Estudios previos de nuestro grupo demostraron que la hipertensión portal causa una importante inhibición de RNA mensajeros y proteínas implicadas en neurotransmisión adrenérgica, acompañada de una marcada atrofia simpática de los nervios que rodean la vasculatura mesentérica. Esta atrofia simpática local podría estar contribuyendo a la vasodilatación arterial esplácnica de la hipertensión portal. La hipótesis que se estableció a partir de los resultados obtenidos asumía que durante la hipertensión portal, los cambios de presión detectados en la vasculatura esplácnica podrían promover una señal a través de la vía sensitiva aferente hasta los núcleos de regulación cardiovascular del tronco cerebral, donde se desencadenaría una respuesta eferente responsable de provocar la atrofia simpática. Los resultados de la primera parte del trabajo confirman esta hipótesis y apoyan el papel de la atrofia simpática en la vasodilatación arterial esplácnica de la hipertensión portal, demostrando que mediante el bloqueo de la señal aferente con la neurotoxina capsaicina, de ratas con ligadura de la vena porta (PVL), se consigue evitar la atrofia simpática y las alteraciones hemodinámicas simultáneamente. Además, en ratas PVL, en el ganglio mesentérico superior (SMG) que contiene los somas de las neuronas adrenérgicas que inervan el mesenterio, se demostró un aumento en la expresión de neuromoduladores tales como el factor de crecimiento neuronal NGF y su precusor proNGF y la molécula quimiorepelente Semaforina 3A (Sema3A). Sema3A se localizó en el espacio interneuronal, alrededor de las neuronas adrenérgicas colocalizando con fibras positivas a VAChT. Este aumento en la expresión de moduladores neuronales también se evitó en ratas PVL tratadas con capsaicina. En la segunda parte del trabajo, con el objetivo de confirmar la vía neuronal en la hipertensión portal, se estudiaron dos estructuras intermediarias: el ganglio nodoso donde se confirmó un aumento de la señal aferente sensitiva, vía el nervio vago en animales con hipertensión portal y las neuronas simpáticas colinérgicas preganglionares del núcleo intermediolateral de la médula espinal donde se observó presencia de Sema3A, sugiriendo el origen del aumento de la expresión de Sema3A del SMG en las neuronas colinérgicas preganglionares. Por otro lado, se profundizó en el estudio de alteraciones en la expresión de neuromoduladores implicados en las vías de crecimiento/regresión axonal y supervivencia/muerte neuronal en el SMG de ratas PVL. La expresión de la forma activa del receptor de NGF, la tirosina quinasa A (TrkA), que conduce a la activación de las vías de supervivencia y crecimiento neuronal, se reveló disminuida en ratas PVL comparando con sham. Sin embargo, las vías de apoptosis y de retracción axonal se encontraron estimuladas en ratas PVL, exhibiendo una sobreexpresión significativa de Sema3A y de su receptor Neuropilina1, junto con un aumento en la expresión del receptor de proNGF, el receptor de neurotrofinas p75, la caspasa7 activa, la poli(ADP-ribosa) polimerasa inactiva y Rho kinasa. Finalmente, se probó la administración de un agonista de TrkA, la amida gambógica, en ratas PVL con el fin de estimular la vía de crecimiento y proliferación en detrimento de la vía apoptótica. Los resultados mostraron una mejora de las alteraciones hemodinámicas y de la atrofia simpática, a través de la activación de las vías de supervivencia y la inhibición de la cascada apoptótica y regresión axonal mediada por Rho kinasa. En conclusión, estos resultados indican que la alteración adrenérgica y la atrofia simpática en la vasculatura mesentérica durante la hipertensión portal tiene su origen en alteraciones de la neuromodulación que conducen a regresión simpática post-ganglionar y a apoptosis que contribuyen a la vasodilatación esplácnica. / We have previously demonstrated that portal hypertension causes an important inhibition of messenger RNA and proteins implicated in adrenergic neurotransmission and a marked atrophy in the sympathetic nerves surrounding mesenteric vasculature. This sympathetic atrophy could be contributing to the splanchnic vasodilation of portal hypertension. Our hypothesis assumed that during portal hypertension, pressure changes detected in the splanchnic vascular área could promote a signal through the visceral afferent sensitive pathway to the cardiovascular regulatory nuclei of the brainstem, triggering from there an efferent response resulting in sympathetic atrophy. The present results confirm this hypothesis and support the role for sympathetic atrophy in splanchnic arterial vasodilation of portal hypertension, showing that by blocking the sensitive afferent signal with capsaicin, the splanchnic sympathetic atrophy can be prevented in those animals where, simultaneously, the hemodynamic alterations were normalized. Indeed, in the superior mesenteric ganglia (SMG) of PVL, which contains the somas of adrenergic neurons that innervate the mesenteric vasculature, an increase in neuronal modulators such as nerve growth factor (NGF), its precursor proNGF and the chimiorepelent Semaphorine 3A (Sema3A) molecule was demonstrated. Sema3A localized in the interneuronal space surrounding adrenergic neurons and colocalizing with VAChT positive fibers. This increment in neuronal modulators was also avoided in capsaicin treated PVL. In the second part of the study, the neural pathway of portal hypertension was confirmed through the analysis of two intermediate structures. An increase in neuronal afferent activity was demonstrated in the vagal nodose ganglia of PVL rats and presence of Sema3A in the cholinergic sympathetic preganglionic neurons of the intermediolateral nucleus of the spinal cord suggested that it was the origin of the increased expression of Sema3A in the SMG. We also investigated alterations on neuromodulators and signaling pathways that, in the SMG of PVL rats, lead to axonal regression or apoptosis. We found that the active form of tyrosine kinase receptor A (TrkA), leading to proliferation and survival signaling was decreased in PVL compared to sham rats. In contrast, the apoptotic and axonal retraction pathways were stimulated in PVL, demonstrated by a significant overexpression in Sema3A and its receptor Neuropilin1, together with an increase in the neurotrophic receptor p75, the active caspase7 and the inactive poly(ADP-ribose) polymerase kinase expression. Finally, we tested the administration of a TrkA agonist, gambogic amide, in PVL rats. Our results showed an amelioration of hemodynamic alterations and sympathetic atrophy, through the activation of survival pathways and the inhibition of the apoptotic cascade and axonal regression mediated by Rho kinase. In conclusion, these results suggest that the adrenergic alterations and sympathetic atrophy observed in mesenteric vessels during portal hypertension is caused by alterations on neuromodulation leading to postganglionic sympathetic regression and apoptosis contributing to splanchnic vasodilation.

La proteïna RecA és coneguda per ser la principal recombinasa bacteriana I també l’activador del sistema SOS. RecA no només s’associa amb processos de reparació del DNA sinó que també està relacionada amb altres funcions com ara el control d’integrons, la transferència de resistències antibiòtiques i d’elements de virulència o la inducció de pròfags. A més, en els últims anys s’ha associat a la proteïna RecA un nou paper com a modulador del moviment en eixam o swarming a E. Coli i a S. Typhimurium. A dia d’avui, es coneix que tant la deficiència com l’excés de RecA causen una disminució dràstica de la capacitat de desplaçar-se mitjançant swarming. També es coneix que, en una soca de S. Typhimurium que sobreexpressa recA i que per tant és incapaç de desplaçar-se per swarming, aquest moviment es pot recuperar a través de l’expressió concomitant del gen cheW, indicant que in vivo aquestes dues proteïnes poden estar relacionades. A més, hi ha evidències experimentals de la interacció entre les proteïnes RecA i CheW in vitro. El gen cheW és un dels gens que componen el nucli de l’aparell de quimiotaxi. El seu producte, la proteïna CheW, és la encarregada de l’acoblament entre la proteïna CheA (una histidina quinasa) i els trímers de dímers de quimioreceptors formant la unitat de senyalització bàsica per la quimiotaxi. Es coneix que diverses unitats de senyalització són capaces d’agregar als pols de la cèl·lula donant lloc a una estructura macromolecular coneguda com a clústers de quimioreceptors que, a part de tenir un paper en la transducció de la senyal quimiotàctica, són necessaris per el moviment en swarming. De fet, mutants de E. Coli que sobreexpressen o presenten deficiències en el gen cheW presenten també una estructuració aberrant dels clústers de quimioreceptors, fet que s’ha relacionat amb els defectes en la quimiotaxis i el swarming també observats en aquestes cèl·lules. El mecanisme molecular a través del qual els sistema SOS, i més concretament RecA, modula el moviment per swarming encara es desconeix. De tota manera, hi ha suficients evidències que apunten a una connexió entre el sistema SOS i el sistema de quimiotaxi a través de la interacció entre les proteïnes RecA i CheW. Per això, el principal objectiu d’aquest treball és aclarir el paper del sistema SOS, i de la proteïna RecA, en el moviment per swarming de S. Typhimurium. Els resultats presentats en aquest treball demostren que les proteïnes RecA i CheW de S. Typhimurium són capaces d’interaccionar tant in vivo com in vitro. A més, també es demostra la tenir una estequiometria concreta entre aquestes dues proteïnes constitueix un factor clau a la hora de desplaçar-se per swarming. El mecanisme molecular que permet al sistema SOS controlar la motilitat per swarming encara no ha pogut ser descobert però en aquest treball es demostra que soques de S. Typhimurium que sobreexpressen recA i mutants deficients en el mateix gen presenten severes deficiències en l’estructuració dels clústers polars de quimioreceptors. En conclusió, el present treball clarifica la relació existent entre el sistema SOS i els sistema de quimiotaxi a S. Typhimurium a través de la interacció entre les proteïnes RecA i CheW. Malgrat la demostració de que la variació de la concentració cel·lular de RecA a les cèl·lules ocasiona defectes en l’estructuració dels clústers de quimioreceptors, el mecanisme molecular que permet la regulació del swarming a través de RecA encara no s’ha establert. En aquest treball, s’hipotetitza que RecA afecta el procés de formació de clústers de quimoreceptors a S. Typhimurium i que l’impediment de formar aquests clústers correctament és el motiu principal per el qual els mutants recA presenten defectes en el moviment per swarming. / The RecA protein is known to be the main bacterial recombinase and the activator of the SOS system. RecA is associated not only with DNA repair but also with several other functions such as the control of integron dynamics, prophage induction and the transfer of antibiotic resistances and virulence factors. Furthermore, in the last years a novel role of the RecA protein as a modulator of the swarming motility in E. coli and S. Typhimurium has been revealed. Up to date, it is known that the lack or the excess of RecA causes a dramatic depletion of the swarming motility in the aforementioned bacterial species. Also, the ability to swarm of an S. Typhimurium strain that overexpresses the recA gene can be recovered by concomitantly overexpressing the cheW gene. Moreover, there are experimental evidences of the interaction between RecA and CheW proteins. The cheW gene is one of the chemotaxis system core genes. Its product, the CheW protein, is known to serve in the cell as the coupling protein between the CheA histidine kinase and the chemoreceptors trimers of dimers to form the basic chemotaxis signaling unit. Several chemotaxis signaling units are known to aggregate at the cell poles forming a macromolecular structure known as chemoreceptor signaling arrays that, apart from their role in signal transduction during chemotaxis, are known to be required for swarming motility. E. coli mutants that either overexpress or lacks the cheW gene are known to have severe impairments in the formation of this chemoreceptor clusters. This, have been linked with the depletion of the swarming and chemotactic abilities displayed by those mutants The molecular mechanism by which the SOS system modulates the swarming motility through RecA still remains unknown. There are sufficient evidences pointing towards a link between the chemotaxis and the SOS systems through a RecA-CheW interaction. Thus, the main aim of this work is to elucidate the role of the SOS system through the RecA protein in the swarming motility of S. Typhimurium. Results presented here demonstrate that RecA and CheW proteins of S. Typhimurium are able to interact both in vivo and in vitro thus establishing a link between the SOS system and the bacterial motility. Also, the importance of a concrete stoichiometric relationship between both proteins have been established as a key factor for swarming motility. The molecular mechanism that exactly allows the SOS system to control the swarming motility still remains poorly understood but in this work it has been demonstrated that strains that either overexpress or lack the recA gene present a severe impairment to successfully structuring the chemoreceptor clusters arrays at its cell poles. In conclusion, the present work clarifies the relationship between the SOS and chemotaxis systems of S. Typhimurium through the interaction between the RecA and CheW proteins. The molecular mechanism behind the RecA modulation of the swarming motility still needs to be further investigated but in this work the affectation of the ability to form chemoreceptor signaling arrays in cells with an excess or lack of RecA is reported. Thus, it is hypothesized that RecA affects the clustering process in S. Typhimurium and that the inability to successfully form this clusters is at the core of the swarming impairment shown by the recA mutants of this specie.

El procés tumorigènic ha estat descrit com un procés gradual en el que les cèl·lules normals van acumulant alteracions genètiques que els hi confereixen avantatges selectives de creixement i les transformen cap a un fenotip maligne. Aquesta visió tant focalitzada en la cèl·lula tumoral ha anat evolucionant i actualment un tumor ja no és considerat exclusivament com una massa de cèl·lules tumorals, sinó que és vist com un teixit complex compost per multitud de cèl·lules no malignes que constitueixen l’estroma tumoral, imprescindible en les diferents etapes del procés carcinogènic. Constituït per una matriu extracel·lular que envolta diferents subtipus cel·lulars (cèl·lules angiogèniques, immunitàries i fibroblasts associats a carcinoma), les interaccions directes o indirectes que s’estableixen entre els seus components i les cèl·lules neoplàsiques són claus per a l’evolució del procés. Els fibroblasts associats a carcinoma o CAFs (“Carcinoma associated fibroblasts”), són els principals components de tumors sòlids com el de mama, pulmó o còlon; caracteritzats per un elevat grau de desmoplasia. Els CAFs, denominats també miofibroblasts per l’expressió de l’alfa actina del múscul llis (α-SMA), presenten una elevada heterogeneïtat tant a nivell molecular com genètic. La identificació de biomarcadors específics que en permetin la seva distinció de la resta de fibroblasts aliens al tumor, es presenta com un repte important tant en el pronòstic com en el tractament d’aquest tipus de tumors. El present treball es centra en els CAFs del càncer colorectal. Compara tant a nivell funcional com transcripcional els fibroblasts presents en les diferents demarcacions anatòmiques amb els que es pot trobar la cèl·lula neoplàsica al llarg de la progressió tumoral: els fibroblasts de la mucosa colònica normal adjacent al tumor primari (NCF), els fibroblasts associats al tumor primari (CAF-PT), i els fibroblasts associats a la metàstasi hepàtica (CAF-LM). Fent ús de la tecnologia dels microarrays, s’han analitzat els perfils d’expressió dels diferents fibroblasts per a identificar biomarcadors moleculars diferencials, útils com a possibles dianes terapèutiques. També s’han definit un seguit de signatures genètiques estromals amb valor pronòstic. Són dues les aproximacions que s’han dut a terme en aquesta tesi. Per una banda, tot i que s’ha vist que els miofibroblasts de les diferents localitzacions anatòmiques del carcinoma colorectal presenten un perfil transcriptòmic diferent, s’ha definit una signatura d’expressió gènica comú a les tres demarcacions i gradual al llarg de la seqüència de progressió tumoral. Així mateix, amb només 19 gens d’aquesta signatura comuna s’ha vist que es poden classificar els pacients afectats de carcinoma colorectal estadis II/III en funció del seu risc de recurrència. Per altra banda, i tenint en compte l’elevat grau d’heterogeneïtat dels miofibroblasts, l’ús de mostres aparellades de fibroblasts de tumor primari i de la mucosa normal, ha permès la identificació d’una signatura de gens diferencialment expressats entre ambdues poblacions. Conèixer gens diferencialment expressats pot ser molt útil alhora d’identificar possibles dianes terapèutiques, a l’estar presents en els fibroblasts associats a carcinoma del càncer colorectal però no en la resta de fibroblasts. A partir dels 108 gens desregulats, a més, s’ha identificat també un classificador genètic constituït únicament per 5 gens estromals i que proporciona una informació més acurada del risc de recurrència que les variables clíniques convencionals. L’anàlisi de la seva expressió sembla facilitar la selecció de pacients estadi II d’alt risc que podrien beneficiar-se amb el tractament de quimioteràpia adjuvant. Aquest classificador ha estat validat tant en dades d’expressió de microarrays independents (validació in silico), com mitjançant la tècnica de la qRT-PCR (PCR quantitativa a temps real); molt més manejable en la pràctica clínica diària. Així doncs, en aquesta tesi es mostra la importància que té l’estroma tumoral en el càncer colorectal, especialment els CAFs (independentment de la seva quantitat), i remarca la rellevància que té el seu estat transcripcional en la prognosi. Així mateix es corrobora que és un tipus cel·lular molt heterogeni i per tant, múltiples i diferents respostes biològiques es poden trobar presents alhora en un mateix tumor; sent el balanç net final entre aquestes respostes el que proveeix el valor pronòstic. / Tumorogenesis has been described as a multistep process where epithelial normal cells accumulate genetic alterations that confer them with selective advantages that transform them into a malignant phenotype. However, in recent years, the role of microenvironment has being getting more important and a tumour is not longer considered as a tumour cell mass, but as a complex tissue. Tumour microenvironment is the cellular environment in which the tumour exists, including angiogenic cells, immune cells, carcinoma associated fibroblasts and the extracellular matrix. The tumour and the surrounding microenvironment are closely related and interact with each other influencing and determining the tumour’s fate. Carcinoma associated fibroblasts (CAFs) are the main constitutors of that tumour stroma, especially in solid tumours such as breast, lung and colon; characterized by a high degree of desmoplasia. CAFs, also known as myofibroblasts due to their expression of α-smooth muscle actin (α-SMA), are highly heterogeneous both at molecular and genetic level. Identification of genetic/molecular markers specific of CAFs but not expressed in other fibroblasts, could be useful both in treatment and prognosis. The current work is focus on carcinoma associated fibroblasts from colorectal cancer (CAFs). It compares both at functional and transcriptional level, fibroblasts from different anatomic demarcations involved in colorectal tumour progression: fibroblasts from normal colonic mucosa adjacent to primary tumour (NCF), carcinoma associated fibroblasts from primary tumour (CAF-PT), and carcinoma associated fibroblasts from liver metastases (CAF-LM). Using microarray technology, analysis of gene expression profile from different fibroblasts has been performed in order to identify for differentially molecular biomarkers that could be useful as a therapeutic targets. As well as, prognostic stromal gene signatures have been defined. Two main approximations have been performed in this work. Firstly, although we have seen that myofibroblasts from different anatomic demarcations in colorectal cancer show different gene expression profile; we have been able to identify a common gene expression signature make up of genes whose expression is sequential and scalable in tumour progression (NCF-CAF-PT and CAF-LM). Only 19 of these common genes from the fibroblast progression signature are enough to classify colorectal cancer patients stage II/III in terms of risk recurrence. Additionally, and considering high heterogeneity of myofibroblasts, using matched samples of carcinoma associated fibroblasts from primary tumour and from normal colonic mucosa, allows us to identify a list of differentially expressed genes between both populations. Identification of differentially expressed genes in one population but not in the other could be useful to identify new molecular biomarkers and therapeutic targets specific for CAFs. We have refined the list of de-regulated gens defining a 5-gene stromal classifier which provides risk recurrence information more accurately than conventional clinical variables do; and also allows better identification of stage II colorectal cancer patients at high risk of recurrence, who could benefit with adjuvant treatment. The stromal classifier has been validated in microarray data from independent datasets (in silico validation) and also by means of qRT-PCR (quantitative real time PCR), more affordable in clinical practice. To summarize, this work shows how important tumour stroma is in colorectal cancer, specially, carcinoma associated fibroblasts. Their transcriptional state seems to be more relevant in colorectal cancer prognosis than their proportion in the tumour stroma. As well as, we confirm that CAFs are highly heterogeneous and different biological responses could be present at the same time in the same tumour determining the final prognosis.

El traumatismo cráneo encefálico (TCE) moderado y severo produce una gran variedad de alteraciones que pueden ser físicas, cognitivas y conductuales. Los cambios conductuales y emocionales son una de las secuelas más devastadoras del TCE. Diferentes trabajos señalan la disminución que provocan en la calidad de vida del paciente; de sus capacidades vitales, laborales, relacionales y afectivas; pero también el gran impacto que tienen en la familia ya que generan situaciones de gran dependencia que exigen una reorganización con la consiguiente sobrecarga del cuidador principal. El presente estudio fue realizado con pacientes afectos de traumatismo cráneo encefálico moderado y severo y sus familiares, con el objetivo de valorar los síntomas conductuales, su evolución en el tiempo y la repercusión que estos tienen en la funcionalidad del paciente y en la sobrecarga del cuidador. Se estudió un grupo de 150 pacientes mediante mediciones transversales y también mediante un seguimiento longitudinal a un año de un sub-grupo de 50 individuos. Las valoraciones se realizaron mediante entrevista clínica utilizando criterios DSM-IV-TR; así como a partir de la administración de escalas neuroconductuales tales como el Inventario Neuropsiquiátrico (NPI) y la Escala Comportamental de Sistemas Frontales (FrSBe). Los resultados permiten afirmar que alrededor de un 90% de los individuos, desde los primeros seis meses del traumatismo y hasta ocho años después de la lesión, presentan algún grado de psicopatología. Los síntomas predominantes son la apatía, la irritabilidad, la desinhibición y las alteraciones de la alimentación. Síntomas de tipo psicótico como alucinaciones, delirios y comportamientos motores aberrantes fueron infrecuentes en nuestra población. La valoración subjetiva de los familiares indica que hasta en un 32% de los individuos aparecen cambios positivos en la personalidad como ser más cariñoso, amable, abierto, expresivo de las emociones y sociable; pero también ser menos impulsivo e irritable. Los factores de riesgo para desarrollar alteraciones conductuales fueron la duración de la amnesia postraumática y la historia de consumo de tóxicos. En nuestro estudio, el diagnostico clínico de cambio orgánico de la personalidad según criterios DSM-IV-TR se correlacionó con la psicopatología medida con la escala NPI. Un resultado consistente fue la repercusión negativa que tienen las alteraciones conductuales en los familiares de los pacientes con TCE moderado y severo. Debido a la elevada prevalencia de psicopatología en estos pacientes y a la sobrecarga que genera en los familiares, se recomienda hacer una búsqueda activa de los trastornos conductuales en los servicios de daño cerebral y a realizar una adecuada intervención como parte del proceso integral neurorrehabilitador. / The moderate and severe traumatic brain injury (TBI) produces a variety of impairments that can be physical, cognitive and behavioral. Behavioral and emotional changes are one of the most devastating consequences of TBI. Different studies show that the behavioral disorders cause a decrease in the quality of life for patients, their life skills, but also their labor and social integration. They have a great impact on the family and caregiver burden because the high dependency situations that generate. This study was conducted with moderate and severe TBI patients and their families, with the aim of assessing the behavioral symptoms, their evolution over time and the impact they have on the functionality of the patient and caregiver burden. We studied a group of 150 patients with transverse measurements and also by a one-year longitudinal follow-up of a sub-sample of 50 subjects. The assessments were performed by clinical interview using DSM- IV -TR , as well as the administration of neurobehavioral scales such as the Neuropsychiatric Inventory ( NPI) and the Frontal Systems Behavior Scale (FrSBe). The results support that about 90 % of individuals, from the first six months after the injury and up to eight years after the injury, present some degree of psychopathology. The predominant symptoms are apathy, irritability, disinhibition and eating disorders. Psychotic symptoms such as hallucinations, delusions and aberrant motor behaviors were infrequent in our population. Subjective evaluation of the family members indicates that up to 32 % of individuals have some positive changes in personality as being more loving, kind , open, expressive of emotions and sociable, but also be less impulsive and irritable. Risk factors for developing behavioral disorders were the duration of posttraumatic amnesia and history of drug and alcohol consumption. In our study, the clinical diagnosis of organic personality change according to DSM -IV-TR correlated with psychopathology as measured by the NPI. A consistent finding was the negative impact that the behavioral disorders produce in relatives of patients with moderate and severe TBI. Due to the high prevalence of psychopathology in these patients and the burden generated to the family, it is recommended to actively search behavioral disturbances in brain injury services and appropriate intervention as part of comprehensive neurorehabilitation.

INTRODUCCIÓN: La localización radioguiada de lesiones no palpables de mama, conocida internacionalmente como ROLL, es una alternativa al método convencional de marcaje (arpón). Se puede realizar simultáneamente con la biopsia selectiva del ganglio centinela (GC) en pacientes con tumores clínicamente ocultos, conocida como técnica SNOLL. OBJETIVOS: Primario: Demostrar la utilidad de ROLL y SNOLL en pacientes con lesiones no palpables de mama (LNPM). Secundarios: Valorar la correcta localización intralesional del radiofármaco y analizar los márgenes de resección; evaluar los porcentajes de detección gammagráfica y quirúrgica del GC; valor de la ROLL en el diagnóstico de las LNPM con biopsia indeterminada; valorar la utilidad de la localización simultánea ROLL y GC (técnica SNOLL) en pacientes con cáncer no palpable de mama; valorar la utilidad de la localización simultánea ROLL y GC en pacientes tratadas con quimioterapia neoadyuvante (QTNA). MATERIAL Y MÉTODOS: Pacientes. Se distinguen 3 grupos: Grupo A pacientes con LNPM (69); Grupo B pacientes con cáncer no palpable de mama (27). Grupo C pacientes con cáncer de mama tratadas con QTNA (31). Protocolo exploratorio: 1) Administración intralesional, guiada mediante ecografía o mamografía estereotáxica, de macroagregados de albúmina marcados con 99mTC. En caso de detección simultánea del GC se administran nanocoloides-99mTc intratumoral (en grupo B) o subdermal (en grupo C). 2) Adquisición de imágenes gammagráficas para comprobar correcta colocación del radiofármaco a nivel intralesional e identificar el GC. 3) Exéresis quirúrgica de la lesión y del GC con la ayuda de una sonda gammadetectora. 4) Comprobación de la pieza quirúrgica (mamografía o inspección). Análisis anatomopatológico de la lesión primaria y de los bordes de resección. Parámetros estadísticos evaluados: valor predictivo negativo (VPN) y porcentaje falsos negativos (FN). RESULTADOS: Hubo correcta colocación intralesional del radiofármaco en 66/69 casos (95.6 %) en el grupo A, en los 27 casos (100%) del grupo B y en 30/31 casos (97%) en el grupo C. En el grupo A: La ROLL permitió resecar completamente la lesión en 21/32 de las malignas (66%). En el grupo B: los bordes de resección en el grupo B fueron libres en el 67% y cercanos en el 25%. Se identificó el GC en 26 casos (96%). El VPN fue del 100%. En el grupo C: Se identificó el GC en 28 casos (90%). El VPN fue del 87.5 % y el porcentaje de FN fue de 9.6 %. CONCLUSIONES: La técnica ROLL es una técnica de marcaje sencilla, segura y precisa para localizar lesiones no palpables de mama. Permite seleccionar la mejor vía de abordaje quirúrgico. La técnica SNOLL facilita la localización y exéresis quirúrgica de la lesión primaria no palpable debido a la elevada retención del radiotrazador en el punto de inyección y la migración del mismo por las vías de drenaje linfático permite la identificación del GC en un elevado porcentaje de pacientes. La BSGC en pacientes tratadas con QTNA predice el estado ganglionar axilar en un 85% de los casos y permite un análisis anatomopatológico exhaustivo del GC mejorando la identificación de las micrometástasis en los ganglios con cambios post-quimioterapia, aunque presenta una elevada tasa de FN. / INTRODUCTION: Radioguided non palpable breast lesion localization, known as ROLL, is an alternative to the standard preoperative method (wire-guide). Simultaneous SLNB and non palpable breast localization is feasible in patients with occult tumors, a procedure known as SNOLL. OBJECTIVES: Primary objective: To show the utility of ROLL and SNOLL in patients with non palpable breast lesions. Secondaries objectives: To assess the correct intralesional radiotracer localization and to analyze the status of surgical margins; to assess scintigraphic and intraoperative identification rates of sentinel lymph node (SLN); the utility of ROLL in the diagnoses of indeterminate non palpable breast lesions (NPBL); to assess the utility of the SNOLL in patients with non palpable breast tumors; to assess the utility of simultaneous of the ROLL and SLNB in patients with locally advanced breast cancer (LABC) treated with neoadjuvant chemotherapy (NC). MATERIAL AND METHODS: Patients. We have distinguished 3 groups: A patients with indeterminate NPBL (69); B patients with non palpable breast cancer (27). C patients with LABC treated with NC (31). Exploratory protocol: 1) Intralesional radiotracer injection guided by ultrasound or stereotactic mammography (human serum albumin macroaggregates labelled with 99mTc). Intratumoural (in group B) or subdermal (in group C) radiotracer (nanocolloids labelled with 99mmTc) injection was performed when simultaneous SLNB. 2) Scintigraphic scans were performed in order to verify the intralesional correct placement of radiotracer and to identify the SLN. 3) Surgical removal of the lesion and SLNB were performed using a gamma probe. 4) Removed specimen was verified by mammography control or macroscopic inspection. Anatomopathological analysis of the primary lesion and surgical margins was performed. Statistical parameters (negative predictive value-NPV- and false negative-FN rate) were evaluated. RESULTS: Intralesional placement of tracer was correct in 66/69 cases (95.6 %) of group A, in 27 cases of group B (100%) and in 30/31 cases (97%) of group C. ROLL allows complete removal of the lesion in 21/32 of the malign lesions (66%) in group A. In group B, surgical margins were free in 67% and closed in 25%. SLN was detected in 26 cases (96%). NPV was 100%. In group C: Intraoperative detection of SN was found in 28 cases (90%). NPV and FN were 87.5 % and 9.6 %. CONCLUSIONS: ROLL is a simple, safe and precise preoperative localization in non palpable breast lesions. ROLL allows the more appropriate surgical procedure. SNOLL allows the localization and surgical removal of the non palpable breast tumor due to high retention of tracer in the place of injection and its migration through the lymphatic channels allow the identification of SN in a high number of patients. The SLNB in patients with breast cancer treated with NC predicts the status of axillary region in 85% patients and allows an accurate anatomopathological analysis of SL, improving the identification of the micrometastases in nodes with chemotherapy changes, although it has a high rate of FN.

INTRODUCCIÓ: Diversos tipus dʼestrès, incloent oncògens actius i dany al DNA, són capaços de induir una aturada irreversible del cicle cel·lular que es defineix com senescència prematura [93-103]. En clínica, els tractaments que actuen produint dany al DNA indueixen apoptosi o bé sensència prematura, disminuint la progressió tumoral [217]. Tot i la resposta inicial, la senescència induïda pel tractament pot suposar un empitjorament de la resposta clínica a llarg termini. De fet, sota tractament, les cèl·lules cancerígenes senescents augmenten la ratio de recaiguda a través del Fenotip Secretor Associat a Senescència (Senescence Associated Secretoy Phenotype, SASP) [236]. Aquest estudi profunditza en com lʼactivitat dels oncògens que sʼexpressen en cèl·lules cancerígenes senescents modulen les seves SASP. RESULTATS: Els resultats mostren que p95HER2 és una forma troncada del receptor HER2 capaç de senyalitzar en forma de homodímer estabilitzat per ponts disulfit intermoleculars. Aquesta forma constitutivament activa de HER2 actua com un potent oncogen tant in vitro com in vivo [24]. Es mostra que lʼexpressió dʼaquest fragment altament actiu de HER2 indueix senescència oncogènica en diferents línies cel·lulars de càncer de mama. Les cèl·lules senescents induïdes per p95HER2 produeixen de forma activa un SASP enriquit en factors protumorigènics. Quan aquestes cèl·lules entren en senescència com a resposta a estímuls no oncogènics, com ara doxorubicina i irradiació gamma, aquestes mateixes cèl·lules no secreten la major part dels factors analitzats. Al mateix temps, lʼexpressió de lʼoncogen en cèl·lules epitelials de mama proliferants presenta un efecte pro-secretor mínim. Tot i així, en aquest treball es presenten evidències de que lʼexpressió de p95HER2, en cèl·lules epitelials de mama senescents generades per irradiació, activa la secreció de diversos factors protumorigènics. Aquests efectes depenen de lʼactivitat de p95HER2 ja que el tractament amb lʼinhibidor de tirosina kinasa, Lapatinib, disminueix dramàticament la resposta secretora en tots els casos estudiats. Evidències preliminars impliquen lʼactivitat transcripcional de NFkB i la via de senyalització PI3K-AKT-mTOR com a mitjancers del SASP protumorigènic depenent de p95HER2. Finalment, emprant tècniques d'imatge en viu, aquests resultats suggereixen que les cèl·lules senescents que expressen p95HER2 exerceixen un efecte prometastàtic cel·lular no-autònom. Aquest efecte, segurament degut al SASP, sʼobserva tant a nivell local com a nivell sistèmic. CONCLUSIONS: La senyalització constitutiva de HER2 potencia i controla la resposta secretora de les cèl·lules epitelials de mama senescents. In vivo, la presència en el tumor primari de cèl·lules senescents que expressen p95HER2 correlaciona amb un increment de la capacitat metastàtica de les cèl·lules tumorals no-senescents que expressen luciferasa (tant presents en el mateix tumor com circulants) [211]. Especulem que les cèl·lules cancerígenes senescents en les que determinades vies de senyalització es troben sobreactivades podrien exercir efectes protumorigènics similars. Això fa rellevant explorar lʼimpacte de lʼexpressió dels oncògens en el secretoma de cèl·lules cancerígenes senescents. Aquests resultats també suggereixen que, quan sigui possible, adequats inhibidors capaços de reduir SASP haurien de ser administrats conjuntament amb tractaments que indueixen senescència. Una teràpia que presenti com a diana les cèl·lules cancerígenes senescents podria representar també una nova interessant oportunitat [237]. En el cas de senescència induïda pel tractament del càncer, aquestes intervencions limitarien els efectes negatius del SASP, tant de bó, millorant la resposta clínica a llarg termini dʼalguns pacients. / INTRODUCTION: Various stresses, including active oncogenes and DNA-damage, are able to induce cells to a largely irreversible cell cycle arrest defined as premature cellular senescence [93-103]. In the clinic, DNA-damaging cancer treatments induce either apoptosis or premature senescence, slowing down tumor progression [217]. Despite the initial response, therapy-induced senescence might worsen the long-term clinical outcome. Indeed, upon treatment, senescent cancer cells are suggested to increase the rate of relapse through their Senescence Associated Secretory Phenotype (SASP) [236]. This work gives insight on how the activity of oncogenes expressed in senescent cancer cells modulates their SASP. RESULTS: The results presented in this dissertation show that p95HER2 is a truncated receptor able to signal as a HER2 homodimer stabilized by intermolecular disulphide-bonds. This constitutively active form of HER2 acts as a potent oncogene both in vitro and in vivo [24]. It is shown that expression of this highly active HER2 fragment induces oncogenic senescence in different breast cancer cell lines. p95HER2-induced senescent cells actively produce a SASP enriched in protumorigenic factors. When senescent in response to a variety of non-oncogenic stimuli, including doxorubicin and γ-irradiation, the same cells do not secrete the most of factors analyzed. At the same time, expression of the oncogene in proliferating breast epithelial cells has modest pro-secretory effects. However, evidence is provided that p95HER2 expression in irradiated senescent breast epithelial cells potently activates the secretion of various protumorigenic factors. These effects depend on p95HER2 activity as treatment with the tyrosine kinase inhibitor Lapatinib dramatically impairs the secretory response in all cases studied. Preliminary evidence implicates NFkB transcriptional activity and the PI3K-AKT-mTOR pathway as mediators of the p95HER2-dependent protumorigenic SASP. Finally, using in vivo imaging, these results suggest that p95HER2-expressing senescent cells exert a cell-non-autonomous prometastatic effect. This effect, likely due to the SASP, is observed both at the local and at the systemic level. CONCLUSIONS: Constitutive HER2 signalling potentiates and controls the secretory response of senescent breast epithelial cells. In vivo, the presence of senescent cells expressing p95HER2, within a primary tumor, correlates with increased metastatic capacity of non-senescent luciferase-expressing tumor cells (either present in the same tumor or circulating) [211]. We speculate that senescent cancer cells in which certain signalling pathways are over-activated might exert similar protumorigenic effects. This makes relevant to further explore the impact of oncogenes expression on the secretome of senescent cancer cells. These findings also suggest that, whenever possible, appropriate inhibitors able to dampen the SASP should be administered together with senescence-inducing cancer treatments. Senescent cancer cells-targeted therapy could also represent an interesting new opportunity [237]. In the eventuality of cancer therapy-induced senescence, such interventions would restrain the detrimental effects of the SASP, hopefully improving the long-term clinical outcome of some patients.

Dentro de los cánceres de pulmón de célula no pequeña se ha concentrado una gran cantidad de esfuerzos en los adenocarcinomas, tanto en la práctica clínica diaria como en la investigación básica. Por ello, este tipo histológico es uno de los tumores mejor caracterizados desde el punto de vista molecular y se han desarrollado diversas terapias dirigidas contra alteraciones genéticas frecuentes en el mismo, terapias que han conseguido mejoras objetivas en supervivencia y calidad de vida en subgrupos seleccionados de pacientes. En comparación, el carcinoma escamoso ha recibido una atención relativa y no existen fármacos específicos contra el mismo en uso clínico, ni se han identificado claros marcadores moleculares con valor predictivo o pronóstico. En este trabajo, se incluyeron 95 pacientes diagnosticados de carcinoma escamoso de pulmón del Hospital Universitario Quirón Dexeus y del Hospital Universitari General Germans Trias i Pujol. De todos ellos se recogieron los datos clínicos de edad, sexo, performance status (estado general), habito tabáquico, estadio clínico y TNM al diagnóstico. Los patólogos de ambos centros hicieron una selección de muestras tumorales a estudiar y tras valoración y macro o microdisección de las mismas, se analizaron 19 genes mediante cuatro técnicas de biología molecular buscando: mutaciones, amplificaciones y niveles de expresión génica, con el objetivo de realizar una caracterización molecular en este tipo de tumor analizando genes clave, así como identificar marcadores moleculares pronósticos o predictivos. Los resultados de la presente tesis apoyan la hipótesis que el carcinoma escamoso constituye una entidad diferenciada del adenocarcinoma desde el punto de vista molecular. Muchas alteraciones genéticas se hallan en porcentajes distintos en ambos tipos histológicos (como las mutaciones de EGFR o PIK3CA) y en algunos casos los subgrupos de alteraciones genéticas también difieren (como es el caso de las mutaciones de K-RAS, siendo la G12C mucho más frecuente en adenocarcinomas de fumadores). Finalmente, ciertas alteraciones parecen ser casi exclusivas del carcinoma escamoso (como la amplificación de FGFR1, PIK3CA o SOX2). En este trabajo se han identificado diversos marcadores con posible valor pronóstico en carcinoma escamoso que sería interesante validar en una cohorte más amplia de pacientes lo que permitiría, además, correlacionarlos con distintos tratamientos. En estadios I-IIIA se ha correlacionado la alta expresión de los genes SOX2 y EZH2 con una mejor Overall Survival (OS) y Progression Free Survival (PFS) de forma estadísticamente significativa. Por otro lado, en estadios avanzados, no mutaciones de K-RAS, co-amplificación de SOX2 + PIK3CA y elevada expresión de los genes SIAH2, BRCA1 y EZH2 correlacionaban, de forma estadísticamente significativa o quasi-significativa, con OS más larga. Estos tres últimos genes se asociaban también a mejor PFS. Todos estos marcadores se podrían integrar en firmas genéticas específicas con valor pronóstico para carcinoma escamoso. Por lo general, se considera al carcinoma escamoso como un subtipo histológico sin marcadores predictivos definidos y con un arsenal de terapias dirigidas limitado en comparación con el adenocarcinoma. Esta tesis demuestra que esta visión no se corresponde con la realidad. En efecto, un porcentaje muy elevado de pacientes con esta patología presenta alteraciones moleculares susceptibles de tratamiento con fármacos dirigidos en uso clínico (como los inhibidores de la tirosina quinasa) o en fases avanzadas de ensayos clínicos, entre los que podemos citar amplificaciones de FGFR1, AXL y MET o las mutaciones de PIK3CA. Sería interesante que se iniciaran más ensayos clínicos para determinar el beneficio terapéutico de tratamientos dirigidos e identificar biomarcadores de respuesta adicionales en carcinoma escamoso. / Within non-small-cell lung cancer, a great deal of research efforts have focused on adenocarcinomas, both in daily clinical practice and basic research. This histological type is therefore one of the best characterized tumors from the molecular point of view, and targeted therapies against common genetic alterations have been developed which have achieved improvements in survival and quality of life in selected subgroups of patients. In comparison, less attention has been paid to squamous cell carcinoma, and no targeted therapies exist against this subtype for clinical use; neither have any molecular markers with clear predictive or prognostic value been identified. In the present study, we included 95 patients diagnosed with squamous cell carcinoma of the lung from the Hospital Universitario Quirón Dexeus and Hospital Universitario Germans Trias i Pujol. Clinical data was collected for all patients: age, sex, performance status, smoking habits, and TNM stage at diagnosis. Pathologists from both hospitals selected the tumor samples to be studied and, after evaluation and macro- or micro-dissection, 19 genes were analyzed using four different molecular biology techniques to look for mutations, amplifications and gene expression levels, with the aim of molecularly characterizing this tumor type, analyzing key genes and identifying prognostic or predictive molecular markers. The results of this thesis support the hypothesis that squamous cell carcinoma of the lung is a distinct entity from adenocarcinoma from the molecular point of view. Many genetic alterations (such as EGFR or PIK3CA mutations) have different rates of detection between both histological types, and in some cases the subgroups of genetic alterations also differ (as in the case of K-RAS mutations, G12C being much more frequent in adenocarcinoma in smokers). Finally, some alterations appear to be almost exclusive to squamous cell carcinoma (such as FGFR1, PIK3CA and SOX2 amplification). In this paper we have identified several markers with potential prognostic value in squamous cell carcinoma which it would be interesting to validate in a larger cohort of patients, something which would also permit correlation of these markers with different treatments. In stages I-IIIA, high expression of EZH2 and SOX2 genes has been correlated with statistical significance with better overall survival (OS) and progression free survival (PFS). Similarly, in advanced stages, K-RAS wild type, co-amplification of PIK3CA + SOX2 and high expression of SIAH2, BRCA1 and EZH2 correlated, also statistically significantly or quasi-significantly, with longer OS. These last three genes were also associated with better PFS. All these markers could be integrated into specific genetic signatures with prognostic value in squamous cell carcinoma. In general, squamous cell carcinoma is considered to be a histological subtype without defined predictive markers and with a limited arsenal of targeted therapies when compared to adenocarcinoma. This thesis demonstrates that this view does not correspond to the reality. In fact, a high percentage of patients with this disease have molecular alterations which are susceptible to treatment with targeted drugs currently in clinical use (such as tyrosine kinase inhibitors) or under investigation in advanced phase clinical trials, such as FGFR1, AXL and MET amplifications or PIK3CA mutations, among others. It would be interesting to initiate more clinical trials to determine the therapeutic benefit of targeted therapies and identify additional biomarkers of response in squamous cell carcinoma of the lung.

Más Europa. Desde su adhesión a las Comunidades Europeas en 1986, España se ha presentado como un actor dinámico, fiable y responsable ante sus socios europeos. Dicho compromiso por una mayor profundización en la integración europea le ha permitido a España ser considerado como uno de los estados miembros más europeístas. Una de las estrategias de la política europea de España ha sido el bilateralismo, es decir, la intensificación de las relaciones con algunos estados miembros para ser más influyente en las decisiones sobre el rumbo del proceso de integración europea. Encontrar aliados para las propuestas que un país plantea dentro de la Unión Europea es vital para que éstas sean adoptadas. En este sentido, los sucesivos gobiernos de España (1986-2008) han promovido un acercamiento bilateral a los países grandes de la UE (Francia, Alemania, Italia y, más secundariamente, el Reino Unido) mediante la celebración de encuentros regulares entre sus máximos responsables gubernamentales. Y ello con un triple objetivo: profundizar en la agenda bilateral de cooperación, disponer de una antesala para acercar posiciones sobre los principales políticas de la integración europea y aumentar el estatus de España dentro de la Unión, situándose en el grupo de los países grandes. Uno de los ámbitos en los que la estrategia bilateralista de España ha sido más activa ha sido el de la política exterior europea, un espacio privilegiado para el análisis del ejercicio del poder por parte de los estados, tanto en las negociaciones en Conferencias Intergubernamentales como en la acción exterior desarrollada por la UE hacia determinadas regiones y países terceros. ¿Cómo ha construido España, en el marco del proceso de integración europea, las relaciones bilaterales con los países grandes de la Unión y qué actores han intervenido? ¿Cuáles han sido los aliados de España en sus propuestas de impulso de algunos temas de interés propio en la agenda de política exterior de la Unión Europea? A través del Análisis de Política Exterior, esta tesis estudia la estrategia española del bilateralismo en algunos ámbitos concretos de la acción exterior de la UE, que son de especial interés para el país (institucionalización de la PESC/PESD, desarrollo de políticas europeas hacia el Mediterráneo y América Latina, refuerzo de las relaciones de la UE con Marruecos y Cuba). Analizaremos, pues, cómo se ha elaborado la política europea de alianzas de España a nivel doméstico (qué actores han participado y cuáles han sido las prioridades españolas) y cómo se ha trasladado a la agenda europea (quiénes han sido sus aliados y qué resultados han obtenido). / More Europe. Since its accession to the European Communities in 1986, Spain has presented itself as a dynamic, reliable and responsible actor before its European partners. This commitment with deeper European integration has allowed Spain to be considered as one of the most Europeanist member states. One of the strategies of the European policy of Spain has been bilateralism, that is to say, the development of intense relationships with some member states in order to be more influential in the decisions about the process of European integration. In addition, finding allies has proved essential for the success of Spanish proposals in the EU. In this sense, the successive Spanish governments (1986-2008) have promoted a bilateral rapprochement with EU large member states (France, Germany, Italy and secondarily the United Kingdom) through regular meetings among its governmental leaders. Such bilateral rapprochement had a triple goal: to deepen cooperation vis-à-vis the bilateral agenda, to have information beforehand in order to forge closer positions on the main policies of the European integration and to increase Spain’s status within the European Union, placing it in the group of the large states. One of the fields where Spain’s bilateralist strategy has been more active is European foreign policy, which has become a privileged sphere for the analysis of the power of States within the EU, both in the Intergovernmental Conferences negotiations and in the EU external action towards certain regions and third countries. How has Spain developed bilateral relations, all along the European integration process, with the EU large member states? Which actors have been involved? Which countries have become allies for Spain in promoting an issue in the EU foreign policy agenda? Through Foreign Policy Analysis, this thesis examines the Spanish bilateralist strategy in some specific issue areas of the EU external action, which have resulted to be of special interest for Spain (institutionalization of CFSP/ESDP, European policies towards the Mediterranean and Latin America, relationships between the EU and Morocco and Cuba). We will also analyze the domestic process involved in this European policy of alliances (which actors have taken part in it and which priorities have been established) and how these Spanish priorities have become part of the European agenda (which countries have been Spain’s allies and which results has it obtained).

Objetivo: La detección temprana del cáncer gástrico (CG) es crucial para el tratamiento y supervivencia del paciente. Sin embargo, la adherencia a programas de cribado del CG con los actuales métodos de screening es extremadamente baja. Este estudio fue diseñado para identificar y validar una firma de expresión de proteínas específicamente asociada a la malignización de la mucosa gástrica mediante el empleo de técnicas proteómicas de bajo coste. Métodos: Se llevó a cabo la detección de 120 citoquinas, 43 factores angiogénicos, 41 factores de crecimiento, 40 factors inflamatorios y 10 metaloproteasas mediante el empleo de micromatrices de proteínas basadas en anticuerpos disponibles comercialmente (RayBiotech, Inc.). Se analizaron 33 muestras pareadas divididas en un set de entrenamiento (n=11 pacientes) y un set de validación (n=22 pacientes) para la identificación de proteínas expresadas diferencialmente en la mucosa normal y tumoral de los pacientes. Resultados: El empleo de la cohorte de descubrimiento permitió la identificación de 21 proteínas con niveles de expresión significativamente alterados en las muestras tumorales respecto al tejido normal. Para analizar el funcionamiento de los 21 predictores en la clasificación de muestras desconocidas, llevamos a cabo un test de predicción ciega del fenotipo “CG” o “mucosa normal” en un set blindado de muestras. El empleo de esta cohorte independiente de validación demostró que la firma de 21 proteínas fue capaz de clasificar las muestras de mucosa gástrica como “CG” o “mucosa normal” con una sensibilidad del 82% (IC95% 59-94) y una especificidad del 73% (IC95% 49-89). Los valores predictivos positivos (CG) o negativos (mucosa normal) de la firma de 21 proteínas en la cohorte de validación fueron del 75% (IC95% 53-90) y del 80% (IC95% 56-94), respectivamente. La firma de 21 proteínas estuvo enriquecida con factores implicados en la respuesta inflamatoria/inmune y quimiotaxis. Conclusiones: El análisis de proteomas complejos en tejidos tumorales como el CG mediante el empleo de micromatrices de proteínas basadas en anticuerpos es una nueva herramienta de utilidad para definir firmas oncoproteómica específicamente asociadas con el proceso de malignización. Nuestro estudio fue capaz de identificar y validar una firma de 21 proteínas capaz de discriminar de manera sensible y específica la presencia de CG en la mucosa gástrica. Dado que la mayoría de los biomarcadores incluidos en la firma pertenecen a familias de proteínas secretadas al medio extracelular, los resultados obtenidos en este estudio justifican el desarrollo de nuevos estudios de validación de la firma oncoproteómica de 21 proteínas en la sangre para el diagnóstico y detección precoz del CG en una población asintomática. / Purpose: The early detection of gastric cancer (GC) is crucial for successful treatment and patient survival. However, compliance with current screening methods remains poor. This study aimed to identify and validate an accurate a tissue-based protein expression signature for GC detection using low-cost affinity proteomics. Methods: The detection of 120 cytokines, 43 angiogenic factors, 41 growth factors, 40 inflammatory factors and 10 metalloproteinases was performed using commercially available Human antibody microarray-based Arrays (RayBiotech, Inc.). There were 33 paired samples divided into a training set (n=11) and a validation set (n=22) for the identification of differentially expressed proteins between GC tissues and normal gastric mucosae. Results: Using a discovery cohort of matched pairs of tumor/normal gastric tissues we identified 21 proteins with significant differences in expression between malignant and normal samples. To assess the performance of the 21 predictors in the classification of unknown samples, we carried out a prediction for “GC” or “non-GC” phenotype in a blinded test set. Using this expanded independent validation cohort, the 21-protein expression signature classified gastric samples as “GC” or as “non-GC” with sensitivity of 82% (95% CI 59-94) and a specificity of 73% (95% CI 49-89). Positive predictive value and negative predictive value in this validation cohort was 75% (95% CI 53-90) and 80% (95% CI 56-94), respectively. The signature was significantly enriched in proteins involved in inflammatory/immune and chemotaxis responses. Conclusions: Antibody microarray analyses of complex proteomes in tissue-based studies can be useful tools to define cancer-associated protein signatures. This study identified and validated a 21-protein signature that accurately discriminated GC and noncancerous gastric mucosae. Because most of the biomarkers belonged to the secreted class of proteins, our results prompt the further blood-based development of the GC 21-protein expression signature for the diagnosis and early detection of GC in general population.

El objetivo de esta Tesis fue evaluar el uso de nuevas tecnologías en ganadería. Para ello se estudió: 1) la termografía por infrarrojos (IRT), como método para la detección de infecciones intramamarias (Exp. 1 y 2) y, 2) biosensores ruminales para medir la evolución del pH y temperatura (Exp. 3, 4 y 5). En Exp. 1, se utilizaron 83 ovejas lecheras al inicio de lactación (Manchega, n = 48; Lacaune, n = 35) para detectar infecciones intramamarias (IMI) a partir de la temperatura de la piel de la ubre (UST) medida por IRT. Las imágenes IRT de las ubres se tomaron antes y después de cada ordeño (a.m y p.m), mediante una cámara portátil de infrarrojos (IRI 4010, Irisys, Northampton, UK), por duplicado y en un total de 10 sesiones. La detección de IMI se realizó mediante cultivo bacteriano de muestras de leche en laboratorio y California Mastitis Test en granja. En Exp. 2, se utilizaron 9 ovejas al final de la lactación, en las que se indujo una respuesta inflamatoria aguda similar a IMI. Para ello se infundió intramamariamente una única dosis de 1 mL de lipopolisacárido de E. coli O55:B5, 30 min después del ordeño. Las IRT y muestras de leche se tomaron a distintos intervalos de tiempo hasta las 73 h. Pese a la precisión de la cámara (±0.15 ºC), capaz de detectar los efectos del ordeño (P < 0.05 a 0.001) y la diferencia entre razas (P = 0.003), la IRT no resultó de utilidad para detectar la aparición de IMI clínicas o subclínicas (P = 0.48) en ovejas, así como tampoco la respuesta aguda a la infusión de E. coli. En los Exp. 3 y 4, se utilizaron un total de 16 cabras Murciano-Granadinas multíparas y no-lactantes, previamente provistas de bolos ruminales con sensores inalámbricos de pH y temperatura (145 × 27 mm; KB1001, Kahne Bolus, NZ) introducidos mediante cirugía. En la Exp. 3 (n = 8) se evaluaron los efectos de la relación forraje:concentrado (F:C) de la ración (HF, alta forraje 70:30; HC, alto concentrado 30:70), a nivel de mantenimiento, en los parámetros ruminales a lo largo del día (cada 30 min), según un diseño cruzado. La F:C de la ración indujo marcadas diferencias en la evolución del pH del rumen (P < 0.001), pero no en la temperatura ruminal (P = 0.40). Sin embargo, la toma de agua fría (9.8 ºC), redujo marcadamente la temperatura del rumen durante 2 h (nadir, ‒3.5 ºC; P < 0.001). En Exp. 4, las cabras (n = 8) se alojaron en jaulas metabólicas, se sometieron a condiciones ambientales de termo-neutral (TN, 20 a 23°C día y noche, 45% humedad) y estrés por calor (HS, 37°C día y 30.5°C noche; 40% humedad) con fotoperiodo constante (día:noche, 12:12 h), según un diseño cruzado. La ración consistió en una mezcla F:C = 50:50 a nivel de mantenimiento. Las temperaturas ruminal y rectal se vieron afectadas por la temperatura ambiente, siendo mas elevadas en las cabras HS respecto a las TN (P < 0.01). Pese a que la ingestión de materia seca no se vio afectada por la temperatura ambiente (P = 0.18), el pH del rumen fue inferior en las cabras HS respecto a TN (‒0.12; P = 0.003) en respuesta al estrés térmico. Finalmente, en la Exp. 5 se estudió el efecto de la suplementación o no de la misma ración de la Exp. 4 con aceites funcionales (C, control; FO, 1 g/d de Essential, Oligo Basics Agroindustrial, Cascavel, Brasil) en el pH y temperatura ruminales. Estos datos, junto con los de la Exp. 4 fueron utilizados para modelizar la evolución del pH a partir de la temperatura ruminal utilizando regresiones logísticas (RL) o distribuciones normales acumulativas (DNA). Las DNA resultaron tan exactas como las RL, pero mucho más sencillas de calcular. En conclusión, la termografía por infrarrojos no resultó útil para la detección de mamitis en condiciones de granja, pero detectó diferencias producidas por el ordeño y la raza. El uso de biosensores permitió obtener información precisa sobre el pH del rumen en condiciones diversas. La distribución normal acumulativa fue un adecuado modelo para predecir el pH del rumen, aunque para la temperatura del rumen no mostró suficiente precisión y se necesitó incluir otras variables (i.e., ración, temperatura ambiente). / The aim of this Thesis was to evaluate the use of new technologies for livestock. The studied technologies were: 1) Infrared thermography (IRT), as a method for detecting intramammary infections (Exp. 1 and 2), and 2) ruminal biosensors to measure the evolution of ruminal pH and temperature (Exp. 3, 4 and 5). In Exp. 1, 83 dairy sheep (Manchega, n = 48; Lacaune, n = 35) were used to detect intramammary infections (IMI) by measuring the udder skin temperature (UST) by IRT. Udder IRT images were taken in duplicate before and after each milking (a.m. and p.m.) using a portable infrared camera (IRI 4010 Irisys, Northampton, UK) on a total of 10 sessions. Detection of IMI was performed by bacterial culture of milk samples in laboratory and by California Mastitis Test in the farm. In Exp. 2, 9 sheep at late lactation were used to induce an IMI like acute inflammatory response. Ewes were intramammary infused with a single dose of 1 mL endotoxin from E. coli O55: B5, 30 min after milking. The IRT and milk samples were taken at various time intervals until 73 h. Despite the accuracy of the camera (± 0.15 ºC), able to detect the effects of milking (P < 0.05 to 0.001) and breed differences (P = 0.003), IRT was unable to detect the occurrence of clinical or subclinical IMI (P = 0.48) in sheep, neither the acute response to the infusion of E. coli endotoxin. In Exp. 3 and 4, we used a total of 16 Murciano-Granadina multiparous and non-lactating dairy goats, carrying rumen boluses with wireless sensors of pH and temperature (145 × 27 mm; KB1001, Kahne Bolus, NZ), previously introduced by surgery. In Exp 3 (n = 8) the effects of diet forage:concentrategasol19 (F:C) ratio (HF, high forage 70:30; HC, high concentrate 30:70), fed at maintenance level and according to a crossover design, were evaluated on the variation of ruminal parameters throughout the day (every 30 min). The F:C ratio induced marked differences on the evolution of ruminal pH (P < 0.001), but not on ruminal temperature (P = 0.40). However, intake of cold water (9.8°C) dramatically reduced rumen temperature during 2 h (nadir, ‒3.5°C, P < 0.001). In Exp. 4, the goats (n = 8) were housed in metabolic cages, and submitted to environmental conditions of thermal neutral (TN, 20 to 23°C day and night; 45% humidity) and heat stress (HS, 37°C day and 30.5°C night; 40 % humidity) with constant photoperiod (day:night, 12:12 h), according to a crossover design. The ration consisted of a mixture F:C = 50:50 fed at maintenance level. Ruminal and rectal temperatures were affected by ambient temperature, being higher in the HS than in the TN goats (P < 0.01). Despite the fact that dry matter intake did not change by ambient temperature (P = 0.18), rumen pH decreased in the HS goats when compared to TN (‒0.12, P = 0.003) as a response to heat stress. Finally, Exp. 5 studied the effects of supplementing the same ration as in Exp. 4 with or without functional oils (C, control; FO, 1g/d of Essential, Oligo Basics Agroindustrial, Cascavel, Brazil) on ruminal pH and temperature. Joint data of Exp. 4 and 5, were used to model the evolution of ruminal pH and temperature using logistic regressions (LR) or cumulative normal distributions (CND). The CND proved to be as accurate as LR, but it was much easier to calculate. In conclusion, the infrared thermography was not useful for the detection of mastitis in farm conditions, but it detected differences produced by milking and breed. The use of biosensors allowed obtaining accurate information on ruminal pH under various conditions. The cumulative normal distribution was an adequate model to predict the pH of the rumen, although the temperature of the rumen showed no sufficient accuracy and it was needed to include other variables (i.e., ration type, ambient temperature conditions).