Mon travail de thèse s'est intéressé au rôle des protéines Dok-1 et Dok-2 dans l'hématopoïèse physiologique chez la CSH et dans l'hématopoïèse pathologique dans le cas de la leucémie myélomonocytaire chronique (LMMC). Ce sont des régulateurs négatifs de la voie de signalisation RAS/MAPK, activée en réponse à des facteurs activant les récepteurs tyrosine kinase. La double inactivation des gènes Dok1 et Dok2 (Dok DKO) cause un syndrome myéloprolifératif assimilé à la forme myéloproliférative (MP) de la LMMC. Les anomalies génétiques de la LMMC identifiées sont nombreuses et souvent non spécifiques. Le gène RAS est cependant retrouvé muté dans 30% des cas de LMMC MP. Nous avons identifié des variants nucléotidiques de DOK1 et DOK2. La mutation DOK2 L238P a fait l'objet d'études fonctionnelles démontrant qu'il s'agit d'un mutant perte de fonction haplo-insuffisant, induisant une augmentation de la prolifération cellulaire, corrélée avec la LMMC MP.J'ai également étudié l'hématopoïèse précoce du modèle murin Dok DKO, me permettant de démontrer que ces protéines sont des régulateurs de la quiescence des CSH et du cycle cellulaire des progéniteurs myéloïdes engagés dans la différenciation.Les protéines Dok-1 et Dok-2 jouent un rôle dans la régulation de la quiescence et la prolifération des CSH et des progéniteurs hématopoïétiques. Leur dérégulation pourrait jouer un rôle dans la pathogenèse de la LMMC, attestant leur fonction de suppresseur de tumeur. Il serait intéressant de lier leur fonction chez la CSH à la LMMC en elle-même et de mieux définir les mécanismes par lesquels les protéines Dok-1 et Dok-2 interviennent dans la leucémogenèse. / My work focused on the roles of Dok-1 and Dok-2 proteins in physiological hematopoiesis in the CSH and pathological hematopoiesis in the case of chronic myelomonocytic leukemia (CMML). They are negative regulators of the RAS/MAPK signaling pathway, activated upon receptor tyrosine kinase (RTK) triggering. Moreover, Dok1 and Dok2 gene ablation (Dok DKO) in mice induces a myeloproliferative syndrome illustrating myeloproliferative (MP) form of CMML. This MP-CMML subtype is primarily characterized by alterations of genes encoding for proteins involved in RAS pathway, found in 30% of MP-CMML cases.We have identified DOK1 and DOK2 nucleotide variants. The DOK2 L238P mutationhas been functionally studied, demonstrating that DOK2 L238P is an haploinsufficient loss of function mutant, inducing increased cell proliferation, correlated to MP-CMML phenotype.I also studied early hematopoiesis in Dok1 / Dok2 double KO (Dok DKO) mice. This model allowed us to demonstrate that Dok-1 and Dok-2 proteins act as switch regulators of HSC between quiescence and cell cycle entry. Moreover, they negatively regulate cell cycle in myeloid committed progenitors.Thus, Dok-1 and Dok-2 proteins appear to play an important role in the regulation of HSC quiescence and proliferation, as well as hematopoietic progenitors. Their deregulation by haploinsufficient mutation may play a role in the pathogenesis of the CMML, attesting to their function as tumor supressors. Finally, it would be interesting to link their function in HSCs to CMML pathogenesis and to further define the mechanisms by which Dok-1 and Dok-2 proteins are involved in leukemogenesis.

Ce projet vise à fournir une nouvelle compréhension moléculaire du programme de transcription impliqué dans la différenciation des cellules souches neurales en oligodendrocytes myélinisant. La logique de ce travail repose sur des études antérieures ayant montré le rôle des facteurs de transcription bHLH Olig2 et Ascl1, opérant en synergie dans la spécification des OPCs, les cellules progénitrices d‘oligodendrocytes . L‘objectif central de ce travail était de comprendre au niveau génomique et transcriptomique les mécanismes par lesquels Ascl1 et Olig2 agissent pour spécifier les OPCs. Nous avons suivi une stratégie utilisant l'analyse du transcriptome et des profils de fixation des facteurs de transcription par immuno- précipitation de la chromatine. Nous avons pu identifier les cibles directes de Ascl1 et Olig2 dans les OPC et lors de la différenciation des oligodendrocytes. Nous avons également identifié de nouveaux marqueurs spécifiques des différents stades des lignées oligodendrocyte et nous sommes concentrés sur Chd7 et Tns3, deux gènes régulé par Ascl1 etOlig2 et enrichis dans la lignée oligodendrogliale à deux stades intéressants, la phase de spécification précoce et la transition entre la migration et la différenciation des oligodendrocytes, respectivement. De plus, nous avons porté notre attention sur le rôle spécifique des oligodendrocyte dans la synthèse de la créatine et son rôle possible de support métabolique dans la synthèse de myéline et de support axonal. Nous avons également initié une approche de repositionnement toxicogénomique pour identifier de nouvelles molécules à tester dans le cadre de maladie demyélinisantesLa plupart des traitements disponibles pour traiter les maladies démyélinisantes sont basées sur une approche immune modulatrice et anti-inflammatoire. A ce jour, aucun n'est en mesure de promouvoir directement la réparation de la myéline de manière efficace. Nous espérons que les gènes dont l'expression est régulée dans les lésions de démyélinisation identifiés lors de cette étude permettront de mieux comprendre le mécanisme de remyelinisation et le développement de nouvelles stratégies dans les maladies démyélinisantes telles que la sclérose en plaques ou dans les leucodystrophies. / Our project aims to provide a new molecular understanding of the transcription program involved in neural stem cells differentiation into oligodendrocytes. The rational of this work relies on previous studies demonstrating that the bHLH transcription factors Olig2 and Ascl1 work in synergy to specify OPCs, the oligodendrocyte progenitor cells. One central goal of this work was to understand at a genomic and transcriptomic level, how Ascl1 and Olig2 work together to specify OPCs. We followed a strategy using genome-wide transcriptome analysis and chromatin immuno-precipitation to characterize Ascl1 and Olig2 directly regulated genes in OPCs and during oligodendrocyte differentiation.We identified new specific markers of different stage of the neural lineages and new important genes correlated to OPCs differentiation. We focused on Chd7 and Tns3, two genes which expressions are driven by Ascl1 and Olig2 and enriched in the oligodendroglial lineage at two interesting stage, the early specification stage and the transition between migrating and differentiating oligodendrocytes, respectively. Moreover, we identified the myelinating oligodendrocyte as the cell in charge of the creatine synthesis in the brain and potentially driving axonal metabolic support. We also used an approach a toxicogenomic and drug repositioning approach to identify new molecules known to modify OPCs and myelin genes but untested in the context of demyelinating diseases. As currently, most of the available treatments for demyelinating diseases are based on immuno-modulatory and anti-inflammatory drugs but none are able to directly promote myelin repair, we expect that these identified genes involved in oligodendrogenesis and whose expression are regulated in demyelinated lesions will allow the development of new therapeutic strategies promoting an efficient remyelination in demyelinating diseases such as Multiple sclerosis or leukodystrophies.

Le glioblastome est la tumeur cérébrale de mauvais pronostic la plus fréquente et la plus agressive. Les traitements actuels combinent la chirurgie à la radio thérapie et la chimiothérapie. Cependant ces traitements sont peu efficaces. Le taux de récidive est élevé et la survie moyenne est de 15 mois.La récidive s'explique en partie par la présence de cellules initiatrices de glioblastomes (CIG). Ces cellules possèdent des propriétés de cellules souches adultes. Elles s'auto-renouvellent en maintenant un pool de cellules tumorales et se différencient en différents types cellulaires. Elles sont aussi résistantes aux thérapies par l'activation de mécanismes d'élimination des molécules destinées à les détruire. L'engagement des CIGs vers un état tumoral différencié diminue fortement leur potentiel tumorigénique les rendant plus vulnérables.Le facteur de transcription EGR1 est impliqué dans des processus biologiques comme la prolifération et la différenciation. Dans les CIG l'expression d'EGR1 est anormalement élevée. Ce niveau diminue lorsque les cellules se différencient. L'expression d'EGR1 est donc corrélée avec un état souche suggérant sa contribution dans la régulation de la prolifération des CIG ou dans le maintien de cet état.Mon objectif est de caractériser le rôle d'EGR1 dans la régulation de l'état proliférant des CIG.Nous avons démontré l'implication d'EGR1 dans une cascade de régulation impliquant le mir18a* et les gènes SHH et GLI1. Il contribue ainsi à l'autorenouvellement, à la prolifération et au maintien de l'état souche des CiGs. De plus en régulant directement le gène PDGFa, EGR1 entretient ce système régulatoire par une deuxième boucle moléculaire. / Glioblastoma is the most commun and agressive cerebral tumor. The current treatments combine surgery with chemotherapy and radiotherapy. However these treatments are poor effective. The relapse is frequent and the rate survival is less than 18 months.The relapse is in part due to the presence of glioblastoma initiating cells (GIC). The cells have stem cell properties. They can self-renew to maintain a pool of tumor cells and they can differentiate in different kind of tumor cells. They are also able to resist to the therapies by activating mechanisms of drug efflux. The commitment of GIC toward a differentiated tumor state decreases strongly their tumorigenic potential.EGR1 transcription factor is involved in many biological processes such as proliferation and differentiation. In the GIC EGR1 expression is abnormally elevated. This level decreases when cells are differentiated. EGR1 expression is strongly correlated with stem state suggesting its contribution in the proliferation regulation of GIC or in the maintenance of this state.My aim is to characterize the role of EGR1 in the regulation of proliferating state of the GIC.We have demonstrated the involvement of EGR1 in the pathway involving the mir18a* and the genes SHH and GLI1. It contributes so to the self-renewal, to the proliferation and to the maintenance of the stem state of GIC. In addition by directly regulating the gene PDGFa EGR1 maintains this system by a second molecular loop.

La transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un traitement couramment utilisé pour traiter plusieurs types de maladies hématologiques telles que les leucémies. Par contre, une limite importante de ce type de traitement est la quantité restreinte de CSH disponibles pour la transplantation. Il importe donc de trouver des moyens pour expandre efficacement ces cellules ex vivo tout en préservant leurs propriétés. Le gène HOXB4 est présentement un candidat très prometteur pour atteindre cet objectif. Il a en effet été montré que HOXB4 est capable d’expandre les CSH in vivo et in vitro sans mener au développement de leucémie. Le gène HOXC4, qui appartient au même paralogue est aussi en mesure d’expandre les cellules hématopoïétiques primitives suggérant un rôle commun pour les gènes HOX du paralogue 4 dans l’autorenouvellement des CSH. Le gène HOXA4 est dix fois plus exprimé que le gène HOXB4 dans des CSH du foie fœtal au moment de leur principale expansion. De plus, les CSH mutantes pour Hoxa4, contrairement aux CSH mutantes pour Hoxb4, sont incapables de reconstituer un receveur irradié lorsqu’elles sont transplantées en condition de compétition. HOXA4 pourrait donc jouer un rôle plus important que les autres gènes du paralogue 4 pour l’expansion des CSH au niveau physiologique. Nous avons donc posé l’hypothèse que HOXA4 est capable d’expandre des CSH de façon plus importante que HOXB4. Les résultats obtenues dans le cadre de ce projet de recherche ont montré que la surexpression de HOXA4 était capable d’expandre les CSH et les progéniteurs hématopoïétiques primitifs dans le même ordre que ce qui est connu pour HOXB4. Des cultures et des essais de transplantation en situation de compétition ont confirmé la capacité égale des CSH surexprimant HOXA4 et HOXB4 de proliférer et de reconstituer les receveurs irradiés à long terme. Par contre, nous avons observé une meilleure reconstitution périphérique à court terme par les CSH HOXA4+ par rapport aux CSH HOXB4+, associée à une meilleure reconstitution lymphoïde. Nous avons aussi comparé les niveaux d’expression de gènes cibles potentiels dans des CSH surexprimant HOXA4 ou HOXB4 et observer que plusieurs gènes importants pour la fonction des CSH était régulé positivement suite à leur surexpression, notamment plusieurs gènes impliqués dans les voies de signalisation Notch et Wnt, tels que des récepteurs et ligands. Les gènes HOX du paralogue 4 pourraient donc réguler la communication entre les CSH et leur microenvironnement via ces voies de signalisation majeures et ainsi réguler leur autorenouvellement. La modulation de différents gènes codant pour des facteurs de transcription et des molécules impliquées dans la pluripotence suggère également que HOXA4 et HOXB4 utilisent des mécanismes intrinsèques et extrinsèques pour réguler leur potentiel d’autorenouvellement. Ces connaissances pourront ainsi être utilisées pour optimiser les protocoles d’expansion ex vivo des CSH dans un but thérapeutique. / Transplantation of hematopoietic stem cells (HSC) is a treatment commonly used to treat several types of hematological diseases such as leukemia. However, a major limitation of this type of treatment is the limited number of HSC available for transplantation. It is therefore important to develop ways to expand these cells ex vivo. The HOXB4 gene is a promising candidate for achieving this goal. It has indeed been shown that HOXB4 is able to expand HSC in vivo and in vitro without inducing leukemia. HOXC4, which belongs to the same paralog group, is also able to expand primitive hematopoietic cell suggesting a common role for paralog 4 HOX genes in the self-renewal of HSC. HOXA4 is ten times more expressed in fetal liver HSC during their primary expansion. Furthermore, Hoxa4 mutant HSC, unlike Hoxb4 mutant HSC, are unable to reconstitute an irradiated recipient when transplanted in competition. Therefore, HOXA4 could play a more important role than other paralog 4 genes for HSC expansion at the physiological level and we hypothesized that HOXA4 can expand HSC more efficiently than HOXB4. The results obtained during this research project showed that the overexpression of HOXA4 expand HSC and primitive hematopoietic progenitors in the same order as HOXB4. Direct competitive culture and transplantation assays confirmed the equal capacity of HSC overexpressing HOXA4 and HOXB4 to proliferate and engraft at long-term. However, we observed a better short-term peripheral reconstitution by HOXA4+ HSC compared to HOXB4+ HSC, which was associated with a better lymphoid reconstitution. We also compared the expression levels of potential target genes in HSC overexpressing HOXA4 or HOXB4 and observed that many genes important for HSC function were upregulated following their overexpression, including several genes involved in the Notch and Wnt signaling pathway. These included both receptors as well as ligands, indicating that HOX4 genes might regulate the communication of primitive HSCs with their environment through these major signaling pathways and promote self-renewal. In addition, modulation of genes coding for transcription factors and molecules known for their function in pluripotency suggest that HOXA4 and HOXB4 have both intrinsic and extrinsic potential to control self renewal potential. This knowledge can then be further explored and used to optimize ex vivo HSC expansion protocols for clinical purposes.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La morphogenèse de la glande mammaire résulte de la coordination de différentes voies, incluant l'apoptose, la prolifération, la différenciation et la dynamique des cellules souches/progénitrices. La transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) semble être impliquée dans ces voies de signalisation. Ainsi, nous nous sommes concentrés sur le facteur de transcription Slug, un gène clé régulant l'EMT, et son implication dans la morphogenèse de la glande mammaire. Dans un premier temps, en utilisant un modèle de souris transgéniques Slug-Lacz, nous avons localisé Slug dans une sous-population couvrant 10 à 20% des cellules basales du tubule et des cap cells du bourgeons terminal, coexprimant les marqueurs P-cadhérine, CK5, CD49f. Ensuite, nous avons montré par des expériences in vitro de perte et de gain de fonction, que Slug régulait la différenciation et la prolifération des cellules épithéliales mammaires. De plus, nous avons trouvé que Slug inhibait l'apoptose, promouvait la motilité cellulaire, et permettait l'émergence et la croissance de mammosphères clonales. Ce dernier point montre l'implication de Slug dans les cellules souches, qui est renforcé par le fait que des cellules primaires déficientes pour Slug étaient incapables de donner des mammosphères secondaires. Par ailleurs, nous avons pu observer in vivo que les souris déficientes pour Slug présentaient un retard de développement de la glande mammaire, possédant moins de cellules en prolifération, et une surexpression des marqueurs des cellules luminale CK8/18, GATA3 et ER. D'autres gènes régulant l'EMT sont retrouvés surexprimés, suggérant un mécanisme de compensation, qui peut expliquer le fait que le retard de développement de la glande mammaire est rattrapé à l'âge adulte. Les glandes mammaires Slug-knockout présentaient également des branchements excessifs, évoquant une différenciation précoce, similaire aux glandes mammaires de souris déficientes pour la P-cadhérine, exprimée dans les cellules basales. Sachant cela, nous avons constaté que la P-cadhérine était diminuée dans les glandes mammaires Slug-knockout, et dans les cellules CommaDβ traitées par siRNA ciblant Slug. Nous avons alors trouvé que Slug se liait directement au promoteur de la P-cadhérine et l'activait, et que cette dernière intervenait dans certains effets fonctionnels de Slug, tels que la croissance de mammosphères, la différenciation et la migration cellulaire. Ainsi, nous avons montré l'importance d'une nouvelle voie de signalisation Slug/P-cadhérine dans les capacités souches/progénitrices des cellules épithéliales mammaires, intégrant la différenciation et la motilité cellulaire, et nous avons maintenant une meilleure compréhension de son rôle dans l'agressivité de certains cancers du sein. / Mammary gland morphogenesis results from the coordination of different pathways, including apoptosis, proliferation, differentiation, and stem/progenitor cell dynamics. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) appears to be involved in these signalling pathways. Thus, we focused on transcription factor Slug, a key gene regulating EMT, and its involvement in mammary gland morphogenesis. First, using a Slug–LacZ transgenic mice model, we located Slug in a subpopulation covering about 10–20% basal duct cells and cap cells of terminal end bud, coexpressed with basal markers P-cadherin, CK5 and CD49f. Then, we have shown by in vitro experiments of loss and gain of function that Slug regulated the differentiation and proliferation of mammary epithelial cells. Moreover, we found that Slug inhibited apoptosis, promoted cell motility, and allowed the emergence and growth of clonal mammospheres. This last point shows the involvement of Slug in stem cells, which is reinforced by the fact that primary cells deficient for Slug were unable to give secondary mammospheres. Furthermore, we observed in vivo that mice deficient for Slug showed delayed development of the mammary gland, with less proliferating cells, and overexpression of markers of luminal cells CK8/18, GATA3 and ER. Other genes regulating EMT are found overexpressed, suggesting a compensatory mechanism, which can explain the fact that the delayed development of the mammary gland is caught up in adulthood. The Slug-knockout mammary glands also showed overbranching, evoking an early differentiation, similar to the mammary glands of mice deficient in P-cadherin, expressed in the basal cells. Knowing this, we found that P-cadherin was decreased in Slug-knockout mammary glands, and in CommaDβ cells treated with siRNA targeting Slug. We then found that Slug binds directly to the promoter of the P-cadherin and activated it, and that P-cadherin was involved in some functional effects of Slug, such as mammospheres growth, differentiation and cell migration. Thus, we have shown the importance of a new signalling pathway Slug/P-cadherin in the capacity of mammary epithelial stem/progenitor cells, integrating differentiation and cell motility, and we now have a better understanding of its role in the aggressiveness of some breast cancers.

Chez les métazoaires, la différenciation terminale est généralement accompagnée par une sortie définitive du cycle cellulaire. Cependant, les macrophages et très peu d'autres types cellulaires rompent avec ce dogme. En effet, il est maintenant admis que les macrophages conservent la capacité de s'auto-renouveler indépendamment des cellules souches ou progénitrices. À cet égard, nous avons démontré que la double déficience en facteurs Maf dans les macrophages (Maf-DKO) leur confère la capacité de s'auto-renouveler indéfiniment en culture sans se dé-différencier ou devenir tumorigènes. Ce phénotype d'auto-renouvellement semble être médié par un réseau transcriptionnel de de gènes régissant l'auto-renouvellement qui sont également actifs dans les cellules souches embryonnaires, parmi lesquels Myc et Klf4. Ces deux facteurs sont activés et nécessaires pour l'auto-renouvellement des Maf-DKO. De façon intéressante, l'expression de Myc seul induit une prolifération illimitée des macrophages, mais provoque une transformation tumorale. Nous avons donc cherché à décrypter les mécanismes grâce auxquels Myc et Klf4 induisent l'auto-renouvellement des macrophages, en comparaison à la transformation cellulaire causée par l'expression de Myc uniquement. En outre, nous nous sommes concentrés sur l'identification de gènes candidats permettant un auto-renouvellement illimité des macrophages, tout en les protégeant de la transformation cancéreuse. Notre objectif est de contribuer à l'identification du programme transcriptionnel régulant l'auto-renouvellement non tumoral des macrophages. / In metazoan, terminal differentiation is generally accompanied by permanent exit from the cell cycle. Yet, macrophages and very few other examples break with this dogma. Indeed, it has become evident that macrophages retain the ability to self-renew independently of stem or progenitor cells. In this regard, we have previously shown that MafB/c-Maf double deficient (Maf-DKO) macrophages are able to self-renew indefinitely in vitro without dedifferentiating or becoming tumorigenic. This self-renewal phenotype appears to be mediated by a transcriptional network of self-renewal genes also active in embryonic stem cells, among which Myc and Klf4. Interestingly, these two factors are activated and required for Maf-DKO self-renewal. By contrast, Myc alone induces an unlimited proliferation of macrophages but causes malignant transformation. We aimed to decipher the mechanisms by which Myc and Klf4 induce stem cell-like self-renewal in macrophages, in comparison to cellular transformation caused by the expression of Myc alone. Additionally, we focused on identifying candidate genes allowing an unlimited self-renewal of macrophages while protecting them from tumorigenic transformation or aberrant proliferation. Our objective is to contribute to the identification of the transcriptional program regulating non-tumorigenic self-renewal in macrophages.

Le médulloblastome (MB) est la plus fréquente des tumeurs cérébrales malignes pédiatriques qui représentent la première cause de mortalité par cancer chez l’enfant. Malgré les avancées des nouveaux traitements, les risques de récidive, séquelles et décès après traitement restent importants. Le récepteur de neuropiline-1 (NRP-1) a été récemment impliqué dans la progression tumorale des MBs et semble jouer un rôle important dans le phénotype des cellules souches cancéreuses (CSCs). Le ciblage de cette molécule pourrait ainsi présenter un intérêt thérapeutique dans le traitement des MBs. Nous avons sélectionné des cellules souches de MB capables de former des médullosphères (MS) à partir de 3 lignées cellulaires (DAOY, D283-Med et D341-Med). Ces modèles ont été caractérisés par l’expression de neuropilines (NRP-1 and NRP-2) et de marqueurs phénotypiques (CD133，CD15 et NF-M). Les résultats ont montré une augmentation significative de l’expression de NRP-1 par les cellules cultivées en médullosphères confortant notre stratégie de ciblage. L’impact du traitement de ces cellules par un composé innovant ciblant spécifiquement NRP-1, le MR438, a été ensuite évalué in vitro seul et association avec la radiothérapie notamment sur l’étude de la capacité d’auto-renouvellement des CSCs de MBs. Nous avons mis en évidence une diminution de la capacité d’autorenouvellement des cellules souches de MBs après exposition au MR438 avec une radiosensibilité augmentée pour les 3 modèles cellulaires. In vivo, le composé MR438 a été evalué sur des modèles de xénogreffes hétérotopiques chez la souris nude et montre un effet radiopotentialisant significatif pour les tumeurs issues de la lignée Daoy avec une tendance à la diminution de la progression tumorale pour les 2 autres lignées. De façon intéressante, le composé MR438 induit une diminution significative du nombre de cellules souches pour l’ensemble de nos modèles. Par conséquent, le composé semblerait induire les cellules souches vers un phénotype différencié au moins pour la lignée DAOY, même si les mécanismes n’ont pas pu être clairement élucidé. En conclusion, l’inhibition de NRP-1 via MR438 semble stimuler la différenciation des cellules souches cancéreuses pouvant à terme réduire la progression du MB et apporter un bénéfice en association avec la radiothérapie. L’evaluation du composé sur des modèles orthotopiques de MB permettrait d’obtenir des informations quant à son efficacité sur des modèles plus proche de la physiopathologie tenant compte de sa distribution au niveau cérébral / Medulloblastoma (MB) is the most common malignant pediatric brain tumors which is the leading cause of cancer death in children. Despite the progress of new treatments, the risk of recurrence, morbidity, and death after treatment remain important. The neuropilin-1 receptor (NRP-1) has recently been implicated in tumor progression of MBs, which seems to play an important role in the phenotype of cancer stem cells (CSCs). Targeting this molecule could thus present an interesting therapeutic value in the treatment of MB. We have selected cancer stem like cells of MBs in the form of medullospheres (MSs) from 3 cell lines (DAOY, D283-Med and Med-D341). These models were characterized by expression of neuropilins (NRP-1 and NRP-2) and phenotypic markers (CD133, CD15 and NF-M). Results showed a significant increase of the expression of NRP-1 by our CSCs models cultured in MSs that confirms our targeting strategy. The impact of the treatment of these cells with an innovative compound specifically targeting NRP-1, MR438, was then evaluated in vitro alone and in association with radiotherapy, especially on the study of the capacity for self-renewal. A decrease of self-renewal capacity for MB stem cells after exposition of MR438 with an increase of radiosensitivity for the 3 cell models in vitro was demonstrated. In vivo, MR438 was evaluated on heterotopic xenograft models in nude mice and showed a significant augmentation of radiosensitivity for DAOY tumors with a tendency to decrease tumor progression for the other 2 cell lines. Interestingly, the compound MR438 induced a significant decrease in the number of stem cells for all of our models. The compound appeared to induce CSCs to a differentiated phenotype at least for the DAOY cells, although mechanisms could not be clearly elucidated. In conclusion, inhibition of NRP-1 via MR438 seems to stimulate the differentiation of CSCs that may eventually reduce the progression of MB and bring a benefit in association with radiotherapy. Evaluation of this compound on orthotopic models of MB would provide information on its effectiveness on models closer to the physiopathology taking into account its distribution at the cerebral level

De par leur incidence et un diagnostic tardif, les cancers du sein et du colon restent parmi les plus meurtriers en France. L’identification de marqueur précoce semble primordiale pour détecter rapidement ces maladies et ainsi améliorer la survie des patients. Le protéome de chaque stade du cancer du côlon a été identifié et quantifié par spectrométrie de masse. L’Olfactomedine-4 (OLFM4) a été définie comme un biomarqueur potentiel par sa présence dans le sérum et ses variations d’expression. Alors que cette protéine est surexprimée, au niveau du site tumoral primaire,uniquement dans les stades précoces du cancer colorectal, sa surexpression est maintenue dans le sang des patients tous stades confondus. Cette variabilité d’expression est également retrouvée dans le cancer du sein. L’OLFM4 est décrite comme un marqueur des cellules souches colorectales mais ses fonctions restent contradictoires. Selon le contexte cellulaire, nos travaux associent cette protéine sécrétée à l’établissement de propriétés de cellule souche cancéreuse comme la prolifération en faible adhésion et la formation de mammosphères. Elle facilite également le processus migratoire et la résistance à la chimiothérapie. De plus, des expériences in vivo ont confirmé le caractère protumoral de cette protéine. Nous avons également mis en évidence son implication dans la régulation de l’expression du facteur de transcription GLI1 de la voie Sonic Hedgehog et de protéines d’adhésion telle que l’E-Cadherine. Cette étude décrit le lien étroit entre l’induction d’un phénotype agressif et l’OLFM4 dont le dosage sérique permettrait une détection précoce de ces maladies. / Through their high frequencies and the lack of early diagnosis, breast and colorectal cancer remain poor prognosis’ diseases. Therefor, the identification of early markers appears as crucial. The proteomic approach isone of the potential tools to identify these biomarkers as it enables the study of tumour cell lines or tissues amples. Indeed, proteins enriched from a shotgun proteomic approach can be identified and quantified by mass spectrometry. In a previous study, we have analysed the proteome of colorectal tumour at different stages and defined Olfactomedine-4 (OLFM4) as a potential biomarker. While OLFM4 expression is increased at primary tumoral site only in non-invasive stages, we have observed that OLFM4 isover expressed in the blood of patients regardless of the cancer stage. The same analysis was made on breast cancer patients. Although OLFM4 has been described as a stem cell marker, its functions remain unclear. In this study, we found that OLFM4 confers cancer stem cell properties. It acts as a regulator of proliferation in low adhesion conditions, migration, mammosphere formation and tumor growth. These abilities could be dependent of Sonic Hedgehog signalling pathway, especially of transcriptional factor GLI1, and regulation of adhesion proteins like E-cadherin. According to the cellular background, all these features highlight a close relationship between a potential biomarker and its involvement in the acquisition of an aggressive phenotype.

Les cellules souches de l’épiderme interfolliculaire humain, appelées cellules souches kératinocytaires (CSK), assurent l’homéostasie et le renouvellement du tissu durant toute la vie d’un individu grâce à leur importante capacité d’autorenouvellement. Ma thèse de doctorat a porté sur l’étude des effecteurs moléculaires impliqués dans la balance entre prolifération et quiescence dans un modèle in vitro de CSK, isolées de manière clonale et définies par le terme holoclone. Je me suis tout d’abord intéressée à la réponse des holoclones à l’effet d’un régulateur important de la prolifération et de la quiescence des cellules souches adultes : le facteur de croissance TGF β1. Mon travail s’est ensuite focalisé sur l’étude d’un gène agissant en aval de la voie de signalisation TGF β, le facteur de transcription Klf4, et dont le rôle dans la biologie des cellules souches adultes reste largement méconnu. Klf4 est en effet surtout décrit pour son rôle dans la reprogrammation des cellules somatiques en cellules iPS. Le maintien de la sensibilité des holoclones aux signaux inhibiteurs de la croissance constitue un gage de la normalité des CSK. Notre étude de la réponse des holoclones à l’effet antiprolifératif du TGF β1 montre que les holoclones, dotés d’un fort potentiel de croissance, caractéristique des CSK, conservent leur sensibilité à l’effet du TGF β1. Ces résultats nous ont permis de valider les holoclones comme constituant un modèle pertinent pour caractériser la biologie normale des CSK et décrypter les contrôles moléculaires de l’état souche. Le modèle des holoclones a été exploité dans le cadre d’une approche de génomique fonctionnelle visant à déterminer le rôle du facteur de transcription Klf4 dans les CSK. L’utilisation de vecteurs lentiviraux exprimant un shARN dirigé contre l’ARNm de Klf4 nous a permis d’étudier l’impact d’une modulation fine du niveau d’expression de Klf4 sur les propriétés des holoclones. La répression transcriptionelle de Klf4, d’environ un facteur 2, favorise de manière significative l’expansion du compartiment clonogénique au sein des holoclones. Ce gain de fonction concerne à la fois les potentiels de croissance et de reconstruction épidermique des holoclones. Un aspect important de ce travail a concerné la recherche des réseaux moléculaires régulés par Klf4 dans les holoclones. Une analyse du transcriptome nous a permis de montrer que Klf4 participe au contrôle des mécanismes de cycle cellulaire et de différenciation. Klf4 interviendrait également dans la régulation des voies de signalisation TGF β/BMP et Wnt, connues pour exercer des rôles clés dans la biologie des cellules souches. Klf4 constituerait donc un censeur de l’activité du compartiment immature dans l’épiderme interfolliculaire. Il participerait aux mécanismes de régulation du cycle cellulaire et serait susceptible d’intervenir dans le contrôle de l’autorenouvellement du compartiment souche. / Stem cells present within the human interfollicular epidermis, which are defined as keratinocytes stem cells (KSC), ensure the homeostasis and renewal of the tissue throughout the whole individual life. These functions are related to their important self-renewal capacity. My PhD project was focused on the knowledge of the molecular effectors involved in the control of the balance between proliferation and quiescence in KSC. This scientific question was investigated in an in vitro model of KSC which were clonally derived and characterized as holoclones. Holoclones are controlled by mitogenic growth factors and also by antiproliferative signals. One of these regulators is the growth factor TGF β1 which plays an important role in the control of quiescence and cell proliferation within several adult stem cell systems. In the context of growth inhibition by TGF β1, I have studied the role of a downstream gene of the TGF β pathway, the transcription factor Klf4, whose role in adult stem cell biology remains unclear. In fact, Klf4 is mostly described for its involvement in the reprogramming process of somatic cells into iPS cells. The maintenance of holoclone sensitivity to cell growth inhibitors is a critical parameter of KSC normal physiology. Holoclones possess an extensive growth capacity, which is characteristic of KSC. Despite this high proliferation rate, holoclones are still responsive to the antiproliferative effect of TGF β1. These results allowed us to validate the use of holoclone as a relevant model of non-transformed KSC suitable for the characterization of the role of candidate stemness genes in KSC biology, such as Klf4. The holoclone model was exploited to perform a functional genomic approach to investigate the role of Klf4 in KSC. We have developed a shRNA-based gene knock-down method using lentiviral vectors to assess the impact of Klf4 down-modulation on holoclone functional properties. Our results show that Klf4 down modulation controls the expansion of the clonogenic compartment present within holoclone progeny. This gain-of-function, which is maintained at the long term level, leads to an increase in holoclone 3D epidermis reconstruction capacity. A major point of this project was to elucidate the molecular networks controlled by Klf4 in holoclones. Microarray data show that Klf4 regulates the expression of several genes related to pathways involved in the control of stem cell fate. In particular, we identified many transcripts related to TGF β/BMP and Wnt signallings. Interestingly, the majority of the modulated transcripts are involved in the regulation of cell cycle and in keratinocyte differentiation process. All together these results suggest a critical role Klf4 as a stemness censor of the most immature compartment activity. Klf4 is likely to be involved in cell cycle regulation of KSC compartment and in the control of KSC self-renewal process.