Made available in DSpace on 2014-06-12T18:32:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo8116_1.pdf: 1962710 bytes, checksum: 5ebaf8e3e492aa93f271a69fd56dc604 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2007 / As úlceras corneanas são importante causa de morbidade ocular e cegueira prevenível. Vários estudos têm reportado a incidência de patógenos bacterianos e fúngicos isolados de úlceras corneanas. O objetivo deste estudo foi descrever o perfil microbiológico e os fatores predisponentes de úlcera corneana em pacientes atendidos na Fundação Altino Ventura, Recife-PE, no período de novembro de 2005 a novembro de 2006. Foram estudados 40 casos de úlcera corneana, sendo analisados em cada paciente: etiologia da infecção, padrão de resistência a antibióticos, características sociodemográficas e fatores predisponentes ao desenvolvimento da úlcera corneana. Vinte e cinco pacientes (62,5%) foram do sexo masculino e 15 (37,5%) do sexo feminino; a idade variou entre 10 e 79 anos (média 45,0 ± 16,7). As profissões mais encontradas foram: agricultor/trabalhador rural 11 (27,5%) e donas de casa 9 (22,5%). As culturas foram positivas em 28 (70,0%) pacientes. Foi isolado um agente etiológico em 22 culturas (78,6%) e em 6 (21,4%) houve crescimento misto (bactéria + fungo). Das culturas onde houve isolamento de um único agente, 18 (81,8%) foram de etiologia bacteriana e 4 (18,2%) de etiologia fúngica. Entre as bactérias isoladas 19 (79,2%) foram Gram positivas e 5 (20,8%) Gram negativas. A bactéria mais freqüentemente isolada foi o Staphylococcus coagulase-negativa 8 (33,5%). Staphylococcus aureus e Bacilus sp. foram isolados em 4 culturas (12,5% respectivamente). Entre as Gram negativas, a mais freqüente foi Pseudomonas aeruginosa em duas culturas (8,3%). Fungos foram isolados em 10 (35,7%) amostras, sendo o Aspergillus sp. o mais freqüente (30,0%). As bactérias em geral mostraram-se resistentes a oxacilina (50,0%), cefalotina (33,3%) e tobramicina (33,3%). Os principais fatores predisponentes identificados neste estudo foram: trauma ocular (25,6%), doença sistêmica (14.0%), doença ocular (11,6%) e cirurgia ocular realizada no mesmo olho (11,6%). Neste trabalho, houve um predomínio de úlceras de córnea de origem bacteriana em relação à de etiologia fúngica. Staphylococcus coagulase-negativa ocorreu na maioria das úlceras bacterianas e Aspergillus sp. foi o agente responsável pela maior parte da infecções fúngicas. Estes achados têm importantes implicações para o tratamento e prevenção de úlceras corneanas

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:41Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014 / Objetivos: analisar as caracteristicas epidemiologicas e microbiologicas da ceratite microbiana, em pacientes menores de 18 anos, num centro de referencia terciario em Oftalmologia. Metodos: estudo retrospectivo tipo coorte, utilizando fichas de 859 pacientes atendidos no Departamento de Oftalmologia e Ciências Visuais da Escola Paulista de Medicina - Universidade Federal de São Paulo, entre 15 de julho de 1975 e 31 de dezembro de 2010. Foram analisados 346 olhos de 346 pacientes, que tiveram resultados positivos no estudo microbiologico pela cultura de amostras colhidas da cornea. De cada paciente foram analisados dados como idade, sexo, olho envolvido, uso de medicacoes topicas, fatores predisponentes como comorbidades e antecedentes oculares, sinais clinicos e sintomas. Estas variaveis foram correlacionadas com os resultados dos cultivos positivos e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos. A incidencia anual de ceratite infecciosa tambem foi estudada. Resultados: em relacao a idade, houve maior acometimento de ceratite nos pacientes entre 13 e 18 anos (47,4%). Os antecedentes oculares mais frequentes foram conjuntivite (20%) e leucoma (19,6%). Entre os sinais clinicos analisados, infiltrado corneano (39%) e hipopio (10,6%) tiveram maior incidencia, enquanto que hiperemia (36,2%) e dor (24,1%) foram os sintomas mais relatados pelos pacientes. Resultados de cultivos positivos com o isolamento de bacterias Gram positivas (71,8%) foram os mais recorrentes e os principais microrganismos identificados Staphylococcus coagulase-negativa (23,8%) e Staphylococcus aureus (20,9%). Bacilos Gram negativos tambem ocorreram sendo a Pseudomonas spp (14,2%) o microrganismo mais isolado. Complexo Fusarium solani (64,3%) foi o fungo mais recorrente enquanto que o protozoario Acanthamoeba spp esteve presente em 6,6% das ceratites. De acordo com a regressao logistica aplicada, idade, uso de antimicrobiano e trauma por queimadura causada por agentes fisicos, foram fatores relacionados a ceratite nao bacteriana. Ja na analise comparativa entre ceratite causada por bacterias Gram positivas e Gram negativas, idade foi relacionada a ceratite por bacterias Gram negativas enquanto que a presenca de infiltrado corneano e secrecao conjuntival foram relacionadas a ceratite por bacterias Gram positivas. Conclusoes: a ceratite infecciosa em crianca pode ocorrer em qualquer idade; porem, quanto maior a idade do paciente, maior a probabilidade da ceratite ser de origem bacteriana por bacilos Gram negativos, fungica ou parasitaria por Acanthamoeba spp. O uso de antimicrobianos e trauma por queimadura com agentes fisicos, predispoem a ceratite nao bacteriana. O conhecimento dos fatores predisponentes e dos resultados laboratoriais levara a um tratamento mais especifico e com menos danos visuais em pacientes com ceratite na faixa etaria estudada / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Acanthamoeba spp. são patógenos protistas de vida livre, capazes de causar ceratite grave e encefalite granulomatosa fatal. Trofozoíto é a forma infectiva de Acanthamoeba spp. e pode provocar infecções em uma variedade de hospedeiros mamíferos e seres humanos, como resultado da complexa interação patógeno-hospedeiro. O dano causado por trofozoítos em infecções da córnea ou do cérebro é o resultado de vários mecanismos patogênicos diferentes não elucidados a nível molecular até agora. Neste trabalho, descrevemos os resultados da caracterização genotípica de isolados ambientais de Acanthamoeba spp. e a identificão por análises proteômicas do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Nossos resultados permitiram a caracterização de 13 isolados ambientais de Acanthamoeba spp. obtidos da água de piscinas, que foram classificados em nível de genótipo com base na análise da sequência do gene da subunidade menor do rDNA. Nove dos 13 isolados foram identificados como pertencentes ao genótipo T5, três ao genótipo T4 e um ao genótipo T3. Vários genótipos têm sido relatados em todo o mundo como agentes causadores de ceratite amebiana, incluindo os genótipos T3, T4 e T5. O presente estudo indica que o genótipo T5 é um contaminante comum na água de piscinas. Este trabalho também estabeleceu uma ampla análise do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de A. polyphaga, baseado no conjunto de estratégias por 2-DE MS/MS e LC-MS/MS. Foram identificadas 192 proteínas não redundantes. Um mapa proteômico de referência de A. polyphaga na faixa de pH 3-10 foi produzido e de 370 spots resolvidos, 136 proteínas foram identificadas. A classificação funcional das proteínas revelou diversas proteínas com relevância potencial para a sobrevivência do parasita e infecção de hospedeiros mamíferos, incluindo proteínas de superfície e proteínas relacionadas aos mecanismos de defesa. Este estudo descreveu a primeira análise proteômica abrangente do estágio de trofozoíto de Acanthamoeba spp. e fornece bases para estudos prospectivos, comparativos e funcionais de proteínas envolvidas nos mecanismos moleculares de sobrevivência, desenvolvimento e patogenicidade de Acanthamoeba spp. / Acanthamoeba spp. are free-living protist pathogen, capable of causing a blinding keratitis and fatal granulomatous encephalitis. Trophozoite is the form infective of Acanthamoeba spp. and can provoke infections in a variety of mammalian hosts and humans, as result of complex interaction host-pathogen. The damage caused by trophozoites in human corneal or brain infections is the result of several different pathogenic mechanisms not elucidated at the molecular level so far. Here, we describe the results of the characterization genotypic of environment isolates of Acanthamoeba spp. and we performed proteomic analysis to identify the repertoire of proteins expressed by trophozoites of an environmental strain of Acanthamoeba polyphaga. Our results allowed the characterization of 13 Acanthamoeba isolates from swimming pools water that were classified at the genotype level based on the sequence analysis of the small-subunit rDNA gene. Nine of the 13 isolates were genotype T5, three were genotype T4, and one was T3. Several genotypes have been reported worldwide as causative agents of keratitis, including genotypes T3, T4, and T5. The present study indicates that genotype T5 is a common contaminant in swimming-pool water. This work also established a comprehensive analysis of the proteins expressed by A. polyphaga trophozoites based on complementary 2-DE MS/MS and gel-free LC-MS/MS approaches. Overall, 192 nonredundant proteins were identified. An A. polyphaga proteomic map in pH range 3-10 was produced, with protein identification for 136 out of 370 resolved spots. Functional classification of identified proteins revealed several proteins with potential relevance for parasite survival and infection of mammal hosts, including surface proteins and proteins related to defense mechanisms. This study describes the first comprehensive proteomic survey of the trophozoite infective stage of an Acanthamoeba species, and provides foundations to prospective, comparative and functional studies of Acanthamoeba proteins involved in molecular mechanisms of survival, development, and pathogenicity.

Protozoários do gênero Acanthamoeba estão presentes nos mais variados ambientes, sendo esta a ameba mais isolada entre as amebas de vida livre (AVL). Acanthamoeba spp. pode causar encefalomielite e outras doenças graves em animais e seres humanos. Os fatores que contribuem para infecções por Acanthamoeba incluem biologia parasitária, diversidade genética, propagação no meio ambiente e suscetibilidade do hospedeiro. Acanthamoeba pode hospedar diversos microrganismos como: algas, bactérias, fungos, protozoários e vírus. Os estudos sobre as interações entre Acanthamoeba e microrganismos tem aumentado nos últimos anos, principalmente para entender como certas bactérias resistem à fagocitose de seus hospedeiros. Existem poucos estudos sobre adesão e a interação in vitro de Acanthamoeba com macrófagos, que são a primeira linha de defesa em doenças infecciosas. Neste trabalho foi proposto o isolamento de AVL do gênero Acanthamoeba de amostras clínicas de cães. Os resultados deste trabalho foram: 14 isolados de Acanthamoeba confirmados pela PCR, sendo o alvo o gene do 18S rDNA, de mucosa nasal e lesões cutâneas de 96 amostras coletadas de 48 cães. Destes, 13 isolados de Acanthamoeba foram sequenciados, o genótipo foi determinado e o potencial de patogenicidade em células VERO de 8 isolados foi avaliado. Os isolados eram pertencentes aos genótipos T3 (3 amostras), T4 (5 amostras), T5 (4 amostras) e T16 (1 amostra). Os 14 isolados de Acanthamoeba continham pelo menos uma espécie bacteriana internalizada e um isolado continha todas as espécies de endossimbiontes pesquisados. Observou-se que 79% dos isolados de Acanthamoeba hospedavam Legionella pneumophila, 50% Mycobacterium, 79% Pseudomonas e 57% Enterobacteriaceae. Os isolados de Acanthamoeba foram co-cultivados com macrófagos e observou-se à aderência em apenas 1h de contato, confirmando que Acanthamoeba é contato dependente. Este estudo descreveu os primeiros isolados de Acanthamoeba de amostras clínicas provenientes de cães. Também foi o primeiro relato da presença de endossimbiontes neste tipo de isolado realizado na América Latina. Neste estudo foi isolado pela primeira vez o genótipo T16 de amostra clínica. A importância deste estudo está no fato de verificar a presença de Acanthamoeba potencialmente patogênica em amostras clínicas de animais e pesquisar bactérias patogênicas internalizadas nestas amebas. Podendo estes microrganismos estar envolvidos em doenças infecciosas e futuras complicações como doenças graves em mamíferos. / Protozoa of the genus Acanthamoeba are present in diverse environments and are the most common free-living amoeba (FLA). Acanthamoeba spp. cause encephalitis and can cause severe illness in animals and humans. The factors that contribute to infections include Acanthamoeba parasite biology, genetic diversity, spreading in the environment and host susceptibility. Acanthamoeba may host various microorganisms such as algae, bacteria, fungi, protozoa and viruses. Studies regarding the interactions between Acanthamoeba and microorganisms have increased in recent years, mainly to understand how certain bacteria resist phagocytosis by their hosts. There are few studies on adherence and in vitro interaction of Acanthamoeba with macrophages, which are the first line of defense in infectious diseases. In this study, we proposed the isolation of the FLA Acanthamoeba from clinical samples from dogs. We found 14 Acanthamoeba isolates confirmed by PCR and by the 18S gene target rDNA in nasal mucosa and skin lesions out of 96 samples collected from 48 dogs. From this 14 isolates, 13 Acanthamoeba isolates were sequenced and the genotype was determined. Regarding the potential for pathogenicity in VERO cells, 8 isolates was assessed. The isolates belonged to genotype 3 (3 samples), T4 (5 samples), T5 (4 samples) and T16 (1 sample). The 14 isolates of Acanthamoeba contained at least one bacterial species internalized and one isolate contained all endosymbionts species studied. It was observed that 79% of isolates of Acanthamoeba carryng Legionella pneumophila, Mycobacterium 50%, 79% Pseudomonas and 57% Enterobacteriaceae. Acanthamoeba isolates were co-cultured with murine macrophages and adherence was observed in 1h of contact, confirming that Acanthamoeba interact with defense cells in a contact-dependent manner. This study describes the first clinical isolates of Acanthamoeba samples from dogs. It was also the first report of the presence of this type of endosymbionts isolated held in Latin America. As far as we know, this is the first study to isolate a T16 genotype amoeba from clinical sample. The importance of this study lies on the fact verify the presence of potentially pathogenic Acanthamoeba in samples from animals and search pathogenic bacteria internalized by these amoebae. These microorganisms may be involved in infectious diseases in mammals.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:46:08Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os objetivos deste estudo sao: 1) Estudar e comparar a diversidade filogenetica de cepas de Fusarium spp isoladas de casos de ceratites infecciosas no Sul da Florida u Estados Unidos da America (EUA) por meio de identificacao por genotipagem e metodos microbiologicos de analise fenotipica; 2) Analisar as especies de Fusarium isoladas de ceratites no Sul da Florida u EUA identificadas por genotipagem, seus perfis de susceptibilidade in vitro a antifungicos, bem como os dados clinicos dos pacientes; 3) Estudar e comparar a diversidade filogenetica de cepas de Fusarium spp isoladas de casos de ceratites infecciosas no Brasil, identificadas por genotipagem e metodos microbiologicos de analise fenotipica, os resultados dos testes de susceptibilidade in vitro a antifungicos e os dados clinicos dos pacientes; 4) Comparacao dos dados de identificacao de cepas de Fusarium spp de portadores de ceratites infecciosas nos EUA e no Brasil, avaliando tambem a susceptibilidade a antifungicos e os dados clinicos dos pacientes estudados. Para a identificacao das cepas provenientes de casos de ceratite por Fusarium spp nos EUA e no Brasil, utilizou-se a analise de sequencia de DNA da regiao Internal Transcribed Spacer (ITS), assim como a classificacao morfologica pela microbiologia tradicional, com o estudo macro e microscopico das cepas. Testes por microdiluicao em caldo foram efetuados para obter-se os perfis de susceptibilidade in vitro das cepas estudadas aos antifungicos natamicina, anfotericina B e voriconazol. Os prontuarios dos respectivos pacientes foram analisados e suas caracteristicas clinicas comparadas aos dados de genotipagem e testes de susceptibilidade a antifungicos. Nos EUA 58 isolados de ceratites foram classificados por genotipagem em: Fusarium solani (75%), F. oxysporum (16%), F. incarnatum-equiseti (5%), F. dimerum (2%) e um Fusarium spp (2%) que nao foi classificado dentro de nenhum complexo de especies. Isolados de F. solani tiveram valores de MIC90 de voriconazol significativamente mais elevados do que os F. nao-solani (16 e 4ug/ml, respectivamente). Os pacientes com isolados de F. solani tambem exibiram um tempo para cura mais longo (65 vs 40 dias), uma pior acuidade visual final media (20/118 vs 20/36), e um maior necessidade de ceratoplastia terapeutica (7 vs 0 cirurgias), quando comparados aos que tiveram infeccoes causadas por F. nao-solani. O uso de lentes de contato foi o fator de risco mais frequente entre os pacientes deste estudo (66%). No Brasil os 41 isolados de ceratites foram classificados genotipicamente em: F. solani (88%), F. oxysporum (5%), F. dimerum (2%) e dois Fusarium spp (5%) que nao foram classificados dentro de nenhum complexo de especies. O atraso para o inicio do tratamento foi de 19 dias em media, e o tempo para a cura foi em media 107 dias. A acuidade visual final dos pacientes variou de 20/20 a percepcao de luz e foi em media 20/800 (LogMAR 1,6). A historia de trauma foi o fator de risco mais frequente, estando presente em 20 pacientes (50%). Ceratoplastia terapeutica foi necessaria em 22 pacientes (54%). A anfotericina B teve os menores valores de MIC90 (2ug/ml) tanto no Brasil como nos EUA. Voriconazol teve os maiores valores (16ug/ml) em ambos paises. Os isolados foram um pouco mais resistentes a natamicina no Brasil (8 vs 4 ug/ml nos EUA), e neste pais tambem houve uma associacao entre cepas com maior MIC para natamicina e maior necessidade de ceratoplastia terapeutica. Pela comparacao dos resultados de identificacao, susceptibilidade a antifungicos e dados clinicos, obtidos de casos de ceratites por Fusarium spp nos EUA e no Brasil, e possivel concluir-se que: as acuidades visuais inicial e final foram piores no Brasil; um maior numero de homens e trauma estavam presentes no estudo brasileiro ao inves de mulheres e uso de lentes de contato (LC) nos EUA; um maior numero de ceratoplastias terapeuticas foram necessarias no Brasil; e um maior tempo para o diagnostico e para a cura foram encontrados no Brasil / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Acanthamoeba spp. são patógenos protistas de vida livre, capazes de causar ceratite grave e encefalite granulomatosa fatal. Trofozoíto é a forma infectiva de Acanthamoeba spp. e pode provocar infecções em uma variedade de hospedeiros mamíferos e seres humanos, como resultado da complexa interação patógeno-hospedeiro. O dano causado por trofozoítos em infecções da córnea ou do cérebro é o resultado de vários mecanismos patogênicos diferentes não elucidados a nível molecular até agora. Neste trabalho, descrevemos os resultados da caracterização genotípica de isolados ambientais de Acanthamoeba spp. e a identificão por análises proteômicas do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Nossos resultados permitiram a caracterização de 13 isolados ambientais de Acanthamoeba spp. obtidos da água de piscinas, que foram classificados em nível de genótipo com base na análise da sequência do gene da subunidade menor do rDNA. Nove dos 13 isolados foram identificados como pertencentes ao genótipo T5, três ao genótipo T4 e um ao genótipo T3. Vários genótipos têm sido relatados em todo o mundo como agentes causadores de ceratite amebiana, incluindo os genótipos T3, T4 e T5. O presente estudo indica que o genótipo T5 é um contaminante comum na água de piscinas. Este trabalho também estabeleceu uma ampla análise do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de A. polyphaga, baseado no conjunto de estratégias por 2-DE MS/MS e LC-MS/MS. Foram identificadas 192 proteínas não redundantes. Um mapa proteômico de referência de A. polyphaga na faixa de pH 3-10 foi produzido e de 370 spots resolvidos, 136 proteínas foram identificadas. A classificação funcional das proteínas revelou diversas proteínas com relevância potencial para a sobrevivência do parasita e infecção de hospedeiros mamíferos, incluindo proteínas de superfície e proteínas relacionadas aos mecanismos de defesa. Este estudo descreveu a primeira análise proteômica abrangente do estágio de trofozoíto de Acanthamoeba spp. e fornece bases para estudos prospectivos, comparativos e funcionais de proteínas envolvidas nos mecanismos moleculares de sobrevivência, desenvolvimento e patogenicidade de Acanthamoeba spp. / Acanthamoeba spp. are free-living protist pathogen, capable of causing a blinding keratitis and fatal granulomatous encephalitis. Trophozoite is the form infective of Acanthamoeba spp. and can provoke infections in a variety of mammalian hosts and humans, as result of complex interaction host-pathogen. The damage caused by trophozoites in human corneal or brain infections is the result of several different pathogenic mechanisms not elucidated at the molecular level so far. Here, we describe the results of the characterization genotypic of environment isolates of Acanthamoeba spp. and we performed proteomic analysis to identify the repertoire of proteins expressed by trophozoites of an environmental strain of Acanthamoeba polyphaga. Our results allowed the characterization of 13 Acanthamoeba isolates from swimming pools water that were classified at the genotype level based on the sequence analysis of the small-subunit rDNA gene. Nine of the 13 isolates were genotype T5, three were genotype T4, and one was T3. Several genotypes have been reported worldwide as causative agents of keratitis, including genotypes T3, T4, and T5. The present study indicates that genotype T5 is a common contaminant in swimming-pool water. This work also established a comprehensive analysis of the proteins expressed by A. polyphaga trophozoites based on complementary 2-DE MS/MS and gel-free LC-MS/MS approaches. Overall, 192 nonredundant proteins were identified. An A. polyphaga proteomic map in pH range 3-10 was produced, with protein identification for 136 out of 370 resolved spots. Functional classification of identified proteins revealed several proteins with potential relevance for parasite survival and infection of mammal hosts, including surface proteins and proteins related to defense mechanisms. This study describes the first comprehensive proteomic survey of the trophozoite infective stage of an Acanthamoeba species, and provides foundations to prospective, comparative and functional studies of Acanthamoeba proteins involved in molecular mechanisms of survival, development, and pathogenicity.

Orientador : Prof. Dr. Felipe F. Bondan Tuon / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 09/12/2016 / Inclui referências : f. 46-50;63-65 / Resumo: A ceratite infecciosa e uma causa importante de morbidade ocular e de prejuízo da visão. O diagnostico microbiológico precoce e o tratamento imediato podem evitar um prognostico visual ruim. Os objetivos desse estudo foram: determinar a taxa de positividade das culturas em pacientes com ceratite infecciosa, investigar os fatores associados a culturas positivas, estabelecer as principais etiologias de ceratite em nosso meio e avaliar o grau de concordância entre a cultura e a PCR (reação em cadeia da polimerase) na pesquisa de Acanthamoeba. Pacientes com suspeita de ceratite infecciosa atendidos no serviço de emergência de dois hospitais em Curitiba/PR/Brasil, entre junho de 2014 e abril de 2016 foram selecionados para inclusão no estudo. Os pacientes que preencheram os critérios de inclusão foram submetidos a exame oftalmológico e raspado de córnea para exames laboratoriais. Dados demográficos, historia atual da doença, tratamentos em curso e historia pregressa de comorbidades oculares foram coletados. Setenta e cinco pacientes preencheram os critérios de inclusão. As culturas foram positivas em 41% (31/75) dos exames. Os agentes causadores mais encontrados foram as bactérias (54%;17/31), seguida por fungos (32%;10/31) e Acanthamoeba sp. (16%,5/31)). Os fatores associados com culturas positivas foram o uso de corticoide antes da coleta (p=0,006) e ulceras maiores que 3.62mm2 (p=0,016). Pacientes em uso de antibiótico antes da coleta tiveram maior chance de um resultado de cultura negativo [OR: 3,65 (IC95%: 1,32 - 10,07)]. Em 26 casos foi possível comparar a concordância entre os testes de cultura e PCR na pesquisa de Acanthamoeba. Houve concordância entre os testes em 96% dos casos. A taxa de positividade das culturas de raspado de córnea encontrada foi de 41%. Os agentes infecciosos mais prevalentes foram as bactérias. O tratamento com antibiótico antes da coleta diminuiu a chance de uma cultura positiva, o uso de colírio de corticoide e o tamanho da ulcera maior que 3.62mm2 estão associados a maior probabilidade de uma cultura positiva. Houve uma alta concordância entre os testes de cultura e PCR na pesquisa de Acanthamoeba. Palavras-chave: Ceratite. Ulcera da córnea. Cultura. Antibióticos. Corticosteroides. / Abstract: Infectious keratitis is an important cause of ocular morbidity and visual impairment. Prompt microbiological diagnosis and treatment can avoid a bad outcome. The purposes of this study were: to determine the rate of positive cultures in patients with infectious keratitis, investigate the factors associated with culture positivity, identify the main microorganisms responsible for keratitis in our hospitals and determine the rate of agreement between culture and polymerase chain reaction (PCR) in the identification of Acanthamoeba. Patients with suspected infectious keratitis presenting to the emergency service of two hospitals in Curitiba, PR, Brazil, between June 2014 and April 2016, were recruited for the study. Patients who met the inclusion criteria were submitted to eye examination and corneal scraping for laboratorial tests. Demographic data, current medical history, current treatments and history of ocular comorbidities were obtained. Seventy-five patients fulfilled the inclusion criteria. The culture positivity rate was 41.3% (31/75). The most frequent microorganisms identified were bacteria (54%,17/31), followed by fungi (32%,10/31), and Acanthamoeba sp. (16%,5/31). Two factors were significantly associated with positive cultures: previous treatment with corticosteroid drops (p=0.006) and ulcer size larger than 3.62 mm2 (p=0.016). Patients on topical antibiotics before corneal scraping were more likely to be culture negative [OR: 3.65 (IC95%: 1.32 - 10.07)]. In twenty-six cases the comparison between culture test and PCR test for Acanthamoeba sp. identification was realized. There was agreement between tests in 96% of the cases. The culture positivity rate of corneal scraping was 41.3%. The most frequent microorganisms identified were bacteria. Antibiotic treatment before corneal scraping decreases the probability of a positive culture, corticosteroids treatment and ulcer size larger than 3.62 mm2, are associated with positive cultures. There was a great agreement between the culture test and PCR test in the identification of Acanthamoeba sp. Keywords: Keratitis. Corneal ulcer. Cultures. Antibiotics. Corticoids.

Orientadora : Profª Drª Larissa M. Alvarenga / Coorientadoras : Profª Drª Adriana Oliveira Costa e Profª Drª Juliana F. de Moura / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciencias Biológicas (Microbiologia, Parasitologia e Patologia Básica). Defesa: Curitiba, 20/03/2012 / Inclui referências : f. 56-68 / Área de concentração: Patologia / Resumo: As amebas de vida livre do gênero Acanthamoeba encontram-se amplamente distribuídas na natureza e são consideradas organismos potencialmente patogênicos. Ocasionalmente podem desencadear infecções humanas, como a encefalite amebiana granulomatosa e a ceratite amebiana. A investigação de características diferenciais entre as linhagens patogênicas e aquelas não associadas à infecção pode auxiliar a determinar fatores relacionados à patogenicidade e desenvolvimento de testes de diagnóstico. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi avaliar comparativamente, por meio de critérios fisiológicos, morfológicos e imunoquímicos, amostras clínicas e ambientais de Acanthamoeba. Trofozoítos de quatro isolados foram utilizados: uma amostra clínica, obtida de caso de ceratite amebiana, outra amostra ambiental, obtida da poeira da residência do mesmo paciente, e outras duas amostras de referência A. poliphaga #2, de ceratite amebiana (ATCC 30641) e A. poliphaga #4, de água de um lago (ATCC 30782). Os quatro isolados foram cultivados axenicamente em meio PYG (proteose-peptona, extrato de levedo e glicose) usados para análise por microscopia eletrônica de varredura e submetidos individualmente à lise em ultra-som para obtenção de extrato protéico bruto. Os extratos foram utilizados para determinação do perfil protéico por eletroforese e na imunização de camundongos para produção anticorpos policlonais e monoclonais. Os anticorpos produzidos foram caracterizados por ELISA, Western Blotting e imunofluorescência. A análise do perfil protéico apresentou distinções quanto à presença e expressão de algumas proteínas entre os isolados. Os resultados obtidos com os anticorpos policlonais sugerem a presença de proteínas específicas para cada uma das amostras estudadas, além de um perfil imunoquímico com anticorpos co-reativos para componentes conservados. Dez clones de anticorpos monoclonais foram obtidos, dos quais o mAb3 reconhece proteínas de três das quatro amostras estudadas. O conhecimento adquirido com a realização desse trabalho poderá ser empregado na padronização de novos critérios para identificação e caracterização de linhagens desse gênero. Além disso, permitirá que proteínas previamente caracterizadas imunoquimicamente possam ser utilizadas como marcadores de patogenicidade. Palavras - chaves: Acanthamoeba, ceratite amebiana, perfil protéico, anticorpos policlonais e monoclonais, patogenicidade. / Abstract: The free-living amoebae of the genus Acanthamoeba are widely distributed in nature and are considered potentially pathogenic organisms. Occasionally they can trigger human infections such as granulomatous amoebic encephalitis and amoebic keratitis. The investigation of differentiating characteristics between pathogenic strains and those not associated with infection may help to determine factors related to pathogenicity and the development of diagnostic tests. In this sense, the aim of this study was to perform a comparative evaluation; by means of physiological, morphological and immunochemical criteria; between clinical and environmental samples of Acanthamoeba. Trophozoites of four isolates were used: a clinical sample, obtained from a confirmed case of amoebic keratitis; an environmental sample, obtained from the dust of the residence of the same patient; and two reference samples A. poliphaga #2, obtained from an amoebic keratitis (ATCC 30641) and A. poliphaga #4, obtained from the water of a lake (ATCC 30782). The four isolates were axenically grown in PYG (proteose-peptone, yeast extract and glucose), used for analysis by scanning electron microscopy and individually submitted to lysis by ultrasound to obtain a crude protein extract. The extracts were used to determine the protein profile by electrophoresis and were used for the immunization of mice to produce polyclonal and monoclonal antibodies. The antibodies produced were characterized by ELISA, Western Blotting and Immunofluorescence. The analysis of the protein profile presented distinctions about the presence and expression of some proteins among the isolates. The results obtained with polyclonal antibodies suggest the presence of specific proteins for each of the studied samples, besides an immunochemical profile with co-reactive antibodies to conserved components. Ten clones of monoclonal antibodies were obtained, from which mAb3 recognizes three of the four samples studied. The knowledge acquired from the development of this work may be employed at the standardization of new criteria for identification and characterization of strains from this genus. Furthermore, it can enable that previously immunochemically characterized proteins could be used as markers for pathogenicity. Keywords: Acanthamoeba, amebic keratitis, protein profile, polyclonal and monoclonal antibodies, pathogenicity.

Protozoários do gênero Acanthamoeba estão presentes nos mais variados ambientes, sendo esta a ameba mais isolada entre as amebas de vida livre (AVL). Acanthamoeba spp. pode causar encefalomielite e outras doenças graves em animais e seres humanos. Os fatores que contribuem para infecções por Acanthamoeba incluem biologia parasitária, diversidade genética, propagação no meio ambiente e suscetibilidade do hospedeiro. Acanthamoeba pode hospedar diversos microrganismos como: algas, bactérias, fungos, protozoários e vírus. Os estudos sobre as interações entre Acanthamoeba e microrganismos tem aumentado nos últimos anos, principalmente para entender como certas bactérias resistem à fagocitose de seus hospedeiros. Existem poucos estudos sobre adesão e a interação in vitro de Acanthamoeba com macrófagos, que são a primeira linha de defesa em doenças infecciosas. Neste trabalho foi proposto o isolamento de AVL do gênero Acanthamoeba de amostras clínicas de cães. Os resultados deste trabalho foram: 14 isolados de Acanthamoeba confirmados pela PCR, sendo o alvo o gene do 18S rDNA, de mucosa nasal e lesões cutâneas de 96 amostras coletadas de 48 cães. Destes, 13 isolados de Acanthamoeba foram sequenciados, o genótipo foi determinado e o potencial de patogenicidade em células VERO de 8 isolados foi avaliado. Os isolados eram pertencentes aos genótipos T3 (3 amostras), T4 (5 amostras), T5 (4 amostras) e T16 (1 amostra). Os 14 isolados de Acanthamoeba continham pelo menos uma espécie bacteriana internalizada e um isolado continha todas as espécies de endossimbiontes pesquisados. Observou-se que 79% dos isolados de Acanthamoeba hospedavam Legionella pneumophila, 50% Mycobacterium, 79% Pseudomonas e 57% Enterobacteriaceae. Os isolados de Acanthamoeba foram co-cultivados com macrófagos e observou-se à aderência em apenas 1h de contato, confirmando que Acanthamoeba é contato dependente. Este estudo descreveu os primeiros isolados de Acanthamoeba de amostras clínicas provenientes de cães. Também foi o primeiro relato da presença de endossimbiontes neste tipo de isolado realizado na América Latina. Neste estudo foi isolado pela primeira vez o genótipo T16 de amostra clínica. A importância deste estudo está no fato de verificar a presença de Acanthamoeba potencialmente patogênica em amostras clínicas de animais e pesquisar bactérias patogênicas internalizadas nestas amebas. Podendo estes microrganismos estar envolvidos em doenças infecciosas e futuras complicações como doenças graves em mamíferos. / Protozoa of the genus Acanthamoeba are present in diverse environments and are the most common free-living amoeba (FLA). Acanthamoeba spp. cause encephalitis and can cause severe illness in animals and humans. The factors that contribute to infections include Acanthamoeba parasite biology, genetic diversity, spreading in the environment and host susceptibility. Acanthamoeba may host various microorganisms such as algae, bacteria, fungi, protozoa and viruses. Studies regarding the interactions between Acanthamoeba and microorganisms have increased in recent years, mainly to understand how certain bacteria resist phagocytosis by their hosts. There are few studies on adherence and in vitro interaction of Acanthamoeba with macrophages, which are the first line of defense in infectious diseases. In this study, we proposed the isolation of the FLA Acanthamoeba from clinical samples from dogs. We found 14 Acanthamoeba isolates confirmed by PCR and by the 18S gene target rDNA in nasal mucosa and skin lesions out of 96 samples collected from 48 dogs. From this 14 isolates, 13 Acanthamoeba isolates were sequenced and the genotype was determined. Regarding the potential for pathogenicity in VERO cells, 8 isolates was assessed. The isolates belonged to genotype 3 (3 samples), T4 (5 samples), T5 (4 samples) and T16 (1 sample). The 14 isolates of Acanthamoeba contained at least one bacterial species internalized and one isolate contained all endosymbionts species studied. It was observed that 79% of isolates of Acanthamoeba carryng Legionella pneumophila, Mycobacterium 50%, 79% Pseudomonas and 57% Enterobacteriaceae. Acanthamoeba isolates were co-cultured with murine macrophages and adherence was observed in 1h of contact, confirming that Acanthamoeba interact with defense cells in a contact-dependent manner. This study describes the first clinical isolates of Acanthamoeba samples from dogs. It was also the first report of the presence of this type of endosymbionts isolated held in Latin America. As far as we know, this is the first study to isolate a T16 genotype amoeba from clinical sample. The importance of this study lies on the fact verify the presence of potentially pathogenic Acanthamoeba in samples from animals and search pathogenic bacteria internalized by these amoebae. These microorganisms may be involved in infectious diseases in mammals.

Acanthamoeba spp. são patógenos protistas de vida livre, capazes de causar ceratite grave e encefalite granulomatosa fatal. Trofozoíto é a forma infectiva de Acanthamoeba spp. e pode provocar infecções em uma variedade de hospedeiros mamíferos e seres humanos, como resultado da complexa interação patógeno-hospedeiro. O dano causado por trofozoítos em infecções da córnea ou do cérebro é o resultado de vários mecanismos patogênicos diferentes não elucidados a nível molecular até agora. Neste trabalho, descrevemos os resultados da caracterização genotípica de isolados ambientais de Acanthamoeba spp. e a identificão por análises proteômicas do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de Acanthamoeba polyphaga. Nossos resultados permitiram a caracterização de 13 isolados ambientais de Acanthamoeba spp. obtidos da água de piscinas, que foram classificados em nível de genótipo com base na análise da sequência do gene da subunidade menor do rDNA. Nove dos 13 isolados foram identificados como pertencentes ao genótipo T5, três ao genótipo T4 e um ao genótipo T3. Vários genótipos têm sido relatados em todo o mundo como agentes causadores de ceratite amebiana, incluindo os genótipos T3, T4 e T5. O presente estudo indica que o genótipo T5 é um contaminante comum na água de piscinas. Este trabalho também estabeleceu uma ampla análise do repertório de proteínas expressas por trofozoítos de A. polyphaga, baseado no conjunto de estratégias por 2-DE MS/MS e LC-MS/MS. Foram identificadas 192 proteínas não redundantes. Um mapa proteômico de referência de A. polyphaga na faixa de pH 3-10 foi produzido e de 370 spots resolvidos, 136 proteínas foram identificadas. A classificação funcional das proteínas revelou diversas proteínas com relevância potencial para a sobrevivência do parasita e infecção de hospedeiros mamíferos, incluindo proteínas de superfície e proteínas relacionadas aos mecanismos de defesa. Este estudo descreveu a primeira análise proteômica abrangente do estágio de trofozoíto de Acanthamoeba spp. e fornece bases para estudos prospectivos, comparativos e funcionais de proteínas envolvidas nos mecanismos moleculares de sobrevivência, desenvolvimento e patogenicidade de Acanthamoeba spp. / Acanthamoeba spp. are free-living protist pathogen, capable of causing a blinding keratitis and fatal granulomatous encephalitis. Trophozoite is the form infective of Acanthamoeba spp. and can provoke infections in a variety of mammalian hosts and humans, as result of complex interaction host-pathogen. The damage caused by trophozoites in human corneal or brain infections is the result of several different pathogenic mechanisms not elucidated at the molecular level so far. Here, we describe the results of the characterization genotypic of environment isolates of Acanthamoeba spp. and we performed proteomic analysis to identify the repertoire of proteins expressed by trophozoites of an environmental strain of Acanthamoeba polyphaga. Our results allowed the characterization of 13 Acanthamoeba isolates from swimming pools water that were classified at the genotype level based on the sequence analysis of the small-subunit rDNA gene. Nine of the 13 isolates were genotype T5, three were genotype T4, and one was T3. Several genotypes have been reported worldwide as causative agents of keratitis, including genotypes T3, T4, and T5. The present study indicates that genotype T5 is a common contaminant in swimming-pool water. This work also established a comprehensive analysis of the proteins expressed by A. polyphaga trophozoites based on complementary 2-DE MS/MS and gel-free LC-MS/MS approaches. Overall, 192 nonredundant proteins were identified. An A. polyphaga proteomic map in pH range 3-10 was produced, with protein identification for 136 out of 370 resolved spots. Functional classification of identified proteins revealed several proteins with potential relevance for parasite survival and infection of mammal hosts, including surface proteins and proteins related to defense mechanisms. This study describes the first comprehensive proteomic survey of the trophozoite infective stage of an Acanthamoeba species, and provides foundations to prospective, comparative and functional studies of Acanthamoeba proteins involved in molecular mechanisms of survival, development, and pathogenicity.