Une étude génomique réalisée dans notre laboratoire a identifié le facteur de transcription ST18 comme étant potentiellement un régulateur transcriptionnel important de la cellule pancréatique bêta. Nous avons donc voulu découvrir son rôle, selon l'hypothèse que ST18 pourrait servir de commutateur transcriptionnel liant la masse et la fonction de la cellule bêta à son statut nutritionnel. Nos résultats indiquent tout d'abord qu'au niveau du pancréas, l'expression de ST18 est restreinte au tissu endocrine. De plus, l'expression et l'activité de liaison à l'ADN de ST18 sont augmentées in vitro en présence de traitements délétères, tels que le palmitate et les cytokines. Aussi, notre étude démontre que ST18 induit l'apoptose de la cellule bêta, en plus de réduire la replication cellulaire ainsi que la sécrétion d'insuline. Somme toute, nos résultats identifient et caractérisent ST18 comme un régulateur négatif de la fonction et de la masse de cellules bêta.

Le diabète est associé à une réduction de la masse des cellules β. Par conséquent, la régénération des cellules β est un champ d'étude important. Nous avons testé l'hypothèse selon laquelle le GLP-1, un médicament anti-diabète, stimule la differentiation de cellules progénitrices en cellules β matures (néogenèse) et étudié les mécanismes impliqués dans le processus. Nos résultats indiquent que le GLP-1 induit l'expression de marqueurs spécifiques à la cellule β (Pdxl, Glut2 et le gène de l'insuline) dans un modèle de cellules progénitrices (lignée AR42J). Cette action est précédée de l'expression de Ngn3, un gène contrôlant la differentiation des cellules endocrines du pancréas au cours du développement embryonnaire. De plus, notre étude suggère que la voie Pi3k et Hnf1-α/Hnf3-β participent à l'effet du GLP-1. Nos résultats pourraient mener à la découverte de cibles moléculaires permettant l'expansion de la masse de cellules β

L'apoptose des cellules bêta pancréatiques est une cause du diabète de type 2. La glycosylation par la voie des hexosamines modifie l'activité de protéines régulatrices. La déacétylase Sirt1 est connue pour son rôle dans la survie cellulaire et pour sa sensibilité face au métabolisme glucidique. Cette étude visait à montrer que l'activation directe de la voie des hexosamines stimule la mort de ces cellules par l'implication de Sirt-1. Le traitement des cellules Nit-1 avec la glucosamine a causé une augmentation temporelle significative de l'apoptose, jumelée à l'expression de facteurs pro-apoptotiques, la réduction des niveaux protéiques de Sirt-1 ainsi que sa glycosylation. De plus, l'attténuation génétique de Sirt1 a accentué la vulnérabilité des cellules à l'apoptose. Ces résultats montrent pour la première fois que Sirt1 joue un rôle important dans la survie de la cellule bêta et que sa glycosylation serait impliquée dans la perturbation de son rôle protecteur.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le pancréas est organisé en deux compartiments : le pancréas exocrine et le pancréas endocrine. Ce dernier est constitué d’Îlots de Langerhans composés de 5 types cellulaires : les cellules α, β, δ, ε et PP, synthétisant respectivement le glucagon, l’insuline, la somatostatine, la ghréline et le polypeptide pancréatique. Le diabète de type 1 est une maladie auto-immune entrainant la destruction des cellules β productrices d’insuline, conduisant à une hyperglycémie chronique. Le remplacement des cellules β nécessite de déchiffrer les mécanismes impliqués dans leur genèse au cours du développement. La coopération de plusieurs facteurs de transcription spécifie successivement les cellules progénitrices en cellules pancréatiques, endocrines puis α, β, δ, ε ou PP. Parmi ceux-ci, Arx et Pax4, jouent un rôle essentiel dans la détermination des cellules α/ PP et β/δ, respectivement. Nous avons récemment démontré que l’expression ectopique de Pax4 dans des cellules α adultes entrainait leur régénération et leur conversion en cellules productrices d’insuline. De plus, une augmentation du nombre de cellules δ a également été notée chez ces animaux. Ces cellules n’étant pas accumulées, nous avons suggéré leur possible conversion en cellules β. Ce travail de thèse porte donc sur la génération et la caractérisation d’animaux permettant l’expression ectopique de Pax4 dans les cellules δ. Nous démontrons que l’expression de Pax4 dans ces cellules δ est suffisante pour induire leur conversion en cellules « β-like ». De plus, nous montrons que cette conversion contribue à la réactivation du développement endocrine, conduisant à une hyperplasie des cellules produisant de l'insuline / The pancreas is organized into two compartments: the exocrine and the endocrine pancreas. The latter consists of functional units named islets of Langerhans which contain five cell subtypes, α, β, δ, ε and PP-cells responsible for the secretion of glucagon, insulin, somatostatin, ghrelin and pancreatic polypeptide, respectively. Type 1 Diabetes Mellitus is an autoimmune disorder resulting in the loss of insulin-producing β-cells, leading to chronic hyperglycemia. Therefore, approaches aiming at gaining further insight into the molecular mechanisms underlying β-cell (neo)genesis, are of growing interest. A network involving numerous transcription factors was found to progressively specify endodermal progenitors toward the pancreatic, endocrine, and islet cell fates. Among these, Arx and Pax4, were found to exert key roles for the allocation to the α-/PP- and β/δ-cell lineages, respectively. Importantly, we recently showed that adult α-cells can be regenerated and converted into functional β-like cells upon the ectopic expression of Pax4. Surprisingly, an increase of δ-cells was noted in these animals, such cells not accumulating over time. We therefore wonder whether δ-cells could be regenerated and converted into β-like cells. Here, we report the generation and characterization of transgenic animals allowing the misexpression of Pax4 in somatostatin-expressing cells. We demonstrate that the sole ectopic expression of Pax4 in δ-cells is sufficient to induce their conversion into β-like cells. We show that this conversion contributes to the reactivation of endocrine developmental processes, leading to a massive β-like cell hyperplasia

SUMMARY<p><p>Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is an autoimmune disease caused by progressive destruction of insulin-producing pancreatic beta-cells. Both viral infections and the cytokines interleukin-1beta (IL-1beta) and interferon-gamma (IFN-gamma) have been suggested as potential mediators of beta-cell death in early T1DM. Nitric oxide (NO) is a highly diffusible, short-lived free radical gas, which plays a significant role in several physiological processes in a diversity of tissues and organisms. Prolonged exposure of rodent or human pancreatic beta-cells to combinations of cytokines induces the expression of the inducible form of nitric oxide synthase (iNOS) and Fas, NO production, and cell death. It also induces the expression of potential "defense" genes, such as manganese superoxide dismutase (MnSOD) and heat shock protein (hsp) 70. Recent studies have shown that NO, in addition to having cytotoxic actions, may also regulate gene transcription. It remains unclear whether NO mediates cytokine-induced gene expression and subsequent beta-cell death. Previous studies using NO synthase blockers yielded conflicting results, which may be due to non-specific effects of these agents. <p>In the first part of our work, we examined the role of NO in beta-cell dysfunction and death by using an iNOS knockout mice (iNOS-/-, background C57BL/6x129SvEv). We evaluated the effects of cytokines on gene expression, as determined by reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR), and viability, as determined by nuclear dyes, of pancreatic islet cells or fluorescence-activated cell sorter (FACS)-purified beta-cells isolated from iNOS knockout mice or their respective controls (C57BL/6x129SvEv). The combination of cytokines used was interleukin-1beta (50 U/ml) + gamma-interferon (1000 U/ml) + tumor necrosis factor-alpha (1000 U/ml). The lack of cytokine-induced iNOS activity in the iNOS-/- islet cells was confirmed by RT-PCR and nitrite determination. Cytokines induced a > 3-fold increase in Fas and MnSOD mRNA expression in wild-type (wt) and iNOS-/- islets. On the other hand, hsp 70 was induced in wt but not in iNOS-/- islets. Prolonged (6-9 days) exposure of wt islets to cytokines lead to an 80-90% decrease in islet cell viability, whereas viability decreased by only 10-30% in iNOS-/- islet cells. To determine the mode of cytokine-induced cell death, FACS-purified beta-cells were exposed to the same cytokines. After 9 days, the apoptosis index was similarly increased in wt (39 +/- 3%) and iNOS-/- (33 +/- 4 %) beta-cells. On the other hand, cytokines increased necrosis in wt (20 +/- 4 %) but not in iNOS-/- (7 +/- 3 %) beta-cells. From these data, we conclude that: 1) NO is required for cytokine-induced hsp 70 mRNA expression, but not for Fas and MnSOD expression; 2) cytokines induce both apoptosis and necrosis in mouse beta-cells; 3) cytokine-induced apoptosis is mostly NO-independent, whereas necrosis requires NO formation.<p>In the second part of our work, we examined the role of the viral product double-stranded RNA (dsRNA) in beta-cell dysfunction and death. DsRNA is produced by many viruses during their replicative cycle. We investigated whether dsRNA (here utilized as synthetic poly IC (PIC)) modifies the effects of IL-1beta and IFN-gamma on gene expression and viability of rat pancreatic beta-cells and the role of NO in this process. FACS-purified rat beta-cells were exposed for 6-16 h (study of gene expression by RT-PCR) or 6-9 days (study of viability by nuclear dyes) to PIC and/or IL-1beta or IFN-gamma. PIC increased the expression of Fas and Mn superoxide dismutase mRNAs by 5-10-fold. IL-1beta and a combination of PIC + IFN-gamma& / Doctorat en sciences biomédicales / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le pancréas est une glande mixte à composantes endocrine et exocrine. Le tissu endocrine, essentiellement composé de cellules bêta productrices d’insuline, joue un rôle prépondérant dans le maintient de l’homéostasie glucidique. La perte qualitative ou quantitative des cellules bêta conduit au développement de pathologies caractérisées par une hyperglycémie chronique et connues sous le nom de diabète. Le développement de stratégies thérapeutiques innovantes, thérapie cellulaire ou médecine régénérative, pour guérir le diabète repose sur une connaissance précise des mécanismes développementaux impliqués dans la formation des cellules bêta. Ainsi, au delà de l’intérêt cognitif, il est primordial de comprendre au mieux les évènements cellulaires et moléculaires qui régissent l’organogénèse pancréatique pour offrir des thérapies alternatives. Le développement embryonnaire s’effectue dans un environnement où la pression partielle en oxygène (pO2) est faible. Par ailleurs, une étude menée au sein du laboratoire a montré que la pO2 influence la différenciation des cellules bêta pancréatique in vitro. En effet, lorsque des pancréas embryonnaires sont cultivés sur filtre en hypoxie (pO2=3%), le développement des cellules bêta est drastiquement diminué comparativement à une condition de 21% d’O2. Le facteur de transcription HIF-1 (Hypoxia Inducible Factor-1), composé d’une sous-unité alpha sensible au niveau d’oxygène et d’une sous-unité bêta constitutivement présente, permet à la cellule de s’adapter à un environnement pauvre en O2, notamment en favorisant la formation de nouveaux vaisseaux sanguins au cours d’un processus appelé angiogénèse. L’objectif de ma thèse était d’étudier le rôle de HIF-1alpha au cours du développement embryonnaire du pancréas in vivo. Pour cela, nous avons utilisé des lignées murines génétiquement modifiées permettant de stabiliser constitutivement la protéine HIF-1alpha dans l’épithélium pancréatique. En utilisant ce modèle murin, nous avons montré que la différenciation endocrine et le développement des cellules bêta est altéré dans les pancréas mutants comparativement aux contrôles. Par ailleurs, en utilisant une approche pharmacologique in vitro conduisant à l’ablation des cellules endothéliales du pancréas, nous avons pu restaurer une différenciation endocrine comparable aux contrôles. Ce travail a permis d’éclaircir le rôle de HIF-1 et de la vascularisation au cours du développement embryonnaire du pancréas. Nos résultats indiquent que ces paramètres doivent être pris en compte pour améliorer les protocoles actuels permettant de générer des cellules bêta in vitro. / The pancreas is an endoderm-derived organ which is composed by both an exocrine and an endocrine compartment. Within the endocrine tissu, insulin-producing beta-cells are essential for the regulation of glucose homeostasis. The loss of beta-cells can lead to pathologies such as diabetes. Currently, people suffuring from diabetes can be treated but not permanently cured. The development of innovating therapeutical approaches, like cellular therapy or regenerative medecine, relies on the precise knowledge of the mechanisms regulating the ontogenesis of pancreatic beta-cells. Different studies have linked proper embryonic development and low-oxygen tension (pO2). Specifically, when embryonic pancreases are cultured in vitro under a hypoxic condition (pO2=3%), the beta-cells development is impaired compared to a normoxic condition (pO2=21%). Different pathways are involved in the cell adaptation to hypoxia, such as the ubiquitous Hypoxia Inducible Factor 1-alpha (HIF-1alpha). The aim of my PhD project was to elucidate the role of HIF-1alpha during pancreatic development in vivo. To do so, we used genetically modified mice allowing the constitutive stabilization of HIF-1alpha in pancreatic epithelial cells. We have shown that HIF-1alpha stabilization leads to a reduction of endocrine differentiation and beta-cells development. Moreover, using a pharmacological approach in vitro consisting in deleting endothelial cells, we rescued the endocrine differentiation in the mutant pancreases. In conclusion, my data demonstrated the negative influence of both HIF-1 and endothelial cells on endocrine differentiation processes.

Le diabète de type 2 est aujourd'hui un réel problème de santé publique mondial. Il résulte d'un défaut de masse et/ou de fonction des cellules bêta pancréatiques. L'identification et la compréhension des mécanismes à l'origine de ces défauts permettrait de développer des stratégies pour restaurer la masse fonctionnelle de cellules bêta. Les hormones glucocorticoïdes (GC), hormones de stress et d'adaptation métaboliques, sont capables d'inhiber la sécrétion d'insuline mais leur mode d'action n'est pas encore entièrement compris. Récemment, la sérotonine, neurotransmetteur présent dans les cellules bêta, a été décrite comme étant à l'origine de l'augmentation de la masse bêta lors de la gestation et d'une modulation de la sécrétion d'insuline chez la souris. Dans ce contexte, nous avons voulu définir si les GC pouvaient moduler le système sérotonine des cellules bêta. Nous nous sommes alors intéressés aux enzymes de synthèse de la sérotonine Tph1 et Tph2. Nous avons pu montrer que l'expression des enzymes Tph1 et Tph2 était inhibée par les GC entrainant une diminution de la synthèse de la sérotonine. Ensuite nous avons confirmé que l'expression de Tph1 et 2 était stimulée par la prolactine mais aussi montré pour la première fois que ces enzymes étaient stimulées par l'exenatide-4, un analogue de GLP-1. Dans ces deux situations stimulantes, nous retrouvons un effet contre-régulateur des GC. Enfin, nous nous sommes intéressés au rôle de la sérotonine sur la fonction des cellules bêta. Nous avons pu mettre en évidence que la sérotonine est capable d'inhiber la sécrétion d'insuline par altération du flux calcique dans la cellule bêta pancréatique. En conclusion, nos résultats montrent que, au sein de la cellule bêta, le système sérotonine est une des cibles des GC, suggérant que la réduction de sérotonine puisse être un relais des effets des GC sur les cellules bêta. / Type 2 diabetes is now a real global public health problem. It results from a defect of mass and / or function of pancreatic beta cells. The identification and understanding of the mechanisms underlying these defects would help develop strategies to restore the functional beta cell mass. Glucocorticoid hormones (GC), hormones of stress and metabolic adaptation, can inhibit insulin secretion but their mode of action is not yet fully understood. Recently, the neurotransmitter serotonin present in the beta cells has been described as involved in the increase in beta-cell mass during gestation and a modulation of the insulin secretion in mice. In this context, we wanted to determine whether GC could modulate the serotonin system of beta cells. We focused on the enzymes required for serotonin synthesis Tph1 and 2. We could show that the expression of Tph1 and Tph2 1 and Tph2 enzyme was inhibited by GC causing a decrease in serotonin synthesis. We then confirmed the expression of Tph1 and 2 was stimulated by prolactin but also showed for the first time that these enzymes were stimulated by exenatide-4, a GLP-1. In these two stimulating situations, we found that GC exerts a counter-regulatory effect. Finally, we studied the role of serotonin on beta cell function. We were able to show that serotonin can inhibit the secretion of insulin by altering the calcium flux in the pancreatic beta cell. In conclusion, our results show that, within the beta cell, the serotonin system is one of GC target, suggesting that serotonin reduction can be a relay of the effects of GC on beta cells.

Cette thèse présente un système bioélectronique prometteur, l'Hynet. Ce Réseau Hybride (vivant-artificiel) est conçu pour l'étude du comportement à long terme des cellules électrogénératrices, comme les neurones et les cellules betas, en deux aspects : l'individuel et en réseau. Il est basé sur une boucle fermée et sur la communication en temps réel entre la culture cellulaire et une unité artificielle (Matériel, Logiciel). Le premier Hynet utilise des Matrices d'électrodes (MEA) commerciales qui limitent les performances spatiotemporelles du Hynet. Une nouvelle Matrice d'électrodes intelligente (iMEA) est développée. Ce nouveau circuit intégré, analogique et mixte, fournit une interface à forte densité, à forte échelle et adaptative avec la culture. Le nouveau système améliore le traitement des données en temps réel et une acquisition faible bruit du signal extracellulaire.

La fonction endocrine du pancréas est essentielle pour l'homéostasie du glucose parce que les îlots pancréatiques contiennent le seul type des cellules endocrines, nommées cellules bêta, qui sont capable de produire et sécréter de l’insuline. Le facteur de transcription RFX6, maintenu dans toutes les cellules endocrines matures, est essentiel pour le développement, l'identité et la fonction des cellules bêta. Chez l'homme, des mutations de RFX6 causent le syndrome de Mitchell-Riley, un trouble du développement caractérisé par un diabète néonatal et des malformations du système gastro-intestinal. La recherche des cibles de RFX6 dans les îlots murins a révélé que le facteur de transcription Mlxipl est directement régulé par RFX6. Dans cette thèse, nous avons étudié le mécanisme de la régulation transcriptionnelle de Mlxipl par RFX6 ainsi que les rôles de RFX6 et MLXIPL dans les cellules bêta adultes. Nous avons démontré que RFX6 se lie au premier intron de Mlxipl qui contient un motif de liaison (xbox) critique, et nous avons identifié les cofacteurs de ce processus. En comparant l’effet de la répression de Rfx6 et Mlxipl dans des milieux riches ou faibles en glucose dans la lignée cellulaire bêta Ins-1 832/13 sur le transcriptome, nous avons déterminé les programmes génétiques contrôlés par RFX6 et MLXIPL. / Pancreatic endocrine function is critical for glucose homeostasis because pancreatic islets contain the only cells of the body, the beta cells, capable of producing and secreting insulin. The transcription factor RFX6 is maintained in all mature islet cells and is as an essential regulator of beta cell development, identity and function. In humans, RFX6 mutations cause Mitchell-Riley syndrome, a developmental disorder characterized by neonatal diabetes and malformations of the digestive tract. The search for RFX6 targets in murine islets revealed that the transcription factor Mlxipl is directly regulated by RFX6. In this thesis, we investigated the mechanism of Mlxipl transcriptional regulation by RFX6, and the respective roles of RFX6 and its downstream target MLXIPL in adult beta cells. We demonstrated that RFX6 binds to the first intron of Mlxipl that contains a critical RFX binding motif (xbox), and we identified cofactors of this process. By comparing the changes in the transcriptomes linked to the loss of RFX6 or MLXIPL in the pancreatic beta cell line Ins-1 832/13 and the glucose level, we determined the genetic programs controlled by RFX6 and MLXIPL.