En esta tesis se ha abordado la caracterización de sensores LSPR refractométricos desde diferentes puntos de vista. En primer lugar, se presenta un análisis teórico y experimental de nanocápsulas cilíndricas (nanorods) de oro, comparando su capacidad sensora con sensores SPP convencionales. El estudio ha conducido al hallagzo de una región espectral con rendimiento sensor optimizado, y a la que se puede acceder llevando a cabo un diseño preciso y detallado de las nanoestructuras. Por otro lado, el análisis desvela un rendimiento superior de los LSPR comparado con los convencionales SPP, con atisbos de mejoras adicionales si se superan ciertos inconvenientes inherentes a estas plataformas biosensoras. De cara a identificar y suprimir estos inconvenientes, se han empleado matrices de nanodiscos de oro como nanoestructura modelo. En primer lugar, se han analizado las influencias negativas que se derivan de las finas capas metálicas de adhesión y de los altos índices de refracción del sustrato que soporta a los nanodiscos. Se ha demostrado que la elección adecuada del material y del espesor de estas capas de adhesión mejora significativamente la relación señal-ruido. Además, mediante la colocación de los nanodiscos sobre nanopilares dieléctricos, alejándolos del sustrato, se han obtenido incrementos significativos de sensibilidad, proporcionando así una estrategia que se puede extender fácilmente a otros sistemas plasmónicos. Se ha demostrado, por otro lado, que estas matrices de nanodiscos soportan un modo guiado, que, además de otras aplicaciones nanofotónicas interesantes, provoca un cambio en la radiación en campo lejano de estas estructuras que causa mejoras en sensibilidad y en la relación señal-ruido. Por último, se han combinado todos los conocimientos adqueridos y resultados obtenidos para esbozar la creación de un biosensor LSPR con funciones de multiplexado y con microfluídica integrada. / In this dissertation, different aspects of refractometric nanoplasmonic sensors are discussed. First, a theoretical and experimental sensing performance assessment is made of Localized Surface Plasmon Resonance (LSPR) sensors based on single gold nanorods, by directly comparing them to conventional thin film Surface Plasmon Polariton (SPP) sensors. Besides the discovery of a material-specific optimized spectral sensing region that can be accessed via precise nanoparticle engineering, this work reveals a better biosensing performance for LSPR sensors that can be further improved if certain - inherent - drawbacks are overcome. For this, arrays of gold nanodisks are used to identify and suppress such drawbacks. First, negative influences that stem from thin metal adhesion layers and the high refractive indices of the supporting substrate are analyzed. It is shown that the right choice of material and thickness for these adhesion layers, significantly improves the signal-to-noise ratio (S/N)-values of these biosensors. Besides, by placing the nanodisks on nanopillars, thereby distancing them from the substrate, much higher sensitivities can be obtained, providing a strategy that can be easily expanded to other plasmonic systems. Next, it is demonstrated that the employed arrays of gold nanodisks support a guided mode that besides other interesting nanophotonics applications, alters the far-field radiation of these nanoplasmonic structures in such a manner, that both enhanced sensitivities and improved S/N-ratios are obtained. Finally, combining all gathered knowledge, a road map is sketched towards the creation of a LSPR sensor with multiplexing capabilities and integrated microfluidics.

Esta tesis doctoral trata sobre la síntesis, y el estudio de la actividad catalítica de partículas de oro de tamaño inferior a 2 nm, nanoclústers de oro. El interés proviene de la actividad catalítica a temperatura ambiente que tiene el oro cuando las dimensiones son inferiores a aproximadamente los 5 nm. En esta tesis se desarrollan dos métodos de síntesis que permiten obtener clústeres de oro estables con un tamaño de partícula bien definido. En un método se sintetizan nanoclústeres de oro de tamaño inferior a 2 nm, los cuales son posteriormente depositados sobre un soporte. En cambio, el otro método consiste en sintetizar los nanoclústeres de oro directamente sobre el soporte seleccionado. Con este ultimo método, se puede modificar el tamaño de los clústeres de oro alterando la cantidad de precursor de oro durante el proceso de síntesis. De esta manera se puede obtener desde una dispersión uniforme de átomos de oro aislados, clústeres de Au de 2 nm o nanopartículas de más de 10 nm en la superficie del material de soporte. Los catalizadores sintetizados han sido caracterizados mediante distintas técnicas físico químicas: HRTEM, SEM, AFM, XPS and XAS. Además también se ha estudiado la actividad catalítica para la oxidación de CO y materiales carbonosos. Finalmente, se ha relacionado el tamaño de partícula con la actividad catalítica del material. / This doctoral thesis is about the synthesis and the catalytic activity study of gold particles with a diameter lower than 2 nm, gold nanoclusters. The interest is due to the catalytic activity that gold has at room temperature when its size is less than approximately 5 nm. In this thesis, two distinct synthesis’ methods that allow stable gold clusters with a well defined particle size to be obtained have been developed. In one method, gold clusters with a narrow size distribution and a particle diameter less than 2 nm are firstly synthesised and then deposited on a support. In the other method, gold clusters are directly synthesised on the selected support. In the latter method, the size of gold can be easily varied by simply altering the gold precursor quantity during the synthesis process. Thus, uniformly dispersed isolated gold atoms, 2 nm Au clusters or nanoparticles larger than 10 nm can be obtained on the material support surface. The synthesised catalysts were characterised using distinct physico-chemical techniques: HRTEM, SEM, AFM, XPS and XAS. Additionally, their catalytic activity was investigated for the oxidation of CO and carbonaceous materials. Finally, the particle size was related with the catalytic activity of the material.

El camp de l'òptica integrada es presenta com un dels mes prometedors a curt-mig plaç degut als clars avantatges que presenta amb respecte de l'electrònica tradicional. El fet d'utilitzar la llum com a medi vehicular, la qual no es veu afectada per les possibles pertorbacions electromagnètiques, entre altres propietats, fan que aquest camp sigui una de les sortides mes viables als greus problemes de congestió de les vies de telecomunicacions que es preveuen en un futur proper. Per altra part, l'ús de l'òptica integrada per a la realització de sensors ofereix unes prestacions superiors a la majoria de transductors actuals: La resistència a condicions hostils, la mesura sense contacte directe i la seguretat en ambients perillosos, fan que aquests siguin de gran interès pel mon industrial.Dels diferents materials aptes per a la realització de components òptics integrats, únicament el silici, amb l'ampli bagatge de processos altament desenvolupats, derivats de la micromecanització i la microelectrònica, permet la fabricació de grans sèries a preus reduïts. Tot i que les propietats òptiques d'aquest element son limitades, la seva abundància, baix preu, elevada puresa, estabilitat química i rigidesa mecànica, fan d'aquest el substrat ideal per a la realització d'estructures híbrides, on les diferents funcions, òptiques i electròniques es combinen sobre el silici, utilitzant tècniques de muntatge superficial amb interconnexió òptica, a través de guies d'ona, dels diferents elements.El confinament òptic amb estructures ARROW es basa en la reflexió total interna a l'interfase amb l'aire i l'elevada reflectivitat que provoquen les capes subjacents al nucli. L'índex de refracció i el gruix d'aquestes capes es sintonitza de manera que el mode fonamental presenti un mínim de pèrdues, mentre que els modes superiors pateixen una elevada atenuació. D'aquesta manera, és possible obtenir guies d'ona monomode amb tamany similar a la fibra òptica, encarregades d'injectar la llum, minimitzant les pèrdues d'inserció. Aquesta propietat fa que aquest tipus de guies siguin les candidates òptimes per a la fabricació de transductors òptics, els quals es basen en la idea que qualsevol alteració d'una propietat física o química produïda a un medi pot detectar-se a partir del canvi que produeix a las característiques de propagació de la llum a través d'ell.En aquest treball s'han desenvolupat les eines necessàries per a la caracterització dels transductors òptics integrats: s'ha posat a punt els programes de simulació de diferències finites amb xarxa no-uniforme (NU-FDM) i el Mètode de propagació del feix (BPM), que permeten analitzar el comportament tridimensional de tota l'estructura. La tecnologia de Sala Blanca ha estat acondicionada per tal d'aconseguir els requeriments que necessitava l'Òptica Integrada. A aquest fet, l'obtenció de capes per PECVD amb diferents índexs de refracció, així com l'optimització de les tècniques de gravat RIE, han permès realitzar tota una sèrie de transductors òptics amb unes característiques notables. Les guies d'ona han estat mesurades en potència i longitud d'ona. Així, s'ha pogut comprovar com la configuració ARROW es trobava ben sintonitzada, a la longitud d'ona de treball (633nm) tant en gruix com en índex de refracció, validant la tecnologia emprada.Gràcies als punts anteriors, s'han pogut realitzar tres tipus de transductors. El primer d'ells consisteix en un interferòmetre Mach-Zehnder (MZI), el qual basa el seu principi de funcionament en la modificació del camí òptic a una de les seves branques, obtenint un patró interferomètric. A partir d'aquest, és possible determinar la variació en la part real de l'índex de refracció. El segon transductor es basa en la modificació de la part imaginaria de l'índex de refracció. Entremig de dues guies es situa una membrana selectiva, la qual té com a característica principal la modificació de la seva transmissió, a una certa longitud d'ona, a mesura que absorbeix un determinat ió. A partir de l'atenuació mesurada al final del dispositiu, és possible conèixer la quantitat d'ions absorbits. Finalment, el tercer transductor es basa en l'obstrucció del camí òptic amb un material absorbent mòbil. La posició d'aquest absorbent ha estat dissenyada per variar amb l'acceleració, obtenint un accelerómetre òptic. / Integrated optics is one of the most interesting research fields in the short-mid term due to the clear advantages that it has as compared to the traditional electronics. Using light as the carrier of information, which is unaffected to electromagnetic perturbations, cause this field to be one of the most viable solutions concerning the telecommunications bottleneck. In addition, the application of integrated optics in the sensor field offers a better response as compared to the transducers used nowadays: Its capability to resist harsh environments, the measurement without direct contact and the safety in explosive media cause this to be of huge interest for the industry.Between the different materials available to be used for integrated optics, only silicon, with the great knowledge of their technological aspects, allows the mass low-cost fabrication. Although its limited optical properties, its abundance, high purity, chemical stability and mechanical stiffness cause it to be ideal for hybrid integration, where the optical an electrical parts of the device are combined on silicon, using surface mounting techniques and with optical interconnection, using waveguides, between them.The optical confinement with ARROW structures is based on the total internal reflection at the upper interface and the ultra-high reflectivity that cause the layers beneath the core. The refractive index and the thickness of these layers is tuned in such a way that the lowest order mode has a minimum of losses, while the rest of the modes suffer from high attenuation. Then, it is possible to obtain single mode waveguides with core thickness comparable to the single-moded fiber optics, minimizing the insertion losses. Then, these waveguides seem to be the most promising candidates for the fabrication of optical transducers, which are based on the idea that any variation of a physical or chemical property caused to a media can be detected form a the change that is produced on the light path across it.In this thesis it has been developed the necessary tools to characterize the integrated optical transducers: It has been implemented the simulation programs based on non-uniform finite-difference method (NU-FDM) and the Beam propagation method (BPM), that allows analyzing the 3D behavior of any structure. The technological steps have been arranged so as to meet the integrated optics requirements. Concretely, the deposition of PECVD layers with different refractive index, together with the optimization of the RIE process, has allowed obtaining several optical transducers with excellent properties. Their waveguides have measured, both in power and in wavelength, showing that the ARROW structure was tuned in according to specifications.With the basis of the waveguides, it has been possible to define three different optical transducers: A Mach-Zehnder Interferometer, an absorption sensor and an optical accelerometer.

La tesis analiza la maternidad y la paternidad y su significado diferencial en la construcción de identidades de género. Dicho análisis se enmarca en un contexto de cambios en las relaciones de género y en las dinámicas familiares por las que ha atravesado la sociedad uruguaya en las últimas décadas. Esta investigación se realiza dentro del campo disciplinario de la demografía. En el análisis demográfico, la fecundidad es usualmente una variable analizada desde la óptica del resultado y no del proceso. En este caso se profundiza en un aspecto del proceso por el cual se tienen hijos: aquél que tiene que ver con las decisiones y los resultados que produce la experiencia o la no experiencia de la maternidad y la paternidad en la vida de las personas. Es por ello que se analiza aquí la fecundidad bajo la óptica biográfica de la trayectoria reproductiva y en base a dos conceptos que resultan de particular relevancia: género y familia. Para aclarar la vinculación entre estas tres dimensiones es que se desarrollan, en el marco teórico del trabajo, las relaciones existentes entre fecundidad, género y familia. Estos enfoques se analizan desde la perspectiva del análisis demográfico pero también, e indefectiblemente, desde el análisis social que conlleva la interpretación causal de los datos. Posteriormente a esta reflexión se presenta el enfoque metodológico de esta propuesta que articula dos técnicas paralelas. Por un lado, en base al trabajo con datos secundarios, se accede a una contextualización demográfica del Uruguay y en particular a los cambios registrados en la fecundidad, la nupcialidad y la familia. Paralelamente se realiza un seguimiento de algunas de las características que presenta el sistema de género en Uruguay y se intenta trazar, en la medida de lo posible, su evolución. La otra técnica utilizada en esta investigación refiere a la realización de entrevistas en profundidad. Dichas entrevistas fueron realizadas a 30 hombres y mujeres nacidos entre 1955 y 1960 (tienen aproximadamente entre 40 y 45 años en el momento de la entrevista) pertenecientes a sectores socioeconómicos medios y medios-altos de Montevideo, capital del Uruguay. Los entrevistados fueron seleccionados a partir de una grilla de clasificación que procuró una diversificación de trayectorias reproductivas y familiares.El marco teórico y el enfoque metodológico constituyen la primera parte de esta tesis. La segunda parte consiste en la presentación de datos del Uruguay. Estos datos pretenden alcanzar una caracterización socio-demográfica de la sociedad uruguaya con especial énfasis en los cambios recientes ocurridos en el sistema familiar y en el sistema de género. En la tercera parte de la tesis se analizan los resultados de las entrevistas realizadas. Este análisis se presenta en base a tres ejes analíticos: 1) el significado de la maternidad y la paternidad en la construcción de identidades de género 2) la maternidad y la paternidad desde la perspectiva de las relaciones de género 3) la configuración de los vínculos entre padres, madres e hijos desde la perspectiva del cambio familiar. A partir de este análisis se aborda la temática desde un enfoque cualitativo profundizando en los significados, experiencias y prácticas que supone la maternidad y la paternidad para la generación entrevistada. Dicha generación es la primera en vivir los cambios en las relaciones de género y en las dinámicas familiares a través de los cuales empiezan a asomar significados alternativos de la maternidad y la paternidad en la sociedad uruguaya que conviven a su vez con la permanencia de los modelos tradicionales. Es en este sentido que se convierte en una generación clave para el análisis de estos procesos en un contexto de finalización de la trayectoria reproductiva. / Introduction: Transplantation of pancreatic islets is an alternative to insulin therapy for the treatment of type I diabetes. Yet this therapy is still at experimental stage and it has yielded worse results than pancreatic transplantation. This is due to different reasons, among them, graft localization. The target organ able to accommodate the islets without further complications is unkown at present. Transplantation into different graft has been experimentally attempted, among them the liver and kidney capsula are the most frequent and those that have yielded the best results. Also, the testicles and brain offer the advantage of being immunologically privileged. Seminal vesicles are even organs offering easy surgical access. Furthermore, they could be considered immunologycally privileged organs because of their role and characteristics. There is no worldwide experience in transplantation of pancreatic islets to seminal vesicles. Hipothesis: Seminal vesicles are well-irrigated and inervated organs, which may be immunologycally privileged. Therefore, Langerhans islets may be implanted and may survive to restore the normoglyicemia in an animal model of experimental diabetis. Objectives: To determine the viability of singenic transplantation of pancreatic islets into diabetic rat seminal vesicles. Material and methods: 158 Lewis singenic male rats were used, weighting between 200 and 400 grams. 49 rats received the transplant. Diabetis was induced with an intraperitoneal dosis of 65 mg/Kg of streptotozine. The pancreas of 98 donor rats were removed from and the islets were purified. An in vitro study demonstrated the correct function of the purified islets as well as the toxicity of collagenase on the islets and the rest of the pancreatic tissue. 800 to 1500 islets from two rats were transplanted into the right seminal vesicle of each receptor rat. A first study consisted on the removal of transplanted vesicles from 6 rats, at 48 and 96 hours, to show their immediate reversion to diabetis. A second study involving 43 receptor rats consisted on a 42-day follow-up to analyze the post-transplant evolution. The vesicles were analyzed by histology and immunohistochemistry (with anti-glucagon and insulin antibodies). The results were compared with a group transplanted on the kidney capsula. Statistic analysis was performed using the SPSS system. Results: The islets worked correctly in vitro, i.e. increasing amounts of glucose induced increased secretion of insulin. The toxicity of collagenase was lower on the islets than on the exocrine tissue and the rest of the pancreatic tissue. Rats became diabetic after the removal of the transplanted vesicles. In the 42 day follow-up, 4 groups could be determined, according to their response. The "functional graft" (16%), the "partially functional graft" (partially working or working only during 10 days) (28%), the "non-fonctional graft" (56%) and the control group. The histology analysis indicated that in the "fonctional graft" group the islets were implanted into the wall of the vesicle. Those that were transplanted to the kidney capsula (44%) were more successful than those transplanted to the seminal vesicle (16%).Conclusions: Singenic transplantation of pancreatic islets into diabetic rat seminal vesicles is viable, but our results do not improve those achieved by transplantation into the kidney capsula.

Introducción: El Test Barcelona abreviado (TB-A) constituye un instrumento de exploración neuropsicológica general que ha mostrado ser sensible y válido en la detección de deterioro cognitivo. Desde la publicación en 1997 de la versión abreviada del Test Barcelona, no se han vuelto a desarrollar datos normativos para todos los subtest que componen esta prueba. Por lo tanto, se hace necesaria una nueva normalización del test. La Teoría de Respuesta a los Ítems (TRI) es en la actualidad una de las teorías predominantes en la investigación psicométrica. Esta teoría presenta múltiples ventajas, pero la más importante en neuropsicología, es la invarianza de la medida. Por otro lado, en el ámbito de las demencias y del deterioro cognitivo leve (DCL), la exploración neuropsicológica debe ir encaminada a la identificación de perfiles cognitivos. El TB-A permite la creación de un perfil clínico, muy útil como representación gráfica de las funciones cognitivas preservadas y alteradas. Por último, las redes neuronales artificiales (RNA) se han desarrollado como herramientas de soporte en la toma de decisiones clínicas en el contexto de clasificación de patrones y predicción de funciones. Objetivos: 1) Aportar los nuevos datos normativos del Test Barcelona abreviado, así como crear un perfil único para todos los sujetos. 2) Identificar el perfil cognitivo del deterioro cognitivo leve y la enfermedad de Alzheimer (EA). 3) Estudiar las propiedades psicométricas del TB-A mediante la Teoría de Respuesta a los Ítems utilizando los siguientes grupos diagnósticos: envejecimiento normal, deterioro cognitivo leve y enfermedad de Alzheimer. 4) Utilizar redes neuronales artificiales como método de clasificación mediante el Test Barcelona abreviado, entre sujetos con envejecimiento normal, DCL y EA.Método: El presente estudio se engloba en el contexto del Proyecto Neuronorma. La muestra estaba formada por 346 controles, 79 sujetos con deterioro cognitivo leve y 97 sujetos con enfermedad de Alzheimer. Se estudió la fiabilidad del TB-A mediante el coeficiente de consistencia interna. Con el objetivo de aportar nuevos datos normativos del TB-A se utilizó la técnica de solapamiento de intervalos y punto medio. Se estudió el efecto de las variables sociodemográficas de edad, escolaridad y sexo. Se transformaron las puntuaciones brutas a escalares ajustadas para la edad y escolaridad. Se realizan los perfiles cognitivos del DCL y EA. Desde la TRI, se aplicó el modelo logístico de dos parámetros para datos binarios. Para la calibración de los parámetros se utilizó el programa BILOG MG versión 3. Se crearon tres redes neuronales artificiales, a partir de la combinación de los tres grupos diagnósticos. Se utilizó una arquitectura de Perceptrón Multicapa entrenado con el algoritmo de retropropagación del error. Desde esta perspectiva se utilizó el programa Easy-NN-Plus V.10. Resultados y conclusiones: El TB-A mostró una excelente consistencia interna (α de Cronbach .921). Se presentaron los nuevos datos normativos del TB-A en puntuaciones escalares mediante tablas ajustadas por edad y escolaridad. Los resultados revelaron un perfil cognitivo diferente para el grupo DCL y EA, tanto en el número de funciones cognitivas alteradas como en su magnitud. Desde la TRI, el TB-A presentó una buena sensibilidad clínica y excelente validez discriminante en diferentes grupos de sujetos: envejecimiento normal, deterioro cognitivo leve y enfermedad de Alzheimer. En este sentido, permite separar entre diferentes niveles de habilidad o rasgo latente. El empleo de RNA mostró una exactitud de clasificación de 66.67% en el caso más complejo (tres grupos diagnósticos), 98.33% (controles vs. deterioro cognitivo leve) y 100% (controles vs. enfermedad de Alzheimer). Asimismo, esta aproximación aporta cuáles son las medidas del TB-A más importantes y sensibles en cada situación. / Background: The brief version of the Barcelona Test (a-BT) is an instrument for general neuropsychological assessment. Since 1997, no normative data has been developed for this test. Therefore, a new normalization is needed. Nowadays, Item Response Theory (IRT) is a predominant theory in psychometric research. These models provide several advantages over Classical Test Theory, such as the invariance of ability and item parameters as the most important. On the other hand, neuropsychological assessment in dementia and Mild Cognitive Impairment (MCI) is directed towards identifying cognitive profiles. The a-BT enables creating cognitive profiles, very useful for identifying maintained and impaired cognitive domains. Finally, Artificial Neural Networks (AANs) are interesting computational tools which can provide valuable support to clinical decision making, classification and the prediction of cognitive functioning. Objectives: 1) To provide new normative data of the a-BT, and develop a unique cognitive profile. 2) To identify cognitive profile of MCI and Alzheimer's disease. 3) To apply IRT to assess the psychometric properties of the a-BT in following diagnosis groups: healthy controls, MCI and Alzheimer's disease. 4) To use artificial neural networks to classify among normal aging, MCI and Alzheimer's disease.Method: The sample, within NEURONOMA project, consisted of 346 healthy controls, 79 MCI patients and 97 Alzheimer's disease (AD) patients. Reliability was studied through internal consistency. "Overlapping cell procedure" and midpoint was applied to develop the normative data. Age, education and sex influence were studied. Raw scores were transformed to age-education adjusted scaled scores. MCI and AD cognitive profiles were developed. A two parameter IRT logistic model for binary data was used to calibrate the parameters using BILOG MG version 3. Three artificial neural networks were developed from the combination of the three diagnostic groups. Sofware Easy NN-Plus V. 10 was used to simulate a Multilayer Perceptron trained with backpropagation learning rule.Results and conclusions: The a-BT showed an excellent internal consistency (Cronbach's alpha .921). Normative data were presented on age-education scaled scores. Different cognitive profiles emerged for MCI and AD, according to the number of impaired cognitive domains and magnitude of cognitive alterations. By using IRT, the a-BT showed an appropriate clinical sensitivity and excellent discriminant validity in the following diagnostic groups: normal ageing, MCI and AD. Furthermore, the test allowed to classify individuals according to different skill levels or latent trait. ANNs successfully classified 66.67% of the overall sample in the three diagnostics groups. When using two diagnostic groups, ANNs showed higher accuracy: 98.33% (healthy controls and. MCI) and 100% (healthy controls vs. AD). Finally, this model was useful for identifying relevant and sensitive variables for neuropsychological diagnosis of MCI and AD.

Aquesta tesi mostra, primerament, els resultats de l'enquesta efectuada als titulars d'explotacions araneses d'ovins, així com la caracterització morfològica de la raça Aranesa mitjançant l'estudi de 31 mesures morfològiques quantitatives, 17 índexs d'interès etnològic i funcional, i les variables qualitatives més importants en etnologia, així com un estudi de la llana. En total s'han enquestat 54 ramaderies, amidat 197 animals adults per a la biometria i mostrejat 53 animals per a l'estudi de la llana. El cens oví aranès l'any 2003 era de 2.569 ovelles i 92 marrans, estimant-se en unes 1.489 ovelles i uns 61 marrans els ovins purs aranesos. Aquestes xifres fan entrar l'Aranesa dins la categoria 4, estatus de perill d'extinció, d'acord amb els criteris de l'EAAP (European Association for Animal Production). Els ramats són de dimensions enormement variables i s'exploten en sistema extensiu en pastures naturals, amb aprofitament estival en peixius d'alta o mitjana muntanya. L'Aranès és un tipus oví d'aptitud càrnia poc marcada, que produeix corders de tipus pasqual pesat, criats "a braguer". El maneig productiu és força dissimilar entre explotacions. Poc menys de la meitat de les explotacions sincronitzen els zels mitjançant la separació dels mascles; en aquestes explotacions, la paridora es concentra sobretot els mesos de març a maig, i d'agost a gener, amb uns màxims a l'octubre i al novembre. Unes tres quartes parts dels ramaders practiquen alguna mena de desparasitació periòdica. La disposició d'electricitat és irregular entre explotacions, però és el recurs aigua el de més valor en les explotacions. Les explotacions són de tipus individual, poquíssimes a títol principal, i la mitjana d'edat dels ramaders és de 50,2 anys. Morfològicament, la raça ovina Aranesa presenta un dimorfisme sexual força marcat; es dóna poca variabilitat morfològica intrasexe i no es detecten subpoblacions biomètricament diferenciables, al menys entre terçons. És una raça subhipermètrica i longilínia; en relació al cap, podem definir els animals com a subconvexos, mesaticèfals, braquicraniots i mesoprosopis, de banya en espiral oberta, i de capa polícroma, les més habituals de la qual són la blanca, la negra, la beret i la capiroia. La llana està formada per metxes quadrades tancades amb un clar predomini de les fibres curtes-fines, de diàmetre mitjà, i que es classificaria com a tipus comercial V, "entrefí corrent" (XI si es tracta del fenotip negre) de la classificació espanyola. En aquesta tesi, a partir dels caracters morfològics i de la llana, es fa un estudi comparatiu entre races ovines pirinenques, que situa l'Aranesa en el que anomenem "entrefí occità pirinenc". Finalment, pel que fa a l'estudi genètic, es pot destacar que el grau de subestructuració entre els diferents peixius estivals és molt reduït i generalment poc significatiu. A nivell de marcadors microsatèl·lit, la raça ovina Aranesa mostra una elevada variabilitat genètica i una diferenciació genètica poc pronunciada amb races geogràficament veïnes, com la Tarasconesa i la Xisqueta. Les races Aranesa i Tarasconesa corresponen a agrupacions poc diferenciades entre elles, tant en el pla genètic com morfològic. / This thesis gives the results of the research done with the farmers of sheep farms in the Vall d'Aran. It indicates the morphological characteristics of the Araneses breed through the study of 31 measurements and 17 indexes of ethnological and functional value, the most important qualitative variables in ethnology as well as a study of the wool. 54 breeding flocks have been investigated, 197 adult animals have been measured biometrically and a sample study of the wool of 53 animals has been carried out. The ovine census in 2003 was of 2,569 ewes and 92 rams, of which 1,489 ewes and 61 rams were considered to be of pure Aranese breed. These figures put the Araneses breed in category 4, a status indicating danger of extinction according to the criteria of the EAAP (European Association for Animal Production). The flocks are of very different sizes. They are reared on extensive natural pastures, taking advantage of high and medium alps in summer. The Aranese is not a breed marked out for meat production. The lambs reach optimum weight around Easter after rearing by suckling. The way of rearing varies greatly from farm to farm. Slightly less than half the farms synchronize the coming on heat of the ewes by separating them from the rams. In theses farms lambing period goes from March to May and from August to January, peaking in October and November. About three quarters of the breeders periodically practise some form of deparasitation. The electricity supply is irregular on the farms but water resources are always readily avalaible. The main activity of the farmers is not sheep farming. The average age of the farmers is 50.2 yr. In morphological terms the Aranese breed exhibits a very pronounced morphological variability between the sexes and no biometrically different subpopulations can be detected at least among in the studied areas. The breed is subhypermetrical and longilineal. Their heads can be defined as subconvex, mesaticephalic, brachicranial and mesoprosopeial, with horns in an open spiral and with a polychrome coat. The white, the black, the "beret" and the "capiroia" are the most common. The wool is made up of closed square tufs wich a clear predominance of short-fine fibres of medium diametre, which are classified as of the commercial type V (XI if it is the black phenotype) according to the Spanish classification. In this Thesis, starting from the morphological characteristics and from the wool, there is a comparative study of the pyrenean sheep breeds. The Aranese breed belongs to the "entrefí occità pirinenc". Finally, as regards the study of theier genes the degreee of substructuration in the differents alps is very limited and of little significance. Using microsatellite markers, the Aranese breed shows high genetic variability and little genetic differentiation in geographically neighbouring breeds such as the Tarasconese and the Xisqueta. The Aranese and the Tarasconese appear in similar groupings both genetically and morphologically. / Aguesta tèsi mòstre, en prumèr lòc, es resultats dera enquèsta hèta as titulars d'espleites araneses d'ovins, atau com era caracterizacion morfologica dera raça Aranesa miejançant er estudi de 31 mesures morfologiques quantitatives, 17 indèxs d'interès etnologic e foncionau, e es variables qualitatives mès importantes en etnologia, atau coma un estudi dera lan. En totau s'an enquestat 54 ramaderies, mesurat 197 animaus adults entara biometria e mostrejat 53 animaus entar estudi dera lan. Eth cens ovin aranés er an 2003 ei de 2.569 oelhes e 92 mardans, estimant-se en ues 1.489 oelhes e uns 61 mardans es ovins purs aranesi. Aguestes chifres hèn a entrar ara Aranesa laguens dera categoria 4, estatus de perilh d'escandiment, cossent damb es critèris der EAAP (European Association for Animal Production). Es ramats son de dimensions enormament variables e s'espleiten en sistèma extensiu en peisheus naturaus, damb aprofitament estivau en peisheus de mieja o nauta o montanha. Er Aranés ei un tipe d'ovin d'aptitud càrnia pòc mercada, produsint anhèths de tipe pasqual pesat, criats "a braguèr". Eth maneg productiu ei fòrça desparièr entre espleites. Pòc mens dera mitat des espleites sincronizen es zèls miejançant era separacion des mascles; en aguestes espleites, era paridora se concentre sustot es mesi de març a mai, e d'agost a gèr, damb uns maxims en octobre e noveme. Ues tres quataus parts des ramadèrs practiquen bèra sòrta de desparasitacion periodica. Era disposicion d'electricitat ei irregulara entre es espleites, mès ei eth recors aigua eth de mès valor enes espleites. Es espleites son de tipe individuau, ben pògues a títol principau, e era mejana d'edat des ramadèrs ei de 50,2 ans. Morfologicament, era raça ovina Aranesa presente un dimorfisme sexuau fòrça marcat; se da pòga variabilitat morfologica intrasèxe e non se detècten sospoblacions biometricament diferenciables, aumens entre terçons. Ei ua raça subipermetrica e longilinha; en relacion ath cap, podem definir as animaus coma subconvèxi, mesaticèfals, braquicraniòts e mesoprosòpis, de còrna en espirau dubèrta, e de capa policròma, en tot èster era mès abituau era blanca e era nera, era beret e era capiroia. Era lan ei formada per mèches quarrades tancades damb un clar predomini des fibres cuertes-fines, de diamètre mejan, e que se classificarie coma tipe comerciau V, "entrefin corrent" (XI se se tracte deth fenotip nere) dera classificacion espanhòla. En aguesta tèsi, a compdar des caractèrs morfologics e dera lan, se hè un estudi comparatiu entre races ovines pirenenques, en tot èster era Aranesa en que nomentam "entrefin occitan pirenenc". Fin finau, per çò que hè ar estudi genetic, subergés qu'eth grad de sosestructuracion entre es diferenti peisheus estivaus ei plan redusit e generaument pòc significatiu. A nivèu de marcadors microsatellit, era raça ovina Aranesa mòstre ua elevada variabilitat genetica e ua diferenciacion genetica pòc prononciada damb races geograficament vesies, com era Tarasconesa e era Xisqueta. Es races Aranesa e Tarasconesa corresponen a agropacions pòc diferenciades entre eres, autant en plan genetic com morfologic.

La present tesis doctoral està basada en el desenvolupament de noves metodologies de RMN per la mesura de constants d’acoblament homo- i heteronuclears en molècules petites. La tesi es presenta com a compendi de publicacions d’articles de recerca que han estat publicats en diferents revistes científiques. El punt de partida està basat en l’experiència i coneixement previ del nostre grup de recerca en aquest camp. S’ha pres com a referència principal l’experiment selHSQMBC, al qual s’hi han implementat noves funcions per tal de dissenyar un conjunt de noves metodologies capaces de resoldre els principals problemes que afecten aquest tipus de mesures. En la majoria de casos s’ha utilitzat la metodologia IPAP per tal d’aconseguir una mesura més exacte. A la vegada, el patró E.COSY, així com el concepte de espectroscòpia J-resolt, s’han implementat conjuntament amb la metodologia IPAP per tal d’obtenir una mesura simultània de diferents constants d’acoblament en un sol experiment de RMN. Tanmateix, també es descriuen nous avenços en la mesura de constants d’acoblament protó-carboni a un enllaç, així com constants d’acoblament protó-protó a dos enllaços en grups metilens diastereotòpics. Cada nou experiment s’analitza des d’un punt de vista metodològic alhora que s’avalua la seva aplicabilitat. La tesi s’ha dividit en cinc apartats. En el primer d’ells es fa una introducció general per situar el lector. Al segon capítol es descriuen els objectius principals. El tercer capítol, i més rellevant, conté les diferents publicacions presentades com a resultats i discussió. El quart capítol conté dos apèndixs diferents que no s’han pogut incloure com a publicacions degut a que encara es troben en preparació. Finalment, l’últim capítol conté les conclusions generals del treball. / The present doctoral thesis is focused on the development of modern NMR methodologies for the measurement of homo- and heteronuclear coupling constants in small molecules. The thesis is presented as a compendium of publications that have been published in different scientific journals as original research papers. The starting point was the previous experience and knowledge of our research group. Taking as a reference the selHSQMBC experiment, several new features have been implemented in order to design a complete set of different methodologies that allow us to overcome some of the most typical drawbacks regarding such measurements. In most of the cases the IPAP methodology is used to achieve an accurate measurement. A spin-state selective technique like the E.COSY pattern, as well as the concept of J-resolved spectroscopy, are implemented in conjunction with the IPAP methodology to obtain simultaneous measurement of several coupling constants in a single-shot NMR experiment. Moreover, advances in the measurement of one-bond proton-carbon and germinal proton-proton coupling constants in diastereotopic methylene groups are also presented. Each new experiment is theoretically discussed from a methodological point of view and an assessment on its application is also performed. The thesis is divided in five chapters. In the first one a general introduction is presented in order to situate the reader. In the second chapter main objectives of the thesis are described. The third section is the main chapter which collects all the publications presented as results and discussion. The fourth chapter contains two different appendixes with the results that could not be included as original research papers because they are still in preparation. Finally, last chapter contains general conclusions of the work.

Durante las últimas décadas un gran número de trabajos se han centrado en la implementación de plataformas lab-on-chip compactas y de alta sensibilidad, para una amplia gama de aplicaciones descentralizadas. Los dispositivos basados en óptica integrada se han revelado como candidatos prometedores, ya que combinan una alta sensibilidad en ensayos directos sin marcadores, con una fabricación de bajo coste a través de la tecnología estandar microelectrónica, permitiendo su producción en masa. En particular las configuraciones interferométricas han demonstrado las prestaciones superiores, en términos de resolución y límite de detección, en comparación con otros dispositivos de óptica integrada como los resonadores o las redes de difracción. Sin embargo, la complejidad en la interpretación de su señal de respuesta, consecuencia de su periodicidad con las variaciones de fase, dificulta su comercialización y su adopción en la práctica clínica. Para resolver las limitaciones de los biosensores interferométricos tradicionales y permitir una integración completa en una plataforma lab-on-chip, se ha estudiado teórica y experimentalmente un nuevo método para la linearización de la señal de salida. Este método se basa en la variación de la longitud de onda de emisión de la fuente láser, que se traduce en una modulación de fase. A fin de mantener una plataforma compacta y rentable, la modulación se introduce aprovechando la dependencia entre la longitud de onda y la potencia de los diodos láser comerciales. El método se ha aplicado a dos plataformas, los interferometros Mach-Zehnder y de guía de onda bimodal, desarrollados en el grupo de investigación donde se ha realizado este trabajo. Los sensores interferométricos modulados en longitud de onda permiten una lectura directa en tiempo real y sin ambigüedades, con una alta sensibilidad tal y como requieren las aplicaciones biosensoras en ámbitos reales. / During the last decades impressive efforts have been devoted to the implementation of compact and highly sensitive lab-on-chip platforms for a wide range of decentralized applications. Among optical devices, those based on integrated optics have been underlined as promising candidates since they combine a high sensitivity in a label-free approach with a cost-effective fabrication through standard Si microfabrication technology, rendering in potential mass production. In particular interferometric arrangements have shown superior performances in terms of resolution and limits of detection compared to other integrated optics solutions as resonators or grating structures. However the complexity of their read-out, consequence of the periodicity of the output signal with the phase variation, still hinders their successful commercialization and adoption in the clinical practice. In order to solve the limitations of standard integrated interferometric biosensors and to allow a complete integration onto a lab-on-chip platform, an innovative method for linearization of the interferometric output is theoretically and experimentally analyzed. The proposed phase modulation system is based on tuning of the emission wavelength of the laser source. In order to keep a compact and cost-effective platform, the wavelength modulation is introduced by taking advantage of the power-wavelength dependence of commercial laser diodes. Thanks to our research Group experience in the design and fabrication of integrated optical biosensors, two different platforms have been analyzed along this Thesis, namely the well-known Mach-Zehnder interferometer and the recently proposed Bimodal Waveguide interferometric biosensors. The wavelength modulated interferometric biosensors allow a direct, unambiguous, highly sensitive real-time read-out, as required by real biosensing applications.

La calidad o competencia del oocito se define por su capacidad para ser madurado, fecundado y dar lugar a una gestación normal y a un parto con un nacimiento sano. .La producción in vitro de embriones (PIVE)s posibilita la obtención de un gran número de embriones de una hembra seleccionada. Utilizar oocitos de hembras prepúberes para la PIVE permite acortar el intervalo generacional y de esta forma intensificar la selección genética en los programas de mejora animal. Sin embargo los oocitos de hembras prepúberes son obtenidos de folículos pequeños y son oocitos de menos calidad para formar embriones in vitro. En estudios anteriores en nuestro laboratorio observamos que la calidad del oocito está mas relacionada con el tamaño del folículo del cual provienen que de la edad de la hembra. Así observamos el mismo porcentaje de embriones producidos in vitro en oocitos de cabras prepúberes (30 a 45 días de edad) obtenidos de folículos mayores de 3mm que de oocitos de cabras adultas. LA conclusión a la que se llega es que la calidad y competencia del oocito está estrechamente relacionada con el desarrollo folicular y la composición del liquido folicular del cual proviene. En vacuno se han realizado varios estudios en los que se relaciona la fertilidad de las vacas con su dieta rica en grasas no saturadas. También los grasos poli insaturados son los ácidos grasos que se encuentran en mayor concentración en el líquido folicular. Entre estos ácidos grasos los que más atención y estudios han conseguido son el Acido Linoleico (AL) y el acido Linolenico (ALA) de las familias omega 6 y omega 3, respectivamente. Ambos ácidos han demostrado su efecto sobre la calidad de los oocitos in vivo e in vitro. Las hembras prepúberes tiene una composición corporal pobre en grasa y presumiblemente también su liquido folicular tenga baja concentración en ácidos AL y ALA. Así uno de los objetivos de este trabajo de tesis ha sido estudiar el efecto de la adicción de diferentes concentraciones de AL y ALA en los medios de maduración in vitro de oocitos de corderas sobre su desarrollo embrionario in vitro. El Acido Hialurónico (AH) es un polisacárido con largas cadenas de azucares que se encuentra en la matriz extracelular e intracelular de los tejidos animales. El AH se encuentra como un glicosaminoglicano (GAG) en el tracto reproductivo de las hembras: úteros, oviducto y liquido folicular. Además se ha demostrado que el AH juega un papel importante retrasando la muerte por fragmentación de los oocitos porcinos. En vacuno, la adición del AH ha mejorado la producción in vitro de blastocistos y añadido en los medios de crioconservación también ha mejorado la supervivencia de los embriones crioconservados. El siguiente objetivo de este trabajo es añadir AH en los medios de cultivo embrionario con el objetivo de incrementar el desarrollo hasta blastocisto de los cigotos de corderas producidos in vitro y su resistencia a la crioconservación. Con estos objetivos se han realizado 3 estudios: 1) Efecto del Acido Linolenico (ALA) sobre la maduración del oocito y su desarrollo embrionario en oocitos de oveja prepúber.2) Efecto del Acido Linoleico (AL) sobre la maduración del oocito y su desarrollo embrionario en oocitos de ovejas prepúberes y 3) Efecto del Acido Hialuronico de alto peso molecular sobre el desarrollo a blastocisto y su resistencia a la crioconservación. En el Experimento 1, se añadió al medio de Maduración in vitro (MIV) de oocitos de corderas concentraciones 50, 100 y 200 µM de Acido Linolenico (ALA) y se estudió su efecto sobre la maduración nuclear, la expansión del cumulus, la secreción de prostaglandinas E2 y F2α, estradiol, progesterona y el porcentaje de oocitos que alcanzaban el estadio de blastocistos. Estos resultados se compararon con un grupo control que no llevaba ALA. Los resultados de este experimento demostraron que a concentraciones 200 µM la maduración del oocito y la expansión del cumulus disminuían comparado con los otros grupos (P≤0.05). La adición de ALA incrementaba la secreción de ambas prostaglandinas analizadas después de las 24 h de maduración de los oocitos (P≤0.05). No se observaron diferencias en el porcentaje de blastocistos obtenidos entre el grupo control (12.2%) y los grupos de 50, 100 y 200 µM ALA (6.9, 11.5 y 14.0%, respectivamente). Sin embargo si que hubo diferencias en el total de células por blastocisto (46.50±5.85, 67.94±6.71, 45.20±6.37, y 59.80±5.51, respectivamente, P≤0.05) y en el total de células apoptoticas por blastocisto (6.45±0.89, 2.48±0.81, 4.02±1.15, y 3.67±1.15, respectivamente, P≤0.05). Después de la MIV la concentración de E2 fue mas baja y la de P4 mas alta en los grupos con ALA que en el grupo control (P≤0.05). En conclusión, estos resultados indican que la adición de ALA al medio de MIV han afectado la calidad de los blastocistos producidos y alterado la liberación de hormonas reproductivas En el experimento 2, se añadió al medio de MIV concentraciones de 50, 100 and 200 µM de Acido Linoleico (LA) y se estudiaron los mismos parámetros que en el experimento 1. Los resultados de este experimento no demostraron ningún cambio en el número de oocitos que alcanzaban la metafase II. La producción de PGE2 y PGF2α incrementó en todos los grupos de AL comparados con el control (P≤0.05). La relación PGE2/PGF2α tampoco fue alterada. Después de la FIV el grupo con 50 µM de AL presentaba un porcentaje de cigotos correctamente fertilizados (2PN) superior al control (57.89 vs. 45.45, respectivamente, P≤0.05). No se observaron diferencias en el porcentaje de blastocistos obtenidos. Sin embargo la calidad de los blastocistos fue superior en el grupo de 50 µM con un número total de células por blastocisto superior al control (63.88±4.54 vs. 53.35±3.64, P≤0.05, respectivamente). No hubo diferencias en el número de células apoptoticas. La producción de E2 fue menor en los grupos AL y no hubo diferencias en la producción de P4. En conclusión, la adición de LA no ha afectado la maduración nuclear ni la producción de blastocistos, sin embargo dosis bajas de LA han incrementado el porcentaje de cigotos normales con 2 pronucleos y la calidad de los blastocistos evaluada por el número total de células. En el experimento 3, concentraciones de 0.25, 0.5 y 1 mg/ml de Acido Hialuronico (AH) fue añadido al medio de cultivo de los embriones producidos en in vitro con oocitos de corderas. El medio de cultivo se preparó sin suero. Los embriones de 2-4 células se cultivaron durante 7 días. Los resultados que se obtuvieron fueron que el porcentaje de blastocistos obtenidos con las distintas concentraciones de AH (33±5.7%, 32±6.0%, 35±5.5%, respectivamente) y el porcentaje de supervivencia embrionaria después de la vitrificación (63±17.1%, 83±15.2%, 58±14.2%; respectivamente) fue estadísticamente superior (P≥0.05) al grupo control (25±5.2%, 38±17.1%, respectivamente). Además, la adicción de AH aumentó el número total de células por blastocisto (83.6±4.6, 100.7±3.8, 97.2±3.7, 105.0±3.9; respectivamente, P<0.05) y el número de células de trofoectodermo ((58.4±3.8, 74.2±3.2, 75.6±3.3, 80.1±3.4; respectivamente, P<0.05). Los embriones que sobrevivieron a la vitrificación también presentaron mayor número de células totales (63.2±3.7, 130.8±3.6, 113.9±5.2, 149.8±5.4; P<0.05), del trofoectodermo (42.9±3.0, 96.7±3.1, 85.2±4.5, 111.9±4.7; P<0.05) y del botón embrionario (20.3±2.2, 32.9±1.8, 27.7±2.6, 36.5±2.7; P<0.05) los blastocistos cultivados con AH que los del grupo control. En conclusión, con oocitos de corderas de 3 meses de edad, aproximadamente, la utilización de AL, ALA en el medio de MIV y de AH en el medio de cultivo no ha incrementado el porcentaje de blastocistos obtenidos. Sin embargo, los ácidos grasos LA y ALA han mejorado la calidad de los embriones aumentando su número de células y el AH ha mejorado la calidad de los blastocistos y mejorado su resistencia a la vitrificación. / The prepubertal sheep ovaries have a large number of small follicles containing oocytes with a capability of developing to upper stages of nuclear maturation, cleaving subsequent post insemination and finally being a blastocyst, that can be transferred to surrogate ewes for progressing of animal breeding programs. Whereas, it has shown that oocytes from prepubertal animals have low competence to develop to higher stages. Accordingly, in this study we have tried to do experiments to improve this deficiency by using Alpha linolenic acid (ALA) and Linoleic Acid (LA). Also, we have tried to improve survival of sheep embryos cultured in vitro using Hyaluronan (HA). Polyunsaturated fatty acids (PUFAs) have shown to have beneficial effects on oocyte maturation and embryo development in vivo and in vitro conditions. Also, PUFAs constitute the major portion of the fatty acid content of the follicular fluid in small and large follicles. ALA and LA from PUFAs used in the present study in 2 separate experiments (experiment 1 for ALA and experiment 2 for LA). To our knowledge there are no previous reports using ALA and LA in prepubertal sheep oocytes in vitro. We used in three concentrations (50, 100 and 200µM) of ALA and LA in maturation media. Subsequently, we evaluated parameters such as cumulus cell expansion, nuclear maturation, secretion of prostaglandins (PGE2 and PGF2α) and steroids (E2 and P4), two pro-nuclei, polyspermy, asynchrony, cleavage, blastocyst rate and embryo quality via counting total cell number and apoptotic cells. In experiment 1, oocytes nuclear maturation and the number of fully expanded cumulus cells were reduced in 200 µM ALA treatment compared to other groups (P≤0.05). Supplementation with ALA increased both PGE2 and PGF2α concentration in the spent media (P≤0.05). No differences were observed in blastocyst development among control (12.2%) and 50, 100 and 200 µM ALA groups (6.9, 11.5 and 14.0%, respectively). However, total cells (46.50±5.85, 67.94±6.71, 45.20±6.37, and 59.80±5.51, respectively, P≤0.05) and apoptotic cell number (6.45±0.89, 2.48±0.81, 4.02±1.15, and 3.67±1.15, respectively, P≤0.05) were significantly improved. After IVM, E2 concentration was lower and P4 concentration was higher in ALA groups compared to control (P≤0.05). In conclusion, these results showed that ALA affects prepubertal sheep embryo quality associated with alteration of releasing reproductive hormones. In experiment 2, no changes were observed in the number of oocytes achieving MII nuclear maturation (91.8, 91.6, 87.9, 93.1 and 93.1, respectively). Production of PGE2 and PGF2α increased in all LA concentrations compared to control (P≤0.05). The ratio of PGE2/PGF2α was not altered. LA at 50µM significantly improved the rate of 2 pro-nuclear (2PN) compared to control (57.89 vs. 45.45, respectively, P≤0.05). There were no differences in cleaved embryos and blastocyst rates. However, embryo quality was improved by 50µM of LA with increase in total cell numbers compared to control (63.88±4.54 vs. 53.35±3.64, P≤0.05, respectively). There was no difference in apoptotic cell numbers. Also, production of E2 decreased significantly while there were not differences in P4 production and the rate of E2/P4 ratio. In conclusion, LA supplementation to prepubertal sheep oocytes in IVM media negatively altered the fully expanded cumulus cells significantly without inhibition of MII nuclear stage percentage of oocytes. The results from the present study provide evidence in increased number of zygotes with normal 2PN and also showed beneficial effects of low level LA on embryo quality of blastocysts at 8 day of post insemination in serum free media. HA is a polysaccharide with long polymer chains of sugars and has found in the extracellular matrix and intercellular matrix of animal tissues. HA is found enormously as a plentiful Glycosaminoglycan (GAG) in the female reproductive tract like uterus, oviduct and follicular fluids. Furthermore, it has been illustrated that HA plays a role in introducing a delay of death in the oocyte with preventing of oocyte from fragmentation in porcine. Also HA improves in vitro produced bovine embryos to develop to the blastocyst stage. It has also been indicated that embryo cryo-survival improvement is due to the HA added to cryopreservation medium HA numerically increased blastocyst percentage at 7-day (33±5.7, 32±6.0, 35±5.5; P≥0.05) and survival rates 48 h after culture in serum free media (63±17.1, 83±15.2, 58±14.2; P≥0.05) as compared to the respective controls (25±5.2, 38±17.1). It increased the total cell (TC) number (83.6±4.6, 100.7±3.8, 97.2±3.7, 105.0±3.9; P<0.05) and trophectoderm cells (TE) (58.4±3.8, 74.2±3.2, 75.6±3.3, 80.1±3.4; P<0.05) at 7-day embryos. Survived embryos had higher TC (63.2±3.7, 130.8±3.6, 113.9±5.2, 149.8±5.4; P<0.05), TE (42.9±3.0, 96.7±3.1, 85.2±4.5, 111.9±4.7; P<0.05) and ICM (20.3±2.2, 32.9±1.8, 27.7±2.6, 36.5±2.7; P<0.05). The results indicate that HA improves the embryo development and viability even quality which might have implication for improving embryo transfer.

Objetivo: Determinar la viabilidad y la seguridad microbiológica del tejido corneal y escleral canino [c] , felino [f] y equino [e] crioconservado a -20ºC, comparando tejidos crioconservados durante menos de 1 año (G≤1a) con aquellos crioconservados durante largos periodos de tiempo (G≥6a). Materiales y métodos: Treinta y seis globos oculares de perro, 20 de gato, y 34 de caballo se obtuvieron de la Fundació Hospital ClínicVeterinari entre 2003 y 2013. Todos los animales estaban libres de neoplasias o enfermedades infecciosas y no presentaban alteraciones oculares. Tras un protocolo de descontaminación, los ojos se enuclearon en condiciones estériles antes de las 10 horas post-mortem. Los globos se almacenaron a -20ºC en condiciones atmosféricas con un antibiótico de amplio espectro y se mantuvieron a esa temperatura durante diferentes periodos de tiempo hasta su análisis. Se realizaron estudios microbiológicos, histológicos y ultraestructurales, tanto del tejido corneal como del escleral. La microbiología consistió en sembrar las muestras de córnea y esclera en agar sangre, McConkey y Sabouraud, y en caldo de cultivo cerebro-corazón. Histológicamente se evaluaron los artefactos de crioconservación y mediante microscopia electrónica de transmisión se analizó la integridad del colágeno, y se establecieron el número y las características de los queratocitos, clasificándolos en normales, apoptóticos y necróticos. En una selección de muestras caninas se comprobó la muerte celular por apoptosis mediante TUNEL. Resultados. Microbiología: Los cultivos directos de los G≤1afueron positivos en un 27,5% [c], 15,0% [f] y 0% [e] y los de los G≥6a en un 0% [c], 0% [f] y 0% [e]. Los cultivos enriquecidos de los G≤1afueron positivos en un 47,5% [c], 30,0% [f] y 27,5% [e] y los de los G≥6a en un 16,7% [c], 0% [f] y 25,0% [e]. Histopatología:En las tres especies, los artefactos de crioconservación fueron más frecuentes en muestras G≥6a que en G≤1a. MET: El tipo de queratocito predominante fue el apoptótico en todas las muestras de las 3 especies. La estructura del colágeno se conservó a lo largo del tiempo, clasificándose como organizada o semiorganizada en todos los casos, excepto en una muestra de córnea canina. Conclusión. El tejido corneal y escleral canino, felino y equino puede crioconservarse a -20ºC y utilizarse al menos durante 8, 10 y 9 años respectivamente sin impedimentos microbiológicos o estructurales. El paso del tiempo parece reducir la contaminación bacteriana en estos tejidos. La apoptosis es la vía de muerte celular más importante para los queratocitoscriocongelados a -20ºC. / Objective: To determine the viability and microbiological safety of canine [c], feline [f] and equine [e] corneal and scleral tissue cryopreserved at -20°C, comparing tissues cryopreserved for less than 1 year (G≤1a) with those cryopreserved for long periods (G≥6a). Materials and Methods: Thirty-six eyeballs from dogs, 20 from cats, and 34 from horses were obtained from the Fundació Hospital Clinic Veterinari between 2003 and 2013. All animals were free of neoplasia or infectious diseases and had no ocular abnormalities. After a decontamination protocol, the eyes were enucleated under sterile conditions within 10 hours post-mortem and stored at -20°C under atmospheric conditions with a broad spectrum antibiotic until analysis. Microbiological, histological and ultrastructural studies of both, the scleral and corneal tissue were performed. Microbiology consisted on cultures of corneal and scleral samples on blood, McConkey and Sabouraud agar and brain heart broth. Cryopreservationartefacts were evaluatedby histology. Transmission electron microscopy (TEM) was used to establish collagen integrity, as well asthe number and characteristics of keratocytes, classifying those in normal, apoptotic and necrotic. Cell death by apoptosis was assessed by TUNEL in selected canine samples Results.Microbiology: Direct cultures were positive in 27.5% [c] 15.0% [f] and 0% [e] of G≤1aand in none of the G≥6a.Enriched cultures were positive in 47.5% [c] 30.0% [f] and 27.5% [e] of G≤1aand in 16.7% [c] 0% [f] and 25.0% [e] ofG≥6a.Histopathology: In all three species, cryopreservation artefacts were more frequent in G≤1a samples than in G≥6a. TEM: The predominant keratocyte was apoptotic in all samples of the 3 species. Collagen structure is retained over time, classified as organized or semi-organized in all cases, except in one sample of canine cornea. Conclusion. The canine, feline and equine corneal and scleral tissues cryopreserved at -20°C can be used for at least 8, 10 and 9 years respectively without microbiological or structural impediments. Bacterial contamination in these tissues seems to be reduced over time. Apoptosis is the most important cell death pathway for cryopreserved (-20º)keratocytes.