Orientador: Carmino Antonio De Souza / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T04:16:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Miranda_ElianaCristinaMartins_D.pdf: 1801629 bytes, checksum: b4c847d7141a9b207af7438bdef8c791 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O estudo analisa duas metodologias que estão sendo usadas para estimar a probabilidade de eventos. Um método é a inversão do Kaplan-Meier (1-KM), o qual não considera eventos competitivos, e o outro método é a função da incidência cumulativa (FIC). O estudo contemplou a definição do conceito de risco competitivo e a aplicação dos métodos citados em um conjunto de dados de pacientes submetidos ao transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH). Os critérios de inclusão foram pacientes consecutivos transplantados no período de Janeiro de 1994 a Dezembro de 2010, com diagnóstico de leucemia aguda (LA) ou leucemia mieloide crônica (LMC). O evento de interesse foi a doença do enxerto contra o hospedeiro (DeCH) crônica, enquanto os eventos competitivos foram: recaída e morte prévia a DeCH crônica. O resultado após a aplicação do método 1-KM para o grupo de pacientes com LA foi de 52% e estratificado pelo tipo de enxerto foi 44% para medula óssea (MO) e 77% para sangue periférico (SP) p= 0.003. Quando aplicado o método FIC a probabilidade geral foi de 45% e por tipo de enxerto foi 17% para MO e 33% para SP, p= 0.00002. No grupo de pacientes diagnosticados com LMC, usando a mesma racional os resultados foram similares. Não há comparações entre os métodos estatísticos, principalmente porque o pressuposto de se considerar o evento competitivo é aplicado somente na metodologia FIC. A fonte de células SP cotejada com fonte de células MO conduzem a uma incidência cumulativa maior de DeCH, independente da doença de base. Os resultados apresentaram, na grande maioria, diferenças grandes entre os testes, indicando a importância de se averiguar os detalhes no momento da aplicação / Abstract: This study presents two methodologies that have been used to estimate the probability of events. One method is the Kaplan-Meier inversion (1-KM), which no consider the competitive events, and another one is the cumulative incidence function (CIF). The study showed the definition of competitive risk concepts and its application in the database of patients submitted to the hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). Inclusion criteria were consecutive transplanted patients in the period between January 1994 to December 2010, with acute leukemia (AL) or chronic myeloid leukemia (CML). The interest event was chronic graft versus host disease (GVHD), insofar, competitive events were relapse or early death previous to chronic GVHD. The results after 1-KM application in the AL group was 52% and stratified by source of graft was 44% in bone marrow (BM) and 77% in peripheral blood (PB) with p=0.003. When CIF test applied the results was 45% and by source of graft was 17% in BM and 33% in PB, p= 0.00002. In the CML group the results were similar. There is no comparison between the statistical tests, mainly because their assumptions are not the same. PB as source of graft induces a higher incidence of chronic GVHD, independent of disease. All results presented, in the mayor, huge differences among the tests, indicating the importance to check the details at time of application / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

A esclerose múltipla (EM) é uma doença autoimune desmielinizante progressiva imunomediada por linfócitos T auto-reativos, que provocam uma cascata imunológica, amplificando a inflamação local. No Diabetes mellitus tipo 1 (DM1), existem linfócitos T auto reativos destroem as células beta do pâncreas, causando deficiência na produção de insulina. O desenvolvimento de terapêuticas específicas fica limitado pela etiologia indefinida destas doenças, apesar de avanços na terapêutica antiinflamatória e imunossupressora. Uma alternativa de tratamento atual para tais doenças é o transplante autólogo de células tronco hematopoéticas (TACTH). O presente estudo, observacional do tipo transversal, com a coleta de dados de caráter retrospectivo, tem como objetivo identificar as reações adversas manifestadas pelos pacientes diabéticos ou de esclerose múltipla, submetidos ao TACTH no período de 2004 a dezembro de 2010. Para a coleta de dados elaborou-se dois instrumentos que foram submetidos à validação aparente e de conteúdo por três juízes. A amostra final do estudo foi constituída pela obtenção dos dados de 72 prontuários, sendo 23 de pacientes diabéticos e 49 de pacientes com EM. Em relação aos pacientes diabéticos 16 pertenciam ao sexo masculino e a idade média foi 18,26 anos. Todos possuíam positividade para o anticorpo anti-carboxilase do ácido glutâmico (antiGAD65). Quanto aos pacientes com EM, trinta e três pertenciam ao sexo feminino e idade média foi de 37,2 anos. O subtipo da doença mais frequente foi o surto-remissivo em 21 (42,9%) pacientes. A escala expandida do estado de incapacidade (EDSS) variou entre 3,0 e 6,5. Em relação às reações adversas manifestadas pelos pacientes diabéticos foram mais frequentes os calafrios, febre, cefaléia, náusea e vômito e nos pacientes com esclerose múltipla foram retenção hídrica e cefaléia. As principais intervenções de enfermagem identificadas para os pacientes diabéticos e com EM foram monitorização dos sinais vitais, coleta de hemocultura, otimização da administração de medicamentos antieméticos, controle da infusão da globulina antitimocitária, orientações sobre alimentação e para reduzir o risco de queda. Os pacientes com DM1 apresentam reações mais agudas e necessitam de monitorização contínua. Já os pacientes com EM são mais dependentes dos cuidados de enfermagem, exigindo maior tempo de cuidados prestados pelo profissional. Embora o DM1 e a EM sejam doenças distintas, percebe-se que na prática clínica, exigem do enfermeiro uma excelência no cuidado, quer pelas particularidades do tratamento realizado ou pelas singularidades de cada uma delas. / Multiple sclerosis (MS) is a progressive demyelinating autoimmune disease, immune- mediated by auto-reactive T lymphocytes, which provoke an immunological cascade, enhancing the local inflammation. In type 1 diabetes mellitus (DM1), self-reactive T lymphocytes exist that destroy ? cells in the pancreas, causing insulin production deficiency. The development of specific therapeutics is limited by these diseases\' undefined etiology, despite advances in anti-inflammatory and immunosuppressive therapy. A current treatment alternative for these diseases is autologous hematopoietic stem cell transplantations (AHSCT). The aim of this observational and cross-sectional study with retrospective data collection is to identify the adverse reactions manifested by diabetic or MS patients who were submitted to AHSCT between 2004 and December 2010. For data collection, two instruments were elaborated, submitted to face and content validation with the help of three experts. The final study sample comprised data from 72 patient files, 23 from diabetic and 49 from MS patients. As for the diabetic patients, 16 were male and the mean age was 18.26 years. All were positive for the anti-glutamic acid decarboxylase (antiGAD65) antibody. Concerning MS patients, 33 were female and the mean age was 37.2 years. The most frequent disease subtype was relapsing-remitting in 21 (42.9%) patients. The expanded disability status scale (EDSS) score ranged between 3.0 and 6.5. As for the adverse reactions the diabetic patients manifested, shivers, fever, migraine, nausea and vomiting were the most frequent, while fluid retention and migraine were the most frequent among multiple sclerosis patients. The main nursing interventions identified for the diabetic and MS patients were vital sign monitoring, blood culture collection, optimization of anti-emetic drug administration, control of anti- thymocyte globulin infusion, dietary orientations and advice to reduce the risk of falls. DM1 patients present more acute reactions and need continuous monitoring. MS patients are more dependent on nursing care, demanding lower professional care time. Although DM1 and MS are distinct conditions, in clinical practice, they demand excellent care from nurses, whether due to the particularities of the treatment or the singularities of each disease.

Medulloblastoma is a common malignant brain tumor in childhood, but a rare disease amongst adults. The tendency to metastasize along cerebrospinal fluid pathways is well known. Extraneural metastases represent only a small number of recurrences and are associated with a poor outcome. Encouraging results of high-dose chemotherapy followed by autologous stem cell transplantation were reported previously in children with recurrent malignant brain tumors.

Einleitung Der Einsatz von Stammzellen als Grundlage neuer therapeutischer Strategien wird bereits seit über 25 Jahren intensiv erforscht. Stammzellen sind in der Lage, in verschiedene funktionale Zelltypen auszudifferenzieren und verfügen über ein enormes Proliferationspotential (NAM et al. 2015). Ausgehend von den Fähigkeiten von Stammzellen sehen Forscher und Kliniker erstmals eine realistische Möglichkeit, kurative Therapieoptionen für Erkrankungen zu entwickeln, die bisher als schwer behandelbar oder sogar unheilbar angesehen wurden. Davon könnten insbesondere Patienten chronisch-degenerativer neurologischer und zerebrovaskulärer Erkrankungen, einschließlich der großen Anzahl an Schlaganfallopfern, profitieren. Schlaganfälle repräsentieren eine der häufigsten Todesursachen in der westlichen Welt (LOPEZ et al. 2006). Ein Drittel der betroffenen Patienten verstirbt innerhalb eines Jahres, während etwa 40% von dauerhaften Behinderungen betroffen sind (MOZAFFARIAN et al. 2015). Trotz intensiver Forschung existieren neben der systemischen Thrombolyse, die auf einen engen Zeitraum von maximal 4,5 Stunden nach dem Akutereignis beschränkt ist, keine zugelassenen Therapieoptionen (HACKE et al. 2008, SAVER et al. 2009). Zelltherapeutische Strategien zur Behandlung des Schlaganfalls werden daher als besonders vielversprechend angesehen (ANDRES et al. 2011). Neben den bereits gesicherten Erkenntnissen zur stammzelltherapeutischen Sicherheit und Wirksamkeit aus Studien unter Einsatz gängiger Nagermodellen (BLISS et al. 2006, JOO et al. 2013) wird insbesondere die Überprüfung der Wirksamkeit an geeigneten Großtiermodellen gefordert, die die Situation des menschlichen Schlaganfallpatienten möglichst realistisch wiedergeben sollen (SAVITZ et al. 2011). Eine Voraussetzung für die erfolgreiche Testung eines zelltherapeutischen Ansatzes in einem Großtiermodell mit fokaler zerebraler Ischämie besteht darin, ein langfristiges Überleben xenogener Zelltransplantate durch ein geeignetes Immunsuppressionsprotokoll zu erreichen. Die Notwendigkeit einer Immunsuppression besteht darin, dass sowohl allo- als auch xenogene Transplantate eine Immunantwort beim Empfänger auslösen und somit zu einer Abstoßungsreaktion führen können (JANEWAY 2002). Die Anwendung von immunsuppressiven Medikamenten geht dabei aber häufig mit Nebenwirkungen einher. Insbesondere beim Schaf existiert jedoch nur eine limitierte Datenlage zu immunsuppressiven Protokollen und deren Nebenwirkungen. Ziele der Untersuchung Das Ziel der vorliegenden Studie bestand darin, eine xenogene Transplantation von fetalen humanen neuralen Progenitorzellen (fhNPZ) in einem gesunden Schafsmodell durchzuführen, um die Wirksamkeit in Hinblick auf das Transplantatüberleben und die Nebenwirkungen einer Immunsuppression mittels Cyclosporin A (CsA) zu untersuchen. Materialien und Methoden Hierfür wurden je 5 Schafe in zwei Gruppen über einen Zeitraum von 64 Tagen immunsupprimiert (iCsA: 3 mg CsA/kg 2x tägl. bis einschließlich Tag 36, danach 3 mg CsA/kg 1x tägl. jeden 3. Tag; kCsA: kontinuierlich 3 mg CsA/kg 2x tägl.), während eine Kontrollgruppe (Kon) von ebenfalls 5 Tieren keine Immunsuppression erhielt. Am Versuchstag 22 wurde den Schafen eisenmarkierte fhNPZ (Eisenkonzentration: 3,0 mM, ca. 200.000 Zellen pro Transplantationsposition) stereotaktisch in das gesunde Gehirn transplantiert. Aufgrund der Eisenmarkierung der Stammzellen konnten diese an den Versuchstagen 23, 36 und 64 mittels 3,0 MRT-Aufnahmen in vivo überwacht und anschließend ex vivo das Überleben der fhNPZ im Schafhirn 42 Tage nach Transplantation histologisch untersucht werden. Für die Untersuchungen zu Wirkspiegeln und Nebenwirkungen von CsA im Schaf wurden den Versuchstieren innerhalb des Versuchszeitraums regelmäßig Blutproben entnommen und am Versuchsende eine pathologische und histologische Untersuchung von Leber und Nieren durchgeführt. Ergebnisse Bei den durchgeführten Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass die CsA-Wirkspiegel im Blut bei der kCsA (424,0 ± 135,0 ng/ml) signifikant höher waren im Vergleich zur iCsA (198,5 ± 155,9 ng/ml). Diese Unterschiede besaßen jedoch keinen Einfluss auf das Langzeitüberleben der transplantierten fhNPZ. In keiner der drei Versuchsgruppen konnten vitale Zellen 42 Tage nach der Transplantation aufgefunden werden. Die Untersuchung der Nebenwirkungen von CsA ergab, dass die Langzeitgabe von CsA Anzeichen für einen hämatologischen Einfluss zeigt. Ebenso konnte sowohl eine hepatotoxische, als auch eine nephrotoxische Wirkung von CsA beim Schaf nachgewiesen werden. Schlussfolgerungen Schlussfolgernd kann zusammengefasst werden, dass die Gabe von 3 mg CsA/kg 2x tägl. nicht suffizient einer Abstoßungsreaktion xenogener ins Schafhirn transplantierter fhNPZ entgegenwirkt. Für das Ziel einer suffizienten zelltherapeutischen Anwendung im Schaf nach einem Schlaganfall sind somit weitere Untersuchungen zu einer wirksamen Immunsuppression beim Schaf und zu einem verbesserten Transplantatüberleben notwendig. Desweiteren konnten klinische und pathologische Nebenwirkungen beim Schaf durch die Langzeitgabe des Immunsuppressivums CsA festgestellt werden.:INHALTSVERZEICHNIS .................................................................................................................... I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................................... VI 1 EINLEITUNG .............................................................................................................................. 1 2 LITERATURÜBERSICHT ......................................................................................................... 2 2.1 Klassifikation von Stammzellen ......................................................................................... 2 2.2 Tierexperimentelle Stammzelltherapie beim Schlaganfall .............................................. 5 2.2.1 Hintergrund der translationalen Forschung am Tiermodell ............................................... 5 2.2.2 Tiermodelle der fokalen zerebralen Ischämie .................................................................... 6 2.2.3 Das Schaf als Großtiermodell ............................................................................................ 7 2.2.4 Transplantation fhNPZ als zelltherapeutischer Ansatz nach fokaler zerebraler Ischämie . 8 2.2.4.1 Die In-vivo-Überwachung von in Schafhirne transplantierten fhNPZ .......................... 9 2.2.4.2 Der immunhistochemische Nachweis vitaler humaner Zellen ex vivo im Schafhirn .. 11 2.3 Immunsuppression nach der Transplantation von Stammzellen .................................. 12 2.3.1 Wirkmechanismen des angeborenen und erworbenen Immunsystems ........................... 12 2.3.2 Immunantwort nach Transplantation ............................................................................... 12 2.3.3 Wirkstoffklassen von Immunsuppressiva ........................................................................ 14 2.3.4 Cyclosporin A .................................................................................................................. 16 2.3.4.1 Wirkmechanismus von Cyclosporin A ........................................................................ 16 2.3.4.2 Pharmakokinetik und Metabolisierung von Cyclosporin A ........................................ 16 2.3.4.3 Applikation und Dosierung von Cyclosporin A .......................................................... 17 2.3.4.4 Nebenwirkungen und Toxizität von Cyclosporin A .................................................... 17 2.3.4.5 Anwendung von Cyclosporin A in der tierexperimentellen Forschung ...................... 18 2.4 Fragestellung und Versuchsziele der Dissertation .......................................................... 19 3 TIERE, MATERIAL UND METHODEN ............................................................................... 20 3.1 Zellkultur ............................................................................................................................ 20 3.1.1 Zellkulturmedien und Zusammensetzung ........................................................................ 20 3.1.2 Auftauen und Aussaat der Zellen .................................................................................... 20 3.1.3 Ablösen der Zellen ........................................................................................................... 21 3.1.4 Zellzählung mittels Trypanblautest ................................................................................. 21 3.1.5 Passagieren der Zellen ..................................................................................................... 21 3.1.6 Eisenmarkierung der Zellen ............................................................................................. 22 3.1.7 Proliferations- und Vitalitätstests .................................................................................... 22 3.1.8 Ablösen der Zellen für Transplantationsexperimente ...................................................... 22 3.1.9 Mykoplasmentest ............................................................................................................. 23 3.2 Bestimmung der T2 NMR-Relaxationszeit ...................................................................... 23 3.3 Gelphantome ....................................................................................................................... 24 3.3.1 Herstellung und Ausgießen .............................................................................................. 24 3.3.2 Anfertigen von In-vitro-MRT-Aufnahmen zum Nachweis der eisenmarkierten fhNPZ . 25 3.4 Versuchstiere ...................................................................................................................... 26 3.4.1 Tierhaltung ....................................................................................................................... 26 3.4.2 Versuchstiere im tierexperimentellen Versuch ................................................................ 26 3.4.2.1 Tierärztliche Untersuchung der Vitalparameter .......................................................... 26 3.4.2.2 Durchführung des neurologischen Untersuchungsgangs ............................................. 27 3.4.2.3 Blutprobenentnahme, Versand und Detektiermethode ................................................ 27 3.5 Versuchsaufbau und Durchführung ................................................................................ 28 3.5.1 Anästhesie ........................................................................................................................ 29 3.5.2 Schmerzmittelregime und Infektionsprophylaxe ............................................................. 30 3.5.3 Implantation des Portsystems .......................................................................................... 31 3.5.4 Applikation von CsA ....................................................................................................... 32 3.5.4.1 Herstellung der Infusionslösung .................................................................................. 32 3.5.4.2 Applikation über das Portsystem ................................................................................. 33 3.5.5 Stammzelltransplantation ................................................................................................. 33 3.5.5.1 Anfertigen von MRT-Aufnahmen im 1,5 T MRT ....................................................... 34 3.5.5.2 Planung der stereotaktischen Zelltransplantation ........................................................ 34 3.5.5.3 Stereotaktische Zelltransplantation .............................................................................. 34 3.5.6 Nachweis der eisenmarkierten Stammzellen im 3,0 T MRT ........................................... 35 3.5.6.1 Methodik zum Nachweis und zur Quantifizierung der eisenmarkierten fhNPZ im Schafhirn ...................................................................................................................... 35 3.5.7 Sektion der Versuchstiere und Probenentnahme ............................................................. 36 3.5.8 Anfertigen der histologischen Gewebeschnitte ................................................................ 36 3.5.8.1 Herstellung der Paraffinschnitte .................................................................................. 37 3.5.8.2 Probenaufarbeitung und Lamellieren der Gehirne ....................................................... 37 3.5.8.3 Herstellung der Gefrierschnitte .................................................................................... 38 3.5.9 Histologische Färbungen ................................................................................................. 38 3.5.9.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung ....................................................................................... 40 3.5.9.2 Berliner Blau-Färbung ................................................................................................. 40 3.5.9.3 Fouchét-Färbung .......................................................................................................... 40 3.5.9.4 Immunmarkierung mit STEM101-DAB und Berliner Blau-Färbung ......................... 40 3.5.9.5 Immunhistologische Markierung mit Iba1-Antikörpern .............................................. 40 3.5.10 Auswertung der histologischen Präparate ........................................................................ 41 3.6 Statistik ............................................................................................................................... 44 4 ERGEBNISSE ............................................................................................................................. 47 4.1 Nachweis eisenmarkierter fhNPZ in vitro via MRT-Aufnahmen .................................. 47 4.1.1 Welche Eisenkonzentration ist für die Markierung der fhNPZ am geeignetsten? ........... 47 4.1.2 Können markierte fhNPZ durch eine T2-gewichtete MRT-Sequenz dargestellt werden? ......................................................................................................................................... 49 4.1.3 Wo liegt das Detektionslimit markierter fhNPZ in einer T2-gewichteten MRT-Sequenz? ......................................................................................................................................... 50 4.2 Der Einfluss des Immunsuppressivums CsA auf das Überleben der transplantierten fhNPZ im Schafhirn .......................................................................................................... 51 4.2.1 Gibt es gruppenspezifische Unterschiede in den CsA-Blutkonzentrationen? ................. 51 4.2.2 Besitzt die Transplantation fhNPZ einen neurologischen Einfluss auf die Sensorik und Motorik? .......................................................................................................................... 54 4.2.3 Was geschieht mit den transplantierten fhNPZ im Zeitverlauf und Gruppenvergleich? . 55 4.2.4 Können vitale fhNPZ 42 Tage nach Transplantation im Schafhirn nachgewiesen werden? ......................................................................................................................................... 56 4.3 Klinische und pathologische Nebenwirkungen von CsA im Schaf ................................ 59 4.3.1 Beeinflusst die CsA-Applikation in vivo klinische Parameter oder Blutwerte beim Schaf? ......................................................................................................................................... 59 4.3.1.1 Auswertung der Körpertemperaturverläufe ................................................................. 59 4.3.1.2 Auswertung der Körpergewichtsverläufe .................................................................... 60 4.3.1.3 Auswertung hämodynamischer Parameter .................................................................. 61 4.3.1.4 Auswertung hämatologischer Blutparameter .............................................................. 62 4.3.1.5 Auswertung leberspezifischer Blutparameter .............................................................. 65 4.3.1.6 Auswertung nierenspezifischer Blutparameter ............................................................ 69 4.3.1.7 Auswertung sonstiger Blutparameter .......................................................................... 70 4.3.2 Können ex vivo toxische Einflüsse von CsA auf das Schaf nachgewiesen werden? ....... 71 4.3.2.1 Makroskopische Auswertung der Sektionsbefunde .................................................... 71 4.3.2.2 Histologische Auswertung Leber und Nieren ............................................................. 73 5 DISKUSSION ............................................................................................................................. 76 5.1 Hintergrund der Arbeit und Versuchsziele ..................................................................... 76 5.2 Bewertung des Studiendesigns und der Versuchsdurchführung .................................. 76 5.2.1 Versuchstiere und Haltungsbedingungen ........................................................................ 76 5.2.2 Studiendesign und das Schaf als Tiermodell ................................................................... 77 5.3 Diskussion der Ergebnisse ................................................................................................. 78 5.3.1 Ein Nachweis eisenmarkierter fhNPZ in vitro via MRT-Aufnahmen ist möglich .......... 78 5.3.1.1 Eine Eisenkonzentration von 3,0 mM ist für die Markierung der fhNPZ am geeignetsten ................................................................................................................. 79 5.3.1.2 Markierte fhNPZ können durch eine T2-gewichtete Sequenz dargestellt werden ...... 80 5.3.1.3 Das Detektionslimit markierter fhNPZ liegt in einer T2-gewichteten MRT-Sequenz bei 50.000 Zellen ......................................................................................................... 81 5.3.2 Die Langzeitgabe des Immunsuppressivums CsA besitzt keinen Einfluss auf das Überleben der transplantierten fhNPZ im immunprivilegierten Gehirn .......................... 81 5.3.2.1 Es gibt gruppenspezifische Unterschiede in den CsA-Blutkonzentrationen ............... 81 5.3.2.2 Die Transplantation von fhNPZ besitzt keinen bedeutenden Einfluss auf die Sensorik und Motorik ................................................................................................................. 83 5.3.2.3 Die transplantierten fhNPZ zeigen Veränderungen in Zeitverlauf und Gruppenvergleich ........................................................................................................ 84 5.3.2.4 Es können keine vitalen fhNPZ 42 Tage nach Transplantation im Schafhirn nachgewiesen werden .................................................................................................. 85 5.3.2.5 Schlussfolgerung zur Immunsuppression mittels CsA nach Stammzelltransplantation ins Schafhirn ................................................................................................................ 87 5.3.3 Die Langzeitgabe von CsA verursacht Anzeichen für pathologische Veränderungen und klinische Symptome beim Schaf ...................................................................................... 88 5.3.3.1 Die Langzeitgabe von CsA beeinflusst klinische Parameter beim Schaf .................... 88 5.3.3.2 Die Langzeitgabe von CsA zeigt wahrscheinlich keine hämodynamische Wirkung .. 89 5.3.3.3 Die Gabe von CsA zeigt Anzeichen für eine hämatologische Wirkung beim Schaf ... 89 5.3.3.4 Die Gabe von CsA zeigt eine hepatotoxische Wirkung beim Schaf ........................... 90 5.3.3.5 Die Gabe von CsA zeigt eine nephrotoxische Wirkung beim Schaf ........................... 93 5.3.3.6 Die Langzeitgabe von CsA beeinflusst weitere unspezifische Blutparameter ............ 95 5.3.3.7 Schlussfolgerungen zu Nebenwirkungen von CsA beim Schaf .................................. 95 5.4 Allgemeine Schlussfolgerung ............................................................................................. 95 5.5 Ausblick ............................................................................................................................... 96 6 ZUSAMMENFASSUNG ............................................................................................................ 97 7 SUMMARY ................................................................................................................................. 99 8 LITERATURVERZEICHNIS ................................................................................................. 101 9 ANHANG ................................................................................................................................... 110 9.1 Ergänzende Tabelle zur Herstellung der Gelphantome ............................................... 110 9.2 Ergänzende Tabellen zur Herstellung histologischer Präparate ................................. 111 9.2.1 Herstellung der Paraffinblöcke ...................................................................................... 111 9.2.2 Histologische Färbungen und Immunhistochemische Methoden .................................. 112 9.3 Ergänzende Tabellen zur Statistik ................................................................................. 116 9.4 Verwendete Referenzwerte ............................................................................................. 118 9.5 Übersicht der ausgewerteten Blutparameter ................................................................ 119 9.6 Übersicht zu tierexperimentellen Einsätzen von Stammzellen in Schlaganfallmodellen ........................................................................................................................................... 122 9.7 Auflistung verwendeter Materialien und Geräte .......................................................... 123 9.8 Abbildungsverzeichnis ..................................................................................................... 129 9.9 Formelverzeichnis ............................................................................................................ 130 9.10 Tabellenverzeichnis ......................................................................................................... 130 10 DANKSAGUNG ....................................................................................................................... 132

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Aufgrund der verfügbaren Literatur und Daten ist nicht erwiesen, dass eine prophylaktische Thrombozytentransfusion nach myeloablativer Chemotherapie notwendig oder für den Patienten vorteilhaft ist. Die im Verlauf der Jahre immer weiter gesenkten Schwellenwerte zur prophylaktischen Thrombozytentransfusion legten nahe, die Möglichkeit zu überprüfen, auf eine prophylaktische Substitution ganz zu verzichten und nur im Falle relevanter Blutungen zu transfundieren. Mit der hier ausgewerteten Studie liegen erstmals Daten aus einer multizentrischen, prospektiv randomisierten Studie zum Vergleich einer prophylaktischen mit einer therapeutischen Transfusionsstrategie für Thrombozyten nach autologer Stammzelltransplantation vor: es wurde eine prophylaktische Thrombozytentransfusion bei Thrombozytenwerten ≤ 10/nl mit einer neuen Transfusionsstrategie (Substitution nur bei relevanter Blutung oder definierten Risikosituationen) verglichen. Mit der experimentellen, therapeutischen Transfusionsstrategie für Thrombozyten kann eine Reduktion der Thrombozytentransfusionen um ca. 50% im Vergleich zu dem etablierten prophylaktischen Transfusionsregime erreicht werden: bei den hier untersuchten 92 Patienten wurden im experimentellen Arm für 47 Patienten nur 37 Thrombozytenkonzentrate benötigt, für die 45 prophylaktisch behandelten Patienten wurden insgesamt 71 Thrombozytenkonzentrate verbraucht. Die experimentelle therapeutische Transfusionsstrategie für Thrombozyten führte zu keiner statistisch signifikanten Zunahme von Blutungskomplikationen; auch bei der Anzahl der benötigten Erythrozytentransfusionen gab es keine signifikanten Unterschiede; Nebenwirkungen der Transfusionen, Dauer der Thrombopenie und Anzahl der Tage im Krankenhaus waren ebenso nicht signifikant unterschiedlich. Das Risiko, während der Beobachtungszeit (Chemotherapie und autologe Stammzelltransplantation bis zur Regeneration der Thrombozytenwerte), eine Blutung zu erleiden, lag insgesamt bei 14.1%; im experimentellen Arm lag das Risiko bei 19.2%, bei den prophylaktisch substituierten Patienten bei 8.9%; dieser Unterschied war statistisch nicht signifikant, ohnehin traten bei den beobachteten Patienten nur milde, klinisch wenig bedeutsame Blutungen des WHO – Schweregrades < 3 auf, es kam zu keinen blutungsassoziierten Todesfällen Bei klinisch stabilen Patienten und sorgfältiger Überwachung ist ein therapeutisches Transfusionsregime für Thrombozyten nach autologer Stammzelltransplantation praktikabel und sicher anwendbar, die Sicherheit dieses Vorgehens bei Patienten nach autologer Stammzelltransplantation wird mit der vorliegenden randomisierten Studie belegt. Eine therapeutische Thrombozytentransfusionsstrategie ist vermutlich bei einer Vielzahl weiterer hämato-onkologischer Patienten bzw. Krankheitsbilder ausreichend und kann unter signifikanter Einsparung kostbarer Thrombozytenkonzentrate bedrohliche Blutungen ebenso aufhalten oder verhindern wie ein prophylaktisches Regime.

Graft-versus-host disease (GvHD) remains one of the major complications following allogeneic haematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT). GvHD can occur in almost every tissue, with the skin, liver, and intestines being the mainly affected organs. T cells are implicated in initiating GvHD. T cells identify a broad range of antigens and mediate the immune response through receptors on their surfaces (T cell receptors, TCRs). The composition of TCRs within a T cell population defines the TCR repertoire of an individual, and this repertoire represents exposure to self and non-self proteins. Monitoring the changes in the TCR repertoire using TCR sequencing can provide an indication of the dynamics of a T cell population. Monitoring the frequency and specificities of specific TCR clonotypes longitudinally in different conditions and specimens (peripheral blood, GvHD-affected tissue samples) can provide insights into factors modulating immune reactions following allogeneic transplantation and will help to understand the underlying mechanisms mediating GvHD. This review provides insights into current studies of the TCR repertoire in GvHD and potential future clinical implications of TCR sequencing.

Graft-versus-host disease (GvHD) is a frequent, and often life-threatening, complication after an allogeneic, hematopoietic stem cell transplantation (allo-SCT). It can appear in an acute or a chronic form and presents different grades of severity. Particularly, the severe forms of GvHD are often responsible for a change of the curative intent for allo-SCT into a palliative goal of care. For this non-systematic review, we conducted a focused literature search in the MEDLINE database via PubMed to examine whether patients with severe forms of GvHD might have special needs and burdens from a supportive and palliative care perspective. To draw a comprehensive picture of this patient group, we included findings on quality of life (QoL) and physical symptoms and function as well as psychological and spiritual well-being. In most domains, patients with severe forms of GvHD showed greater impairment and a higher symptom burden compared to patients with milder forms of GvHD. However, we could not identify any studies that specifically investigated patients with severe forms of GvHD. Further research in this field is necessary to guarantee the highest standard of care for this very special patient group.

Ein neuartiger Ansatz für die Immunphänotypisierung wird vorgestellt. Die Durchflusszytometrie (FACS) ist die übliche Methode für die Charaketrisierung des Immunsystems. Jedoch ist die Verfügbarkeit von frischem Vollblut, sowie ein schnelle Probenlogistik Vorraussetzung für die Analyse. Als potentialle Alternative werden epigentische qPCR Assays vorgestellt. Für die Quantifizierung von B- und NK-Zellen wurden epigenetische qPCR Systeme etabliert. Anhand eines erweiterten epigenetischen Markerpanels wurde die klinische Anwendung in drei Kohorten getestet: a) 41 Patienten mit primären Immundefizienzen (PID); b) 19 Neugeborene mit und ohne PID und c) 28 Patienten nach einer Stammzelltransplantation (SZT). In Kohorte a) und c) konnte die Äquivalenz der Ergebnisse mit FACS bestätigt werden. Diskrepanzen bei der regulatorischen T-Zell Quantifizierung in einzelnen PID Patienten wurde festgestellt, welche durch Mutationen verursacht wurden, die die Integrität der analysierten Proteine beeinflussen. Zudem konnte die Anwendung der epigentischen Quantifizierung in Trockenblutkarten von Neugeborenen gezeigt werden. Dies würde die Anwendung auch im Neugeborenen-Screening für die Erkennung von PIDs ermöglichen. Für die Anwendung in der SZT konnte gezeigt werden, dass das epigenetische System eine frühe Analyse der Immunrekonstitution ermöglicht, welche eine prädiktive Aussage über das Überleben der Patienten erlaubt. Patienten, welche eine Immunantwort der Lymphozyten gegen eine Virusinfektion bereits am Tag 26 nach Transplantation aufwiesen, hatten eine signifikant höhere Überlebenschance als Patienten ohne Immunantwort. Zusammengefassend zeigen die Daten, dass die epigenetische Systeme für klinische Anwendungen eine zuverlässige Methode darstellt. Die Aussagekraft der Daten ist aufgrund der Studiengröße noch limitiert, und komplizierte klinische Szenarien erschweren die Evaluierung. Deshalb sind weitere Studien erforderlich, um das gezeigte Potenzial zu validieren. / A novel approach for immunophenotyping for clinical applications is presented here. Flow cytometry is currently a common method to characterize the immune system but requiring fresh whole blood and good sample logistics which is not always available. To overcome this limitations, epigenetic qPCR assays are introduced as potential alternative. New epigenetic qPCR systems to quantiy B and NK cells have been established. Using an extended epigenetic marker panel, clinical applications were tested in three patient cohorts: a) 41 patients with different primary immunodeficiencies (PID); b) 19 newborns with and without PID and c) 28 patients after stem cell transplantation (SCT). In cohort a) and c) the equivalence of the epigenetic quantification with flow cytometry was confirmed. However, discrepancies between both methods for regulatory T-cell quantification were found in individual PID patients caused by disease-associated mutations affecting the integrity of the respective protein. Furthermore, the epigenetic quantification using dried blood spots from newborns was demonstrated. This would allow the implementation of epigenetic immunophenotyping in neonatal screening for the detection of congenital immunodeficiencies. For the application in SCT, it was shown that the epigenetic system allows an early analysis of immune reconstitution, which may allow a prediction of the patients' overall survival. Patients who showed an immune response of lymphocytes against viral infections at day 26 after transplantation had a significantly higher survival rate. In summary, the available data show that epigenetic immunophenotyping is a reliable analytical method for various clinical applications. The significance of the data is still limited due to the size of the study and complicated clinical scenarios make the evaluation of individual measurements difficult. Therefore, further extensive investigations are needed to clinically validate the demonstrated potential.