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BAY 41-2272: um imunomodulador com potencial para o controle de infecções. / BAY 41-2272: potential immunomodulator to control infections.Pereira, Paulo Vitor Soeiro 25 September 2008 (has links)
A ativação dos fagócitos é crítica para a defesa contra vários patógenos, por isso a importância de estudos que desenvolvam alternativas para a ativação dessas células. Nosso estudo visou investigar os efeitos do BAY 41-2272 na ativação de fagócitos. Para este propósito avaliamos a fagocitose, liberação de superóxido e atividade microbicida. Foram usados PBMC, neutrófilos e a linhagem celular THP-1, cultivadas na presença ou ausência de BAY 41-2272 (1mM ou 3mM) por 1h ou 48h a 37°C. A liberação de superóxido foi avaliada pelo ensaio da redução do citocromo c inibido especificamente pela superóxido dismutase; a fagocitose foi analisada através da co-cultura com partículas de Zymosan e contagem das células com partículas englobadas; e a atividade microbicida foi mensurada por meio da co-cultura com E. coli enteropatogênica seguida pela contagem das CFU formadas pelas bactérias recuperadas dos fagócitos. Além disso, fizemos a dosagem de IL-12, IFN-g e TNF-a e a análise da expressão gênica do gene CYBB. Todos os tipos celulares responderam aos tratamentos. Os PBMC, neutrófilos e THP-1 tratados com BAY 41-2272 produziram significativamente mais superóxido (cerca de 50% mais), e apresentaram significativamente maior atividade fagocítica (cerca de 54% mais), microbicida (cerca do dobro) comparados ao grupo controle não tratado, além de produzir TNFa. Ainda, o tratamento com o fármaco aumentou a expressão do gene da gp91phox nas THP-1 e PBMC. BAY 41-2272, especialmente na dose de 3mM, mostrou um grande potencial na ativação dos fagócitos em vários aspectos. Este potencial pode ser explorado na busca por novas terapias destinadas ao controle de infecções, principalmente no caso das imunodeficiências. / Phagocyte activation is critical role for host defense against several pathogens, so that studies developing alternatives for activating these cell are very important. We investigated the effects of BAY 41-2272 on phagocytes activation. For this purpose we evaluated several aspects indicating cellular activation, as phagocytosis, superoxide release and microbicidal activity. We used PBMC, neutrophils and THP-1 cell lineage cultured or not with BAY 41-2272 (1mM and 3mM) for 1h or 48h at 37°C. Superoxide release was tested by superoxide dismutase-inhibitable cytochrome c reduction assay; phagocytosis was evaluated through co-culture with zymosan particles and counting of ingested particles; and microbicidal activity was measured through co-incubation with enteropathogenic E. coli followed by counting of CFU from recovered bacteria from phagocytes. We analyzed the IL-12, IFN-g and TNF-a cytokine production and gp91phox gene expression. All cell types showed a response to treatments. PBMC, PMN and THP-1 treated with BAY 41-2272 produced significantly more superoxide (about 50% more), and presented significantly more phagocytic (about 54% more), microbicidal (about twice) activity than control group and production more TNF-a than control group. The expression of CYBB gene was more expressed on treated cells than control. BAY 41-2272, especially at 3mM, showed a great potential in activation of phagocytes in several aspects. This potential should be investigated at the light of new therapies seeking infection control, mainly in immunodeficiency.
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Protective effects of antiapoptotics and antioxidants in the treatment of retinal neurodegenerative diseasesFernández Sánchez, Laura 20 March 2015 (has links)
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Efecto de la testosterona en el sistema reproductor e inmunitario de la dorada (Sparus aurata L.). Identificación de una variante constitutivamente activa del receptor de andrógenos.= Effect of testosterone on reproductive and immune systems of gilthead seabream (Sparus aurata L.). Identification of a constitutively active androgen receptor variantSánchez Hernández, Miriam 20 December 2013 (has links)
En la siguiente Tesis Doctoral hemos analizado la influencia de la testosterona (T) exógena sobre el metabolismo de esteroides sexuales y la fisiología de la gónada de la dorada (Sparus aurata L.). Además hemos descrito la presencia de un mecanismo de procesamiento alternativo del ARN, para el receptor de andrógenos (AR), cuya expresión varía con el estado reproductor y se correlaciona con el nivel de T. Esta forma truncada del AR está presente en los granulocitos acidófilos (GAs), descubriéndonos así nuevos mecanismos de regulación en la biología de los neutrófilos de vertebrados. El uso de la dorada como ejemplar de estudio se debe a que es una especie de alto interés comercial en el Mar Mediterráneo. La dorada es un teleósteo marino que presenta un hermafroditismo protándrico, siendo los ejemplares machos durante sus dos primeros años de vida, y pudiendo cambiar de sexo a partir del segundo año. El ciclo reproductor (CR) de los ejemplares macho se caracteriza por presentar cuatro etapas secuenciales: espermatogénesis (ES), puesta (P), post-puesta (PP) y quiesciencia (Q) durante el primer CR. La etapa de Q es sustituida por una etapa de involución testicular (IT), en el segundo CR que permite el cambio de sexo. Tras la puesta, el testículo suele sufrir una serie de cambios morfológicos, entre los que se encuentra una infiltración masiva de leucocitos, la cual es mayor en la etapa IT, antes del cambio de sexo. En primer lugar, quisimos comprobar la capacidad de la T exógena para modificar el balance de las hormonas sexuales esteroideas y la fisiología de la gónada. Con este fin, incorporamos la T en las doradas utilizando el sistema de micropartículas in situ (ISM) (T-ISM). La T exógena promueve un incremento supra-fisiológico en los niveles plasmáticos de T y una disminución de los niveles de 17β-estardiol (E2). Sin embargo, no se vieron alterados los niveles de 11-cetotestosterona (11KT). La T, además, bloquea la proliferación de las células germinales del testículo aunque el incremento en la expresión del gen que codifica para dmrt1 podría prevenir la eliminación completa de las células germinales. Por otra parte, comprobamos que los andrógenos, al igual que había sido demostrado para los estrógenos, están implicados en la migración de leucocitos hacia la gónada. Además, la T de los T-ISM promueve una disminución de la expresión de los genes que codifican receptores Toll-like (tlrs), quedando inhibida la capacidad de reconocer y responder a patógenos. Posteriormente, identificamos una variante, constitutivamente activa, del AR que carece de dominio de unión al ligando (ARΔLBD) en testículo y riñón cefálico (RC) de dorada y su expresión varía con el estado reproductor y con los niveles plasmáticos de testosterona. Esta variante se forma por un procesamiento alternativo del ARNm del AR. Nuestros datos sugieren que este procesamiento alternativo es capaz de modificar la fisiología del testículo, debido a que los andrógenos son capaces de modular el procesamiento alternativo del AR. Además, los andrógenos, concretamente la T, es capaz de regular la respuesta inmunitaria a través de la variante ARΔLBD. Otro dato interesante es que sólo los AGs expresan esta forma truncada mientras que los macrófagos (MØs) no la expresan. Además, el procesamiento alternativo del AR también no sólo se ve modulado por T, sino también por estímulos inmunitarios, aunque esta modulación depende del estado reproductor de los individuos. Todos estos datos nos indican una interacción entre los estímulos endocrinos e inmunitarios en la regulación del procesamiento alternativo del AR así como de las funciones de los AGs. Además, la T podría estar implicada en los cambios fisiológicos de la gónada a través de la regulación del ARΔLBD. / During the development of this thesis, we want to analyze the effect of exogenous androgens, mainly testosterone (T), and the activity of androgen receptor (AR) in immune-reproductive interaction in the sparidae, gilthead seabream (Sparus aurata L.). Furthermore, we described the presence of a mechanism, in which the unique AR gene can give diverse transcripts either in testis or immune organs. The gilthead seabream is a marine, protandrous teleost fish with significant economic value in the Mediterranean aquaculture. The specimens of this specie are male during the two first years, and present a reproductive cycle (RC) divided in four stages. In first RC, the stages are spermatogenesis (SG), spawning (S), post-spawning (PS) and resting (R); in the second RC, the last stage is substituted by testicular involution (TI) stage. After spawning there are various changes in gonad, between which are a massive infiltration of leukocytes, being higher in TI and that can lead to sex change. For this motive this specie can being used as a model for studying the immune-reproductive interactions. In first place, we wanted to observe the capacity of exogenous T to modify the balance of sex steroid hormones and on the physiology of the gonad (proliferation, apoptosis, leukocyte influx and immune status) of mature male specimens of the gilthead seabream. To this end, we used the in situ forming microparticle (ISM) system, which delivers sex steroids without promoting significant physiological alterations in gilthead seabream and that has been previously used in our laboratory to show that T modulates the inflammatory response of head kidney (HK) leukocytes in the gilthead seabream. The results suggest that in mature males, exogenous T can blocked the cell proliferation and increase the migratory influx of leukocyte, although decrease the ability to recognize and response to pathogens. Secondly, we identified a truncated form of the AR generated by alternative splicing that lacks the ligand-binding domain (ARΔLBD) either in testis, HK and acidophilic granulocytes (AGs). We studied the modulation of this variant by androgens and immune stimulus in order to demonstrate its mediation in the role of androgens in the immune response. The results showed that T is able to regulate the testicular morphology through the modulation of the expression of ARΔLBD variant. Furthermore, T was also able to regulate the immunecompetence through ARΔLBD variant. Interestingly, ARΔLBD variant only is expressed in AGs but no in macrophages (MØ). Furthermore, the stimulation with bacterial DNA, also regulated the alternative splicing of AR, but depending of the reproductive stage. These data suggest a crosstalk between endocrine and immune stimuli in the regulation of AR alternative splicing and AGs function. Furthermore, T might be implicated, in the migratory influx into gonad and the physiological changes in gonad through by means of regulation of ARΔLBD.
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El pez zebra (Danio rerio) como modelo de estudio in vivo del papel de la telomerasa en la hematopoyesis= The zebrafish (Danio rerio)as a model to stydy in vivo the role of telomerase in hematopoiesisAlcaraz Pérez, Francisca 28 April 2014 (has links)
Objetivos. En el presente trabajo se han cumplido dos objetivos concretos: 1. Desarrollo de un nuevo sistema chivato basado en la luciferasa para el estudio de promotores tanto constitutivos como inducibles en el contexto de un organismo completo. 2. Estudio del papel extracurricular del componente de ARN de la telomerasa (TR) en la hematopoyesis usando el pez cebra como modelo. - Metodología. Embriones de pez cebra han sido manipulados genéticamente mediante la microinyección de plásmidos, morfolinos y ARN (solos o en combinación) en el estadío de desarrollo de 1-8 células para recrear las distintas condiciones experimentales de estudio. Para el abordaje del primer objetivo, el estudio de la actividad promotora en el contexto de un organismo completo se ha llevado a cabo mediante la medida de luminiscencia. Para el cumplimiento del segundo objetivo, el recuento de los distintos tipos de células sanguíneas en las distintas condiciones experimentales se ha abordado mediante la tinción específica con TSA (neutrófilos) o con o-dianisidina (eritrocitos), o mediante el uso de distintas líneas de pez cebra transgénico que expresan proteínas fluorescentes en neutrófilos y en macrófagos. La funcionalidad de los neutrófilos se ha estudiado mediante ensayos de reclutamiento a una herida y de respuesta a una infección bacteriana. El estudio de la actividad telomerasa se ha realizado mediante una técnica específica y cuantitativa llamada Q-TRAP basada en la amplificación de la secuencia telomérica, y la longitud de los telómeros se ha cuantificado mediante Q-FISH, que consiste en una hibridación in situ con una sonda telomérica fluorescente. El estudio de la expresión de genes se ha llevado a cabo mediante RT-PCR y PCR a tiempo real, y también mediante hibridación in situ con sondas de ARN. Peces cebra han sido mantenidos según se indica en el manual del pez cebra. Todos los experimentos cumplen con la directiva de la Unión Europea (86/609/EU) y han sido aprobados por el Comité de Bioética del Hospital Clínico Universitario “Virgen de la Arrixaca” (España) y por el Comité Institucional del Cuidado y Uso Animal del Hospital Infantil de Boston (EEUU). - Resultados y conclusiones. Para el desarrollo del primer objetivo se combinaron las ventajas que tiene el ensayo clásico de la doble luciferasa con las que tiene el pez cebra como modelo vertebrado para desarrollar una técnica que permita analizar la actividad promotora y la función génica en el contexto de un organismo completo. El resultado fue una técnica rápida y sensible que puede ser utilizada como una nueva herramienta para caracterizar in vivo la mínima región promotora de un gen, la respuesta de promotores inducibles ante distintos estímulos, la validación de construcciones genéticas y la función de un gen de interés. La técnica desarrollada resulta muy valiosa cuando se combina con las ventajas que ofrece el pez cebra para hacer escrutinios a gran escala basados en el fenotipo, convirtiéndose en un sistema muy prometedor para la identificación y la validación de fármacos o genes que, por ejemplo, reviertan el fenotipo. El desarrollo del segundo objetivo de esta tesis muestra varias evidencias que apoyan al pez cebra como modelo para estudiar el papel del componente de ARN de la telomerasa (TR) en la disqueratosis congénita, que es una enfermedad hereditaria de envejecimiento prematuro, cuyos pacientes mueren principalmente debido al fallo de la médula ósea. En este modelo, la inhibición genética de TR resultó en la afectación de la mielopoyesis, a pesar de que el desarrollo de las células madre hematopoyéticas fue normal. Sorprendentemente, la neutropenia causada por la ausencia de TR fue independiente de la longitud telomérica y de la actividad telomerasa. El análisis genetico mostró que TR modula la decisión del destino mieloide/eritroide mediante el control de los niveles de los factores de transcripción mieloide y eritroide spi1 y gata1, respectivamente, mediante la estimulación de gcsf y mcsf. Este modelo de pez cebra deficiente en TR ilumina el papel extracurricular de TR, y podría establecer dianas terapéuticas para la disqueratosis congénita. / The zebrafish (Danio rerio) as a model to study in vivo the role of telomerase in hematopoiesis - Objectives. The specific objectives of the present work are: 1. Development of a new luciferase-based reporter system for studying both constitutive and inducible promoters in the context of a whole organism. 2. Study the non-canonical role of the telomerase RNA component (TR) in hematopoiesis using the zebrafish. - Methodology. Zebrafish embryos were genetically modified by injecting plasmids, morpholinos and RNA (alone or in combination) whitin the 1- to 8-cell developmental stage to simulate the different experimental conditions. For approaching the first goal, the study of the promoter activity in the context of a whole organism was carried out by measurement of luminiscence. To addressing the second goal, the counting of the different blood cells in the different experimental conditions was carried out by specific staining with TSA (neutrophils) or o-dianisidine (erythrocytes), or by using different transgenic zebrafish lines expressing fluorescent proteins in neutrophils or macrophages. The neutrophil functionality was studied by quantifying the recruitment to a wound and the response to a bacterial infection. The telomerase activity was determined by using a specific and quantitative assay based in the amplification of the telomere sequence and called Q-TRAP, and the telomere length was quantified by a whole-mount in situ hybridization with a fluorescent telomeric probe (Q-FISH). The study of gene expression was carried out by RT-PCR and real time PCR, and also by in situ hybridization with RNA probes. Zebrafish were maintained as described in the zebrafish handbook. The experiments performed comply with the Guidelines of the European Union Council (86/609/EU). Experiments and procedures were performed as approved by the Bioethical Committee of the University Hospital “Virgen de la Arrixaca” (Spain) and by the Children's Hospital Boston institutional Animal Care and Use Committee (USA). - Results and conclusions. Firstly, we have adapted the classical dual luciferase reporter assay from cell lines to whole zebrafish embryos/larvae. The result is a rapid and sensitive technique that can be used as a new tool to characterize the minimum promoter region of a gene as well as the in vivo response of inducible promoters to different stimuli. We have illustrated the usefulness of this system for studying both constitutive and inducible promoters. This assay has several advantages compared with the classical in vitro (cell lines) and in vivo (transgenic mice) approaches. Among others, the assay allows a rapid and quantitative measurement of the effects of particular genes or drugs in a given promoter in the context of a whole organism and it can also be used in high throughput screening experiments. We have showed several evidences supporting the zebrafish as a new model to study the role of the telomerase RNA component (TR) in DC, which is an inherited premature disease whose patients usually die of bone marrow failure. In this model, genetic depletion of TR results in impaired myelopoiesis, despite normal development of hematopoietic stem cells (HSCs). Interestingly, the neutropenia caused by TR depletion is independent of telomere length and telomerase activity. Genetic analysis shows that TR modulates the myeloid-erythroid fate decision by controlling the levels of the master myeloid and erythroid transcription factors spi1 and gata1, respectively, through stimulation of gcsf and mcsf. This model of TR deficiency in the zebrafish illuminates the non-canonical roles of TR, and could establish therapeutic targets for DC.
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Bioprospecção de toxinas presentes na hemolinfa e extrato de cerdas da lagarta Lonomia obliquaGouveia, Ana Isabel da Costa Bernuci January 2004 (has links)
Orientador : Silvio Sanches Veiga / Co-orientador : Waldemiro Gremski / Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular Molecular. Defesa: Curitiba, 14/09/2004 / Inclui bibliografia / Resumo: Estudando o extrato de cerdas da lagarta Lonomia obliqua, detectamos uma atividade lítica sobre moléculas de ácido hialurônico. O extrato de cerdas também foi capaz de degradar condroitim sulfato purificado, porém, incapaz de hidrolisar moléculas de heparam sulfato e dermatam sulfato. Além disso, por meio de ensaios de cinética de degradação de ácido hialurônico, observamos que esta atividade lítica é causada por uma enzima do tipo hidrolase e não do tipo liase. Baseando-se no método colorimétrico descrito por Reissig et al (1955), concluímos que esta hidrolase atua como uma enzima do tipo ß- endohexosaminidase originando resíduos terminais de açúcares Nacetilglucosamina após a lise do ácido hialurônico, ao invés de agir como uma enzima do tipo ß-endoglucuronidase que, por sua vez, gera resíduos de ácido glucurônico. Análises do extrato de cerdas por zimografia resultaram na identificação de moléculas com atividade lítica sobre o ácido hialurônico com
mobilidade eletroforética difusa de 49kDa e 53kDa. Uma avaliação da atividade destas moléculas em função do pH mostrou que estas enzimas não apresentam atividade aparente em pH abaixo de 5,0 e acima de 8,0 e indica que a faixa de pH ótimo para a atividade enzimática está entre 6,0 e 7,0. Por fim, através de reação de fluorescência e análise em microscopia confocal, pudemos comprovar a ação de clivagem do extrato de cerdas sobre o ácido hialurônico organizado na matriz extracelular de derme de coelho. Estes dados nos fornecem evidências experimentais sobre a presença de hialuronidases no extrato de cerdas de L. obliqua, que possivelmente, podem estar envolvidos com os efeitos nocivos desencadeados no envenenamento. Inúmeros constituintes moleculares diferentes têm sido estudados a partir dos produtos de secreção da lagarta L. obliqua e entre eles se destacam as serinoproteases com atividade pró-coagulante e/ou fibrinogenolítica. Com base nestes dados, consideramos a hipótese de identificar e caracterizar um inibidor de serinoprotease na hemolinfa da lagarta com possível função de proteção contra suas próprias toxinas, ou mesmo, com função tóxica durante os acidentes. Experimentos utilizando fibronectina como substrato protéico para diferentes proteases (tripsina, elastase, quimiotripsina, proteinase K, papaína, pepsina e colagenase V) foram realizados na presença de hemolinfa. O perfil de degradação da fibronectina foi avaliado por ensaios de Western Blotting utilizando anticorpos que reconhecem fibronectina. A atividade proteolítica da tripsina, elastase, quimiotripsina e proteinase K foi inibida pela hemolinfa da lagarta. Esta atividade inibitória detectada foi avaliada sob diferentes temperaturas de incubação, mostrando que o inibidor de protease presente na hemolinfa é funcional a 4, 20, e 37°C. Além disso, experimentos adicionais mostraram que esta atividade inibitória da hemolinfa também ocorre
quando tripsina é incubada com diferentes substratos protéicos (fibrinogênio, laminina e vitronectina). Com o intuito de purificar a molécula do inibidor de protease, alíquotas de hemolinfa bruta de L. obliqua foram submetidas a ensaios de cromatografia de gel filtração utilizando resina Sephadex G-100 seguidos de ensaios de cromatografia de afinidade utilizando resina tripsinaagarose. As frações eluídas das cromatografias foram monitoradas para a presença de proteínas por absorbância em 280nm e submetidas à incubação com fibronectina e tripsina para detecção da atividade inibitória observada por SDS-PAGE 7,5%. Para fortalecer este resultado foi realizado um zimograma reverso, utilizando gelatina como substrato, em que as frações com atividade inibitória foram avaliadas. Sob estas condições, identificamos um inibidor de
serinoprotease na hemolinfa da lagarta L. obliqua com mobilidade eletroforética na região de 21kDa. Com o objetivo de avaliar o grau de reversibilidade da inibição da atividade proteolítica pela ação do inibidor de protease, alíquotas de tripsina pré-incubada com as frações enriquecidas da cromatografia foram submetidas a experimentos de zimograma com gelatina impregnada. Com isso pudemos observar que a interação inibidor-protease é resistente ao SDS e à eletroforese gerando alteração na mobilidade da tripsina mas não inativando irreversivelmente a sua atividade. Especulando sobre uma futura aplicação biotecnológica deste inibidor, realizamos um experimento, para avaliarmos a possível inibição da ação da molécula de trombina quando na presença de fibrinogênio em solução, em que trombina foi pré-incubada com as frações enriquecidas da cromatografia de gel filtração e depois adicionada à uma solução de fibrinogênio. Pudemos observar que, respeitando uma característica importante dos inibidores de protease que possuem aplicações no campo terapêutico, o inibidor de serinoprotease da hemolinfa da lagarta L. obliqua não foi capaz de inibir a atividade da trombina, uma importante enzima da cascata
de coagulação / Abstract: By studying Lonomia obliqua (caterpillar) bristles extract we were able to detect a lytic activity on purified hyaluronic acid. Also, the bristle extract hydrolyses purified chondroitin sulphate, but was unable to degrade either heparan sulphate or dermatan sulphate. Moreover, through purified hyaluronic acid-degrading kinetic assays, we observed that this lytic activity was caused by a hydrolase instead a lyase enzyme. In addition, by using the colorimetric reaction of Reissig (1955), we detected this hyaluronic acid hydrolase action as a ß-endohexosaminidase enzyme originating terminal N-acetylglucosamine residues instead a â-endoglucuronidase that might originate glucuronic acid residues. Zymogram analysis of the bristle extract detected 49kDa and 53kDa molecules with hyaluronic acid lytic activity. An examination of these hyaluronic acid degrading activities as function of pH showed that these hydrolases had no apparent activities at pH below 5.0 and higher than 8.0 and displayed their optimal activities at pH ranging from 6.0 to 7.0. Finally, through a fluorescence reaction to hyaluronic acid and confocal microscopy, we further comproved this cleaving action upon hyaluronic acid organised on the extracellular matrix of the rabbit dermis. The data provide experimental evidence of the presence of hyaluronidases in the L. obliqua bristle extract, probably involved on the harmful effects of the venom. Several different molecular constituents have been described in L. obliqua secretion products and among them serineproteases with procoagulant and fibrinogenolytic activity were identified in its bristles. Based on these results, we have considered the hypothesis of identifying a serineprotease inhibitor in caterpillar haemolymph with possible self defense function against their own toxins or even deleterious activities during accidents. Experiments using fibronectin as a protein substrate for different proteases such as trypsin, elastase, chymotrypsin, proteinase K, papain, pepsin and collagenase V were performed in the presence and absence of haemolymph. Fibronectin degradation profile was evaluated by Western Blotting assays using antibodies that recognize fibronectin. The proteolytic activities of trypsin, elastase, chymotrypsin and proteinase K were inhibited by incubation with L. obliqua haemolymph. This inhibitory activity was also evaluated at different temperatures showing that the inhibitor is functional at 4, 20, and 37°C. In addition, experiments showed that this inhibitory activity also occurs when trypsin was incubated with different substrates such as fibrinogen, laminin and vitronectin molecules. With the goal of purify the inhibitor molecule, haemolymph was submitted to a Sephadex G-100 gel filtration chromatography followed by an affinity chromatography using trypsin-agarose. Eluted fractions were monitored for the presence of proteins by absorbance at 280nm and were submitted to incubation with fibronectin and trypsin for detection of inhibitory activity that was observed by SDS-PAGE 7,5%. To ensure this result, a reverse zymography of the fractions with activity was performed using gelatin as substrate. Under these conditions, we were able to identify a trypsin inhibitor with a diffuse eletrophoretic mobility apparently at 21kDa region in L. obliqua haemolymph. Next, we studied the mechanism by which haemolymph serine protease inhibitor inactivates proteases. Trypsin was incubated with Sephadex G-100 enriched fractions and then electrophoresed by using a SDS-PAGE (experimental procedure that is able to separate protease from protease inhibitor in case of reversible inhibition), followed by a gelatin-zymogram. This assay suggest that protease inhibitor interaction with trypsin was resitent to SDS and electrophoretic separation conditions, altered trypsin mobility but did not inactivate its proteolytic activities in a unreversible manner. Then, speculating about the biotechnological applications of this protease inhibitor, we evaluated the ability of this molecule inhibit the thrombin activity upon fibrinogen. Aliquots of thrombin were pre-incubated with Sephadex G-100 enriched fractions and, then, incubated with fibrinogen solution. This result showed that the haemolymph serine protease inhibitor is unable to block fibrinogen-thrombin dependent clotting in vitro, as well as waited for all protease inhibitors use.
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Análise da segregação celular : modelos estatísticos e simulaçõesBeatrici, Carine Priscila January 2014 (has links)
O fenômeno de segregação celular ocorre tanto na estruturação inicial dos organismos (morfogênese) quanto durante a regeneração de tecidos danificados. O reordenamento celular ocorre através do agrupamento de células de um mesmo tipo. A evolução do tamanho destes agregados é objeto de experimentos e de simulações relatados na literatura há mais de vinte anos. Os resultados encontrados, no entanto, são controversos. Ao simular a segregação celular pode-se obter uma lei de potência ou uma dependência logarítmica para a evolução do tamanho desses agregados. Por outro lado, dentro de certos intervalos, os experimentos podem ser ajustados com leis de potência, mas os expoentes obtidos diferem dos sugeridos nas simulações, deixando obscura a compreensão do problema. Para entender a origem física deste fenômeno estendemos os modelos de simulações baseados em diferença de adesão para incluir as hipóteses: de diferença de velocidades, de reconhecimento celular e de motilidade de grupo. Verificamos que as proporções de células de cada tecido são determinantes na distribuição espacial final do agregado e mapeamos isto em um diagrama. Para estudar a evolução do crescimento de agregados utilizamos dois métodos: a aproximação de agregado médio e a abordagem através da equação de coagulação-fragmentação de Smoluchowski. Em ambas abordagens supomos que as células formam agregados com simetria esférica e que o mecanismo principal responsável pela segregação é a fusão binária de agregados. Usando o primeiro método obtivemos resultados analíticos que mostram os efeitos de tamanho finito tanto das células individuais quanto do tamanho do sistema sobre as leis de evolução temporal. Além disso, a partir do ajuste de dados experimentais, mostramos que os expoentes corretos das leis de potência só podem ser obtidos redefinindo-se a dependência da constante de difusão dos agregados com sua massa. Para levar em conta o efeito da flutuação de tamanho dos agregados, uma equação de Smoluchowski generalizada é proposta. A distribuição de tamanhos de agregados é obtida integrando-se esta equação e, após, esse resultado é comparado com experimentos e simulações. / The celular segregation happens both in the initial organism structuration (morphogenesis) and in tissue regeneration. Cell sorting happens by grouping of cells of the same kind. The size evolution of these cluters has been reported in experiments and simulations in the literature in the last twenty years. The results found are, nevertheless, controversial. When simulating cell segregation one may obtain a power law or a logaritmic dependency for their evolution. On the other hand, within a limited range, the experiments suggest a power law, however the exponents differ from those obtained by simulations, leaving the problem undefined. In order to understand the physical origin of this phenomenon we have extended the simulations models based on differential adhesion to include the hypotheses of diferential velocities, cell recognition and diferential group motilities. We have verified that different cell type proportions determine different final cell spatial distribution and mapped this in a diagram. In order to study the evolution of cluster growth we have used two methods: the mean cluster approach and the Smoluchowski coagulation-fragmetation equation approach. In both cases we suppose that the cells form spherical clusters and that the primary aggregating mechanism is through binary cluster fusion. Using the first method we obtain analytic results showing the effects produced by the finite size of the individual cells and of the finite syze of the system on the evolution laws. Besides, from the experimental data fitting, we have shown that the correct exponent for the power laws is obtained only if we redefine the difusion constant dependency with the cluster mass. In order to consider the cluster size fluctuation effect, a generalized Smoluchowski equation is proposed. The system cluster size distribution is obtained integrating this equation and, then, this result is compared with experiments and simulations.
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Ontogenia da semente e análise proteômica do integumento interno de Jatropha curcas L. (Euphorbiaceae) / Seed ontogeny and proteomic analysis of the internal integument of Jatropha curcas L. (Euphorbiaceae)Soares, Emanoella Lima January 2015 (has links)
SOARES, Emanoella Lima. Ontogenia da semente e análise proteômica do integumento interno de Jatropha curcas L. (Euphorbiaceae). 2015. 140 f. Tese (Doutorado em agronomia)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-08-29T19:38:50Z
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Previous issue date: 2015 / The economic importance of J. curcas is due to the high amount of oil accumulated in their seeds, specifically in the endosperm. In this context, the events related to the endosperm formation and the accumulation of toxic compounds in the seeds could help in the production of varieties that produce more oil and are less toxic. Thus, anatomical, proteomic and gene expression analysis were made with J. curcas seeds to contribute with the knowledge about physiologic events related with the formation of endosperm and the processes of synthesis and accumulation of phorbol esters. The anatomical analysis showed the maternal tissue responsible for the nutrients transfer to the endosperm and contributed to fill the gaps present in the literature about the anatomy of J. curcas seeds. The inner integument is the maternal tissue that presents the vasculature of the mother plant and is the responsible for the nutrition of the endosperm through the process of programmed cell death (PCD). Based on this result proteomic analysis of two anatomically different regions of the inner integument, named as proximal and distal, were performed. The identified proteins indicated that the inner integument pass through PCD in different degrees in the proximal and distal regions and that in this tissue there is a spatial distribution between catabolism and anabolism. In the proximal region especially hydrolases were identified and in the distal region storage proteins and proteins of biosynthetic pathways were prevalent. The gene expression analysis had two purposes: first, verify wether the transcripts levels of the genes likely involved in PCD, whose proteins were identified and quantified in the proteomic analysis, were related to the protein abundance and second, identify the site of synthesis of the committed enzyme in the phorbol esters biosynthesis, the casbene synthase, through a study with root, leaf, embryo, inner integument and endosperm and 14 putative genes of the mentioned enzyme. The results indicated that the proteins related to PCD must be controlled at transcript level. Nine putative genes from casbene synthase were expressed in roots and one of them was expressed in the leaf and embryo. This work denotes the role of PCD in the inner integument to the development of the seed and also demonstrates the transitory nature of storage of this tissue. In addition gives notation that the seed, despite of accumulates phorbol esters, do not synthesizes these compounds, but probably import them from roots. / A importância econômica da espécie J. curcas deve-se a grande quantidade de óleo acumulada em suas sementes, especificamente no endosperma. Os eventos relacionados à formação do endosperma e ao acúmulo de compostos tóxicos nas sementes podem auxiliar na produção de variedades com maior produção de óleo e menos tóxicas. Visando isso, foram realizadas análises anatômicas, proteômicas e de expressão de genes nas sementes de J. curcas para contribuir com o entendimento sobre os eventos fisiológicos associados à formação do endosperma e aos processos de síntese e acúmulo dos ésteres de forbol. A análise anatômica mostrou o tecido maternal responsável pela transferência de nutrientes para o endosperma e contribuiu para resolver lacunas existentes na literatura sobre a anatomia de sementes de J. curcas. O integumento interno é o tecido maternal que apresenta a vascularização da planta-mãe e é o responsável pela nutrição do endosperma através do processo de morte celular programada (PCD). Com base nesse resultado, realizou-se uma análise proteômica do integumento interno na região proximal e distal ao endosperma, uma vez que as características celulares indicativas de PCD nesse tecido se apresentavam diferentes nessas regiões. As proteínas identificadas indicaram que o integumento interno sofre PCD em diferentes graus nas diferentes regiões e que nesse tecido há uma distribuição espacial entre catabolismo e anabolismo, pois na região proximal identificaram-se principalmente hidrolases e na região distal proteínas de reserva e de vias biossintéticas. A análise de expressão de genes teve dois propósitos: primeiro, verificar se os níveis de transcritos de genes possivelmente relacionados à PCD, cujas proteínas foram identificadas e quantificadas na análise proteômica, estavam relacionados à abundância de proteínas e o segundo foi identificar o local de síntese da enzima comprometida na biossíntese dos ésteres de forbol, a sintase do casbeno, através de um estudo com raiz, folha, embrião, integumento interno e endosperma e 14 genes candidatos à enzima mencionada. Os resultados indicaram que as proteínas relacionadas à PCD devem ser controladas no âmbito transcricional. Nove genes candidatos à sintase do casbeno foram expressos em raiz e um deles foi expresso na folha e no embrião. Este trabalho evidencia o papel da PCD no integumento interno para o desenvolvimento da semente, além de demonstrar a natureza transitória de reserva desse tecido. Adicionalmente, dá indícios de que a semente, apesar de acumular ésteres de forbol, não sintetiza esses compostos, mas possivelmente os importa das raízes.
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Estudo de alvos moleculares relacionados à mitose e ao ciclo celular em pacientes portadores de síndrome mielodisplásica / Study of molecular targets related to mitosis and cell cycle in patients with myelodysplastic syndromeBorges, Daniela de Paula 16 February 2017 (has links)
BORGES,D.P. Estudo de alvos moleculares relacionados à mitose e ao ciclo celular em pacientes portadores de síndrome mielodisplásica. 2017. 113 f. Dissertação (Mestrado em Ciências Medicas) - Faculdade de Medicina, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Ivone Sousa (ppgcm.ufc@gmail.com) on 2017-08-28T13:08:16Z
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Previous issue date: 2017-02-16 / Myelodysplastic syndrome (MDS) are a heterogeneous group of clonal disease characterized by insufficiency of bone marrow, increase of apoptosis and increased risk of acute myeloid leukemia (AML) progression. Proteins related to the mitotic spindle (AURKA, AURKB, TPX2), to the mitotic checkpoint (MAD2, CDC20) and the regulation of the cell cycle (CDKN1A) are directly related to chromosome stability and tumor development. This study aimed to evaluate the mRNA expression levels of these genes in 101 MDS patients and 10 healthy volunteers, using a real-time PCR methodology. After the analysis of mRNA expression, we identified that CDC20 gene expression levels are increased in patients with dysmegakaryopoiesis (p=0.024), thrombocytopenia (p=0.000) and high-risk patients (p=0.014, 0.018.) MAD2 expression levels are decreased in patients with 2 or 3 cytopenias (p=0.000) and neutrophil below 800/mm3. TPX2 is also overexpressed in patients presenting dysmegakaryopoiesis (p=0.009). A decrease in AURKA and AURKB gene expression levels were observed in patients with altered karyotype (p=0.000), who presented dysplasia in 3 lineages (p=0.000; 0.017) (AURKA) and hemoglobin inferior to 8g/dL (p=0.024) (AURKB). Patients with decreased AURKA and AURKB showed low overall survival and increased levels of CDKN1A expression are associated with poorer overall survival (p=0.000). The mRNA expression of AURKA, AURKB and MAD2 (p=0.000; p=0.001; p=0.025) were decreased in patients with hypoplastic MDS, associated with a high frequency of chromosomal alterations and high mortality rate. In this investigation, we found significant clinical correlations regarding AURKA, AURKB, MAD2, CDC20, TPX2 e CDKN1A, reaffirming the importance of studying these genes in MDS patients, to provide a better comprehension of the syndrome pathogenesis and evolution. / A síndrome mielodisplásica (SMD) representa um grupo heterogêneo de doenças clonais caracterizado por insuficiência medular, aumento da apoptose e risco aumentado de evolução para Leucemia Mielóide Aguda (LMA). Proteínas relacionadas ao fuso mitótico (TPX2) e ao ponto de checagem mitótico (MAD2, CDC20) estão diretamente relacionadas com a estabilidade cromossômica e desenvolvimento de tumores. Sendo assim, este estudo tem como objetivo avaliar os níveis de expressão desses genes em pacientes portadores de síndrome mielodisplásica (SMD). A análise de expressão gênica foi realizada utilizando-se a metodologia de PCR em tempo real, a partir de amostras de medula óssea de 101 pacientes diagnosticados com SMD e 10 indivíduos controles sadios. Após a análise da expressão gênica, identificamos que os níveis de expressão do gene CDC20 encontram-se aumentados em pacientes com displasia megacariocítica (p=0,024), trombocitopenia (p=0,000) e em pacientes de alto risco (p=0,014, 0,018). TPX2 também se encontra com expressão diminuída em pacientes com displasia megacariocítico (p=0,009). Os níveis de expressão do MAD2 estão diminuídos em pacientes com 2 ou 3 citopenias (p=0,000) e contagem de neutrófilos inferior a 800/mm3. Foi observada uma diminuição na expressão dos genes AURKA e AURKB foram observados em pacientes que apresentavam cariótipo alterado (p=0,000), displasia em 3 linhagens (p=0,000; p=0,017) (AURKA) e hemoglobina inferior a 8g/dL (p=0,024) (AURKB). Os pacientes que apresentaram baixa expressão de AURKA e AURKB também apresentaram baixa sobrevida global e pacientes com aumento dos níveis de expressão de CDKN1A estão associados a uma pior sobrevida global (p=0,000). Os níveis de expressão da AURKA, AURKB e MAD2 (p=0,000; p=0,001; p=0,025) encontram-se diminuídos em pacientes com medula óssea hipocelular, associado a uma alta frequência de alterações cromossômicas e altas taxas de mortalidade. Neste estudo, observamos correlações clínicas significantes com relação aos genes AURKA, AURKB, MAD2, CDC20, TPX2 e CDKN1A, reafirmando a importância do estudo desses genes em pacientes com SMD, a fim de aprimorar os conhecimentos sobre a patogênese e evolução dessa síndrome.
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Análise ultraestrutural e molecular das cédulas de embriões de camarão de água doce expostas à radiação ultravioleta BQuadros, Thaline de January 2015 (has links)
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e do Desenvolvimento, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-10-06T04:08:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1
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Previous issue date: 2015 / O aumento da radiação ultravioleta (UVB) na superfície terrestre é resultado da diminuição do ozônio estratosférico. A energia desta radiação é capaz de causar diferentes respostas nos organismos terrestres e aquáticos. Macrobrachium olfersi é um camarão de água doce que vive e se reproduz em águas claras e rasas, onde a radiação UVB pode penetrar facilmente. As fêmeas de M. olfersi carregam seus ovos até a eclosão em uma câmara incubadora externa, podendo-se supor que os embriões estão expostos às condições semelhantes de radiação UVB do ambiente, durante todos os estágios embrionários. O objetivo deste estudo foi caracterizar os efeitos da radiação UVB sobre a ultraestrutura, viabilidade celular e dinâmica mitocondrial nas células embrionárias de M. olfersi. A irradiância de 310 mW/cm2 que os embriões estão expostos nos ambientes naturais foi simulada em laboratório. Embriões no 6° dia embrionário (E6), que corresponde às fases de morfogênese e organogênese iniciais, foram irradiados com lâmpada UVB 6W, durante 30 minutos. Após 1, 12, 24 e 48 horas de exposição, os embriões foram analisados. Embriões não irradiados foram usados como controle. A análise ultraestrutural mostrou mudanças no núcleo, como a condensação da heterocromatina próxima ao envelope nuclear, bem como mudanças citoplasmáticas, como a diminuição dos ribossomos associados ao retículo endoplasmático rugoso, formação anômala de membranas, perda das cristas mitocondriais. As alterações mitocondriais foram os efeitos da radiação UVB mais evidentes. Então, a expressão das proteínas Mfn-1 e Drp-1, relacionadas à fusão e fissão mitocondrial, respectivamente, foram quantificadas. Nossos resultados mostraram que a radiação UVB induziu aumento significativo de Drp-1 em todos os tempos analisados e também diminuição significativa de Mfn-1, apenas após 24 e 48 horas de exposição à UVB. Estes resultados indicam que a radiação UVB compromete a dinâmica mitocondrial em células de M. olfersi. Analisando as mudanças observadas nas mitocôndrias, o próximo passo foi investigar a viabilidade celular utilizando um teste baseado na integridade mitocondrial. Uma diminuição significativa da viabilidade celular, em todos os tempos analisados após a radiação de UVB, foi verificada. Em resumo, este estudo revelou diferentes efeitos induzidos pela radiação UVB em embriões de M. olfersi, principalmente relacionados com a estrutura e função mitocondrial.<br> / Abstract : Increased ultraviolet B (UVB) in the Earth's surface is a result of the depletion of stratospheric ozone. The energy of this radiation is able to cause different responses in terrestrial and aquatic organisms. Macrobrachium olfersi is a freshwater prawn that lives and reproduces in clear shallow waters, where UVB radiation can easily penetrate. The females of M. olfersi carry eggs until hatching in external brood pouch, thus is reasonable to assume that the embryos are exposed to similar conditions of environmental UVB radiation during all embryonic stages. The aim of this study was to characterize the effects of UVB radiation on the ultrastructure, cell viability and mitochondrial dynamic in embryonic cells of M. olfersi. Then, the irradiance of UVB (310 mW/cm2) that embryos received in natural environment was simulated in laboratory. Embryos at 6th embryonic day (E6), which corresponds to the early morphogenesis and organogenesis stages, were irradiated with UVB 6W lamp for 30 minutes. After 1, 12, 24 and 48 hours of exposure to UVB radiation, the embryos were examined. Non-irradiated embryos were used as controls. The ultrastructural analysis showed changes in nucleus, as heterochromatin condensation near to the nuclear envelope, as well as, changes in the cytoplasm, as decrease of ribosomes associated to rough endoplasmic reticulum, formation of anomalous membrane, loss of mitochondrial crests, and disruption of mitochondrial membranes. Mitochondrial alterations were the most evident effect of UVB. Thus, the expression of Mfn-1and Drp-1 proteins, related to mitochondrial fusion and fission, respectively, was quantified. Our results showed that UVB radiation induced a significant increase in Drp-1 in all times analyzed and also a significant decrease in Mfn-1, only after 24 and 48 hours of UVB exposure. These results indicate that UVB radiation compromise the mitochondrial dynamic on embryonic cells of M. olfersi. Regarding the changes observed in the mitochondria, the next step was to investigate the cell viability using an assay based on mitochondrial integrity. A significant decrease in viability of cells, in all times analyzed after UVB irradiation, was verified. In summary, this study revealed different effects induced by UVB radiation in embryos of M. olfersi, mainly related to the mitochondrial structure and function.
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Análise da segregação celular : modelos estatísticos e simulaçõesBeatrici, Carine Priscila January 2014 (has links)
O fenômeno de segregação celular ocorre tanto na estruturação inicial dos organismos (morfogênese) quanto durante a regeneração de tecidos danificados. O reordenamento celular ocorre através do agrupamento de células de um mesmo tipo. A evolução do tamanho destes agregados é objeto de experimentos e de simulações relatados na literatura há mais de vinte anos. Os resultados encontrados, no entanto, são controversos. Ao simular a segregação celular pode-se obter uma lei de potência ou uma dependência logarítmica para a evolução do tamanho desses agregados. Por outro lado, dentro de certos intervalos, os experimentos podem ser ajustados com leis de potência, mas os expoentes obtidos diferem dos sugeridos nas simulações, deixando obscura a compreensão do problema. Para entender a origem física deste fenômeno estendemos os modelos de simulações baseados em diferença de adesão para incluir as hipóteses: de diferença de velocidades, de reconhecimento celular e de motilidade de grupo. Verificamos que as proporções de células de cada tecido são determinantes na distribuição espacial final do agregado e mapeamos isto em um diagrama. Para estudar a evolução do crescimento de agregados utilizamos dois métodos: a aproximação de agregado médio e a abordagem através da equação de coagulação-fragmentação de Smoluchowski. Em ambas abordagens supomos que as células formam agregados com simetria esférica e que o mecanismo principal responsável pela segregação é a fusão binária de agregados. Usando o primeiro método obtivemos resultados analíticos que mostram os efeitos de tamanho finito tanto das células individuais quanto do tamanho do sistema sobre as leis de evolução temporal. Além disso, a partir do ajuste de dados experimentais, mostramos que os expoentes corretos das leis de potência só podem ser obtidos redefinindo-se a dependência da constante de difusão dos agregados com sua massa. Para levar em conta o efeito da flutuação de tamanho dos agregados, uma equação de Smoluchowski generalizada é proposta. A distribuição de tamanhos de agregados é obtida integrando-se esta equação e, após, esse resultado é comparado com experimentos e simulações. / The celular segregation happens both in the initial organism structuration (morphogenesis) and in tissue regeneration. Cell sorting happens by grouping of cells of the same kind. The size evolution of these cluters has been reported in experiments and simulations in the literature in the last twenty years. The results found are, nevertheless, controversial. When simulating cell segregation one may obtain a power law or a logaritmic dependency for their evolution. On the other hand, within a limited range, the experiments suggest a power law, however the exponents differ from those obtained by simulations, leaving the problem undefined. In order to understand the physical origin of this phenomenon we have extended the simulations models based on differential adhesion to include the hypotheses of diferential velocities, cell recognition and diferential group motilities. We have verified that different cell type proportions determine different final cell spatial distribution and mapped this in a diagram. In order to study the evolution of cluster growth we have used two methods: the mean cluster approach and the Smoluchowski coagulation-fragmetation equation approach. In both cases we suppose that the cells form spherical clusters and that the primary aggregating mechanism is through binary cluster fusion. Using the first method we obtain analytic results showing the effects produced by the finite size of the individual cells and of the finite syze of the system on the evolution laws. Besides, from the experimental data fitting, we have shown that the correct exponent for the power laws is obtained only if we redefine the difusion constant dependency with the cluster mass. In order to consider the cluster size fluctuation effect, a generalized Smoluchowski equation is proposed. The system cluster size distribution is obtained integrating this equation and, then, this result is compared with experiments and simulations.
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