The assembly and maintenance of central synapses is a complex process, requiring myriad genes and their products. Highwire is a large gene containing a RING domain, characteristic of ubiquitin E3 ligases. Highwire has been shown to restrain axon growth and control synaptogenesis at a peripheral synapse. Here I examine the roles of Highwire at a central synapse in the adult Drosophila Giant Fiber System (GFS). Highwire is indeed necessary for proper axonal growth as well as synaptic transmission in the GFS. Differences arise between the central synapse and the neuromuscular junction (NMJ), where highwire was initially characterized : expresion from the postsynaptic cell can rescue highwire synaptic defects, which is not seen at the NMJ. In addition, a MAP kinase signaling pathway regulated by highwire at the NMJ has differing roles at a central synapse. Wallenda MAPK can rescue not only the highwire anatomical phenotype but also the defects seen in transmission. Another distinction is seen here : loss of function basket and Dfos enhance the highwire anatomical phenotype while expression of dominant negative basket and Dfos suppress the highwire phenotype. As a result we have compared the signaling pathway in flies and worms and found that the NMJ in the two organisms use a parallel pathway while the central synapse uses a distinct pathway. / by Kimberly Diane Rowland. / Thesis (Ph.D.)--Florida Atlantic University, 2012. / Includes bibliography. / Electronic reproduction. Boca Raton, Fla., 2012. Mode of access: World Wide Web.

Malformações fetais são importantes causas de óbito fetal e mortalidade infantil. A medicina regenerativa apresenta-se como a terceira modalidade terapêutica fetal. Células obtidas do líquido amniótico mostram-se como opção preferencial em terapia celular por sua alta taxa de proliferação in vitro, habilidade de autorrenovação e potencial multilinhagem. Para uso clínico, é recomendável a exclusão de material animal não humano do meio de cultura dessas células, prevenindo reações imunes, transmissão de príons, bactérias e vírus. O soro fetal bovino é componente usual do meio de cultura dessas células. Sua substituição por soro humano previne essas possíveis consequências. O objetivo deste trabalho foi estudar células obtidas do líquido amniótico, em meio de cultura suplementado por soro fetal bovino ou humano e compará-las. Foram avaliadas seu isolamento e cultivo, padrão de crescimento, morfologia, imunofenótipo, capacidade de diferenciação osteogênica e condrogênica, e caracterizou-se a expressão dos genes OCT-4, NANOG e SOX2. Foram analisadas amostras provenientes de cinco gestantes, obtidas por amniocentese de segundo trimestre, indicadas por idade materna avançada. As células do líquido amniótico, após centrifugação, foram colocadas em frasco de cultura com meio -MEM suplementado com 20% de soro fetal bovino (grupo B) ou soro humano (grupo H). Ao atingirem 70% de confluência, foram tripsinizadas e expandidas. Após a terceira passagem celular foram separadas alíquotas do grupo B e H para avaliação de seu potencial de expansão, por meio da construção de curvas de crescimento celular para diferentes inóculos iniciais (1.000, 5.000, 10.000 e 15.000 células). Sua morfologia foi avaliada por microscopia ótica através da coloração de Leishman e por microscopia eletrônica. A análise do imunofenótipo das células dos dois grupos foi realizada por citometria de fluxo, analisando-se os marcadores de superfície: CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD106, CD117 e CD133. A diferenciação osteogênica foi realizada pelo acréscimo ao meio de cultura de fosfato-2-ascorbato e -glicerofosfato, comprovada pela produção de cálcio pelas células, coradas pela Alizarina e visualização da Fosfatase Alcalina nas células. A diferenciação condrogênica foi realizada pelo acréscimo ao meio de cultura de dexametasona e TGF-1, comprovada pela análise histológica após coloração pela hematoxilina-eosina. Avaliou-se a expressão gênica dos transcritos OCT-4, NANOG e SOX2, por RT-PCR das células dos dois grupos (B e H), comparadas aos controles celulares MRC-5 e NTERA-2 cl.D1. Observou-se alta taxa de expansão, sem diferença significativa entre os grupos (p=0,715), mesmo considerando-se a evolução dia-a-dia (p=0,681) e a alta viabilidade celular, com média de 94% nos dois grupos (p=0,686). A análise morfológica das células dos dois grupos revelou aspecto mesenquimal típico, com crescimento celular em cultura também típico dessa linhagem. Ao microscópio eletrônico, observou-se maior número de vacúolos lipídicos naquelas células do grupo H. A imunofenotipagem demonstrou marcação positiva para linhagem mesenquimal e negativa para outras linhagens. Ocorreu diferenciação osteogênica e condrogênica e expressão dos transcritos OCT-4, NANOG e SOX2. Não houve diferença significativa nos aspectos estudados, entre os grupos B e H. Concluiu-se que essas células, isoladas do líquido amniótico, apresentam característica de fácil isolamento, alta taxa de proliferação, aspecto morfológico e imunofenótipo mesenquimal, capacidade de diferenciação osteogênica e condrogênica, expressando os transcritos OCT-4, NANOG e SOX2, associados à pluripotência celular, tanto em meio suplementado por soro fetal bovino como por soro humano. / Fetal malformations are a significant cause of fetal death and infant mortality. Regenerative medicine is presented as a third therapeutic method. Cells obtained from the amniotic fluid are seen to be an option of choice for cell therapy because of their high rate of in vitro proliferation, power of selfrenewal and multi-lineage potential. For clinical use the exclusion of nonhuman animal material from the culture medium of these cells is to be recommended, thus precluding immune reactions and the transmission of prions, bacteria and viruses. Bovine fetal serum is a normal component of the culture medium of these cells. Its replacement by human serum precludes those possible consequences. The objective of this present study was investigation into the cells obtained from the amniotic fluid, in a culture medium supplemented with bovine fetal or human serum, and compare them. Their isolation and culture, growth rate, morphology, immune phenotype and osteogenic and chondrogenic capacity were assessed and the expression of the OCT-4, NANOG and SOX2 genes was characterized. Samples taken from five pregnant women by amniocentesis during the second trimester, recommended by virtue of advanced maternal age, were analyzed. The cells of the amniotic fluid, after centrifugation, were placed in a culture flask with an -MEM medium supplemented with 20% of bovine fetal serum (group B) or human serum (group H). After attaining 70% confluence they were trypsinized and expanded. After the third cellular passage they were separated into quotas of groups B and H for assessment of their expansion potential, by means of the construction of cellular growth curves for the different initial inocula (1,000, 5,000, 10,000 and 15,000 cells). Their morphology was assessed by optical microscopy by means of Leishman´s staining and electron microscopy. The analysis of the immune phenotype of the cells of the two groups was undertaken by flow cytometry, the surface markers CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD106, CD117 and CD133 being analyzed. The osteogenic differentiation was undertaken by the addition of ascorbate-2-phosphate-2 and - glycerophosphate to the culture medium and proved by the production of calcium by the cells, stained with Alizarin, and visualization of the Alkaline Phosphatase in the cells. The chondrogenic differentiation was brought about by the addition of dexamethasone and TGF-1 to the culture medium and demonstrated by histological analysis after staining with hematoxilineeosine. The genic expression of the OCT-4, NANOG and SOX2 transcripts was compared with the control cells MRC-5 and NTERA-2 cl.D1 by the RTPCR of the cells of the two groups (B and H). A high expansion rate was observed, with no significant difference between the groups (p=0.715), even when the day-to-day progress (p=0.681) was taken into consideration, and high cell viability, with an average of 94% in the two groups (p=0.686). The morphological analysis of the cells of the two groups presented a typical mesenchymal aspect, with cell growth in the culture also typical of this line. Under the electron microscope, a greater number of lipid vacuoles were observed in the cells of the H group. The immune phenotyping presented a positive marking for the mesenchymal line but a negative one for the others. Osteogenic and chondrogenic differentiation occurred as also did expression of the transcripts OCT-4, NANOG and SOX2. There was no significant difference, as regards the aspects studied, between groups B and H. It is concluded that these cells isolated from the amniotic fluid were characterized by ease of isolation, a high rate of proliferation, mesenchymal morphological aspect and immune phenotype, capacity for osteogenic and chondrogenic differentiation, expressing the transcripts OCT-4, NANOG and SOX2, both in the medium supplemented with bovine fetal serum and in that with human serum.

A anóxia neonatal, considerada problema clínico mundial, é importante causa de lesão encefálica em neonatos que pode apresentar consequências graves e permanentes, como déficits cognitivos e comportamentais. O objetivo deste estudo foi analisar longitudinalmente possíveis alterações na morte, proliferação e diferenciação neuronais no hipocampo de ratos submetidos à anóxia neonatal. Para tanto, utilizamos modelo adaptado e validado em nosso laboratório. Os resultados mostraram que a anóxia neonatal causa morte neural em CA1 e CA2-3, detectadas pela maior quantidade de células TUNEL+ em CA1 e CA2-3 e FJB+ em CA2-3, além de diferentes tipos de morte neuronal em CA1 e GD, 24 horas após a anóxia,observadas por microscopia eletrônica. Houve aumento do volume de CA1 em P14 no grupo anóxia, porém o padrão de proliferação na zona subgranular não foi alterado. Enfim, a anóxia neonatal promoveu diminuição da neurogênese em animais adultos, o que poderia estar associado aos déficits de memória espacial e aprendizagem descritos em literatura para modelos similares. / Neonatal anoxia, considered a worldwide clinical problem, is a major cause of brain injury in neonates and may present serious and permanent consequences such as cognitive and behavioral deficits. The aim of this study was to analyze possible changes longitudinally in neural death, proliferation and neuronal differentiation in the hippocampus of rats submitted to neonatal anoxia. We used an adapted model validated in our laboratory. The results showed that neonatal anoxia cause neural death in CA1 and CA2-3 detected by the TUNEL+ cells in CA1 and CA2-3 and FJB+ in CA2-3, and different types of neuronal death in CA1 and GD 24 hours of anoxia, observed by electron microscopy. There was an increase in the volume of CA1 in the P14 anoxia group but the pattern of proliferation in the subgranular zone was not changed. Anyway, neonatal anoxia caused decrease in neurogenesis in adult animals, which could be associated with deficits in spatial memory and learning described in the literature in similar models.

Paracoccidioidomicose é adquirida pela via respiratória e a enzima indolamina-2,3-dioxigenase (IDO) e o catabolismo do triptofano estão envolvidos no controle da imunidade inata e adaptativa contra patógenos. Investigamos o papel da IDO na doença em animais suscetíveis (B10.A) e resistentes (A/J). Caracterizamos o efeito do tratamento com 1-Metil-DL-Triptofano (1MT) no fenótipo e comportamento de células dendríticas (DCs) e T reguladoras (Tregs) de A/J e B10.A quanto à expressão de IDO. IDO controla a carga fúngica de A/J e B10.A, reduzindo a imunidade de TCD4 e TCD8 e aumentando Tregs. Constatamos que IDO diminuiu a migração de DCs para o pulmão de A/J e B10.A e a inibição da atividade anti-inflamatória de IDO por 1MT tem um efeito deletério somente em B10.A cuja suscetibilidade é ligada à excessiva atividade pró-inflamatória. A infecção de A/J e B10.A parece induzir as funções catalítica e sinalizadora de IDO.Grande parte da função de IDO nos mecanismos imunorreguladores na paracoccidioidomicose se faz através da modulação da função de DCs em A/J e B10.A. / Paracoccidioidomycosis is acquired by the respiratory route and the enzyme indoleamine-2,3-dioxygenase (IDO) and tryptophan catabolism are involved in the control of innate and adaptive immunity against pathogens. We investigated the role of IDO in the infection in susceptible (B10.A) and resistant (A/J) mice. We characterized the effect of treatment with 1-Methyl-DL-Tryptophan (1MT) in the behavior and phenotype of dendritic cells (DCs) and regulatory T cells (Tregs) from A/J and B10.A for expression of IDO. IDO controls the fungal load in A/J and B10.A, reducing the immunity of CD4 and CD8 T cells and Tregs increased. IDO decreased the migration of DCs to the lung of A/J and B10.A and inhibition of anti-inflammatory activity of IDO by 1MT has a deleterious effect only in B10.A whose susceptibility is linked to excessive proinflammatory activity. Infection of A/J and B10.A appears to induce catalytic functions of IDO. Much of the function IDO immunoregulatory mechanisms paracoccidioidomycosis is done by modulating the function of DCs in A/J and B10.A.

Made available in DSpace on 2017-07-21T19:59:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DAIANA MILENA BRONOSKI DE FREITAS.pdf: 2016794 bytes, checksum: 8e2142b92df2ebbcad8ab16140dd6d3b (MD5) Previous issue date: 2014-06-10 / The mesenchymal stem cells ( MSCs ) are a population of tissue -resident adult cells that have the capacity for self-renewal and differentiation into different cell types of mesenchymal origin with great potential for application in cell therapies. Thus the work proposed to obtain, expand and cultivation of MSCs from subcutaneous adipose tissue, visceral mesenteric and omental visceral taken from the same individual . The technique of mechanical dissociation was used, in order to investigate new sources for obtaining MSCs by this simple and cheap method. The samples were collected from patients undergoing bariatric surgery, between 30 to 45 years old, obese patients with associated diseases. Among 10 collected samples it was possible to measure cell viability from 4 patients. The tissue showed higher cell rate was the visceral tissue of omentum. In tests cryopreservation, the substance showed cryoprotectant capacity was 81% dimethylformamide at a concentration of 5% DMSO solution in a concentration of 5% 49% success was obtained. / As células-tronco mesenquimais (CTMs) são uma população residente em tecidos como medula óssea e tecido adiposo. Devido á baixa porcentagem destas células presentes em medula (0,01 – 0,001%), a fonte de maior utilização, se faz necessária à busca de novas fontes para utilização em terapia celular. Desta forma o trabalho propôs-se a obtenção, expansão, cultivo e criopreservação das CTMs a partir de tecido adiposo subcutâneo, visceral mesentérico e visceral de omento retirados de um mesmo indivíduo. Utilizou-se a técnica de dissociação mecânica, a fim de investigar novas fontes de obtenção de CTMs por essa metodologia simples e barata. As amostras foram coletadas de pacientes submetidos à cirurgia bariátrica, entre 30 a 45 anos, pacientes obesos e com doenças associadas. De 10 amostras coletadas foi possível o isolamento e expansão celular de 40% dos pacientes. O tecido que apresentou maior taxa celular foi o tecido visceral de omento. Nos ensaios de criopreservação, a substância que apresentou capacidade crioprotetora de 81% foi a Dimetilformamida em concentração de 5%, a solução de DMSO em concentração 5% obteve 49% de sucesso.

Malformações fetais são importantes causas de óbito fetal e mortalidade infantil. A medicina regenerativa apresenta-se como a terceira modalidade terapêutica fetal. Células obtidas do líquido amniótico mostram-se como opção preferencial em terapia celular por sua alta taxa de proliferação in vitro, habilidade de autorrenovação e potencial multilinhagem. Para uso clínico, é recomendável a exclusão de material animal não humano do meio de cultura dessas células, prevenindo reações imunes, transmissão de príons, bactérias e vírus. O soro fetal bovino é componente usual do meio de cultura dessas células. Sua substituição por soro humano previne essas possíveis consequências. O objetivo deste trabalho foi estudar células obtidas do líquido amniótico, em meio de cultura suplementado por soro fetal bovino ou humano e compará-las. Foram avaliadas seu isolamento e cultivo, padrão de crescimento, morfologia, imunofenótipo, capacidade de diferenciação osteogênica e condrogênica, e caracterizou-se a expressão dos genes OCT-4, NANOG e SOX2. Foram analisadas amostras provenientes de cinco gestantes, obtidas por amniocentese de segundo trimestre, indicadas por idade materna avançada. As células do líquido amniótico, após centrifugação, foram colocadas em frasco de cultura com meio -MEM suplementado com 20% de soro fetal bovino (grupo B) ou soro humano (grupo H). Ao atingirem 70% de confluência, foram tripsinizadas e expandidas. Após a terceira passagem celular foram separadas alíquotas do grupo B e H para avaliação de seu potencial de expansão, por meio da construção de curvas de crescimento celular para diferentes inóculos iniciais (1.000, 5.000, 10.000 e 15.000 células). Sua morfologia foi avaliada por microscopia ótica através da coloração de Leishman e por microscopia eletrônica. A análise do imunofenótipo das células dos dois grupos foi realizada por citometria de fluxo, analisando-se os marcadores de superfície: CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD106, CD117 e CD133. A diferenciação osteogênica foi realizada pelo acréscimo ao meio de cultura de fosfato-2-ascorbato e -glicerofosfato, comprovada pela produção de cálcio pelas células, coradas pela Alizarina e visualização da Fosfatase Alcalina nas células. A diferenciação condrogênica foi realizada pelo acréscimo ao meio de cultura de dexametasona e TGF-1, comprovada pela análise histológica após coloração pela hematoxilina-eosina. Avaliou-se a expressão gênica dos transcritos OCT-4, NANOG e SOX2, por RT-PCR das células dos dois grupos (B e H), comparadas aos controles celulares MRC-5 e NTERA-2 cl.D1. Observou-se alta taxa de expansão, sem diferença significativa entre os grupos (p=0,715), mesmo considerando-se a evolução dia-a-dia (p=0,681) e a alta viabilidade celular, com média de 94% nos dois grupos (p=0,686). A análise morfológica das células dos dois grupos revelou aspecto mesenquimal típico, com crescimento celular em cultura também típico dessa linhagem. Ao microscópio eletrônico, observou-se maior número de vacúolos lipídicos naquelas células do grupo H. A imunofenotipagem demonstrou marcação positiva para linhagem mesenquimal e negativa para outras linhagens. Ocorreu diferenciação osteogênica e condrogênica e expressão dos transcritos OCT-4, NANOG e SOX2. Não houve diferença significativa nos aspectos estudados, entre os grupos B e H. Concluiu-se que essas células, isoladas do líquido amniótico, apresentam característica de fácil isolamento, alta taxa de proliferação, aspecto morfológico e imunofenótipo mesenquimal, capacidade de diferenciação osteogênica e condrogênica, expressando os transcritos OCT-4, NANOG e SOX2, associados à pluripotência celular, tanto em meio suplementado por soro fetal bovino como por soro humano. / Fetal malformations are a significant cause of fetal death and infant mortality. Regenerative medicine is presented as a third therapeutic method. Cells obtained from the amniotic fluid are seen to be an option of choice for cell therapy because of their high rate of in vitro proliferation, power of selfrenewal and multi-lineage potential. For clinical use the exclusion of nonhuman animal material from the culture medium of these cells is to be recommended, thus precluding immune reactions and the transmission of prions, bacteria and viruses. Bovine fetal serum is a normal component of the culture medium of these cells. Its replacement by human serum precludes those possible consequences. The objective of this present study was investigation into the cells obtained from the amniotic fluid, in a culture medium supplemented with bovine fetal or human serum, and compare them. Their isolation and culture, growth rate, morphology, immune phenotype and osteogenic and chondrogenic capacity were assessed and the expression of the OCT-4, NANOG and SOX2 genes was characterized. Samples taken from five pregnant women by amniocentesis during the second trimester, recommended by virtue of advanced maternal age, were analyzed. The cells of the amniotic fluid, after centrifugation, were placed in a culture flask with an -MEM medium supplemented with 20% of bovine fetal serum (group B) or human serum (group H). After attaining 70% confluence they were trypsinized and expanded. After the third cellular passage they were separated into quotas of groups B and H for assessment of their expansion potential, by means of the construction of cellular growth curves for the different initial inocula (1,000, 5,000, 10,000 and 15,000 cells). Their morphology was assessed by optical microscopy by means of Leishman´s staining and electron microscopy. The analysis of the immune phenotype of the cells of the two groups was undertaken by flow cytometry, the surface markers CD14, CD29, CD31, CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, CD106, CD117 and CD133 being analyzed. The osteogenic differentiation was undertaken by the addition of ascorbate-2-phosphate-2 and - glycerophosphate to the culture medium and proved by the production of calcium by the cells, stained with Alizarin, and visualization of the Alkaline Phosphatase in the cells. The chondrogenic differentiation was brought about by the addition of dexamethasone and TGF-1 to the culture medium and demonstrated by histological analysis after staining with hematoxilineeosine. The genic expression of the OCT-4, NANOG and SOX2 transcripts was compared with the control cells MRC-5 and NTERA-2 cl.D1 by the RTPCR of the cells of the two groups (B and H). A high expansion rate was observed, with no significant difference between the groups (p=0.715), even when the day-to-day progress (p=0.681) was taken into consideration, and high cell viability, with an average of 94% in the two groups (p=0.686). The morphological analysis of the cells of the two groups presented a typical mesenchymal aspect, with cell growth in the culture also typical of this line. Under the electron microscope, a greater number of lipid vacuoles were observed in the cells of the H group. The immune phenotyping presented a positive marking for the mesenchymal line but a negative one for the others. Osteogenic and chondrogenic differentiation occurred as also did expression of the transcripts OCT-4, NANOG and SOX2. There was no significant difference, as regards the aspects studied, between groups B and H. It is concluded that these cells isolated from the amniotic fluid were characterized by ease of isolation, a high rate of proliferation, mesenchymal morphological aspect and immune phenotype, capacity for osteogenic and chondrogenic differentiation, expressing the transcripts OCT-4, NANOG and SOX2, both in the medium supplemented with bovine fetal serum and in that with human serum.

As células-tronco mesenquimais (CTM) são células progenitoras indiferenciadas que apresentam altas taxas de proliferação em cultivo, capacidade de diferenciação em inúmeros tecidos e podem ser encontradas no organismo adulto e, também, em tecidos fetais, como cordão umbilical, placenta e liquido amniótico (LA). Estudos demonstraram que o LA humano obtido por amniocentese no segundo trimestre de gestação, comumente utilizado em exames de diagnóstico fetal, apresenta-se como uma fonte em potencial destas células progenitoras. Contudo, estas células necessitam de mais estudos quanto às técnicas de isolamento, expansão e, sobretudo, acerca dos protocolos de congelamento utilizados em sua criopreservação. Com isso, nos propusemos a padronizar técnicas de cultivo para as CTLA, como melhor meio de cultura e densidade de inóculo; avaliar as características biológicas como estado de indiferenciação, ciclo celular, marcadores de membrana, plasticidade e, ainda, testar dois protocolos de congelamento celular (padrão e gradual) com diferentes criopreservantes (DMSO, glicerol, trealose e sacarose) que mantivessem uma alta viabilidade e as demais características das células-tronco após períodos de 3 e 6 meses de armazenamento em nitrogênio líquido. Ao fim dos experimentos constatamos ser o líquido amniótico uma rica fonte de CTM passíveis de serem isoladas e cultivadas com meio de cultura a-MEM suplementado com 20% de SFB. Padronizamos, também, uma contagem celular inicial das amostras para otimizar o plaqueamento primário, uma densidade de inóculo ideal para as passagens posteriores (5.000 céls/cm2) e o tempo de dobramento (30 ± 4 horas) das mesmas. As CTLA expressaram genes de indiferenciação: Oct-4, Sox-2 e Nanog; apresentaram positividade para marcadores de superfície CD29, CD44, CD90 e CD105; alta taxa de proliferação in vitro e diferenciaram-se em tecido ósseo, adiposo, cartilaginoso e neuronal. Não encontramos diferenças significativas entre os dois métodos de congelamento avaliados no que diz respeito à viabilidade pós-congelamento. Todos os criopreservantes analisados mantiveram o estado de indiferenciação e plasticidade das células-tronco congeladas por 3 e 6 meses, contudo o DMSO 10% proporcionou maiores taxas de viabilidade do que os demais. As CTLA ficam desta maneira melhor caracterizadas, com protocolos de cultivo e estocagem bem estabelecidos, facilitando a produção de células-tronco funcionais em larga escala aptas a serem utilizadas em experimentos futuros / Mesenchymal stem cells (MSCs) are undifferentiated progenitor cells that have high proliferation rates in culture, ability to differentiate into various tissues and can be found in adult and fetal tissues such as umbilical cord, placenta and amniotic fluid (AF). Studies showed that human AF obtained by amniocentesis in second trimester of pregnancy, commonly used in fetal diagnostic, is a potential source of progenitor cells. However, these cells require further studies above techniques of isolation, expansion and, especially, about freezing protocols used in their cryopreservation. For then, we analyzed isolation and expansion methods to AFSC as the best culture medium and inoculum density; biological characteristics such as undifferentiated state, cell cycle, membrane markers, plasticity, and also we tested two freezing protocols (standard and graduated) with different cryoprotectors (DMSO, glycerol, trehalose and sucrose) that could be able to maintain high viability and other characteristics of stem cells after 3 and 6 months of storage in liquid nitrogen. At the end of experiments we found that amniotic fluid is a rich source of mesenchymal stem cells that can be isolated and cultured with a-MEM medium supplemented with 20% FBS. Standardized an initial cell samples counting to optimize primary plating, an ideal inoculum density for the later passages (5000 cells/cm2) and doubling time (30 ± 4 hours). AFSC expressed undifferentiated genes: Oct-4, Sox-2 and Nanog, were positive for surface markers CD29, CD44, CD90 and CD105; presented high in vitro proliferation rate and capability to differentiate into bone, adipose, cartilage and neuronal tissues. There was not statistical significance in cell viability between standard and graduated freezing protocols. All evaluated cryoprotectors maintained the basic features of amniotic fluid stem cells, as Oct-4 gene expression, surface markers and plasticity. DMSO 10% showed higher rates of viability than the others. We can conclude that AF is a rich source of MSC with great capacity for expansion and differentiation and that both methods of freezing could be used for AF cells storage. All tested cryoprotectors maintains stemness of AFSC, therefore the highest viability rate is supplied by 10% DMSO. In this way, AFSC are better characterized, with cultivation and storage protocols standardized, resulting in large scale production of functional stem cells suitable for use in future experiments

Tse, Chi Lok. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2011. / Includes bibliographical references (leaves 116-131). / Abstracts in English and Chinese. / Declaration --- p.i / Abstract --- p.iii / Abstract in Chinese --- p.v / Acknowledgements --- p.vi / Table of Contents --- p.vii / List of Figures --- p.X / List of Tables --- p.xii / List of Abbreviations --- p.xiii / Chapter CHAPTER 1 --- General Introduction / Chapter 1.1 --- Regenerative Medicine --- p.1 / Chapter 1.2 --- Embryonic Stem Cells and Reprogramming --- p.3 / Chapter 1.3 --- Transdifferentiation --- p.6 / Chapter 1.4 --- The Cerebellum --- p.7 / Chapter 1.4.1 --- Functions of the cerebellum --- p.7 / Chapter 1.4.2 --- Structure and organization of the cerebellum --- p.8 / Chapter 1.4.3 --- Principle cellular components in the cerebellum --- p.12 / Chapter 1.4.3.1 --- Purkinje cells --- p.12 / Chapter 1.4.3.2 --- Granule cells --- p.12 / Chapter 1.4.3.3 --- Mossy fibres --- p.13 / Chapter 1.4.3.4 --- Climbing fibres --- p.13 / Chapter 1.4.3.5 --- Deep cerebellar nuclei --- p.13 / Chapter 1.4.3.6 --- Other cerebellar neurons --- p.14 / Chapter 1.4.3.7 --- Neuroglia of the cerebellum --- p.16 / Chapter 1.4.4 --- Circuitry of the cerebellum --- p.17 / Chapter 1.5 --- Development of the Cerebellum --- p.21 / Chapter 1.5.1 --- Anatomical changes during cerebellar development --- p.21 / Chapter 1.5.2 --- Molecular control of cerebellar development --- p.25 / Chapter 1.5.2.1 --- Specification of the cerebellar region --- p.25 / Chapter 1.5.2.2 --- Neurogenesis from the ventricular zone --- p.26 / Chapter 1.5.2.3 --- Neurogenesis from rhombic lip --- p.29 / Chapter 1.6 --- Scope of the Thesis --- p.33 / Chapter CHAPTER 2 --- Materials and General Methods / Chapter 2.1 --- Materials for Molecular Biological Work --- p.35 / Chapter 2.1.1 --- Enzymes --- p.35 / Chapter 2.1.2 --- Chemicals and others --- p.35 / Chapter 2.1.3 --- Plasmid vectors and plasmid --- p.36 / Chapter 2.1.4 --- Solutions and media --- p.36 / Chapter 2.2 --- Materials for Tissue/Cell Culture --- p.38 / Chapter 2.2.1 --- Chemicals --- p.38 / Chapter 2.2.2 --- Culture media and solutions --- p.38 / Chapter 2.2.3 --- Culture cells --- p.39 / Chapter 2.3 --- Animals --- p.40 / Chapter 2.4 --- Materials for Immunocytochemistry --- p.40 / Chapter 2.5 --- Oligonucleotide Primers --- p.41 / Chapter 2.6 --- RNA Extraction --- p.44 / Chapter 2.7 --- Generation of cDNA from mRNA --- p.44 / Chapter 2.8 --- Preparation of Recombinant Plasmid DNA --- p.45 / Chapter 2.8.1 --- Small scale preparation of DNA --- p.45 / Chapter 2.8.2 --- QLAGEN plasmid midiprep kit method --- p.46 / Chapter 2.9 --- Preparation of Specific DNA Fragment from Agarose Gel --- p.46 / Chapter 2.10 --- Subcloning of DNA Fragments --- p.47 / Chapter 2.10.1 --- Preparation of cloning vectors --- p.47 / Chapter 2.10.2 --- Subcloning of DNA fragment --- p.48 / Chapter 2.10.3 --- Transformation of DNA into competent cells --- p.48 / Chapter 2.11 --- Preparation of Competent Cells --- p.48 / Chapter CHAPTER 3 --- Generation and Characterization of Induced Neurons / Chapter 3.1 --- Introduction --- p.50 / Chapter 3.2 --- Experimental Procedures --- p.51 / Chapter 3.2.1 --- Construction of expression vector --- p.51 / Chapter 3.2.1.1 --- Preparation of insert DNA --- p.51 / Chapter 3.2.1.2 --- Construction of entry vector --- p.52 / Chapter 3.2.1.3 --- Construction of destination vector --- p.52 / Chapter 3.2.1.4 --- Construction of expression vector --- p.52 / Chapter 3.2.2 --- Generation of induced neural cells --- p.57 / Chapter 3.2.2.1 --- Culture of mouse embryonic fibroblasts (MEF) --- p.57 / Chapter 3.2.2.2 --- Production of expression vector containing retroviruses --- p.57 / Chapter 3.2.2.3 --- Transfection and induction of neural fate of MEF --- p.57 / Chapter 3.2.3 --- Immunocytochemcial analysis --- p.58 / Chapter 3.2.4 --- Efficiency calculation --- p.59 / Chapter 3.3 --- Results --- p.62 / Chapter 3.3.1 --- A screen for cerebellar Purkinje and granule cell fate-inducing factors --- p.62 / Chapter 3.3.2 --- Characterization of the induced neurons --- p.67 / Chapter 3.3.2.1 --- Granule cell induction --- p.67 / Chapter 3.3.2.2 --- Purkinje cell induction --- p.71 / Chapter 3.4 --- Discussion --- p.102 / Chapter 3.4.1 --- Roles of inducing factors in Purkinje cells and granule cells development --- p.102 / Chapter 3.4.2 --- Mechanism of neural transdifferentiation --- p.107 / Chapter CHAPTER 4 --- Future Directions / Chapter 4.1 --- Complete Induction of Purkinje Cell Fate --- p.111 / Chapter 4.2 --- Induced Neurons of Different Subtypes --- p.112 / Chapter 4.3 --- Mechanism of Transdifferentiation --- p.114 / Chapter 4.4 --- Transdifferentiation and Regenerative Medicine --- p.114 / Bibliography --- p.116

Usando incorporação \"in vivo\" de 35S metionina tradução \"in vitro\" de RNA e eletroforese bidimensional, iniciamos um estudo do controle da síntese de proteínas durante duas fases distintas de diferenciação celular, a esporulação e a germinação, do fungo Blastocladiella emersonii. Durante a esporulação ocorre uma intensa variação no padrão de síntese proteica. Foi analisada a síntese de 108 proteínas, sendo verificado que o aumento na síntese de várias proteínas está associado com estágios definidos da esporulação. Um grande número de proteínas básicas é sintetizado exclusivamente no final da esporulação, que corresponde à fase de diferenciação dos zoósporos. Também foram detectadas drásticas variações na população de mRNAs ao longo de toda a esporulação. A síntese de várias proteínas típicas da esporulação parece ser controlada ao nível da transcrição. Além disso a maioria dos RNAs mensageiros específicos da esporulação não é conservada nos zoósporos maduros; o zoósporos contém mRNAs armazenados que provavelmente são sintetizados nos últimos 30 minutos da esporulação. Durante a transição dos zoósporos a células redondas, que ocorre nos primeiros 25 minutos após a indução da germinação em meio inorgânico, não foram verificadas diferenças qualitativas no padrão de síntese proteica, tanto na ausência como na presença de actinomicina D, indicando que os eventos precoces da germinação são inteiramente pré-programados pelo mRNA que está armazenado nos zoósporos. Contudo, na germinação tardia são verificadas profundas variações no padrão de síntese proteica. A síntese de algumas dessas proteínas (seis polipeptídios), provavelmente corresponde a uma tradução seletiva de mensagens armazenadas nos zoósporos, enquanto que a maioria das novas proteínas expressas (vinte e dois polipeptídios) corresponde a tradução de novos mRNAs. Assim, durante a germinação dos zoósporos, ocorrem múltiplos níveis de regulação da síntese proteica, envolvendo controles ao nível da tradução e transcrição. Durante o início da germinação também foi observado um controle ao nível de pós-traduçãoo, com várias proteínas dos zoósporos sendo especificamente degradadas ou modificadas. Também analisamos o padrão das proteínas sintetizadas durante a germinação em meio nutriente sendo observada a síntese de polipeptídios específicos desta condição de germinação e crescimento. Algumas proteínas cuja síntese é controlada pelo desenvolvimento foram identificadas. Utilizando anticorpos monoclonais comerciais contra actina, α e β-turbulinas foip-tubulinas foi possível identificar estas proteínas no perfil eletroforético de proteínas sintetizadas durante a esporulação. Comparando a cinética da síntese \"oin vitro\" destas proteínas com o acúmulo de seus respectivos mRNAs traduzidos \"in vitro\", o, foi possível demonstrar que o intenso aumento na síntese de actina, α e β-tubulinas que ocorre durante a esporulação apresenta uma correlação temporal com o aumento dos mRNAs correspondentes. Em paralelo ao aumento da síntese destas três proteínas citoesqueLéticas pôde ser detectado um aumento dos seus conteúdos em massa. Durante a germinação e crescimento ocorre uma sensível diminuição no conteúdo destas proteínas. Além disso, verificamos que as proteínas identificadas como α e β-tubulinas estão presentes no flagelo dos zoósporos. Muito interessante foi a observação de que três proteínas sintetizadas durante a esporulação correspondiam aparentemente a três proteínas, Hsp70, Hsp76 e Hsp39a, cuja síntese é induzida pelo choque térmico. Esta verificação decorreu do fato de estarmos investigando se em Blastocladiella a resposta ao choque térmico teria algum controle do desenvolvimento, uma vez que alguns dados da literatura sugeriam o envolvimento de certas proteínas de choque térmico (Hsps) no desenvolvimento normal de alguns organismos. Em Blastocladiella a resposta ao choque térmico é dependente do estágio do desenvolvimento. Células expostas a temperaturas elevadas nos diferentes estágios do desenvolvimento (esporulação, germinação e crescimento) mostram uma síntese diferencial de proteínas de choque térmico. Conjuntos específicos de Hsps (de um total de 22 Hsps) são induzidos em cada fase, demonstrando uma expressão não coordenada dos genes de choque térmico. A proteína de 70 kDa, sintetizada espontaneamente durante um certo intervalo da esporulação, apresenta mobilidade eletroforética em géis bidimensionais idêntica à Hsp70. A confirmação da identidade entre estas proteínas foi obtida através de análise dos seus peptídios resultantes de digestão enzimática parcial bem como pelo reconhecimento de ambas as proteínas por anticorpos contra a proteína DnaK (homóloga à Hsp70> de E. coli e contra a proteína Hsp70 de Drosophila. Utilizando tradução o\"in vitro\"o de RNA e hibridização de RNA com uma sonda do gene hsp70 de Drosophila, demonstramos que o aumento de síntese da Hsp70 que ocorre durante o choque térmico e espontaneamente durante a esporulação, está associado com a acumulação do mRNA desta proteína. Embora a síntese de Hsps seja controlada pelo desenvolvimento em Blastocladiella, a aquisição de termotolerância pode ser induzida em qualquer estágio do seu ciclo de vida. A indução da termotolerância em Blastocladiella é dependente da síntese de proteínas e está correlacionada com o aumento da síntese de algumas Hsps: Hsp82a, Hsp82b, Hsp76, Hsp70, Hsp60,Hsp25 e Hsp17b. As outras Hsps parecem não estar envolvidas especificamente com a termotolerância. As observações anteriores de que o estado de fosforilação da proteína ribossômica 56, em Blastocladiella, varia durante o desenvolvimento e em resposta a alterações do meio ambiente (Bonato et al., 1984, Eur. J. Biochem. 144:597-606) e a verificação de que a resposta ao choque térmico, em Blastocladiella, também está sob o controle do desenvolvimento proporcionou a oportunidade de verificar se os diferentes níveis de fosforilação de 56 poderiam ser correlacionados com a tradução de mensageiros específicos isto é, mRNAs normais ou de choque térmico durante o choque térmico, recuperação do choque térmico e indução de termotolerância nos diferentes estágios do ciclo de vida deste fungo. Assim foi observado que, independente do estado inicial de fosforilação de 56 (máximo ou intermediário>, ocorre uma rápida e completa desfosforilação de 56 durante o choque térmico, sendo que a 56 permanece desfosforilada durante a termotolerância. Durante a recuperação do choque térmico, ocorre a refosforilação de 56 para os níveis característicos de cada estágio do desenvolvimento, coincidentemente com a interrupção da síntese de proteínas de choque térmico. / Using 35S methionine pulse labeling in vitro translation and two-dimensional gel electrophoresis, we investigated the regulation of protein synthesis during two distinct phases of cell differentiation, sporulation and germination, in the aquatic fungus Blastocladiella emersonii. We have found dramatic changes in the spectrum of proteins synthesized during sporulation. Synthesis of 108 polypeptides was analyzed and a large increase in the synthesis of several proteins is associated with particular stages. A large number of basic proteins are synthesized exclusively during late sporulation. Changes in translatable mRNA species were also detected by in vitro translation of RNA prepared at different stages of sporulation. The synthesis of several proteins during sporulation seems to be transcriptionally controlled. Most of the sporulationspecific messages are not present in the mature zoospores; the zoospores contain stored mRNA, which is apparently synthesized in the last 30 min of sporulation.We analyzed the pattern of proteins synthesized during zoospore germination in an inorganic solution, in both the presence and absence of actinomycin D. During the transition from zoospore to round cells (the first 25 min), essentially no qualitative differences were noticeable, indicating that the earliest stages of germination are entirely preprogrammed with stored RNA. Later in germination (after 25 min), however, changes in the pattern of protein synthesis were found. Some of these proteins (a total of 6 polypeptides) correspond possibly to a selective translation of stored messages, whereas the majority of the changed proteins (22 polypeptides) corresponds to newly synthesized mRNA. Thus, multiple levels of protein synthesis regulation seem to occur during zoospore germination, involving both transcriptional and translational controls. We also analyzed the pattern of protein synthesis during germination in a nutrient medium; synthesis of specific polypeptides occurred during late germination. During early germination posttranslational control was also observed, several labeled proteins from zoospores being specifically degraded or charge modified. Some proteins whose expression is developmentally regulated were identified. Actin, α- and β-tubulin have been identified in the two-dimensional pattern of proteins synthesized during sporulation by using well characterized monoclonal antibodies and western blotting. We compared the kinetics of synthesis of these proteins, by pulse-labeling experiments with ‌35S‌methionine, with the accumulation of their corresponding mRNAs, translated in a cell-free system. Large increases occur in the rates of actin and α- and β-tubulin biosynthesis during sporulation and there is an accumulation of the corresponding mRNAs. In parallel to the increased synthesis, these cytoskeletal proteins accumulate during the late stage of sporulation. During germination and early growth there is a strong decrease in the level of these proteins. We also verified that α- and β-tubulin are present in flagellar axonemes of zoopores. Very interesting was the observation that three proteins spontaneously expressed during sporulation correspond possibly to three heat shock-induced proteins CHsp70, Hsp76, Hsp39a). This fact was noticed when we were investigating the heat shock-response during the development of Blastocladiella. The heat-shock response in Blastocladiella is dependent on the developmental stage. Cells exposed to elevated temperatures at different stages of life cycle (sporulation, germination or growth) show a differential synthesis of heat-shock proteins (Hsps). Of a total af 22 polypeptides induced, particular subsets of Hsps appear in each phase, demonstrating a non-coordinate heat-shock gene expression. By the criteria of two-dimensional gel electrophoresis and partial proteolysis mapping, the 70-kDa protein, whose synthesis is induced spontaneously during sporulation, is indistinguishable from the heat-inducible hsp70. Additional evidence in support of the identity between the 70-kDa protein and Hsp70 was provided by immunological cross-reaction of both proteins with antibodies against DnaK protein from E.coli and Hsp70 from Drosophila. The techniques of in vitro translation, and Northern analysis using a Drosophila hsp70 probe, demonstrated that enhanced synthesis of hsp70, which occurs during heat-shock treatment and spontaneously during sporulation, is associated with an accumulation of Hsp70 mRNA. Although the Hsps synthesis is developmentally regulated in Blastocladiella, the acquisition of thermotolerance can be induced at any stage of the life cycle. lhe development of thermotolerance is correlated with the enhanced synthesis of some heat-shock proteins: Hsp82a, Hsp82b, Hsp76, Hsp70, Hsp60, Hsp25, Hsp17b. Other Hsps are not specifically involved in thermotolerance. In B. emersonii the state of 56 phosphorylation changes depending on the developmental stage and environmental conditions (Bonato et al., 1984, Eur. J. Biochem. 144, 597-606). On the other hand, we verified that the heat-shock response is developmentally regulated. Then, we examined the changes in 56 phosphorylation during heat shock, thermotolerance, and recovery from heat shock at different stages of life cycle in order to investigate whether the different levels of 56 phosphorylation might be correlated with the translation of specific message subsets. We observed that independently of the initial state of 56 phosphorylation (maximal or intermediate), a rapid and complete dephosphorylation of 56 is induced by heat shock and 56 remains unphosphorylated during the acquired thermotolerance. During recovery from heat shock rephosphorylation of 56 occurs always to the levels characteristic of that particular stage, coincidently with the turn off of heat shock protein synthesis.

O estômago do rato completa sua maturação durante a fase de transição alimentar, em que ocorre ingestão de ração juntamente com leite materno. No desmame precoce (DP) esta fase é interrompida e provoca elevação da corticosterona (CORT). Nosso objetivo foi avaliar, através do tratamento com RU486 (RU), se a CORT elevada modifica a maturação gástrica. Grupos experimentais: amamentado (A), ARU, DP e DPRU. Resultados de PCRq, em filhotes: o DP elevou a expressão de Muc5ac, Bhlha15, Pgc e diminuiu a expressão de Pga5, enquanto que o RU486 reverteu os resultados para Pgc e Muc5ac,. Ainda em filhotes, DP aumentou o número de células mucosas do colo (CMCs), células Mist1-positivas e PGC-positivas, e o RU486 reverteu o resultado para as CMCs e para as PGC-positivas. Em adultos, obtivemos os seguintes dados: redução de Pga5, causada pelo RU486; manutenção dos efeitos do DP sobre Pgc; manutenção dos dados, tanto de DP quanto de RU486, sobre as CMCs; e dos efeitos do RU486 sobre as células PGC-positivas. Portanto, a CORT elevada pelo DP é fundamental na maturação gástrica. / Rat´s gastric mucosa completes their maturation throughout the food transition process, when pups ingest chow and maternal milk. Early weaning (EW) consists in an abrupt suckling (S) interruption that increases corticosterone (CORT) levels. Our aim was to evaluate, using RU486 (RU), if these increase in CORT levels could affect gastric maturation. Experimental groups: S, SRU, EW and EWRU. By RT-qPCR, in 17-d-old rats, EW increased Muc5ac, Bhlha15 and Pgc and decreased Pga5 expression, while RU486 reverted the results for Pgc and Muc5ac. In 17 and 18-d-old pups, EW increased mucous neck cells (MNC), Mist1-positive and PGC-positive cells, although CORT inhibition reverted the result for MNC and PGC. In 30-d-old rats, we had the following results: reduction on Pga5 expression provoked by RU486; the results over Pgc were maintained; the results, caused both by EW as RU486, over MNC were maintained, as well as the effects of RU486 over PGC-positive cells. We concluded that the increase in CORT levels, caused by EW, plays a fundamental role in gastric maturation.