP3 mRNA throughout the process of germinal differentiation suggest that MSC achieved an early premeiotic germ cell differentiation state / Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1161251.

Magíster en fisiopatología / La hipertrofia cardiaca es una respuesta adaptativa del corazón frente a situaciones de sobrecarga de trabajo, la cual funciona inicialmente como un mecanismo compensatorio. Sin embargo, la hipertrofia sostenida en el tiempo puede conducir a la miocardiopatía dilatada, insuficiencia cardiaca y muerte súbita. Los receptores adrenérgicos juegan un papel fundamental en la regulación de la función cardiaca bajo condiciones normales y patológicas. Las mitocondrias son responsables del 90% de la producción de ATP en el cardiomiocito y su función está regulada dinámicamente por procesos de fusión y fisión. Cambios en la dinámica y energética mitocondrial constituyen una característica distintiva de los corazones hipertrofiados. La estimulación de cardiomiocitos con agonistas adrenérgicos genera hipertrofia y aumento de la fisión mitocondrial, lo que se asocia a una disminución de la producción de ATP. Miro1 es una proteína de la membrana mitocondrial externa involucrada en la dinámica y el transporte de este organelo, cuya función ha sido estudiada principalmente a nivel neuronal. Es ampliamente conocido que alteraciones en proteínas mitocondriales están relacionadas directamente con cambios en el funcionamiento mitocondrial, y por ende con patologías como la hipertrofia del cardiomiocito. Es por ello que en base a estos antecedentes nos propusimos la siguiente hipótesis: “Miro1 regula negativamente la hipertrofia inducida por fenilefrina en cardiomiocitos de rata neonata” Para contestar esta hipótesis los objetivos específicos de este trabajo se enfocaron en evaluar tanto en cardiomiocitos control como en aquellos tratados con fenilefrina 50 μM el contenido de Miro1 y los efectos del silenciamiento y sobrexpresión de esta proteína sobre el área celular y los marcadores de hipertrofia. Resultados Cardiomiocitos de rata neonata tratados con fenilefrina 50 μM aumentaron en un 50% el área celular, así como también la expresión de los marcadores hipertróficos de β-MHC, ANP y BNP. El silenciamiento de Miro1 indujo un aumento significativo en los niveles de ARNm de ANP y BNP cuando los cardiomiocitos fueron estimulados con fenilefrina, no observándose cambios en el área celular ni en los niveles de β-MHC. Por el contrario, la sobre expresión de Miro1 en los cardiomiocitos evitó tanto el aumento del área celular como el aumento en la expresión de marcadores de hipertrofia. Estos resultados sugieren la participación de Miro1 como proteína reguladora de la hipertrofia en cardiomiocitos. / Cardiac hypertrophy is an adaptive response to manage the excessive cardiac workload of the heart to maintain normal cardiac function. However, sustained hypertrophy leads to cardiomyopathy, cardiac failure and death. Adrenergic receptors play a key role in the regulation of cardiac function under normal and pathological conditions. Mitochondria are responsible for 90% of ATP production in the cardiomyocyte and their function is dynamically regulated by fusion and fission processes. Changes in mitochondrial dynamics and metabolism are central issues in hypertrophied hearts. The stimulation of cardiomyocytes with adrenergic agonists generate hypertrophy and an increase in mitochondrial fission, which in turn is associated with a decrease in ATP synthesis. Miro1 is a mitochondrial outer membrane protein which is involved in the mitochondrial dynamics and transport at neuronal level. It is known that alterations in mitochondrial dynamics proteins are directly associated with mitochondrial dysfunction and with cardiac pathologies such as cardiomyocyte hypertrophy. Based on these asseverations we hypothesized that: "Miro1 negatively regulates phenylephrine-induced hypertrophy in neonatal rat cardiomyocytes" In order to answer this hypothesis the specific aims were focused on to evaluate Miro1 content, and the effect of silencing or overexpressing Miro1 on surface cellular area and hypertrophic gene markers expression in control cardiomyocytes and phenylephrine treated cardiomyocytes. Results Neonatal rat cardiomyocytes treated with 50 μM phenylephrine 50% increased the surface cell area, as well as the expression of the hypertrophic gene markers: β-MHC, ANP and BNP. Miro1 silencing induced a significant increase in ANP and BNP mRNA levels when cardiomyocytes were stimulated with phenylephrine, with no changes in surface cell area or β-MHC mRNA levels. In contrast, Miro1 overexpression in cardiomyocytes prevented both surface cell area increase and mRNA levels of hypertrophic gene markers. These results suggest the involvement of Miro1 as a regulatory protein of hypertrophy in cardiomyocytes.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniera en Biotecnología Molecular. / El desarrollo de una respuesta inmune anti-tumoral requiere de la comunicación entre diferentes células del sistema inmune, así como del reconocimiento de la célula tumoral. Una vez que los Linfocitos T Citotóxicos (CTL) y las células Natural Killers (NK) reconocen la célula tumoral, forman la Sinapsis Inmunológica Citotóxica (SIC), una estructura supramolecular altamente especializada que resulta fundamental para la liberación localizada de los gránulos citotóxicos y la eliminación específica de la célula tumoral. Recientemente, se ha descrito la participación de canales Gap Junction (GJ) formados por la isoforma Cx43 (GJ-Cx43) en la actividad citotóxica de las células NK durante la SIC. A pesar de las similitudes funcionales y estructurales presentadas por la SIC mediada por las células NK y por CTL, la participación de los canales GJ-Cx43 en la sinapsis mediada por CTL aún no ha sido determinada. En este trabajo se estudió el rol de los canales GJ-Cx43 en la actividad de la SIC entre CTL obtenidos desde ratones pMEL-1 y células de melanoma murino B16F10. Primero, se evaluó la polarización de Cx43 hacia la zona de contacto entre CTL pMEL-1 y células B16F10, durante la SIC. Se determinó que Cx43 se acumula en el sitio de contacto entre estas células de manera antígeno específica y que esta polarización es dependiente de la activación de los CTL. Luego, se disminuyó la expresión de Cx43 en células B16F10 utilizando un RNA interferente contra Cx43 y luego se evaluó la participación de Cx43 en la formación de canales GJ mediante ensayos de transferencia de calceína y en la actividad citotóxica de los CTL, mediante ensayos de actividad de Granzima B (GrzB). Se observó que los CTL transfieren calceína a las células B16F10 formando canales GJ funcionales, al contrario de cuando se utilizan LT CD8+ vírgenes como células efectoras. Además, cuando se utilizaron las células B16F10 que expresan bajos niveles de Cx43 como células blanco, se observó una disminución en la transferencia de calceína y en la actividad de GrzB en comparación al control. Nuestros resultados demuestran que durante el reconocimiento citotóxico se forman canales GJ-Cx43 entre CTL y células B16F10 y que la formación de estos canales durante la SIC son importantes para la eliminación de células tumorales mediada por CTL. / Development of antitumor immune responses requires communication between different immune cells, and specific immune recognition of tumor cells. Upon tumor cell recognition, CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTL) and natural killer (NK) cells form the “Cytotoxic Immunological Synapse (SIC)”, a specialized molecular structure fundamental for the polarized delivery of cytotoxic granules and the specific tumor cell killing. Recently, it has been described the participation of Gap Junction Intercellular Communications formed by Connexin 43 (GJIC-Cx43) in the NK cell SIC activity. Despite that CTL and NK cells present functional and structural similarities in SIC formation, the participation of GJIC-Cx43 in CTL-mediated SIC remains unclear. In this work we studied the role of GJIC-Cx43 in the activity of SIC formed between CTL from pMEL-1 mice and B16F10 murine melanoma cells. First, we evaluated by immunofluorescence the polarization of Cx43 to contact site between CTL and B16F10 during SIC. We found that this protein localizes at the contact site of SIC and this polarization dependent on activation of CTL and is an antigenic-specific process. Then, we decrease Cx43 expression in B16F10 cells using interference RNA against Cx43 and we evaluated the participation of Cx43 in the formation of functional GJ channels by calcein transfer assay and in the cytotoxic activity of CTL by Granzyme B (GrzB) activity assay. We found that CTL transfer calcein to B16F10 forming functional GJ in contrast with when we used a naïve CD8+ T cells as an effector cells. In addition, when we used a B16F10 that express low levels of Cx43 as target cells, we observed a decrease in calcein transfer and GrzB activity in comparison to the control. Our results demonstrate that GJIC-Cx43 are formed between CTL and B16F10 during SIC, and suggest that their formation is important for tumor cells-killing by CTL

Tesis para optar al grado de Magíster en Gestión y Dirección de Empresas / El presente documento describe un modelo de negocios para instalación de sistemas fotovoltaicos tanto para edificios en construcción como para construcciones ya en funcionamiento. Se presenta un desarrollo de un modelo de negocios que estudia la configuración especifica del negocio en términos del precio adecuado de acuerdo al contexto del mercado nacional y los precios actuales, se define además el modelo menos riesgoso de compra de los componentes fotovoltaicos, ya sea a través de importaciones directas desde China (mayorista) o a través de un distribuidor nacional de acuerdo a la demanda (minorista). Este modelo de negocios fue evaluado a través de un análisis de sensibilidad y evaluación del riesgo utilizando el método de Montecarlo, en donde se contrastó el tipo de compra mayorista y minorista. Los resultados señalaron que el riesgo de pérdidas económicas de la compra mayorista fue de un 30,5%, mientras que el riesgo de pérdida de la compra minorista fue de un 17,3%. A su vez, el promedio de los casos mostró que después de los primeros 3 años del negocio propuesto, la utilidad operacional promedio de la compra minorista fue de 178 millones de pesos, mientras que para la opción mayorista 138 millones de pesos. Por lo tanto, se concluyó que la mejor opción fue la compra minorista. De acuerdo a las entrevistas realizadas no fue posible identificar una industria especialmente interesada en la energía fotovoltaica y se infirió que la decisión de comprar un sistema fotovoltaico depende del cliente en específico y no de una industria, más bien es un ejercicio costo-beneficio. Finalmente se define una unidad de venta de sistemas fotovoltaicos de 100 kWp a un precio de entre 62.5 y 69,4 millones de pesos, precio que se define de acuerdo al cliente y el contexto de negociación. El modelo de negocios propuesto tiene una posibilidad promedio de VAN de 98 millones de pesos chilenos con una TIR de 111%, tomando en cuenta una inversión inicial de 17,4 millones de pesos.

Tesis presentada a la Universidad de Chile para optar al grado de Magíster en Química área de Especialización en Química Medicinal y Memoria para optar al Título de Química Farmacéutica / El presente trabajo de investigación informa sobre la preparación de dos familias de compuestos: cationes lipofílicos derivados del ácido cafeico y bromoésteres derivados de ácido cafeico como compuestos citotóxicos mitocondriotrópicos selectivos para células tumorales. Para el diseño de las moléculas, se consideró: (1) Largo de cadena entre los componentes farmacofóricos. (2) Presencia o ausencia de carga que permita o no dirigirlas hacia la mitocondria (3) Incorporación de grupos funcionales con capacidad antioxidante Las moléculas fueron ensayadas en las líneas celulares: HCT-116, H1975, HeLa, MCF-7, HL60 y Vero, con MTT y Rojo Neutro, dando como resultado mayor citotoxicidad para los cationes lipofílicos fosforados, mejores resultados para ésteres bromados y cationes fosforados con cadena de 10 carbonos y mayor selectividad para HeLa con 9-P / This research work provides information on the preparation of families of compounds: lipophilic cations derived from caffeic acid and bromoesters derived from caffeic acid as selective cytotoxic mitochondrotropic compounds for tumor cells. For the design of the molecules, it was considered: (1) Chain length between the pharmacophoric moieties. (2) Presence or absence of charge that allows or does not direct them towards the mitochondria (3) Presence of antioxidant groups The molecules were tested in the cell lines: HCT-116, H1975, HeLa, MCF-7, HL60 and Vero, with MTT and Neutral Red, resulting in greater cytotoxicity for the phosphorus lipophilic cations, better results for brominated esters and phosphorus cations with chain of 10 carbons and greater selectivity for HeLa with 9-P / Conicyt; Fondecyt

Submitted by NOALA VICENSOTO MOREIRA MILHAN null (noalinha@gmail.com) on 2017-03-14T15:32:19Z No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_biblioteca_pdf_com ficha..pdf: 9569489 bytes, checksum: 1675ea8facc1f735605660b0b01b8cad (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-03-20T22:29:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 milhan_nvm_dr_sjc.pdf: 9569489 bytes, checksum: 1675ea8facc1f735605660b0b01b8cad (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-20T22:29:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 milhan_nvm_dr_sjc.pdf: 9569489 bytes, checksum: 1675ea8facc1f735605660b0b01b8cad (MD5) Previous issue date: 2017-01-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O peptídeo LL-37 (catelicidina derivada de humano), é liberado por algumas células humanas e capaz de neutralizar os tecidos com lipopolissacarídeo (LPS), além de atrair células da polpa, e induzir a angiogênese, características que o tornam um possível adjunto para a regeneração do complexo dentino-pulpar. O objetivo desse trabalho foi avaliar in vitro a biocompatibilidade do peptídeo LL-37 nas concentrações de 5 e 10 μg/mL, e sua possível atuação na diferenciação de células-tronco da polpa dentária (DPSC) para odontoblastos- like. Com esse propósito, foram avaliados: (a) a citotoxicidade, pelo teste MTT; (b) a genotoxicidade, através do ensaio do micronúcleo; (c) a produção e quantificação de óxido nítrico; (d) as fases do ciclo celular, por citometria; (e) a expressão de alguns genes associados à formação de tecido mineralizado, através do teste qRT-PCR; (f) o conteúdo de proteína total; (g) a atividade de fosfatase alcalina (ALP); e (h) a produção de sialofosfoproteína dentinária (DSPP), pelo ensaio imunoenzimático ELISA. Foi observado que as concentrações de 5 e 10 μg/mL de LL-37 não foram citotóxicas e ainda aumentaram, em geral, a viabilidade celular (p<0,05), sendo que os maiores valores de absorbância foram observados no 3° dia de contato. As concentrações testadas também não induziram genotoxicidade, após 7 dias de contato, tendo sido genotóxico apenas o grupo controle positivo (EMS) (p<0,05). Ainda, não foi observado diferença estatisticamente significativa na produção de nitrito, pelas células expostas ao LL-37 após 7 dias, em ambas as concentrações. A análise do ciclo celular, evidenciou maior porcentual de células na fase G0/G1, em todos os grupos (p<0,05). Quando estes foram comparados, foi observado maior quantidade de células na fase G0/G1 na concentração de 10 μg/mL de LL- 37 comparada ao grupo controle (p<0,05). Por outro lado, o grupo controle exibiu mais células na fase G2 e em mitose (M) que os grupos tratados com 5 e 10 μg/mL de LL-37 (p<0,05), e mais células na interfase (S) que o grupo tratado com 10 μg/mL de LL-37 (p<0,05). A análise da expressão gênica demonstrou que não houve aumento de expressão dos genes fosfatase alcalina, osteocalcina, osteopontina e Runx2 após tratamento com ambas as concentrações do peptídeo, no 3° dia. Além disso, não foi observado diferença estatisticamente significativa na ALP nos grupos tratados e controle, após 3 e 14 dias, enquanto o conteúdo de proteína total foi maior aos 14 dias nos grupos tratados com LL-37 (p<0,05). Ainda, aos 3 dias, a produção da proteína DSPP foi maior no grupo tratado com 10 μg/mL de LL-37 (p<0,05). Com base nesses resultados, pode-se concluir que o LL-37 é biocompatível nas concentrações testadas nesse trabalho, e ainda aumenta o número de células viáveis, principalmente em período inicial. Além disso, aos 3 dias, na concentração de 10 μg/mL, ele retarda o ciclo celular e aumenta a expressão da proteína DSPP, além de aumentar a síntese proteica aos 14 dias, o que indica que esse peptídeo pode desempenhar algum tipo de função na diferenciação odontoblástica. / The LL-37 peptide (human derived cathelicidin) is released by some human cells and able of neutralizing the tissues that present lipopolysaccharide (LPS), as well as, attracts pulp cells and induces angiogenesis; characteristics that makes it a possible adjunct for regeneration of the dentin-pulp complex. The aim of this study was evaluate in vitro the biocompatibility of LL-37 in the concentrations of 5 and 10 μg/mL, and its possible performance in the differentiation of dental pulp stem cells (DPSC) into odontoblasts-like cells. For this purpose, it was evaluated: (a) the cytotoxicity by MTT assay; (b) the genotoxicity by the micronucleus test; (c) the production and quantification of nitric oxide; (d) the cell cycle, by flow cytometry; (e) the expression of genes associated with the mineralization by qRT-PCR; (f) the total protein content; (g) the alkaline phosphatase activity (ALP); and (h) the production of dentine sialofosfoprotein (DSPP) by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). It was observed that the concentrations of 5 and 10 μg/ml of LL-37 were not cytotoxic, in addition to they increased, in general, the cell viability (p<0,05). Moreover, higher absorbance values were observed on 3rd day of contact. After 7 days, the tested concentrations also did not induce genotoxicity, (p<0,05); only the positive control group (EMS) was genotoxic (p<0.05). Furthermore, there was not statistical significance in the nitrite production by the cells exposed to LL-37 for 7 days, in both concentrations. The cell cycle test showed higher percentage of cells in the phase G0/G1 in all groups (p<0.05). When they were compared, it was noticied that concentration of 10 ug/ml of LL-37 arrested the cells in G0/G1 compared to the control group (p<0.05). On the other hand, the control group, exhibited higher amount of cells in G2 and mitosis (M) than the others (p<0.05) and also higher number of cells in interfase (S) than the group treated with 10 μg/mL of LL-37 (p<0.05). On the 3rd day, the analysis of gene expression demonstrated no increase in the expression of the genes alkaline phosphatase, osteocalcin, osteopontin and Runx2, after treatment with both peptide concentrations. Furthermore, it was not observed statistical significance in the ALP in the treated and control groups after 3 and 14 days, while total protein content was higher in the groups treated with LL-37, at 14 days (p<0.05). On the 3rd day, the production of DSPP protein was higher in the group treated with 10 μg/mL of LL-37 (p<0.05). Based on these results, it can be concluded that LL-37 is biocompatible at these concentrations and increases the number of viable cells, especially in the initial period. Moreover, on the 3rd day, the concentration of 10 μg/mL arrests the cell cycle, and increases the expression of DSPP protein, in addition to raising the protein content at 14 days, which indicates that this peptide may present some kind of function in the odontoblastic differentiation.

Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular / Las Gap Junctions (GJs) son clústers de canales intercelulares localizados en la membrana plasmática que permiten la comunicación directa entre células adyacentes. Cada canal GJ está compuesto por 2 hemicanales hexaméricos conocidos como conexones, los cuales a su vez están compuestos por seis proteínas de transmembrana llamadas conexinas (Cxs), siendo Cx43 la más representada en el sistema inmune. Se ha vinculado la variación de los niveles normales de expresión de las Cxs con la patogénesis de distintas enfermedades, incluyendo sordera congénita, arritmias cardiacas y cáncer. Dentro de esta última nuestro laboratorio ha desarrollado proyectos de investigación que permitan determinar el papel de las GJs en la respuesta inmune antitumoral. Por ejemplo, publicaciones previas de nuestro laboratorio han demostrado que Cx43 participa en la transferencia directa de antígenos tumorales entre células dendríticas (DCs). Así mismo, Cx43 polariza hacia la sinapsis entre DC y linfocitos T (LT) CD4+, formando canales funcionales que permiten una comunicación bidireccional requerida para la activación de LT mediada por APC. Además, se ha encontrado que Cx43 juega un rol en la activación de células natural killer (NK) por parte de DCs y en la regulación de la citotoxicidad de las células NK contra células tumorales. Así mismo, resultados no publicados indican que Cx43 polariza hacia el sitio de contacto entre LT CD8+ citotóxicos (CTLs) y células de melanoma, sugiriendo que Cx43 participaría en la citotoxicidad de CTLs en contra de éstas. Estos antecedentes sugieren que las GJs podría participar en el transporte de moléculas o señales que se encuentren involucradas en el proceso de activación de LT CD8+ mediada por DCs, tema que aún no ha sido estudiado por las investigaciones actuales. En estudios 2 anteriores nuestro laboratorio ha trabajado con modelos celulares humanos, sin embargo, dado que la obtención de LT vírgenes específicos contra el tumor a partir de donantes sanos es improbable y engorroso, en este trabajo decidimos utilizar el modelo murino específico para melanoma pMEL-1 y validar y optimizar su utilización para estudios de la participación de las GJs en la activación de LT CD8+ por parte de DCs. Nuestros resultados indican que el modelo pMEL-1 no representa alteraciones en la expresión de Cx43 respecto a su contraparte silvestre (wild type (WT)), y que es un modelo muy sensible, encontrando expresión del marcador de activación CD69 incluso desde 1 hora post co-cultivo. Además, se determinó que existe transferencia de calceína entre moDC y LT CD8+ pMEL-1 en un contexto estrictamente antígeno específico. Sin embargo, no pudimos dilucidar si las GJs participan del proceso de activación ya que el método de inhibición utilizado, el cual es un péptido mimético de Cx43, presentó problemas técnicos de funcionamiento, fenómeno que fue comprobado en modelos donde anteriormente se había determinado la comunicación mediada por GJs. Proponemos en el futuro utilizar otros métodos de inhibición, como el uso de siRNA contra Cx43, para determinar si estos canales juegan un rol en este proceso. / Gap Junctions are clusters of intercellular channels located in the plasma membrane that allow direct communication between adjacent cells. Each GJ channel is composed of 2 hexameric hemichannels known as connexions, which are composed by six transmembrane proteins called conexins (Cxs), being Cx43 the most represented one in the inmmune system. Variation in normal expression levels on Cxs have been linked to the development of different diseases, including congenital deafness, cardiac arrhythmias and cancer, being the last the one where our laboratory has developed investigation lines that allow to determine the role of GJs in the antitumoral response. In example, previous publications of our group have demonstrated that Cx43 participates in the direct transfer of tumoral antigens between dendritic cells (DCs) and that polarizes to the synapsis between DCs and CD4+ T lymphocytes, forming functional channels that allow bidirectional communication required for the DCs mediated activation of LT. Besides this, we have found that Cx43 plays a role in the activation of natural killer (NK) cells mediated by DCs, and in the regulation of the cytotoxicity of NK cells against tumor cells. Likewise, unpublished data indicate that Cx43 polarizes to the contact site between cytotoxic CD8+ T cells (CTLs) and melanoma cells, suggesting that Cx43 participates in the cytotoxicity of these cells. These backgrounds suggest that GJs may participate in the transport of molecules or signals that may be involved in the process of DC mediated activation of CD8+ T cells, subject that hasn’t been studied by the actual investigations. In previous studies our group has worked with human cellular models, however, given that obtaining naïve T cells from healthy donors is unlikely and difficult, in this work we decided to use the melanoma specific murine model pMEL-1 and valid and optimize it’s use for studies of the participation of GJs in the DCs 4 activation of T cells. Our results indicate that the pMEL-1 model doesn’t have alterations in the Cx43 expression levels compared with the wild type background and that it is a very sensible model, in which we can evaluate the activation of T cells even an hour after co-culture. Besides, it was determined the existence of calcein transfer between moDCs and CD8+ pMEL-1 T cells in a strictly antigen specific context. However, we could not elucidate if the GJs participate or not in the CD8+ T cell activation process, as our inhibition method, which is a Cx43 mimetic peptide, presented technical problems, phenomenon that was proven in models where GJ mediated communication has previously been determinate. We propose in the future to use a different inhibition method, as the use of anti-Cx43 siRNA, in order to determine if these channels play a role in this process.

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