L'une des caractéristiques des cellules souches mésenchymateuses (MSC) est leur capacité à survivre en conditions hypoxiques et à contribuer au développement tumoral. Le transporteur du glucose-6-phosphate (G6PT) exerce, par ailleurs, un contrôle métabolique contribuant à la mobilisation et à la survie des MSC. Les effets d'un environnement faible en oxygène (1,2% O₂) sur l'expression de G6PT sont inconnus et pourraient expliquer en partie la contribution et le recrutement des MSC au centre d'un foyer tumoral hypoxique. Nous avons découvert que l'expression génique de G6PT ainsi que de la sous-unité catalytique G6PC-3 (β) du système glucose-6-phosphatase sont significativement exprimés, tandis que l'expression des isoformes G6PC-I (α) et G6PC-2 (IGRP) était indétectable. L'environnement hypoxique ainsi que l'hypoxie artificielle induite suite à un traitement au chlorure de cobalt (CoCl₂), induisent à la fois l'expression de G6PT, du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF), et du facteur inductible hypoxique-l α (HIF-1 α), mais pas de G6PC-3 (β). L'analyse de la séquence promotrice du gène de G6PT révèle la présence de sites potentiels de liaison pour HIF-1 α. Nous démontrons également, à l'aide d'ARN interférant (siRNA) dirigé contre le gène HIF-1 α, que l'induction de G6PT ainsi que de VEGF dans les MSC en conditions de cultures hypoxiques est antagonisée. Finalement, nous avons généré un modèle de MSC exprimant constitutivement HIF-1 α, et avons observé une augmentation significative des niveaux endogènes de l'expression de G6PT ainsi que de la mobilité cellulaire. De plus, nous avons démontré que l'inhibition de la fonction de G6PT par un dérivé de la mumbaïstatine (AD4-015) permettrait ainsi de cibler préférentiellement la mort des cellules possédant un niveau de G6PT élevé. Nos résultats démontrent un axe de régulation métabolique de G6PT dépendant de HIF-1 α. Cet axe contribuerait à la flexibilité métabolique caractérisant les MSC et leur permettrait de survivre dans des conditions telles l'ischémie ou le développement tumoral, caractérisées par l'hypoxie et la privation en nutriments. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cellules souches mésenchymateuses, Facteur inductible hypoxique-1 α, Transporteur du glucose-6-phosphate, Migration des cellules souches, Tumeur cérébrale.

Si certains cancers sont maintenant traités avec succès, la lutte à finir avec plusieurs autres tels les cancers cérébraux, passe impérativement par une meilleure connaissance des cellules constituant ces tumeurs et de ce qui les entoure. Les tumeurs cérébrales sont isolées du reste du corps par la barrière hémato-encéphalique, ce qui rend le traitement de ces dernières un défi de taille. Cibler le microenvironnement dans lequel évoluent ces tumeurs est un nouveau moyen d'augmenter peut être l'efficacité des thérapies anticancéreuses. En effet, les cellules endothéliales tumorales (CET) sont connues pour avoir un phénotype distinct des CE normales. Ces CE peuvent donc être une cible potentielle supplémentaire pour l'inhibition sélective de la croissance tumorale. En même temps, les tumeurs semblent être dirigées et initiées par une sous-population de cellules au sein de la tumeur, les cellules souches cancéreuses (CSC). Le concept des CSC a pris de l'envergure ces trois dernières années et la recherche de caractéristiques intrinsèques particulières des CSC semblerait un bon début pour l'avancement de l'oncologie. Une des signatures phénotypiques de plusieurs CSC est le marqueur CD133 ou Prominine-1. Comme les cellules cancéreuses ne sont pas la seule cible thérapeutique envisageable, les cellules endothéliales, composantes du milieu tumoral, ont servi de modèle pour l'étude de récepteurs aux facteurs plaquettaires. À l'aide de la lignée HBMEC (human brain microvascular endothelial cell), nous avons mis en évidence une migration préférentielle marquée des HBMEC en réponse à l'acide lysophosphatidique (LPA) comparativement à la sphingosine 1- phosphate (S1P), le LPA et la S1P étant deux facteurs plaquettaires. La voie des MAP (Mitogen-activated protein) kinases semble être une des voies activée chez les HBMEC stimulées au LPA. Nous avons démontré sous condition hypoxique, que cette migration était fortement inhibée (>50%) suite à l'invalidation de l'un ou l'autre des récepteurs au LPA, LPAR-1 ou LPAR-3, deux récepteurs qui s'exprimaient à la hausse suite à l'étude du profil génique des LPAR chez les HBMEC. Dans le but d'investiguer la réponse au LPA et à la S1P dans un modèle de résistance tumorale, une sous-population de cellules CD133(+) a été triée à partir de la lignée cellulaire de médulloblastome DAOY. Il a été observé que les cellules CD133(+) sont plus sensibles au LPA que les CD133(-) , fait qui a été constaté via une réponse précoce et plus intense de l'activation de la voie des MAP kinases chez les cellules CD133(+) ainsi que par une surexpression des récepteurs au LPA, en particulier, LPAR-2 et LPAR-4 chez cette même sous-population. En plus, la résistance des cellules CD133(+) a été reliée à un phénotype d'expression différentielle des récepteurs lipoprotéiques de basse densité (LRP). En effet, la déprivation en nutriments régule à la hausse l'expression des récepteurs LRP-1, LRP-1b et LRP-5 ainsi que celle du marqueur CD133. En somme, nous proposons que les LPAR constituent une cible propice pour combattre le cancer, que ce soit au niveau du compartiment tumoral cérébral ou vasculaire cérébral. Nos résultats suggèrent aussi que les CSC s'adaptent entre autre par l'intermédiaire de récepteurs LRP, qui constituent une autre cible thérapeutique du compartiment tumoral cérébral. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : cellule endothéliale, cellule souche cancéreuse, CD133, acide lysophosphatidique, récepteur au LPA, médulloblastome, low-density lipoprotein receptor-related protein.

L'implication de la Membrane Type-Matrix Metalloproteinase (MT1-MMP) dans la progression du cancer a été grandement étudiée dans la dernière décennie. Elle possède une vaste variété de substrats, incluant des composants de la matrice extracellulaire, des cytokines et des récepteurs membranaires. Nos résultats identifient le marqueur de cellules souches (CSC) CD133 comme une nouvelle cible de l'activité protéolytique de la MT1-MMP. Des essais d'immunoprécipitation et de clivage in vitro effectués à l'aide de protéines recombinantes ont démontré que la MT1-MMP interagit physiquement avec CD133 et clive son domaine N-terminal à la position 30KAWN↓Y34. De plus, cette interaction semble commencer au niveau intracellulaire, dans le réticulum endoplasmique, avant l'activation de la proMT1-MMP et avant la maturation complète de CD133; toutefois, seulement la forme mature de CD133 peut être clivée. Ces résultats représentent la première interaction protéine-protéine connue de CD133, dont la fonction cellulaire demeure incomprise. Des expériences supplémentaires pourraient mener à une meilleure compréhension de cette protéine et de son rôle dans la biologie des CSCs. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : MT1-MMP, CSC, N-terminal, réticulum endoplasmique

Les maladies cardiovasculaires sont une des premières causes de mortalité dans les pays industrialisés. L'infarctus du myocarde provoque la mort d'un grand nombre de cellules cardiaques, diminuant la qualité de vie des gens qui survivent à une telle attaque. La transplantation d'un organe entier présente des limites telles que la faible quantité de donneurs et la possibilité de rejet par l'organisme du receveur. Le cœur possède une capacité de se régénérer mais le nombre de cellules souches résidentes pouvant accomplir cette tâche apparaît être insuffisant. Afin d'aider à la régénération, des approches thérapeutiques tentent l'implantation de cellules fonctionnelles dans la zone infarcie. Les cellules implantées sont, entre autres, des myoblastes squelettiques, des cellules souches embryonnaires ou adultes (cellules souches mésenchymateuses) indifférenciées, des cardiomyocytes fœtaux. Les résultats positifs parfois obtenus ont vite fait passer ces études des animaux à l'humain. La mise au point de thérapies cellulaires efficaces pour le cœur nécessite la compréhension des mécanismes moléculaires gouvernant la différenciation et la morphogénèse cardiaques, et l'habileté à manipuler ces mécanismes. Les cellules de carcinome embryonnaire P19, un modèle de cellules souches embryonnaires (ES), peuvent se différencier en cardiomyocytes lorsqu'elles sont traitées avec l'acide rétinoïque (AR) ou l'ocytocine (OT). Des cellules de muscle squelettique sont aussi générées. D'autre part, l'AR permet la différenciation de cellules ES en adipocytes et l'OT inhibe la maturation finale de pré-adipocytes. Nous avons émis l'hypothèse que l'AR et l'OT peuvent induire les cellules P19 à générer, de façon concomitante mais dans des rapports différents, des adipocytes, cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique. De plus, des analogues de l'AR capables d'activer préférentiellement les récepteurs de l'acide rétinoïque (RAR) ou les récepteurs de rétinoïdes-X (RXR) pourraient influencer les rapports mésodermiques. Enfin, les kinases ERK1/2 et P38, des protéines-kinases activées par des mitogènes (MAPK), pourraient avoir un rôle dans la différenciation mésodermique induite par l'AR et l'OT. Des marqueurs ont servi à identifier les phénotypes cellulaires : PPARy, aP2, lipoprotéines-lipase et gouttelettes lipidiques colorables à l'huile rouge pour les adipocytes; MyoD et α-actinine sarcomérique pour les cellules de muscle squelettique; troponine I cardiaque (cTpnI), chaîne légère de la myosine cardiaque-2v et α-actinine sarcomérique pour les cardiomyocytes. La culture en agrégats de cellules P19 pendant sept jours, avec une induction à l'AR entre les jours deux (J2) et J5, suivie d'une période de maturation de 20 jours en présence d'insuline et de l'hormone thyroïdienne T3 permet d'obtenir des adipocytes. Des cellules battantes exprimant l'α-actinine sarcomérique sont aussi générées. Une importante proportion de ces cellules montre la forme allongée ou fibrillaire caractéristique de myocytes squelettiques. Une faible proportion a une forme arrondie et exprime la cTpnI, indiquant la génération de cardiomyocytes. L'induction des cellules P19 avec l'AR, à J2, a donc un effet mésodermique large. L'ajout d'OT au milieu de maturation n'augmente pas la proportion de cellules cardiaques par rapport aux cellules musculaires squelettiques ou aux adipocytes. L'AR agit principalement en se liant aux RAR et RXR. Pour activer de façon spécifique chacune de ces deux familles de récepteurs, nous avons remplacé l'AR comme agent inducteur par le LG100268, un agoniste spécifique des RXR, ou par le TTNPB, un agoniste spécifique des RAR. Le LG100268 génère des adipocytes et des myocytes aussi efficacement que l'AR. Le TTNPB est un agent adipogénique plus efficace que l'AR mais inhibe la myogenèse. Les influences mésodermiques différentes des trois agents sont associées à des actions différentes sur ERK1/2 et P38. Ainsi, l'AR et le LG100268 diminuent similairement phospho-ERK1/2 et augmentent similairement phospho-P38. Par contre, le TTNPB, le rétinoïde le plus efficace à diminuer phospho-ERK.1/2, n'a pas stimulé la phosphorylation de P38. L'inhibition pharmacologique d'ERK1/2 ou de P38 pendant le traitement des cellules avec l'AR a augmenté le rendement myogénique, et l'inhibition de P38 a, de plus, augmenté le rendement adipogénique. La voie des RXR est permissive à la fois à l'adipogenèse et à la myogenèse alors que celle des RAR n'est permissive qu'à l'adipogenèse. P38 serait un régulateur négatif de l'adipogénèse. La différenciation à base d'OT produit des cardiomyocytes et, dans une moindre mesure, des cellules de muscle squelettique. L'OT est ajouté durant les quatre jours de l'agrégation et la période de maturation est de dix jours. Les rendements myogéniques sont faibles et nous avons pensé que l'ajout d'AR à l'OT pouvait les augmenter. Lorsqu'il est ajouté dès le J0 du traitement des cellules avec l'OT (addition précoce), l'AR inhibe la myogenèse. Cette inhibition est reliée aux RAR puisqu'elle est reproduite par le TTNPB et non le LG100268. Étonnamment, l'AR ajouté au J2 du traitement avec l'OT (addition tardive) fait plus que doubler le rendement des cellules musculaires, spécialement celui des cellules de muscle squelettique. L'AR a donc un effet dual, temporellement régulé, sur l'action myogénique de l'OT. Un tel effet est aussi observé sur la phosphorylation d'ERK1/2. OT stimule cette phosphorylation, et la stimulation est fortement inhibée par l'addition précoce mais non tardive d'AR. L'inhibition pharmacologique d'ERK1/2 abolit l'action myogénique d'OT. Par contre, l'ajout d'un activateur indirect d'ERK2 à la combinaison "OT + AR tardif" augmente la phosphmylation d'ERK1/2 ainsi que le rendement en cardiomyocytes. Des niveaux de phospho-ERK1/2 sont critiques pour la myogénèse et pour les rendements respectifs en cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique. En conclusion, les cellules P19 génèrent adipocytes, cardiomyocytes et cellules de muscle squelettique de façon concomitante lorsqu'elles sont induites avec l'AR. Dans ce processus, l'activation des RAR n'est permissive qu'à l'adipogenèse alors que celle des RXR permet l'adipogenèse et la myogenèse. L'action antimyogénique de l'activation des RAR est aussi observée en présence d'OT, cependant cette action ne se manifeste que si l'activation est faite tôt (J0). AR et OT influencent chacun la phosphorylation de MAPK et, réciproquement, leur action mésodermique est influencée par des modulateurs pharmacologiques de ces kinases. Le sens des influences peut cependant différer. Ainsi, les meilleurs rendements myogéniques ont été observés pour les traitements suivants : "AR + inhibiteur d'ERK (J2 à J5)", "AR + inhibiteur de P38 (J2 à J5)", "OT (J0 à J4) + AR (J2 à J4)", "OT + activateur d'ERK (J0 à J4) + AR (J2 à J4)". La modulation de l'activité des voies RAR, RXR et MAPK a une influence sur les rendements myogéniques et adipogéniques ainsi que sur les rendements en cardiomyocytes et en cellules de muscle squelettique. Le sens de l'influence dépend de la fenêtre temporelle de la modulation et de la présence ou non de l'OT. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Cardiomyocytes, Cellules de muscle squelettique, Adipocytes, Acide rétinoïque, Ocytocine, Rétinoïdes, MAPK, ERK, P38, PCR, Immunobuvardage, Cytofluorescence, Cytochimie

Ce travail a pour but de mettre au point des nouvelles méthodes pour la recherche avancée sur les cellules souches et les cellules cancéreuses. Nous avons d'abord développé une méthode de patch pour la culture et la différentiation des cellules souches pluripotentes induites humain (hiPSCs) "hors sol". Ce patch de culture est constitué des monocouches de nanofibres réticulées de gélatine sur un support en nid d'abeilles pour assurer un minimum de contact de matériel exogène et un maximum de perméabilité. Puis, nous avons démontré la formation des tissues cardiaques et des neurones moteurs sur le patch, partis de colonies des hiPSCs en forme d'embryoïdes et de monocouches respectivement. Nous avons également développé un dispositif microfluidique avec filtre intégré pour isoler les cellules tumorales circulantes (CTCs), montrant une haute performance de capture en termes d'efficacité, de sélectivité et de viabilité cellulaire. Enfin, nous avons évalué l'effet de drogue anticancéreuse à la formation des sphéroïdes tumoraux en utilisant des multi-puits d'agarose micro-fabriqués. Tous ensembles, nous avons progressé dans la micro-ingénierie vers des applications à grande échelle. / This work aimed to provide new tools and methods that can be used for advanced studies of stem cells and cancer cells. We first developed a patch method for off-ground culture and differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). The culture patch we proposed consists of crosslinked monolayer gelatin nanofibers on a honeycomb frame to ensure minimal exogenous material contact and maximum permeability. Then, we demonstrated the formation of cardiac tissue constructs and motor neurons on the patch, started from embryoid-body like and monolayer hiPSC colonies, respectively. We also developed a microfluidic device with integrated filter for isolation of circulating tumor cells (CTCs), showing high capture performances in terms of efficiency, selectivity and cell viability. Finally, we evaluated the anti-cancer drug effect on the formation of tumor spheroids by using microfabricated agarose multi-wells. All together, we progressed in micro-engineering toward large scale applications.

Les cellules souches (CS) se démarquent des progéniteurs et cellules différenciées à de nombreux égards. Notamment, les CS présentent des caractéristiques particulières dans des processus cellulaires fondamentaux, et il a été récemment proposé que la biogenèse des ribosomes (BiRi) participe à la régulation des CS. Pendant ma thèse, j’ai utilisé diverses approches pour étudier le rôle et la régulation de la BiRi dans des populations de CS, in vivo et ex vivo dans des modèles murins.Grâce à un modèle d’inactivation génétique du facteur de BiRi Notchless (Nle), j’ai participé à l’étude de son rôle dans le lignage hématopoïétique et l’épithélium intestinal adultes, et cours du développement embryonnaire précoce. In vivo, la perte constitutive de Nle entraîne une létalité embryonnaire, et j’ai montré ex vivo que l’inactivation de Nle dans des CS embryonnaires induit une réponse au stress ribosomique médiée par le suppresseur de tumeur p53, et des défauts de prolifération/survie. L’induction de la perte de Nle chez l’adulte active également p53 dans les CS hématopoïétiques et intestinale, entraînant leur rapide élimination.En parallèle, j’ai utilisé plusieurs méthodes pour mesurer l’activité de BiRi des progéniteurs immatures et CS hématopoïétiques (CSH) à l’homéostasie, in vivo chez la souris adulte. J’ai ainsi mis en évidence des variations de l’activité de BiRi dans ces populations, révélant notamment une activité de BiRi des CSH jusqu’ici insoupçonnée du fait de leur quiescence.Dans l’ensemble, mon travail renforce l’idée d’un rôle de la BiRi dans la régulation des CS, et apporte une meilleure compréhension de la régulation de ce processus dans le lignage hématopoïétique. / Stem cells (SCs) differ from progenitors and differentiated cells on many aspects. Notably, SCs display particular characteristics in fundamental cellular processes, and ribosome biogenesis (RiBi) has recently been proposed to play an important role in the regulation of SCs. During my thesis, I have used various approaches to study the role and regulation of RiBi in SC populations, using in vivo and ex vivo mouse models.Using genetic inactivation of the RiBi factor Notchless (Nle), I have participated to the analysis of its role in the adult hematopoietic system and intestinal epithelium, and in the establishment of the first cell lineages during early embryogenesis. In vivo, constitutive Nle deficiency causes early embryonic lethality, and I showed ex vivo that Nle inactivation in embryonic SCs induces a ribosomal stress response mediated by the tumor suppressor p53, and proliferation/survival defects. Conditional Nle inactivation in the adult mouse also induces activation of p53 in hematopoietic and intestinal SCs in vivo, leading to their rapid elimination.In parallel, I have used different methods to analyze the RiBi activity of hematopoietic SCs (HSCs) and immature progenitors at homeostasis, in vivo in the adult mouse. Thus, I have unraveled variations in the RiBi activity of these populations, and notably uncovered previously unsuspected RiBi activity in HSCs despite their quiescent state.Altogether, my work supports the hypothesis of a role for RiBi in the regulation of SCs and provides better understanding of the activity of this process during hematopoietic differentiation.

Les cellules somatiques peuvent être reprogrammées en cellules pluripotent en sur-exprimant 4 facteurs de transcriptions: OCT4, SOX2, KLF4 et c-MYC. Ce processus nécessite en théorie un remodelage des organelles et un changement drastique du métabolisme. De plus, la reprogrammation cellulaire possède une composante stochastique qui est peu comprise et conduit à une faible efficacité. Nous avons fait l'hypothèse que cette variabilité est en partie due aux variations de la régulation de l'homéostasie protéique. Nous nous attendons à ce que la première phase de reprogrammation active les voies de stress qui régulent l'homéostasie protéique, ce qui impacterait l'efficacité de reprogrammation. Notre attention s'est dirigée vers le rôle de la réponse aux protéines dépliées du réticulum endoplasmique. Nous avons découvert que cette voie est active pendant la reprogrammation cellulaire et que son activation peut augmenter l'efficacité de ce processus. Par ailleurs le niveau d'activation de cette voie peut prédire l'efficacité de reprogrammation. Ces résultats suggèrent que la faible efficacité de reprogrammation cellulaire est en partie due à l'incapacité des cellules à activer cette voie de stress afin de pouvoir correctement répondre à la nouvelle charge de protéines synthétisées qui changera l'état de cette cellule. / Somatic cells can be reprogrammed into a pluripotent stem cells state and is achieved by the forced expression of 4 transcription factors: OCT4, SOX2, KLF4 and c-MYC. This process theoretically requires a global remodeling of the organelles and a drastic change in metabolism. Furthermore, reprogramming has an inherent property of stochastic variation that is limiting and largely unknown. We hypothesize that this variation is due, in part, by variable regulation of the protein homeostasis network. We therefore postulated that the early steps of reprogramming would result in the activation of a variety of stress pathways that regulate the protein homeostasis network, which might in turn impact the efficiency of reprogramming. We focused in particular on the endoplasmic reticulum unfolded protein response (UPRER). We find that the UPRER is activated during reprogramming and that its activation can increase the efficiency of this process. We find that stochastic activation of the UPRER can predict reprogramming efficiency. These results suggest that the low efficiency of cellular reprogramming is partly the result of the cell’s inability to initiate a proper stress response to cope with the newly expressed load of proteins that will eventually change the fate of this cell.

L’étude des réseaux protéiques perturbés au cours de l’infection par les petits virus oncogéniques amena, vers la fin des années 80, à la découverte de nombreux régulateurs clés de la division et de la survie cellulaire. Parmi ceux-ci, la protéine E4F1 fût initialement identifiée comme une cible de l’oncoprotéine virale E1A. Originellement identifié comme un facteur de transcription, E4F1 est également une ubiquitine-E3 ligase atypique pour d'autres facteurs de transcription tel que le suppresseur de tumeurs p53. Au travers de ses multiples activités, E4F1 est nécessaire à la prolifération des cellules somatiques et souches, et à la survie des cellules cancéreuses. De plus, les travaux de différents laboratoires dont le mien suggèrent qu’E4F1 se situe au carrefour de plusieurs voies de signalisation qui sont fréquemment altérées au cours de l’oncogenèse, et notamment la voie impliquant le suppresseur de tumeurs p53. Afin d’étudier les fonctions physiologiques in vivo d’E4f1, mon laboratoire d’accueil a développé plusieurs modèles de souris génétiquement modifiées. La caractérisation de ces modèles a permis de mettre en évidence un rôle majeur d'E4F1 dans l'homéostasie de la peau. Plus précisément, E4F1 régule le pool de cellules souches de l'épiderme au travers de son rôle dans une voie de signalisation qui implique la protéine p53 et deux de ces régulateurs en amont: Arf et Bmi1. Cependant, il semble que les effets d'E4F1 dans le contrôle du maintien des cellules souches s'étendent au delà de son rôle sur cette voie de signalisation. En effet, j'ai récemment pu démontrer qu'E4F1, au travers de ces fonctions transcriptionnelles, régule directement l'expression d'un sous-groupe de gènes impliqués dans la régulation de l'activité de la pyruvate déshydrogénase (PDH). La PDH est un complexe multimérique situé dans la mitochondrie qui catalyse la décarboxylation du pyruvate (le produit final de la glycolyse) en acétyl coenzyme A (AcCoA), liant ainsi le métabolisme du pyruvate au cycle de Krebs. J’ai pu montrer que l’inactivation d’E4f1 spécifiquement dans l'épiderme conduisait à une diminution importante de l’activité de PDH et à une reprogrammation métabolique de ces cellules. Cette reprogrammation a pour conséquence d'altérer le micro-environnement des cellules souches qui conduit à leur détachement de leur niche et aboutit in fine à une absence du renouvellement de l'épiderme. Cette partie de mes travaux a donc permis d'illustrer pour la première fois l'importance du métabolisme du pyruvate dans l'homéostasie des cellules souches de la peau. Sur la base de ces résultats, je poursuis l'analyse des fonctions d’E4f1 dans l'homéostasie de la peau en étudiant son rôle dans d'autres types cellulaires tels que les mélanocytes. / The multifunctional protein E4F1 is an essential regulator of normal skin homeostasis. During my Phd, I demonstrated that E4f1 inactivation in adult skin results in stem cell autonomous defects causing exhaustion of the epidermal stem cell (ESC) pool. At the molecular level, I identified E4F1 as a new regulator of the pyruvate dehydrogenase complex (PDC) in keratinocytes, an essential mitochondrial complex that converts pyruvate into Acetyl-CoEnzyme A. Using genetically engineered mouse models, I showed that E4F1-mediated control of PDH activity is required to maintain normal skin homeostasis. Consistently, E4F1 deficiency in basal keratinocytes resulted in deregulated expression of dihydrolipoamide acetlytransferase (Dlat), a gene encoding the E2 subunit of the PDC, and impaired PDH activity. The metabolic reprogramming of E4f1 KO keratinocytes associated with the redirection of the glycolytic flux towards lactate production and increased lactate secretion in their microenvironment, leading to enhanced activity of extra-cellular-matrix remodelling proteases Finally, these defects ended in alterations of the basement membrane, ESC mislocalization and the exhaustion of the ESC pool. In the second part of my thesis, I have evaluated the role of E4F1-mediated control of the PDC in melanocytes and showed that the metabolic activities of E4F1 are important for melanocyte function. Consistently, mice with E4f1-deficient melanocytes exhibited hair graying and skin pigmentation defects. Altogether, my data demonstrate the importance of E4f1-mediated control of pyruvate metabolism for normal skin homeostasis.

Nous avons montré que l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE) est un nouveau marqueur de la cellule souche hématopoïétique et identifie l’émergence de l'hématopoïèse dans tous les sites hématogènes de l’embryon humain. L'ACE fait partie du système rénine-angiotensine (SRA) dont la fonction principale est d'agir sur l'angiotensine I pour former l'angiotensine II (AngII), un puissant vasoconstricteur.De plus, nous montrons que les principaux composants du SRA (les récepteurs AT1 et AT2, l’angiotensinogène et la rénine) sont exprimés dans la même région de l'embryon qui exprime l'ACE, suggérant ainsi l’existence d’un SRA local dans l'embryon précoce. Des tests fonctionnels, conduits in vitro chez l'embryon de la souris, montrent que l’Ang II stimule dans la culture l'émergence des progéniteurs hématopoïétiques, effet qui peut être bloqué par un antagoniste spécifique de l’AT1. Ces observations suggèrent pour la première fois, le rôle direct du SRA dans l’émergence hématopoïétique au cours de l’ontogenèse. De plus, nous mettons en évidence l'existence d'un SRA local dans la moelle osseuse (MO) adulte et nous montrons que les principaux éléments de ce système sont surexprimés dans la MO de patients atteints de leucémie aiguë myéloïde, aussi bien dans les blastes que dans les cellules stromales. Ces observations suggèrent une contribution du SRA à la dérégulation de la niche observée dans les hémopathies.Ainsi, la présence d’un SRA local dans la niche hématopoïétique intra-embryonnaire et dans la MO chez l’adulte place ce système dans une position stratégique comme acteur important de l’émergence et de la régulation du système sanguin définitif. / We have shown that the angiotensin-converting enzyme (ACE) is a new marker of human hematopoietic stem cells and also identifies emerging hematopoiesis in all hemogenic sites inside the human embryo. ACE is a key component of renin-angiotensin system (RAS) as it catalyses the production of angiotensin II (Ang II) well known for its effect in the control of blood pressure, through AT1 and AT2 receptors.Furthermore, we observe the presence of the main elements of the RAS (AT1, AT2 receptors, angiotensinogen and renin) in the same region of the embryo expressing ACE, meaning that a local RAS exists in the embryo. Functional in vitro analyses, carried out in mouse model, show a stimulatory effect of AngII in the hematopoietic precursors emergence, an effect inhibited by a specific AT1 antagonist. These observations suggest for the first time a direct role of RAS in the emergence of hematopoiesis during ontogeny. In addition, our data indicate the presence of a local RAS inside the adult bone marrow (BM). This system is overexpressed in the BM of acute myeloid leukemia (AML) patients, both in hematopoietic cells and in stromal cells suggesting a RAS contribution to the bone marrow niche deregulation, always observed in these hemopathies.Therefore, the existence of a local RAS in the intraembryonic niche and in the adult bone marrow suggests that this system is an important actor in the emergence and regulation of the definitive blood system.

L’hématopoïèse est le processus de formation des cellules souches hématopoïétiques (CSH); elle est conservée au cours d’évolution. Durant l’hématopoïèse embryonnaire, deux vagues hématopoïétiques se succèdent, la vague primitive et la vague définitive. La vague primitive produit des macrophages, des neutrophiles et des érythrocytes. Au cours de la vague définitive, les CSH émergent du plancher de l’aorte dorsale par une transition endothélio-hématopoïétique ou TEH, dans une région appelée aorte-gonades-mesonephros (AGM).Ces dernières années, des études des organes hématopoïétiques chez les mammifères ont démontré que le microenvironnement joue un rôle crucial dans l’émergence et le devenir des CSH. Pendant ma thèse, je me suis intéressée au rôle du microenvironnement dans la mise en place de l’hématopoïèse définitive chez l’embryon de zebrafish. Dans l’AGM, j’ai caractérisé et évalué la contribution de différents acteurs dont deux populations en particulier, les macrophages et le système neuronal sympathique. Chacune de ces cellules joue un rôle spécifique durant la vague définitive de l’hématopoïèse. Les macrophages mobilisent des CSH de l’AGM afin de permettre leur intravasation et la colonisation des organes hématopoïétiques. Les catécholamines synthétisées par le système neuronal sympathique quant à elles contrôlent la TEH par l’activation des récepteurs beta2b et beta3 dans l’AGM.En conclusion, nous avons démontré que le microenvironnement influence l’hématopoïèse définitive chez le zebrafish par différents mécanismes. Ces travaux ont pour objectif d’améliorer la compréhension du mécanisme de genèse des CSH et potentiellement de permettre un jour la production de CSH in vitro. / Haematopoiesis is the process of haematopoietic stem cell (HSC) generation conserved in all vertebrates. During the embryonic development, two successive waves of haematopoiesis occur – the primitive and the definitive wave. The first one gives rise to erythrocytes, macrophages and neutrophils. During the second one, HSCs emerge from the ventral wall of dorsal aorta (DA) in the aorta-gonads-mesonephros (AGM) region by a process called endothelial-to-haematopoietic transition or EHT.In the last years, several studies performed in mammals have shown that the microenvironment plays a key role in haematopoiesis. During my thesis I have studied the role of the microenvironment in definitive haematopoiesis in the zebrafish embryo. I have described several cell components present in the AGM and evaluated their contribution to the haematopoiesis. I further analysed two of those players: macrophages and sympathetic nervous system. Each of them plays a specific role during the definitive wave of haematopoiesis. Macrophages mobilise nascent HSCs from the AGM to allow their intravasation and colonisation of haematopoietic organs. Catecholamines synthetized by sympathetic nervous system control EHT through the activation of beta2b and beta3 receptors in the AGM.In conclusion, we have shown that the microenvironment can substantially influence the definitive haematopoiesis in the zebrafish by distinct mechanisms. These findings would help to understand the mechanism of HSC generation and potentially to allow in vitro HSC production.