Aquesta tesi tracta l'estudi de la producció de la vitamina K3 des d'un punt de vista biotecnològic amb l'objectiu de plantejar noves alternatives a la síntesis química clàssica d'aquesta vitamina.La síntesi clàssica de la vitamina K3 es realitza per un procediment químic que comporta una oxidació del 2-metilnaftalè com a material de partida, mitjançant un agent oxidant molt fort, el dicromat sòdic, en un medi que conté àcid sulfúric, creant-se una reacció que genera una elevadíssima quantitat de residus de crom en aigües àcides.Així doncs es tracta d'una reacció molt contaminant que alhora té unes limitacions des del punt de vista químic molt important, com és la no utilització d'un catalitzador, la generació de grans quantitats de residus, així com la formació d'un isòmer de la vitamina K3, la 6-metil-1,4-naftoquinona, de manera que es produeix un compost no biològicament actiu, del qual cal desfer-se mitjançant dificultosos processos de purificació.Els experiments realitzats en aquest treball van estar dirigits cap a la solució d'aquests problemes, és a dir, la utilització de biocatalitzadors en unes condicions suaus per a minimitzar l'impacte ambiental del procediment de síntesi , així com la millora de la selectivitat de la reacció, eliminantse la formació de l'isòmer de la vitamina K3, punt clau per a l'èxit d'aquest nou sistema de síntesi.Amb aquests objectius es va treballar amb microorganismes salvatges, així com amb microorganismes de col.leccions internacionals, fins que es va poder determinar que dos microorganismes salvatges aïllats del producte de partida de la reacció, el 2-metilnaftalè, així com tres soques de les col.leccions internacionals, eren capaços de produir vitamina K3 a partir d'aquest substracte. Un cop obtingudes les soques productores de vitamina K3 es va poder determinar el mecanisme de la reacció, que indicava la formació dels intermediaris 2-metil-1-naftol i 2-metil-4-naftol, seguit del menadiol i finalment la formació de vitamina K3. També es va poder dur a terme la determinació de que els microorganismes productors de vitamina K3 tenien un 100% de selectivitat pel que fa a la formació de quinones, evitantse la formació de l'isòmer no desitjat, fet determinant per a l'interès del món químic-farmacèutic en una reacció d'aquest tipus. Es van poder mostrar diferents alternatives de síntesi d'aquesta vitamina utilitzant sistemes enzimàtics, cèl.lules senceres actives i cèl.lules senceres no proliferants, essent la producció amb Bacillus subtilis i Bacillus cereus biotip I en condicions de no proliferació en glucosa, les millor condicions de productivitat.Des del punt de vista dels estudis mol.leculars, es va poder determinar que la proteïna responsable de la síntesi de vitamina K3, utilitzant com a substracte el 2-metil-1-naftol, era la citocrom aa3-600quinol oxidasa de Bacillus subtilis , però no es va poder determinar la proteïna responsable del primer pas de la reacció, l'oxidació del 2-metilnaftalè a 2-metil-1-naftol.Els resultats obtinguts permeten veure un ventall de possibilitats que donen alternatives reals als processos clàssics de síntesi de la vitamina K3, tot i que són processos en els quals encara s'ha de treballar molt per augmentar-ne la productivitat fins a uns nivells òptims. / The classical synthesis of vitamin K3 is done by a chemical process consisting of an oxidation of the substrate, 2-methylnaphtalene, with a powerful oxidizing agent such as sodium dichromate in a sulphuric acid medium, which leads to a stechiometric reaction that generates an extremely high amount of chromium waste in acidic waters.This process is extremely polluting and at the same time, from a chemical point of view, its limitations are very important. The most important limitations are the low atom echonomy, because no catalysis is achieved as it is a stechiometric reaction that produces a great amount of waste, and the production of an isomer(6-methyl-1,4-naphtoquinone) of the vitamin, which is not a biologically active compound, so producing companies must get rid of this compound by a complex purification process.Experiments done in this study were performed with the aim of improving the reaction using biocatalysts in mild conditions to solve the environment impact , and in order to obtain a 100% selective oxidizing agent avoiding the production of the undesired isomer, which is the key point for the success of this new process.The strains used in this work were mainly isolated from the environment, except for some of them which were purchased from international collections, and two of the wild strains, which were isolated from the substrate of the reaction, and three of the purchased strains showed a positive results for the produciton of vitamin K3 using 2-methylnaphtalene as substrate.The mechanism of the reaction involved the sequential oxidation of 2-methylnaphtalene to 2-methyl-1-naphtol and 2-methyl-4-naphtol, leading to menadiol and finally leading to the formation of menadione as final product, with a 100% selective process for the production of quinones, avoiding the production of the undesired isomer.Different alternatives for the production of menadione were shown by using enzyme systems, active whole cells and whole resting cells of the 5 different menadione producing strains, from which the best results were achieved with Bacillus subtilis and Bacillus cereus biotype I resting cells in glucose.Molecular studies involving the cloning and expression of the cytochrome aa3 600 quinol oxidase of Bacillus subtilis in E.coli BL21, permitted us to determine that this protein is the responsible for the production of menadione using the substrate 2-methyl-1-naphtol, althoug no evidence of its activity against 2-methylnaphtalene was achieved.The results obtained in this work show a broad range of possibilities for alternative processes for the synthesis of vitamin K3, although this processes need to develope much further in order to compete with the stablished chemical process in terms of yield and production.

El sistema SOS és una xarxa multigénico induïble davant del dany al DNA. Les seves funcions estan relacionades amb la replicació, reparació del DNA, mutagènesi I control del cicle cel·lular. Aquesta xarxa ha estat caracteritzada per diferents bacteris grampositius i gramnegatius, trobant-se per a tots ells un motiu d'unió del seu repressor, la proteïna LexA.El present treball de Tesi es centra en la caracterització del motiu d'unió de la proteïna LexA a Xylella fastidiosa, Anabaena sp. i Fibrobacter succinogenes. Mitjançant recerques amb el programa TBLASTN, els gens lexA d'aquests microorganismes han estat identificats. Després de procedir a la seva clonació, els productes que codifiquen han estat expressats I purificats mitjançant sistemes d'afinitat a la cua d'histidines o a la GST. Assaigs de mobilitat electroforética i de footprinting utilitzant el promotor de lexA i proteïna purificada, ens han permès definir el motiu d'unió de la proteïna LexA a tots tres microorganismes: TTAGN6TACTA per a X. fastidiosa, RGTACNNNDGTWCB per a Anabaena i TGCNCN4GTGCA per a F. succinogenes.Aquests motius d'unió han estat utilitzats per determinar la composició del reguló LexA a l'ordre Xanthomonadals i als phyla Cianobacteris i Fibrobacter. Aquest estudi ens ha permès descriure una important variabilitat en la composició d'aquests regulons i la presència de gens induïbles davant del dany al DNA de manera independent de LexA a X.fastidiosa.Estudis de mutagènesis dirigida utilitzant les seqüències d'unió de la proteïna LexA a Anabaena i F. succinogenes i estudis filogenètics amb les proteïnes LexA i RecA ens han permès determinar la història evolutiva del motiu d'unió de LexA al Domini Bacteria, demostrant que a la subdivisió 'Alphaproteobacteria' s'ha perdut la còpia del gen lexA heretada verticalment essent la que presenten actualment aquests bacteris una adquisició per transferència horitzontal a partir d'un ancestre d'una cianobactèria o espècie relacionada.Els següents articles donen suport a les dades i conclusions del treball, que ha estat redactat com a compendi d'aquestes publicacions :Campoy, S., Mazón, G., Fernández de Henestrosa, A.R., Llagostera, M., Monteiro, P.B. i Barbé, J. 2002. A new regulatory DNA motif of the gamma subclass Proteobacteria: identification of the LexA protein binding site of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Microbiology 148: 3583 - 3597.Mazón G., Lucena J.M., Campoy, S., Fernández de Henestrosa, A.R., Candau, P. i Barbé J. 2004. LexA-binding sequence in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Mol. Gen. Genomics 271: 40 - 49.Mazón, G., Erill, I., Campoy, S., Cortés, P., Forano, E. i Barbé, J. 2004. Reconstruction of the evolutionary history of the LexA binding sequence. Microbiology 150: 3783-3795. / The SOS network is a DNA-damage inducible multigenic network whose functions are involved in DNA replication, DNA repair, mutagenesis and control of cell cycle. This network has been characterized in different gram-positive and gram-negative bacterial species. A binding-motif for their repressor, the LexA protein, has been already determined.The present work focuses in the characterization of the LexA-binding motif of Xylella fastidiosa, Anabaena sp. and Fibrobacter succinogenes. Using TBLASTN searches, their respective lexA genes have been identified and cloned, and their products expressed and purified using histidine-tag and GST-tag systems. Electrophoretic mobility shift assays and foot-printing experiments performed using purified LexA proteins and their lexA promoter fragments revealed the presence of the specific LexA-binding motif for these microorganisms: TTAGN6TACTA for X. fastidiosa, RGTACNNNDGTWCB for Anabaena and TGCNCN4GTGCA for F. succinogenes.These three binding motifs have been used to elucidate the LexA regulon composition in the Order Xanthomonadales and the Cyanobacteria and Fibrobacter phyla, showing an important variability in their regulon composition and the presence of LexA-independent DNA-damage inducible genes in X. fastidiosa.Directed mutagenesis of the Anabaena and F. succinogenes LexA-binding sequences and phylogenetic analyses of LexA and RecA proteins have revealed the evolutionary history of the LexA-binding motif in the Bacteria Domain, with the loss of the vertically inherited lexA gene in 'Alphaproteobacteria' and the presence of a lateral gene transfer in these group resulting in a new lexA copy acquired from a cyanobacterium ancestor or related species.This work is supported on data published in the following papers:Campoy, S., Mazón, G., Fernández de Henestrosa, A.R., Llagostera, M., Monteiro, P.B. i Barbé, J. 2002. A new regulatory DNA motif of the gamma subclass Proteobacteria: identification of the LexA protein binding site of the plant pathogen Xylella fastidiosa. Microbiology 148: 3583 - 3597.Mazón G., Lucena J.M., Campoy, S., Fernández de Henestrosa, A.R., Candau, P. i Barbé J. 2004. LexA-binding sequence in Gram-positive and cyanobacteria are closely related. Mol. Gen. Genomics 271: 40 - 49.Mazón, G., Erill, I., Campoy, S., Cortés, P., Forano, E. i Barbé, J. 2004. Reconstruction of the evolutionary history of the LexA binding sequence. Microbiology 150: 3783-3795.

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La anemia de Fanconi (FA) es un desorden genético de naturaleza autosómica recesiva y caracterizado por una serie de malformaciones congénitas, fallo de médula ósea y una elevada predisposición a adquirir tumores sólidos y leucemia mieloide aguda. Las células FA, poseen una elevada inestabilidad cromosómica tanto espontánea como inducida por agents inductors de enlaces cruzados. Otros rasgos celulares son la sensibilidad frente al daño oxidativo, fallos en el ciclo cellular, niveles elevados de apoptosis regulación deficiente de la transcripción y disfunción telomérica. Hasta el momento, se ha descrito que existen 12 genes diferentes que pueden causar esta enfermedad, aunque no todos ellos han sido clonados y caracterizados. De entre ellos, FANCA es el que más frecuentemente se halla mutado entre la población y presenta un amplio espectro de mutaciones, siendo las grandes deleciones una de las principales.Un conocimiento más profundo de la biología de esta enfermedad nos va a permitir adquirir una visión más global de la reparación del daño en el DNA en respuesta a determinados agentes así como un mejor entendimiento de las interacciones moleculares que se establecen entre distintos síndromes genéticos y que tienen un indiscutible valor diagnóstico y terapéutico.En este trabajo de tesis se han planteado cuatro objetivos principales y generales, que son:- Establecer potenciales relaciones entre las características hematológicas de la enfermedad y algunas características celulares tales como el acortamiento telomérico y las anomalías cromosómicas numéricas o estructurales.- Caracterizar genéticamente a la población afectada por la anemia de Fanconi española.- Explorar el papel de la ruta FA en la biología y el mantenimiento telomérico.- Estudiar la biología molecular de la ruta FA en respuesta al daño genómico.Con los estudios llevados a cabo, se ha observado un acortamiento telomérico acelerado en los pacientes Fanconi acompañado de un incremento en el número de fragmentos extrateloméricos y fusiones, aunque este exceso de fusiones terminales ocurre de manera independiente a la presencia de TRF2 en el telómero. Además, este acortamiento no está directamente relacionado con la severidad de la enfermedad a nivel hematológico. Si que se relaciona, sin embargo con la enfermedad hematológica la frecuencia espontánea de roturas cromosómicas.Por otra parte, se ha estudiado y caracterizado exhaustivamente la población Fanconi española, haciendo especial énfasis en los portadores de mutaciones en el gen FANCA y en la población de etnia gitana, poseedores de la mayor frecuencia de portadores de mutaciones en FANCA a nivel mundial.Un dato importante extraído de estos estudios es la participación de la histona H2AX dentro de la ruta Fanconi en respuesta a la irradiación con UV-C. / Fanconi anemia (FA) is an autosomic recessive genetic disorder characterized by a subset of congenital malformations, bone marrow failure and a high predisposition to solid tumours and acute myeloid leukaemia acquisition. FA cells harbour a high spontaneous and induced by interstrand crosslinking agents chromosomic instability. Some other cellular features are the sensibility in front of oxidative damage, cell cycle failure, increased levels of apoptosis, impaired transcription regulation and telomeric dysfunction.Up to date, there have been described 12 genes that cause this disease though not all of them have been cloned and characterized so far. Among them, FANCA is the most prevalent gene in the affected population and it can be affected by a wide spectrum of mutations, being large deletions one of the most common. Acquire a sight about the biology of this illness will allow us having a wider view about/on DNA damage repair in response to some agents. At the same time, we can have a better knowledge about the molecular interactions established among different genetic syndromes with an indisputable diagnostic and therapeutic value. Within the present thesis four main objectives have been raised:- Establishment of potential relationship between the haematological disease and telomere shortening, and numerical or structural chromosomal abnormalities - Genetic characterization of Fanconi anemia Spanish population- Explore the role of the FA pathway on telomeric biology and maintenance- Study the molecular biology of the FA pathway in response to genomic damage As a conclusion of these studies, an accelerated telomeric shortening together with and increased number of extratelomeric fragments and end-to-end fusions has been observed in the FA patients compared to age-matched controls. The excess of terminal fusions is not related with an impaired role of TRF2. This telomeric shortening is not related with the hematologic disease observed in these patients.However, the spontaneous frequency of chromosomal breaks seems to correlate with the haematological severity.Spanish FA population has been extensively studied and characterized, especially those belonging to FA-A complementation group and the gypsy population, which has come out to be the group with the highest frequency of FANCA mutated carriers worldwide.An important point unraveled from our studies is the role of histone H2AX in the FA pathway in response to UV-C irradiation.

Los genes homeóticos (Hox) codifican factores de transcripción involucrados en la especificación de la identidad segmental a lo largo del eje anteroposterior en el embrión de los metazoos. Estos genes se presentan habitualmente agrupados y organizados en el mismo orden en el que se expresan a lo largo del eje anteroposterior del cuerpo. La conservación de esta organización genómica a lo largo de la filogenia ha sugerido la existencia de constricciones funcionales actuando sobre ella, pero la desestructuración del complejo en Caenorhabditis elegans y las tres roturas descritas en el género Drosophila ponen en cuestión que esta organización sea realmente necesaria para su correcto funcionamiento en algunos linajes. En este trabajo se han estudiado las consecuencias genómicas y funcionales de las dos reorganizaciones del complejo de genes Hox presentes en Drosophila buzzatii, especie perteneciente al grupo repleta. En la primera parte del trabajo se han clonado y secuenciado las regiones codificantes del gen labial (lab) en D. buzzatii y D. virilis. Se han comparado las secuencias de estas dos especies y la de D. melanogaster para comprobar si el cambio de posición del gen lab ocurrido en el linaje de D. buzzatii había producido algún cambio en la estructura del gen o en la evolución de su secuencia. Los resultados muestran una tasa de cambio heterogénea a lo largo del gen pero homogénea a lo largo de la filogenia. La tasa de cambio nucleotídico de lab se ha mantenido constante a pesar del cambio de posición. En la segunda parte del trabajo se han secuenciado dos regiones del genoma de D. buzzatii, una contiene los genes lab y abdominal A (abdA) y la otra incluye el gen proboscipedia (pb), y se ha comparado su organización génica con D. melanogaster y D. pseudoobscura para localizar con precisión los puntos de rotura. También se han comparado las secuencias no codificantes de estas regiones, se ha observado una elevada presencia de bloques conservados en los intrones y regiones adyacentes de los genes Hox. La comparación de los bloques conservados con las regiones reguladoras conocidas de los genes Hox (lab, pb y abdA) en D. melanogaster muestra que la posición y orientación de las regiones reguladoras está conservada entre las tres especies, con excepciones menores. Finalmente se analizó el patrón de expresión de los tres genes Hox en embriones y discos imaginales de D. buzzatii, D. repleta, D. virilis, y D. melanogaster, cuatro especies con diferentes organizaciones de los genes Hox. Las dos roturas estudiadas se produjeron mediante inversiones paracéntricas, con los puntos de rotura respetando las regiones reguladoras de ambos genes. De manera que las regiones reguladoras y patrones de expresión de los genes Hox adyacentes se han conservado a pesar de las reorganizaciones. En Drosophila el complejo parece tener una estructura formada por módulos (que incluyen los genes y las regiones reguladoras) independientes, cuya agrupación no es necesaria para su correcto funcionamiento. La organización de estos genes es modular y su agrupación parece ser el resultado de la inercia filogenética más que de la necesidad funcional. El descubrimiento de más reorganizaciones en otros linajes y la importancia de la colinealidad temporal en algunos organismos sugieren que la causa funcional de la conservación de la organización genómica podría ser la colinealidad temporal. Las reorganizaciones serían consecuencia de la pérdida de colinealidad temporal en organismos con desarrollo rápido por modificación de la embriogénesis. / Homeotic (Hox) genes code for transcription factors involved in the specification of segmental identity in the anteroposterior axis of the early metazoan embryo. These genes are usually clustered and arranged in the same order as they are expressed along the anteroposterior body axis. The conservation of this Hox gene organization along the phylogeny has suggested the existence of functional constraints. However, the partial disassembly of the Caenorhabditis elegans complex and the three splits observed in the Drosophila genus question whether this organization is an absolute necessity for proper function in some lineages. In this work, I analysed the genomic and functional consequences of the two splits present in Drosophila buzzatii, a member of the repleta species group. In the first part, the coding regions of the labial (lab) gene were cloned in D. buzzatii and D. virilis. The sequences of these two species were compared with that of D. melanogaster to test whether the change in position of lab in de D. buzzatii lineage produced any change in gene structure or sequence evolution. The results show that the substitution rate is heterogeneous along the gene but homogeneous along the phylogeny. The nucleotide substitution rate of lab has been constant in spite of the positional change. In the second part, two regions of the D. buzzatii genome have been sequenced, one including the lab y abdominal A (abdA) genes and the other containing the proboscipedia (pb) gene, and compared with the genic organization of D. melanogaster and D. pseudoobscura to precisely locate the breakpoints. The noncoding sequences of these regions have also been compared, and a high presence of conserved blocks has been observed in the introns and surrounding regions of Hox genes. The comparison of these conserved blocks with the known regulatory regions of the Hox genes (lab, pb and abdA) in D. melanogaster shows that the position and order of the regulatory regions is conserved between the three species, with minor exceptions. Finally the expression pattern of the three Hox genes has been analysed in embryos and imaginal discs of D. buzzatii, D. repleta, D. virilis, and D. melanogaster, four species with different Hox gene arrangements. The two splits took place through two paracentric inversions, with their breakpoints between the regulatory regions of adjacent genes. So that the regulatory regions and expression patterns of these Hox genes have been conserved in spite of the reorganizations. In Drosophila the Hox gene complex seems to be composed by independent modules (including the gene and its regulatory regions), whose association is not required for proper function. The organization of these genes is modular and their clustering seems de result of phylogenetic inertia more than of functional necessity. The discovery of more rearrangements in other lineages and the significance of temporal colinearity in some organisms suggest that the functional cause of the conservation of this genomic organization would be temporal colinearity. Rearrangements would be the consequence of the loss of temporal colinearity in organisms with a very rapid mode of embriogenesis.

El melón (Cucumis melo L.) es una hortaliza de gran importancia económica en la que existen numerosos programas de mejora genética. Uno de los objetivos de estos programas ha sido la incorporación de resistencias genéticas frente a patógenos que provocan importantes pérdidas económicas en este cultivo. El virus de las manchas necróticas del melón (MNSV) es un Carmovirus endémico de la familia de las Cucurbitáceas cultivadas bajo invernadero. La única resistencia descrita hasta el momento frente a MNSV es la conferida por el gen recesivo nsv de melón. Esta resistencia es efectiva frente a la gran mayoría de aislados conocidos del virus. Se conoce poco sobre el mecanismo de resistencia de la interacción MNSV/nsv. Así pues, el estudio de esta resistencia mediante el clonaje del gen nsv nos permitirá comprender la estrategia que utiliza el virus para infectar a la planta y esta información podrá ser utilizada para un mejor control de este virus.El objetivo principal de este trabajo ha sido el clonaje del gen nsv mediante la estrategia de clonaje posicional. En primer lugar, el gen nsv fue cartografiado en el grupo de ligamiento 11 del mapa genético de melón generado en nuestro laboratorio. A continuación, una población de 69 LDHs fue utilizada para obtener marcadores AFLPs y RADPs ligados al gen nsv mediante la estrategia del "Bulked Segregant Analysis". Dos mapas genéticos de alta resolución fueron construidos en dos poblaciones diferentes, una F2 de 408 individuos y un BC1 de 2727 individuos. Los marcadores flanqueantes y los que cosegregaban con el gen en la primera población de LDHs fueron convertidos en marcadores de PCR para ser usados fácilmente en estas poblaciones de gran tamaño. Además, dos genotecas de BACs de melón, una generada a partir de un genotipo resistente a MNSV y otra a partir de uno susceptible, fueron examinadas con estos marcadores y se obtuvo un mapa físico de la región del gen nsv mediante paseo cromosómico. En la población F2, los marcadores flanqueantes al gen 1L3 y 5B3sp6 se encontraban separados entre sí por 4 recombinantes, mientras que en la población BC1 los marcadores flanqueantes eran 1L3 y 10O16sp6 y 20 el número de recombinantes entre ellos. La relación distancia física/distancia genética en esta región del genoma de melón se estimó en 228 kb/cM, relación óptima para llevar a cabo el clonaje posicional del gen. Finalmente, se ha llegado a identificar el BAC 1-21-10 que contiene físicamente al gen nsv. La existencia de microsintenia en la región del gen nsv con una región del genoma de Arabidopsis permitió la identificación de un gen candidato para nsv de una manera rápida. Se identificó el factor de iniciación de la traducción 4E (eIF4E) como el candidato para nsv, que había sido previamente identificado como el responsable de la resistencia frente a potyvirus en pimiento, guisante y lechuga. El desarrollo de un marcador de PCR a partir del eIF4E de melón confirmó que éste cosegregaba con el gen nsv en las poblaciones F2 y BC1. A continuación, la secuenciación completa del ADNc de eIF4E reveló que la única diferencia entre las secuencias del alelo resistente y de dos alelos susceptibles residía en un nucleótido, que correspondía con un cambio de aminoácido en la posición 228 de la proteína: una leucina en el genotipo resistente a MNSV y una histidina en los dos genotipos susceptibles. Probablemente, esta mutación en eIF4E es la responsable de la resistencia presente en PI161375. / The melon (Cucumis melo L.) it is a vegetable of great economic importance in which numerous breeding programs exist. One of the objectives of these programs has been the incorporation of genetic resistance forehead to pathogens that cause important economic losses in this culture.Melon necrotic spot virus (MNSV) is an endemic Carmovirus of the Cucurbit family grown under greenhouse conditions. The melon gene nsv is the only known natural source of resistance against MNSV. This resistance confers protection against all widespread MNSV. Little is known on the resistance mechanism of the MNSV/nsv interaction. Therefore, the study of this resistance by positional cloning of the gene nsv will allow us to understand the strategy that the virus uses to infect to the plant and this information could be used for a better control of this virus.The main aim of this work has been the cloning of the gene nsv by positional cloning. First, the nsv gene was mapped in the linkage group 11 of the genetic melon map generated in our laboratory. Next, a population of 69 LDHs was used to obtain AFLP and RADP markers around the nsv gene by means of the strategy of the "Bulked Segregant Analysis". Two high-resolution genetic maps were constructed in two different populations, a F2 of 408 individuals and a BC1 of 2727 individuals. The flanking markers and those that they co-segregated with the gene in the first population of LDHs were converted into PCR markers to be used easily in these populations of great size.In addition, two melon BACs libraries, one generated from a resistant genotype to MNSV and another one from one susceptible one, were examined with these markers and a physical map of the nsv region was obtaining by chromosomal walking. In the population F2, nsv-flanking markers 1L3 and 5B3sp6 were separated to each other by 4 recombinant, whereas in population BC1 the flanking markers were 1L3 and 10O16sp6 and 20 the number of recombinant among them. In this melon genome region the physical/genetic relationship was considered in 228 kb/cM, optimal relation to carry out the positional cloning of the nsv gene. Finally, we also identified a single BAC 1-21-10 that physically contains the gene nsv.The existence of microsintenia between the nsv region and a region of the Arabidopsis genome allowed to the identification of a gene candidate for nsv in a fast way. The eukariotic Initiation Factor 4E (eIF4E) was identified like a candidate for nsv. eIF4E had been previously identified as the gene that confers resistance against potyvirus in pepper, pea and lettuce. The development of a PCR marker from eIF4E of melon confirmed that this one co-secreted with the nsv in the F2 and BC1 populations. Next, sequencing full-length cDNA of eIF4E revealed only one difference between a resistant genotype and two susceptible genotypes. This mutation corresponds with a change of amino acid in the protein position 228: a leucine in the resistant genotype to MNSV and a histidine in both susceptible genotypes. Probably, this mutation in eIF4E is the responsible for the resistance in PI161375.

El hierro y el zinc son micronutrientes esenciales para el crecimiento normal de la gran mayoría de microorganismos, siendo los mecanismos de captación de estos cationes divalentes elementos fundamentales para que las bacterias patógenas sean capaces de promover un proceso infectivo. Además, las proteínas receptoras de hierro se localizan en la membrana externa de las bacterias Gram negativas, lo cual las hace candidatas a ser empleadas para el diseño de vacunas.En este marco, el objetivo de la presente tesis doctoral ha sido profundizar en el estudio de los mecanismos de captación de cationes divalentes de Pasteurella multocida, una bacteria patógena que afecta a una gran variedad de animales originando importantes pérdidas económicas en el sector ganadero.En este estudio se ha identificado un receptor de hierro de 60 kDa, al que se ha denominado HbpA, que presenta un mecanismo de regulación distinto al utilizado comúnmente por las bacterias, ya que es independiente del sistema Fur, determinándose que su regulación depende de Fe2+, Mn2+ y hemina. Se ha demostrado que el gen que codifica esta proteína presenta un corrimiento programado de lectura que da lugar a un derivado truncado de 40 kDa. Se ha caracterizado así mismo la función de esta proteína, determinándose que une tanto hemina como hemoglobina, y que la capacidad de unión a ambas se mantiene en el derivado truncado de la proteína. Además, se ha estudiado la antigenicidad de la proteína HbpA, así como su efecto inmunogénico, demostrándose que la proteína HbpA y su derivada truncada son antigénicas, pero no se obtiene protección cuando se administra dicha proteína entera en experimentos de enfrentamiento utilizándose un modelo experimental animal de ratón.Por lo que se refiere a los mecanismos de incorporación de zinc de P. multocida, desconocidos hasta el presente, se han caracterizado los genes de captación de zinc de alta afinidad (znuABC), determinándose que existe una separación de 820 kb entre los genes znuA y znuCB y que los genes znuC y znuB forman parte de una misma unidad transcripcional. A diferencia de lo que ocurre en Escherichia coli y en otras bacterias, en las cuales la proteína Zur regula la expresión de este sistema de captación de zinc, en P. multocida no se ha encontrado una proteína homóloga a dicha proteína Zur. No obstante, se ha podido establecer que en este patógeno es la proteína Fur la responsable de la regulación de las unidades transcripcionales znuA y znuCB, juntamente con los iones Zn2+ y Fe2+. Finalmente, mediante la construcción de mutantes znuA y znuC, también se ha demostrado que estos genes son imprescindibles para la virulencia de P. multocida. / Iron and zinc are essential for the normal growth of almost all the microorganisms, being the uptake mechanisms of these cations elemental for the infective process of pathogenic bacterial. Moreover, in Gram negative bacterial, the iron receptor proteins are located in the outer membrane, making them good candidates in the vaccine design.In this framework, the doctoral thesis aim have been to go deeply into the study of divalent cations uptake mechanisms in Pasteurella multocida, a pathogenic bacterial that has an effect on a wide variety of animals, originating important economic losses in the stock sector.In this study it has been identified a 60-kDa iron receptor, named HbpA, which regulation mechanism is different to that used commonly by the bacterial, because it is Fur pathway independent, being its regulation Fe2+, Mn2+ and haemin dependent. It has being demonstrated that the codifying gene of this protein has a programmed translational frameshift giving rise to a 40 kDa protein. The function of this protein has been characterized as well, demonstrating that it binds both haemin and haemoglobin and this union capacity is maintained in the truncated derivate protein. Furthermore, the antigenicity and its potential protective ability have been studied, showing that HbpA and its truncated derivate are antigenic, but there is non-protective effect when this protein is given in challenge experiments using a mouse animal model. In reference to the zinc uptake pathways in P. multocida, unknown until the present, it has been characterized the high affinity uptake system (znuABC) genes, showing that there is a distance of 820 kb between znuA and znuCB genes, and znuC and znuB are part of the same transcriptional unit. Contrary to what happens in Escherichia coli and other bacterial, in which the Zur protein controls the expression of this high affinity uptake system; in P. multocida has not been found a homolog to this Zur protein. Nevertheless, it could be established that, in this pathogen, the responsible protein of the znuA and znuCB control is the Fur protein, joined with the Zn2+ and Fe2+ ions. Finally, using znuA and znuC mutants, it has also been demonstrated that these genes are essential for the virulence in P. multocida.

Estudis previs duts a terme en el nostre laboratori han caracteritzat estructuralment i fenotípicament el bacteriòfag SE1. Aquest bacteriòfag presenta una elevada freqüència de transducció, capaç d'infectar S. enterica, serovar Enteritidis i serovar Typhimurium. Seguint aquesta línea d'investigació, el present treball s'ha plantejat ampliar la descripció genètica d'aquest bacteriòfag i caracteritzar les diferents funcions del fag SE1 en estat de lisogènia, tals com la conversió lisogènica, la integració i el seu regulador o interruptor genètic .La seqüenciació del genoma del bacteriòfag SE1, a partir d'una genoteca fàgica o per walking directament sobre el genoma, ha permès determinar que té una llargària de 41.941 pb, que es concreta en 67 orf. La comparació amb la base de dades GenBank ha revelat que aquest fag, com d'altres fags lambdoides, és un mosaic genètic resultat de recombinacions i transferències horitzontals amb d'altres bacteriòfags. La seqüència obtinguda va permetre mostrar que la deficiència en l'extrem carboxi terminal periplasmàtic de la proteïna codificada per un dels gens de conversió lisogènica (GtrC) podria ser la causa per la qual el bacteriòfag P22 podria infectar una cèl·lula lisògena per al bacteriòfag SE1.A més, en el present treball s'han determinat les seqüències dels operadors de la regió reguladora que interaccionen amb la proteïna cI de l'interruptor o regulador genètic. A través d'assaigs de retard electroforètic (EMSA) i de footprinting s'ha definit la seqüència consens dels motius d'unió dels operadors a la proteïna cI: AtAN3tTN3TATT.D'altra banda, l'anàlisi de la composició de la unitat transcripcional del gen cI per RT-PCR va permetre determinar que el gen orf23 en formava part. La proteïna Orf23 seria un potencial regulador membre de la superfamília de les ATPases involucrades en la partició genòmica. Mutants defectius en aquest gen presenten un increment de la inducció del cicle lític en presència de mitomicina C, la qual cosa indica que aquesta proteïna podria ser un modulador de la proteïna cI o que podria haver-hi una interacció entre la proteïna Orf23 i la proteïna cI. Aquesta és la primera vegada que es caracteritza una proteïna d'aquesta família d'ATPases en un bacteriòfag que s'integra en el genoma del seu hoste. / Carried out previous studies in our laboratory have characterized structurally and phenotipically the bacteriophage SE1. This bacteriophage presents a high frequency of transduction; it is able to infect S. enterica, to serovar Enteritidis and to serovar Typhimurium. Continuing this line of investigation, in the present work we have considered to extend the genetic description of this bacteriophage and to characterize different functions from phage SE1 in lysogen state, such as the lysogenic conversion, integration and its regulator or genetic switch. The sequencing of the bacteriophage SE1 genome, from its genotec or by walking directly on the genome, has allowed us to determine that it has a 41,041 pb of length, that takes shape in 67 orfs. The comparison with the data base of the GenBank has revealed that this phage, like other lambdoids phages, is a genetic mosaic result of recombination and horizontal transferences with other bacteriophages. The obtained sequence allowed us to show that the deficiency in the periplasmatic carboxi terminal end of the protein (GtrC) codified by one of the genes of lysogenic conversion could be the cause by which the bacteriophage P22 would be able to infect a lysogen cell by bacteriophage SE1. In addition, in the present work, the sequences of operators of regulating region have been determined, which interact with protein cI of the switch or genetic regulator. Through tests of electrophoretic mobility shift assay (EMSA) and footprinting consensus sequence for union of operators to protein cI has been defined: AtAN3tTN3TATT. On the other hand, analysis of the composition of gene cI transcriptional unit by RT-PCR allowed us to determine that the gene orf23 comprised of the same one. The Orf23 protein is a regulating potential member of the superfamily of the ATPases involved in the genomic partition. Defective mutants in this gene present an increase of the induction of the lytic cycle in presence of mitomicina C, this indicates that this protein could be a modulator of the protein cI or that could have an interaction between the Orf23 protein and protein cI. This is the first time that a protein of this family of ATPases is characterized in a bacteriophage which integrates in the genome of its host cell. / Estudios previos llevados a cabo en nuestro laboratorio han caracterizado estructuralmente y fenotípicamente el bacteriófago SE1. Este bacteriófago presenta una elevada frecuencia de transducción, capaz de infectar S. enterica, serovar Enteritidis y serovar Typhimurium. Continuando esta línea de investigación, en el presente trabajo se ha planteado ampliar la descripción genética de este bacteriófago y caracterizar las diferentes funciones del fago SE1 en estado de lisogenia, tales como la conversión lisogénica, la integración y su regulador o interruptor genético.La secuenciación del genoma del bacteriófago SE1, a partir de su genoteca o por walking directamente sobre el genoma, ha permitido determinar que tiene una longitud de 41.041 pb, que se concreta en 67 orfs. La comparación con la base de datos del GenBank ha revelado que dicho fago, como otros fagos lambdoides, es un mosaico genético resultado de recombinaciones y transferencias horizontales con otros bacteriófagos.La secuencia obtenida permitió mostrar que la deficiencia en el extremo carboxi Terminal periplasmático de la proteína codificada por uno de los genes de conversión lisogénica (GtrC) podría ser la causa por la cual el bacteriófago P22 podria infectar una célula lisógena por el bacteriófago SE1.Además, en el presente trabajo se han determinado las secuencias de los operadores de la región reguladora que interaccionan con la proteína cI del interruptor o regulador genético. A través de ensayos de retardo electroforético (EMSA) y de footprinting se ha definido la secuencia consenso de los motivos de unión de los operadores a la proteína cI: AtAN3tTN3TATT.Por otro lado, el análisis de la composición de la unidad transcripcional del gen cI por RT-PCR permitió determinar que el gen orf23 formaba parte de la misma. La proteína Orf23 seria un potencial regulador miembro de la superfamilia de las ATPasas involucradas en la partición genómica. Mutantes defectivos en este gen presentan un aumento de la inducción del ciclo lítico en presencia de mitomicina C, esto indica que esta proteína podría ser un modulador de la proteína cI o que podría haber una interacción entre la proteína Orf23 y la proteína cI. Esta es la primera vez que se caracteriza una proteína de esta familia de ATPasas en un bacteriófago que se integra en el genoma de su hospedador.

El sistema SOS és una xarxa multigènica sota el control negatiu del repressor LexA, amb importància vital per a la supervivència cel·lular ja que la seva desrepressió es dóna quan la cèl·lula presenta danys en el material genètic que poden ser transmesos a la descendència. Aquest fet, junt amb la seva amplia distribució en el domini Bacteria ens presenten el coneixement del seu funcionament en els diferents grups com una eina filogenètica idònia.Per a tal fi, i com a fil conductor d'aquest treball, és va procedir a l'estudi del reguló LexA a Dehalococcoides ethenogenes, un bacteri verd no sulfurós; Magnetococcus sp. soca MC-1,un bacteri magnetotàctic; i Leptospira interrogans serovar Lai, la primera espiroqueta amb un lexA identificat. Per a tal es va procedir a la clonació i purificació del gen lexA de cada un d'ells i a la purificació del seu producte.En el primer d'ells es va definir la caixa d'unió de LexA (AGAACN4GTTCT), comprovant a partir d'ella els seus vincles amb els bacteris grampositius, així com la no regulació del gen recA, considerat com a canònic, pel mateix.A Magnetococcus sp. soca MC-1, la caixa SOS descrita fou GTTCN7GTTC. Fins el moment, aquest microorganisme es trobava ubicat dins la subclasse Alfa del Proteobacteris, però tant el coneixement del motiu d'unió del seu LexA com els gens que integraven el reguló, ens el mostren com una branca estretament relacionada amb aquesta classe, però clarament independent.A Leptospira interrogans serovar Lai, el resultat fou sorprenent, ja que la caixa SOS d'aquest microorganisme, la varem haver d'identificar a partir de la regió promotora de recA, ja que no era present en la de lexA, esdevenint així el primer exemple en el que LexA no autoregula la seva expressió. Aquesta dada així com el fet de no poder detectar cap altre gen sota el seu control, ens mostren Leptospira, com un pas entremig en la tendència evolutiva seguida en les espiroquetes de perdre el seu gen lexA.Els següents articles es presenten a la secció d'annexes, i en ells es descriuen i discuteixen els resultats sobre els quals està basada aquesta tesis.:I. Fernandez de Henestrosa, A.R., J. Cuñé, I. Erill, J.K. Magnuson, i J. Barbé. 2002. A green nonsulfur bacterium, Dehalococcoides ethenogenes, with the LexA binding sequence found in gram-positive organisms. J. Bacteriol. 184(21): 6073 - 6080.II. Fernandez de Henestrosa, A.R., J. Cuñé, G. Mazón, B.L. Dubbels, D.A. Bazylinski, i J. Barbé. 2003. Characterization of a new LexA binding motif in the marine magnetotactic bacterium strain MC-1. J. Bacteriol. 185: 4471 - 4482.III. Cuñé, J., P. Cullen, G. Mazon, S. Campoy, B. Adler, i J. Barbé. 2005. The Leptospira interrogans lexA gene is not autoregulated. J. Bacteriol. 187: 5841 - 5845.

La Tesi descriu la prevalença de les soques portadores de betalactamases d'espectre ampliat (BLEA), cefamicinases i carbapenemases, principals mecanismes de resistència als antibiòtics betalactàmics, no només en l'àmbit clínic [mostres clíniques i malalts atesos al Servei d'Urgències (portadors fecals)] sinó en altres ecosistemes com en els subsòls de granges d'animals (aus, porcs i conills), en aigües residuals humanes, en aliments, i en portadors fecals afectats per un brot alimentari. A més a més s'han caracteritzat aquests enzims per tal de determinar la freqüència de cadascun dels tipus de betalactamases presents: tipus TEM, SHV i CTX-M com a BLEA, CMY, DHA o ACC com a cefamicinases, o VIM, IMP i altres com a carbapenemases. La conclusió del treball mostra com aquests enzims es poden trobar en tots els ecosistemes avaluats i, per tant, com la selecció de soques portadores d'aquests no es dóna només en l'àmbit clínic sinó que roman en tot l'entorn humà. Per altra banda, arran d'aquest treball s'han descrit dues noves betalactamases, la CTX-M-14b, i la CTX-M-51, ambdues derivades de la CTX-M-9. El fet que les soques portadores d'aquests enzims s'hagin trobat en tots els àmbits és causa de greu preocupació. Cal, doncs, intentar evitar la selecció d'aquestes soques, així com esbrinar quin o quins són els mecanismes que han permès aquesta expansió. L'estudi epidemiològic dels mecanismes de resistència, és de gran interès, no només en l'àmbit clínic sinó també veterinari, perquè coneixent la prevalença i el tipus d'enzims implicats es pot actuar oportunament dissenyant polítiques d'antibiòtics correctes. / This thesis describes the prevalence of strains carrying extended spectrum betalactamase (ESBL), plasmid-mediated AmpC and carbapenemase. There are the main mechanism of betalactam resistance, not only in clinic environment [clinical samples and patients attending the emergency room (faecal carriers)] also in others environments such as the floor of animal farms (poultry, pig and rabbit), the urban sewage, food, and human faecal carriers in the context of food-borne disease outbreaks. We have characterized these enzymes to know the frequency of each type of betalactamase: TEM, SHV and CTX-M type as ESBL, CMY, DHA and ACC as plasmid-mediated AmpC, or VIM, IMP and others as carbapenemase. The work's conclusion show's that these enzymes can be found in all environments evaluated. Then the selection of strains carrying this kind of enzymes is due not only to clinic environments otherwise to all human environments. In the other hand, we have described two new betalactamase, CTX-M-14b and CTX-M-51, both deriving from CTX-M-9.The finding of strains carrying these enzymes in all the environments is of great concerning. We need not to select these strains, and to know what are the mechanisms of expansion of these enzymes. The epidemiologic study of the resistance mechanism is of great interest, not only in hospitals also in veterinarian environment, because knowing the prevalence and the type of enzymes, we can design specific antibiotic policy.