Los tapones de corcho se utilizan desde hace muchos años para cerrar botellas que contienen diferentes tipos de vinos. Por este motivo, los tapones de corcho deben ser considerados productos en contacto con bebidas de consumo humano y en consecuencia deberían estar legislados los límites aceptables para cumplir con la seguridad alimentaria. Las normativas existentes, para tapones de corcho, hasta hoy, en el ámbito microbiológico solo exigen recuentos totales de hongos filamentosos y levaduras y de bacterias aerobias mesófilas. El principal objetivo de este trabajo es determinar si los hongos presentes en los tapones de corcho son capaces de elaborar y acumular micotoxinas que difundan a los vinos y en consecuencia proponer si es preciso, los límites tanto de recuentos fúngicos como de especies fúngicas y de sus micotoxinas en estos productos Para desarrollar este objetivo se ha realizado una identificación de las cepas de hongos existentes en los tapones de corcho y se han separado las que a nivel bibliográfico se citan como capaces de elaborar las micotoxinas legisladas.A partir de cultivos específicos se han realizado recuentos y extracciones a los 7, 14 y 21 días con el fin de llevar a cabo cromatografías en capa fina y poder verificar si las cepas seleccionadas son productoras de micotoxinas. Asimismo se ha estudiado la actividad inhibitoria y se ha evaluado la actividad enzimática de estas cepas.Posteriormente se ha esterilizado diferentes tipos de tapones de corcho y se ha comprobado si se han modificado sus características. Tras la esterilización, se procedió a inocular las ocho cepas de hongos productoras de micotoxinas, objeto de este estudio. Se ha calculado el porcentaje de recuperación de los hongos inoculados y se han realizado extracciones para verificar por medio de la cromatografía en capa fina, la producción de micotoxinas.A continuación, se ha procedido a adaptar una técnica ELISA para determinar y cuantificar las micotoxinas legisladas (aflatoxinas, ochratoxinas, fumonisinas, DON5/5, zearalenona y toxina T-2) en estos tapones de corcho inoculados con las cepas de hongos productores.Para reflejar la realidad del sector corchero se han seleccionado tapones de mercado que han sido sometidos a un proceso de extracción y posterior evaluación por la técnica ELISA para cuantificar las posibles micotoxinas existentes.Finalmente se han realizado inoculaciones de micotoxinas en diferentes tipos de tapones de corcho y se han introducido en botellas de vino, para poder determinar el grado de migración de estas micotoxinas al vino.A partir de los resultados obtenidos se proponen valores límite de presencia en los diferentes tipos de tapones de corcho de las cepas de hongos productores de micotoxinas y de las micotoxinas legisladas. / The cork plugs are utilized since many years ago to close bottles that contain different types of wines. For that reason, the cork plugs should be you considered products in contact with beverages of human consumption and consequently they should be legislated the acceptable limits to comply with the eating security. The existing regulations, for cork plugs, until today, in the environment microbiological alone they require total recounts of filamentous mushrooms and yeasts and of bacteria aerobics mesófilasThe main objective of this work is to determine if the present mushrooms in the cork plugs are capable of devising and to accumulate micotoxins that diffuse to the wines and consequently to propose if is to be exact, the so much limits of recounts funguses as of species funguses and of its micotoxinas in these products.To develop this objective has been carried out an identification of the stumps of existing mushrooms in the cork plugs and the ones have been separated that to bibliographical level are cited like capable of devise the micotoxins legislated. From specific cultivations recounts they have been carried out and extractions to the 7, 14 and 21 days in order to carry out chromatography in fine layer and to be able to verify if the stumps selected are producers of micotoxinsLikewise the inhibitory activity has been studied and the enzymatic activity of these stumps has been evaluated. Subsequently it has been sterilized different types of cork plugs and has been verified if its characteristics have been modified. After the sterilization, proceeded to inoculate the eight stumps of producing mushrooms of micotoxins, object of this study. The percentage of recovery of the mushrooms has been calculated inoculated and extractions have been carried out to verify through the chromatography in fine layer, the production of micotoxins. Subsequently, it has proceeded to adapt a technical one ELISA to determine and to quantify the micotoxins legislated (aflatoxins, ochratoxins, fumonisins, DON, zearalenone and toxin T-2) in these cork plugs inoculated with the stumps of producing mushrooms. To reflect the reality of the cork sector plugs of market they have been selected that have been submitted to a process of extraction and subsequent evaluation by the technical one ELISA for quantify the possible micotoxins existing. Finally inoculations have been carried out of micotoxins in different types of cork plugs and they have been introduced in bottles of wine, to be able to determine the degree of migration of these micotoxins al came. From the results obtained presence limit values in the different types of cork plugs of the stumps of producing mushrooms are proposed of micotoxins and of the micotoxins they legislated.

El presente trabajo de tesis estudia diferentes mutantes zeste1 y el efecto que esta mutación tiene sobre la regulación de la transcripción en diversos genes. En primer lugar se estudiaron los machos de las cepas M115 y RM115 cuya característica principal, además de ser portadores de la mutación z1, es la inserción de un elemento FB-NOF en el tercer intrón del gen CG32795, que forma con white un par de genes head-to-tail. Para estudiar el efecto de la inserción de FB-NOF en un entorno z1, fue necesario en primer lugar caracterizar el gen CG32795, a nivel de secuencia del mRNA y de predicción de la posible función de la proteína codificada. Se encontraron diversas variantes de splicing, tanto para su extremo 5' como para el 3', parecidas pero diferentes de las variantes predichas anteriormente. Conociendo más en profundidad este gen, nos propusimos estudiar los posibles efectos de la inserción de FB-NOF respecto a la expresión de los genes w y CG32795. Los resultados nos llevaron a un estudio más detallado de la expresión de w en diferentes partes del cuerpo, teniendo en cuenta la especificidad de tejido que la interacción zeste-white presenta. Así, demostramos que el gen w no se ve afectado por la inserción de FB-NOF en su extremo 3' y que las diferencias de expresión observadas son debidas a la duplicación del Zeste Binding Site de w en un entorno z1. Sin embargo, la inserción de FB-NOF en el tercer intrón de CG32795 si modifica la expresión de este gen. La inserción no es sólo responsable de la alteración de la expresión de CG32795 sino también la reordenación que se produce en la cepa RM115 eliminando la copia de w original y dejando la que se duplicó en M115.La segunda parte de esta tesis estudia las hembras mutantes z1. Analizamos la expresión de dos genes con un ZBS (w y dpp) y observamos como se reduce la expresión de dichos genes en las hembras z1. Además, estudiando la expresión del gen CG32795 constatamos que el efecto de la interacción zeste-white es local, sin afectar a CG32795 aunque su extremo 5' se encuentra a tan solo 700bp del extremo 3' del gen w. La reducción de la expresión podría ser debida a alteraciones en la estructura de la cromatina, puesto que los agregados de Zeste en los ZBS son los responsables de reclutar el complejo remodelador de la cromatina BRM, facilitando así la transcripción. Mediante un ensayo de nucleasa micrococal detectamos algunas modificaciones en el posicionamiento de nucleosomas en los ZBS de w y dpp, siendo el posicionamiento en las hembras z1 más estricto. Si el complejo BRM es el responsable de estas diferencias, los patrones de metilación también podrían verse alterados, pues muchos factores asociados a los complejos SWI/SNF se han relacionado con actividades de regulación de la expresión mediante modificación de los mismos. Mediante el ensayo de modificación del DNA por bisulfito sódico estudiamos los patrones de metilación de cinco regiones. Sorprendentemente, el ZBS de w y de dpp, así como las regiones próximas a ellos, se encontraban hipometilados en las hembras z1. El desconocimiento general sobre la metilación en D. melanogaster nos hizo plantear cuales pueden ser las secuencias diana de la metilación en esta especie. Así realizamos un estudio estadístico sobre cuales son las dos bases anteriores y posteriores a las Cs metiladas en nuestras secuencias. Se obtuvieron diferencias en las frecuencias de cada posición y se estableció como secuencia más frecuente para ser metilada ApDp5mCpDpD. Aún así, es una secuencia muy degenerada, y se hacen necesarios estudios más profundos y amplios para confirmarla. / The present PhD thesis studies several zeste1 mutants and this mutation effect over the transcriptional regulation of some genes. The first part is based on the study of the males of M115 and RM115 strains, mainly characterized by the z1 mutation and the insertion of a FB-NOF element in the third intron of the CG32795 gene, known to form a head-to-tail gene pair with white. To study the FB-NOF insertion effect on a z1 background firstly we need to characterize the CG32795, its mRNA sequence and the codified protein predicted structure and function. Several splicing variants were found, not only for its 5' end but also for its 3'end, similar but different from the ones been predicted previously. Once obtained this information we proceeded to study the effects of the FB-NOF insertion over the w and the CG32795 gene expression. The results lead us to a deeper study of the w expression in different body segments, taking into account the zeste-white interaction tissue specificity. Thus, we proved that the w gene expression is not affected by the FB-NOF insertion downstream of its 3' end. The differences observed in the w expression levels were due to the duplication of the w Zeste Binding Site in a z1 background. On the contrary, the FB-NOF insertion not only does modify CG32795 expression, but also mediates the reordenation produced in the RM115 strain being responsible of the w original copy lost and leaving alone the w copy duplicated in the M115 strain.The second part studies the z1 female mutants. We analyzed the expression of two genes possessing a ZBS (w and dpp). The results obtained showed an expression reduction for both genes in the z1 females. Moreover, through the study of the CG32795 gene expression we showed that the zeste-white interaction effect is local, not having any effect on CG32795 expression even though its 5' end is located at only 700bp from the w gene 3' end. Knowing that the Zeste aggregates in the ZBS recruit the chromatin remodelling complex BRM, facilitating thus transcription, we thought that the expression reduction might occur due to chromatin structure alterations. A micrococal nuclease assay was performed and some modifications in nucleosome positioning were found in w and dpp ZBS, being the positioning in the z1 females stricter. Were the BRM complex responsible of those differences, the DNA methylation patterns might also be changed, since many SWI/SNF associated factors have been related to expression regulation duties through DNA methylation patterns modification. A bisulphite modification assay was performed, studying the DNA methylation pattern of five different regions. Surprisingly, w and dpp ZBS and the regions surrounding them were hypomethylated in the z1 females. The little information available about DNA methylation in D. melanogaster encouraged us to study the DNA methylation sites in this specie. Our sequences were statistically analyzed including the two bases before and after the methylated cytosine. The results showed differences in the each nucleotide frequency in each position. The preferently methylated "consensus sequence": ApDp5mCpDpD. However, it is a much degenerated sequence and deeper and broader studies are required to confirm it.

La resistència als antimicrobians és un procés natural, que com a conseqüència del seu ús ha afavorit la selecció de mutants, l'adquisició de gens de resistència i el sobrecreixement de bacteris intrínsecament resistents als antimicrobians.Els β-lactàmics són una de les famílies més emprades en la pràctica clínica, essent el mecanisme enzimàtic el mecanisme de resistència més important. En enterobacteris els enzims que prenen més importància són les β-lactamases d'espectre ampliat (BLEA) i les cefamicinases (pAMPCt).L'objectiu d'aquest treball fou determinar la prevalença d'aquests enzims en els enterobacteris aïllats a L'Hospital de la Santa Creu i Sant Pau en el període comprés entre 1994 i 2004. Els estudis de sensibilitat en Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae mostren un clar increment de la resistència a cefalosporines de tercera generació (C3G) i aztreonam, fruit d'una major prevalença de soques portadores de BLEA i pAMPCt. La prevalença de soques productores de BLEA en el decenni 1994-2004 ha estat del 1,1% i del 1,6%, respectivament. Les BLEA més freqüents en E. coli han estat les del grup CTX-M (77,5%), essent l'enzim CTX-M-9 el més descrit (43%) mentre que en K. pneumoniae tant les BLEA del grup CTX-M com les SHV han tingut una prevalença similar (50%). K. pneumoniae portador de BLEA ha estat, i encara és, majoritàriament, un patogen nosocomial. En ambdues espècies, les pAMPCt han presentat, respectivament, una prevalença del 0,16%.i del 0,22% amb una clara presència de soques portadores de CMY-2. Els estudis de sensibilitat mostren que en les espècies amb una β-lactamasa cromosòmica induïble tipus AmpC (Enterobacter, Citrobacter freundii i Morganella morganii) no hi ha hagut un increment de la resistència a C3G, indicatiu d'una possible desrepressió de l'enzim, essent el percentatge de soques amb fenotip de desrepressió del voltant del 30% en Enterobacter i C. freundii i del 7,5% en M. morganii.En Klebsiella oxytoca el principal mecanisme implicat és la hiperproducció de llur β-lactamasa cromosòmica que confereix resistència a l'aztreonam. La prevalença d'aquest mecanisme ha incrementat d'un 4% a un 44%. Per altra banda, s'han trobat dues soques productores de BLEA (CTX-M-9 i CTX-M-32).En Proteus mirabilis, s'ha pogut observat al llarg dels deu anys un lleuger increment de la resistència a l'associació amoxicil·lina-àcid clavulànic i de manera puntual l'aparició de soques productores de pAmpCt (tres soques amb CMY-2) o de BLEA (una soca amb CTX-M-1).En Salmonella enterica cal destacar l'aïllament de tres soques productores de BLEA (dues CTX-M-9 i una CTX-M-14) i una soca productora de CMY-2.La resistència a carbapenems ha estat pràcticament nul·la en totes les espècies estudiades. Malauradament, la resistència als β-lactàmics va associada a la resistència a d'altres famílies d'antimicrobians. Les soques productores de BLEA presentaven uns percentatges de resistència a fluoroquinolones, tetraciclina, trimetoprim-sulfametoxazol, cloramfenicol i aminoglicòsids, del 84%, 56%, 52%, 35% i 14%, respectivament mentre que les soques productores de cefamicinasa presentaven uns percentatges de resistència a cloramfenicol, fluoroquinolones, aminoglicòsids, trimetoprim-sulfametoxazol i tetraciclina del 85%, 77%, 67%, 57%, i, 56%, respectivament. De l'estudi de les resistències associades dels antibiòtics no β-lactàmics a la producció de BLEA o pAmpCt no s'ha obtingut un patró predominant associat a cada tipus de β-lactamasa. / Antimicrobial resistance is a natural process but the abuse and misuse of antimicrobial agents has favored the selection of mutants, the acquisition of resistance and the overgrowth of bacteria intrinsically resistant to these drugs. β-lactams (as cephalosporins) are one of the most widely used agents in clinical practice and their main mechanism of resistance by the bacteria is the production of enzymes known as β-lactamases. In Enterobacteriaceae, the Extended-Spectrum-β-lactamases (ESBLs) and plasmid-mediated AmpC enzymes (pAmpCt) are the most relevant of these enzymes.The aim of this study was to determine the prevalence and diversity of Extended-Spectrum-β-lactamases (ESBLs) and plasmid-mediated AmpC enzymes (pAmpCt) isolated from Enterobacteriaceae at Hospital de la Santa Creu i Sant Pau between 1994 and 2004.Results of the susceptibility studies in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae showed a clear increase in third generation cephalosporins (C3G) and aztreonam resistance due to a major prevalence of ESBLs- and pAmpCt-producing strains. The prevalence of ESBL-producing strains from 1994 to 2004 was between 1.11% and 1.6%. In E. coli, the ESBL CTX-M-type was the most frequent (77.5%) due to CTX-M-9-producing strains (43%). In K. pneumoniae, the CTX-M-type as well as the SHV-type had the same prevalence (50%). The prevalence of pAmpC-t in both species increased from 0.16% to 0.22%, with a clear presence of the CMY-2 enzyme. We did not observe an increase in C3G resistance in the chromosomally-depressed AmpC beta-lactamase-producing strains such as Enterobacter, Citrobacter freundii or Morganella morganii. Prevalence was about 30% in Enterobacter and C. freundii and 7.5% in M. morganii.In Klebsiella oxytoca, the main mechanism involved in β-lactam resistance was the depression of its chromosomal β-lactamase, observable because the strains become resistant to aztreonam. The prevalence of this mechanism increased from 4 to 44%. We also found two ESBL-producing strains (CTX-M-9 and CTX-M-32).In Proteus mirabilis, we isolated one ESBL-producing strain (CTX-M-1), and observed a slight increase in coamoxiclav resistance due to three CMY-2 producing strains. In Salmonella enterica three ESBL- producing strains (two CTX-M-9 and one CTX-M-14) and one CMY-2-producing strain were found.β-lactam resistance was associated with other antimicrobial drug resistance. ESBL-producing strains showed rates of resistance to fluoroquinolones, tetracycline, trimethoprim-sulfamethoxazole, chloramphenicol and aminoglycosides of 84%, 56%, 52%, 35% and 14%, respectively. pAmpCt-producing strains showed rates of resistance to chloramphenicol, fluoroquinolones, aminoglycosides, tetracycline and trimethoprim-sulfamethoxazole of 85%, 77%, 67%, 57% and 56%, respectively. No predominant pattern was associated to β-lactams resistance in ESBL or pAmpCt-producing strains.

El sistema SOS és una xarxa multigènica controlada negativament per la proteïna LexA, i està format per un conjunt de gens implicats en el manteniment de la viabilitat cel·lular davant de lesions en el DNA. Aquest sistema es troba en la majoria d'espècies bacterianes, malgrat que existeixen diferències tant en la seqüència d'unió de la proteïna LexA, com en el contingut genètic del reguló. En la present memòria es descriu el sistema SOS de Pseudomonas putida, un bacteri gramnegatiu pertanyent al grup Gamma. Primerament s'han clonat els dos gens lexA, anomenats lexA1 i lexA2, i s'han obtingut els seus productes gènics mitjançant sobreexpressió i purificació per columnes d'afinitat. Ambdues proteïnes s'han utilitzat en assaigs de mobilitat electroforètica (EMSA) amb els promotors de cada un dels gens lexA. Així s'ha pogut identificar la seqüència d'unió de la proteïna LexA1 (CTGTN8ACAG) i de la proteïna LexA2 (AGTACN4GTGCT). Posteriorment, utilitzant RT-PCR, s'ha vist com el gen lexA2 constitueix una única unitat transcripcional amb els gens que el segueixen, formant el casset lexA2-imuA-imuB-dnaE2. Aquest casset s'ha vist que és induïble per danys en el DNA, i que es troba àmpliament distribuït en el domini Bacteria. Seguidament, s'han obtingut dues soques mutants defectives pels gens lexA1 i lexA2, i s'ha analitzat l'expressió gènica de cada una d'elles, respecte la soca salvatge, utilitzant xips de DNA (microarrays). Els resultats obtinguts han demostrat que la proteïna LexA1 controla la majoria de gens del sistema SOS, que a més corresponen amb la resposta convencional del seu grup filogenètic; mentre que la proteïna LexA2 només regula l'expressió de la seva pròpia unitat transcripcional, i la d'un gen (PP3901) pertanyent a un profag resident de P. putida. A més, aquest gen també es troba controlat per la proteïna LexA1, essent l'únic que comparteix les dues regulacions. L'obtenció d'un mutant defectiu pel gen PP3901 ha demostrat que l'expressió d'aquest és necessària per a la transcripció dels gens del profag resident. L'expressió d'aquest profag, però, no origina cap efecte deleteri apreciable sobre el creixement de P. putida. / The SOS system is a multigenic network negatively controlled by the LexA protein, and is composed of a set of genes involved in maintaining cell viability against DNA lesions. This system is present in most bacterial species, despite the existence of differences in the binding sequence of the LexA protein, and in the genetic content of regulon. The present report describes the SOS system of Pseudomonas putida, a Gram negative bacteria belonging to the Gamma proteobacteria group. Firstly we have cloned the two lexA genes, called lexA1 and lexA2 and we have obtained their genetic products through gene overexpression and purification by affinity columns. Both proteins have been used in electroforetic mobility shift assays (EMSA) with the promoters of each of the lexA genes. By this way we could identify the recognition sequence of the LexA1 protein (CTGTN8ACAG) and the LexA2 protein (AGTACN4GTGCT). Subsequently, using RT-PCR, we could see that the lexA2 gene forms a single transcriptional unit with the genes that follow it, forming the cassette lexA2-imuA-imuB-dnaE2. This cassette has been seen that is inducible by DNA damage, and that it is present in many Proteobacteria families. Then, we constructed two defective mutant strains of lexA1 and lexA2 genes, and their gene expression has been analyzed using DNA chips (microarrays). The results have shown that the LexA1 protein controls most of the SOS genes, which also correspond with the conventional response of its phylogenetic group; while LexA2 protein only regulates its own transcriptional unit expression, and a gene (PP3901) belonging to a resident P. putida prophage. In addition, this gene is also controlled by the LexA1 protein, being the only one who shares the two regulations. The construction of a PP3901 defective strain, dempnstrated that the expression of this gene is required for the transcription of the resident prophage genes. However, the expression of the prophage genes, do not cause any significant deleterious effect on the growth of P. putida.

No description available.

La variació genètica és la pedra angular de l'evolució biològica. La descripció i explicació de les forces que controlen la variació genètica dins i entre poblacions és el principal objectiu de la genètica de poblacions. L'obtenció d'un número explosiu de seqüències nucleotídiques a diferents gens i espècies ha canviat radicalment les perspectives de la genètica de poblacions, transformant-la des d'una ciència empírica insuficient fins a un esforç interdisciplinari de gran abast, on els aparells de generació de noves seqüències a gran escala s'integren amb eines bioinformàtiques per a l'extracció i gestió de dades, juntament amb avançats models teòrics i estadístics per a la seva interpretació. Aquesta tesi és un projecte de bioinformàtica i genètica de poblacions complet, l'objectiu principal del qual és l'estudi de la diversitat genètica a les poblacions. S'ha dut a terme en tres passos seqüencials: (i) el desenvolupament d'eines per a l'extracció, processat, filtrat i control de qualitat de seqüències nucleotídiques, (ii) la generació de bases de dades de coneixement a partir de les dades obtingudes a la primera part i (iii) la prova d'hipòtesis que requereixen de dades de varies espècies i loci. A la primera part de la tesi hem desenvolupat PDA (Pipeline Diversity Analysis), una aplicació Web de codi obert que permet l'exploració del polimorfisme a grans conjunts de seqüències de DNA heterogènies. Aquesta eina es nodreix dels milions de seqüències haplotípiques d'estudis individuals que hi ha emmagatzemades a les principals bases de dades moleculars i genera dades de genètica de poblacions que poden ser utilitzades per a descriure patrons de variació nucleotídica a qualsevol espècie o gen. Totes les dades extretes i analitzades a la primera part de la tesi són utilitzades a la segona part per a crear un recurs via Web complet que proporciona col·leccions de seqüències polimòrfiques amb les seves mesures de diversitat associades en el gènere Drosophila (DPDB, Drosophila Polymorphism Database). Aquest recurs ha significat un repte ambiciós que ha permès posar a prova l'eficiència del sistema creat a la primera part.Finalment, s'inclouen dos estudis que utilitzen els mòduls d'extracció i anàlisi de dades desenvolupats a la primera part. En el primer, hem estudiat patrons de variació genètica per a inferir selecció negativa i positiva a seqüències conservades no codificadores a Drosophila. Per a aquest estudi hem utilitzat dades de re-seqüenciació a D. melanogaster junt amb dades genòmiques comparatives a d'altres espècies de Drosophila per a demostrar que les regions fredes de mutació no poden explicar aquests blocs conservats. Els resultats mostren que les seqüències conservades no codificadores són mantingudes per l'acció de la selecció purificadora. El segon estudi es centra en l'evolució codificant dels gens Hox, una classe de factors de transcripció essencials en el desenvolupament primerenc que estan involucrats en l'especificació de les regions al llarg de l'eix anteroposterior del cos. Hem mesurat les taxes de divergència nucleotídica i de fixació d'insercions i delecions a tres gens Hox, i les hem comparat amb les de tres gens derivats de Hox i un conjunt de gens no Hox per a provar la hipòtesi que els gens Hox evolucionen lentament. Els resultats mostren que tant el número de substitucions no sinònimes com el grau de constrenyiment funcional no són significativament diferents entre els gens Hox i els no Hox, i que els gens Hox i els derivats de Hox contenen significativament més insercions i delecions que els gens no Hox a les seves seqüències codificants. Per tant, els gens Hox evolucionen més ràpidament que altres gens essencials expressats al desenvolupament primerenc, amb patrons d'expressió complexos o amb introns llargs rics en elements cis-reguladors.Resumint, els treballs presentats a aquesta tesi tanquen un cicle complet de projecte bioinformàtic, incloent tots els passos necessaris des de l'extracció de dades fins a la generació de nou coneixement científic. És més, el resultat de cada pas és la llavor per a múltiples possibles estudis en el següent pas, i per tant aquesta tesi té moltes aplicacions per a la comunitat científica. / La variación genética es la piedra angular de la evolución biológica. La descripción y explicación de las fuerzas que controlan la variación genética dentro y entre poblaciones es el principal objetivo de la genética de poblaciones. La obtención de un número explosivo de secuencias nucleotídicas en distintos genes y especies ha cambiado radicalmente las perspectivas de la genética de poblaciones, transformándola desde una ciencia empírica insuficiente a un esfuerzo interdisciplinario de un gran alcance, donde los aparatos de generación de nuevas secuencias a gran escala se integran con herramientas bioinformáticas para la extracción y gestión de datos, junto a avanzados modelos teóricos y estadísticos para su interpretación.Esta tesis es un proyecto de bioinformática y genética de poblaciones completo, cuyo objetivo es el estudio de la diversidad genética en las poblaciones, que se ha llevado a cabo en tres pasos secuenciales: (i) el desarrollo de herramientas para la extracción, procesado, filtrado y control de calidad de secuencias nucleotídicas, (ii) la generación de bases de datos de conocimiento a partir de los datos obtenidos en la primera parte y (iii) la puesta a prueba de hipótesis que requieren de datos de varias especies y loci. En la primera parte de la tesis hemos desarrollado PDA (Pipeline Diversity Analysis), una aplicación Web de código abierto que permite la exploración del polimorfismo en grandes conjuntos de secuencias de DNA heterogéneas. Esta herramienta se alimenta de los millones de secuencias haplotípicas de estudios individuales que hay almacenados en las principales bases de datos moleculares y genera datos de genética de poblaciones que pueden ser utilizados para describir patrones de variación nucleotídica en cualquier especie o gen. Todos los datos extraídos y analizados en la primera parte de la tesis son utilizados en la segunda parte para crear un recurso vía Web completo que proporciona colecciones de secuencias polimórficas con sus medidas de diversidad asociadas en el género Drosophila (DPDB, Drosophila Polymorphism Database). Este recurso ha significado un reto ambicioso que ha permitido poner a prueba la eficiencia del sistema creado en la primera parte.Finalmente, se incluyen dos estudios que utilizan los módulos de extracción y análisis de datos desarrollados en la primera parte. En el primero, hemos estudiado los patrones de variación genética en secuencias conservadas no codificadoras para inferir selección negativa y positiva en Drosophila. En este estudio hemos utilizado datos de re-secuenciación en D. melanogaster junto con datos genómicos comparativos en otras especies de Drosophila para demostrar que las regiones frías de mutación no pueden explicar estos bloques conservados. Los resultados muestran que las secuencias conservadas no codificadoras se mantienen por la acción de la selección purificadora. El segundo estudio se centra en la evolución codificadora de los genes Hox, una clase de factores de transcripción esenciales en el desarrollo temprano que están involucrados en la especificación de las regiones a lo largo del eje anteroposterior del cuerpo. Hemos medido las tasas de divergencia nucleotídica y de fijación de inserciones y deleciones en tres genes Hox, y las hemos comparado con las de tres genes derivados de Hox y un conjunto de genes no Hox para probar la hipótesis que los genes Hox evolucionan lentamente. Los resultados muestran que tanto el número de sustituciones no sinónimas como el grado de constreñimiento funcional no son significativamente distintos entre los genes Hox y los no Hox, y que los genes Hox y los derivados de Hox contienen significativamente más inserciones y deleciones que los genes no Hox en sus secuencias codificadoras. Así, los genes Hox evolucionan más rápidamente que otros genes esenciales expresados en el desarrollo temprano, con patrones de expresión complejos o con intrones largos ricos en elementos cis-reguladores.En síntesis, los trabajos presentados en esta tesis cierran un ciclo completo de proyecto bioinformático, incluyendo todos los pasos necesarios desde la extracción de datos hasta la generación de nuevo conocimiento científico. Es más, el resultado de cada paso es la semilla para múltiples posibles estudios en el siguiente paso, y por lo tanto esta tesis tiene muchas aplicaciones para la comunidad científica. / Genetic variation is the cornerstone of biological evolution. The description and explanation of the forces controlling genetic variation within and between populations is the main goal of population genetics. The deciphering of an explosive number of nucleotide sequences in different genes and species has changed radically the scope of population genetics, transforming it from an empirically insufficient science into a powerfully explanatory interdisciplinary endeavor, where high-throughput instruments generating new sequence data are integrated with bioinformatic tools for data mining and management, and advanced theoretical and statistical models for data interpretation. This thesis is an integrative and comprehensive bioinformatics and population genetics project whose central topic is the genetic diversity of populations. It is accomplished in three sequential steps: (i) the development of tools for data mining, processing, filtering and quality checking of raw data, (ii) the generation of databases of knowledge from refined data obtained in the first step, and (iii) the testing of hypotheses that require multi-species and/or multi-locus data. In the first part of the thesis, we have developed PDA Pipeline Diversity Analysis , an open-source, web-based tool that allows the exploration of polymorphism in large datasets of heterogeneous DNA sequences. This tool feeds from the millions of haplotypic sequences from individual studies that are stored in the main molecular biology databases, and generates high-quality, population genetics data that can be used to describe patterns of nucleotide variation in any species or gene. All the extracted and analyzed data resulting from the first part of this thesis is used in the second step to create a comprehensive on-line resource that provides searchable collections of polymorphic sequences with their associated diversity measures in the genus Drosophila (DPDB Drosophila Polymorphism Database ). This resource means an ambitious pledge to test the efficiency of the system created in the first part.Finally, two different studies that make use of the modules of data mining and analysis developed are shown. First, we study patterns of sequence variation to infer constraint and adaptation in Drosophila conserved noncoding sequences (CNSs). For this study we have used population genetics re-sequencing data from D. melanogaster together with comparative genomic data from other Drosophila species. We show that patterns of nucleotide sequence evolution in Drosophila CNSs are incompatible with the notion that mutational cold-spots explain these conserved blocks. Rather, the results support the hypothesis that CNSs are maintained by the action of purifying selection. The second study focuses on the coding evolution of Hox genes, a class of essential transcription factors expressed early in development that are involved in the specification of regional identities along the anteroposterior body axis. We have measured the rates of nucleotide divergence and fixation of insertions and deletions of three Hox genes, and compared them with those of three Hox-derived genes and a set non-Hox genes to test the hypothesis that Hox genes evolve slowly. Our results show that both the number of nonsynonymous substitutions and the degree of functional constraint are not significantly different between Hox and non-Hox genes, and that Hox and Hox-derived genes contain significantly more insertions and deletions than non-Hox genes in their coding sequences. Thus, Hox genes evolve faster than other essential genes expressed early in development, with complex expression patterns or with long introns rich in cis-regulatory elements.As a whole, the works presented in this thesis round a complete bioinformatics project off, including all the necessary steps from mining the data to generating new scientific knowledge. More interestingly, the outcome of each step is the seed of multiple possible studies in the next step, and thus this thesis has many applications for the scientific community.

Streptococcus suis es un importante patógeno que causa grandes pérdidas económicas en la industria porcina a nivel mundial, siendo también un importante agente zoonótico. Aunque son varias las aproximaciones que se han desarrollado mediante vacunas vivas o recombinantes para prevenir las enfermedades provocadas por S. suis, los esfuerzos para controlar su infección se ven dificultados por la falta de herramientas efectivas contra este patógeno.Diferentes tipos de transportadores implicados en la captación de cationes divalentes y asociados a la pared celular, entre ellos los transportadores ABC, se relacionan con la virulencia bacteriana y presentan propiedades inmunogénicas contra las especies bacterianas de las que derivan. Atendiendo a todas estas características, se han desarrollado estrategias para producir vacunas contra las bacterias patógenas basadas en la sobreexpresión en la superficie celular bacteriana de transportadores de cationes divalentes inducidos mediante agentes quelantes o a través de la construcción de cepas deficientes en los represores de la transcripción de estos transportadores. En este contexto, el objetivo del presente trabajo ha sido estudiar los mecanismos de captación de cationes divalentes de S. suis, así como su papel en la virulencia y su posible uso para el desarrollo de herramientas eficaces contra este patógeno. Para abordar el objetivo propuesto, se identificaron in silico diversos transportadores de S. suis implicados en la captación de zinc y hierro y también sus posibles reguladores (AdcR y Fur, respectivamente). Además, se clonó el gen adcR de S. suis, que codifica un posible regulador de los transportadores implicados en la captación de Zn2+ y/o Mn2+ en Streptococcus spp., se purificó la proteína AdcR y mediante ensayos con DNasaI (footprinting) y de movilidad electroforética se demostró, por primera vez, que dicha proteína reconoce y se une específicamente a la secuencia TTAACNRGTTAA. Asimismo, también se ha demostrado que in vitro se requiere Zn2+ o Mn2+ para establecer dicha unión y que la proteína AdcR controla la expresión de los genes que codifican las proteínas SsuiDRAFT 0103 y SsuiDRAFT 1237, componentes de transportadores ABC implicados en la captación de zinc y/o manganeso. Por otra parte, se clonó el gen fur de S. suis, que codifica el posible regulador de los transportadores implicados en la captación de Fe2+, y se sobreexpresó su producto en Escherichia coli. Ensayos de movilidad electroforética con extracto crudo de esta cepa de E. coli mostraron que la proteína Fur de S. suis controla la expresión de los genes feoAB, implicados en la captación de hierro.Seguidamente, se obtuvieron mutantes mediante la deleción de los genes adcR y fur en una cepa virulenta de S. suis con el objetivo de caracterizar ambos regulones. Varios transportadores implicados en la captación de cationes aparecieron desreprimidos en las cepas mutantes cuando la expresión génica fue comparada con la de la cepa salvaje a través de ensayos de RT-PCR a tiempo real. En concordancia con ello, los ensayos de movilidad electroforética mostraron que estos reguladores se unen específicamente al promotor de dichos genes. Asimismo, la ausencia de los genes adcR y/o fur en un estreptococo patógeno mostró, por primera vez, una importante atenuación de su virulencia en el modelo animal de ratón.Finalmente, se abordaron estudios de inmunogenicidad y protección. Para ello, se purificaron tres proteínas periplásmicas de S. suis implicadas en la captación de cationes divalentes (SsuiDRAFT 0103, SsuiDRAFT 0174 y SsuiDRAFT 1237), resultando ser todas ellas inmunogénicas, aunque sólo SsuiDRAFT 0103 confiere una protección significativa contra S. suis en el modelo animal de ratón. Además, las proteínas Ssu0309 y Ssu1103 asociadas a la pared celular, que están sobreexpresadas en el mutante adcR, fueron identificadas mediante espectrometría de masas como factores de virulencia pertenecientes a la familia de proteínas Pht (Pneumococcal histidine triad). Asimismo, se estudiaron las propiedades protectoras de las cepas mutantes demostrándose que aunque enteras no confieren protección contra S. suis en el modelo animal de ratón, las proteínas asociadas a la pared celular del doble mutante adcR fur sí que inducen una protección significativa ante una infección con la cepa virulenta de S. suis 89/1591 en dicho modelo. / Streptococcus suis is an important pathogen that causes significant economical losses in the swine industry worldwide and it is also an important zoonotic agent. Although several approaches to develop either live or recombinant vaccines to prevent S. suis-mediated disease have been tested, efforts to control the infection are hampered by the lack of effective weapons against this pathogen.Different cell-wall-associated transporters involved in divalent-cation uptake, including ABC transporters, have been shown to be involved in bacterial virulence and have immunogenic properties against the bacterial species from which they are derived. Accordingly, several strategies have been developed to produce vaccines against this pathogenic bacterium. One of them involves overexpression on the bacterial cell surface of divalent-cation-uptake transporters induced by chelator agents or by the construction of deficient strains in the cation-uptake repressors. In this context, the aim of this work has been to study the S. suis-cation-uptake mechanisms and their role in virulence as well as their putative use as a tool to achieve broad protection against this pathogen. To achieve this purpose, several transporters involved in zinc and iron uptake and their putative regulators (AdcR and Fur, respectively) have been identified in silico. Furthermore, the S. suis adcR gene, which encodes a predicted regulator of Zn2+ and/or Mn2+ uptake in streptococci, was cloned and its protein product was purified. Footprinting and electrophoretic mobility shift assays with purified S. suis AdcR protein showed, for the first time, that the AdcR-DNA binding sequence corresponds to the TTAACNRGTTAA motif. In addition, the requirement for either Zn2+ or Mn2+ to establish in vitro binding of AdcR to its target sequence and the ability of AdcR to control the genes codifying the ABC-transporter components SsuiDRAFT 0103 and SsuiDRAFT 1237, involved in zinc and/or manganese uptake, were demonstrated.Besides, the S. suis fur gene, which encodes a predicted regulator of Fe2+ uptake, was cloned and its protein product was overexpressed in Escherichia coli. Electrophoretic mobility shift assays with crude extract of this E. coli strain showed that S. suis Fur protein controls the feoAB genes, involved in ferric uptake. In addition, both adcR and fur genes were deleted in a virulent S. suis strain in order to charecterize these regulons. Several cation-uptake transporters appeared desrepressed in the knockout strains when gene expression was compared with wild-type strain through real-time RT-PCR analyses. Accordingly, EMSA results showed that these regulators specifically bind to the promoter of these genes. Moreover, the absence of adcR and/or fur genes in pathogenic streptococci showed, for the first time, an important attenuation of its virulence in mice.Finally, immunogenic and protective analysis were carried out with the products of three genes encoding putative divalent-cation-binding lipoproteins of S. suis (SsuiDRAFT 0103, SsuiDRAFT 0174, and SsuiDRAFT 1237), being all of them immunogenic although only one (SsuiDRAFT 0103) induces a significant protective response against a virulent S. suis strain in mice. Moreover, the overexpressed cell wall-associated proteins Ssu0309 and Ssu1103 of the adcR mutant, were identified by mass spectrometry as putative virulence factors belonging to the Pht (Pneumococcal histidine triad) family. Likewise, protective abilities of mutant strains were analyzed showing that although mutant cells are not effective to confer protection in mice, the combination of adcR- and fur-regulated cell wall-associated proteins confers a significant protection against S. suis 89/1591 challenge to mice vaccinated with them.

Streptococcus pyogenes és un patogen humà responsable d'un ampli ventall d'infeccions que varien des d'infeccions superficials com faringitis i impetigen a formes sistèmiques greus com fascitis necrosant (FN) i síndrome del xoc tòxic estreptocòccic (SSTS). El ressorgiment i persistència de formes invasives greus descrit des de mitjans dels anys 1980 ha motivat una intensa recerca sobre els aspectes epidemiològics, microbiològics i clínics d'aquestes infeccions. S'ha realitzat un estudi retrospectiu de base hospitalària que inclou 126 soques de S. pyogenes (27 procedents d'infeccions invasives i 99 d'infeccions no invasives) aïllades entre gener de 1999 i juny de 2003. Les soques de S. pyogenes es van caracteritzar en base a la distribució de tipus i subtipus emm i els perfils genètics de superantígens (SAgs) (speA-C, speF-J, speL, speM, ssa i smeZ). Tanmateix, es va determinar la prevalença i els mecanismes de resistència a macròlids, tetraciclina i levofloxacino. Les formes clíniques més freqüents d'infecció invasiva van ser les infeccions de la pell i teixits tous (40,7%). La SSTS es va registrar en quatre (14,8%) dels casos invasius i es va associar a FN en la meitat dels casos. La majoria dels pacients afectats de quadres invasius eren adults, en particular d'edat avançada i de mitjana edat, i una elevada proporció presentaven factors predisposants, destacant l'alteració de la barrera cutània, la infecció per HIV, l'ús de drogues per via parenteral, i les neoplàsies. En la col·lecció de 126 soques analitzada es van identificar un total de 29 tipus emm amb una distribució encapçalada pel tipus emm1 (17,5%), seguit d'emm3 (8,7%), emm4 (8,7%), emm12 (7,1%), emm28 (7,1%), emm11 (6,3%) i emm77 (6,3%). Aquests set tipus van constituir el 61,9% del total de soques. No es van observar diferències significatives en la distribució de tipus emm entre soques aïllades d'infeccions invasives i no invasives amb l'única excepció del tipus poc freqüent emm25 que es va trobar associat a infeccions invasives en addictes a drogues per via parenteral. Es va trobar una forta correlació entre el patró de SAgs i el tipus emm independentment del tipus d'infecció. La resistència a eritromicina va mostrar un increment anual progressiu del 16,6% (1999) al 38,8% (2003) i va estar causada per soques pertanyents a 11 tipus emm. Les soques mef(A) positives dels tipus emm4, emm12 i emm75 i erm(B) positives dels tipus emm11 i emm25 constituïren el 80% de les soques resistents. La freqüència de resistència a tetraciclina va fluctuar durant el període estudiat (màxim 34,6% el 2002 i mínim 15,8% el 2001) i va ser superior en les soques resistents a eritromicina que en les soques sensibles (42,8% vs 18,7%). En les soques resistents a tetraciclina el gen tet(M) va ser el predominant i es va trobar en soques pertanyents a 14 tipus emm, mentre que el gen tet(O) només es va trobar en soques emm77. No es van observar diferències significatives en la prevalença de resistència a eritromicina ni a tetraciclina en el grup invasiu respecte del no invasiu. La prevalença de resistència a levofloxacino fou del 3,2%, incloent quatre soques amb sensibilitat reduïda o resistència intermèdia (CIM 2-4 µg/ml) i dues soques amb resistència d'alt nivell (CIM >32 µg/ml). La resistència de baix nivell es va associar a substitucions únicament en ParC (Ser80Pro, Ser79Ala, Ser79Phe i Ala121Val), mentre que la resistència d'alt nivell es va relacionar amb mutacions en ParC (Ser79Phe i Ala121Val) i GyrA (Ser81Tyr). / Streptococcus pyogenes (GAS) is a human pathogen responsible for a wide array of infections, ranging from pharyngitis and impetigo to severe invasive infections such as necrotizing fasciitis (NF) and streptococcal toxic shock syndrome (STSS). The resurgence and persistence of severe forms of GAS diseases reported since the mid 1980s have motivated intensive research on epidemiological, microbiological and clinical aspects of these diseases. A retrospective hospital-based study was conducted including 126 GAS isolates (27 from invasive infections and 99 from non-invasive infections) collected from January 1999 to June 2003. GAS isolates were characterized by emm type and subtype and superantigen (SAg) gene profile (speA-C, speF-J, speL, speM, ssa and smeZ). The prevalence and mechanisms of macrolide, tetracycline and levofloxacin resistance were also determined. The most common clinical presentations of invasive cases were skin and soft-tissue infections (40.7%). SSTS occurred in four cases (14.8%) and was associated to NF in half of the cases. Most invasive cases were found in adults, in particular among the elderly and the middle-aged, and a large proportion had underlying conditions, the most frequent being skin lesions, HIV infection, injection drug use, and malignancy. A total of 29 emm types were identified among the 126 isolates; the most prevalent were emm1 (17.5 %), followed by emm3 (8.7 %), emm4 (8.7 %), emm12 (7.1 %), emm28 (7.1 %), emm11 (6.3 %) and emm77 (6.3 %). These seven emm types accounted for 61.9 % of isolates. There were no differences in the emm type distribution between invasive and non-invasive infections, except for emm25 isolates, which were associated with invasive infections in injecting drug users. The SAg gene profiles were closely associated with the emm type and were independent of the disease type. The prevalence of erythromycin resistance showed an annual progressive increase from 16.6% (1999) to 38.8% (2003) and was caused by isolates belonging to 11 emm types. mef(A)-positive emm types 4, 12 and 75, and erm(B)-positive emm types 11 and 25 were responsible for up to 80% of the erythromycin-resistant isolates. The prevalence of tetracycline resistance fluctuated over the period studied (maximum 34.6% in 2002 and minimum 15.8% in 2001) and was higher in erythromycin-resistant isolates than in susceptible isolates (42.8% vs 18.7%). Among the tetracycline-resistant isolates, the tet(M) determinant was the most prevalent and was distributed in isolates belonging to 14 emm types, whereas tet(O) was only found in emm77 isolates. No significant differences in resistance rates to erythromycin or tetracycline were found between invasive and non-invasive isolates. The rate of resistance to levofloxacin was 3.2%, encompassing four isolates with reduced susceptibility or intermediate resistance (MIC 2-4 µg/ml) and two isolates with a high level of resistance (MIC >32 µg/ml). Low-level resistance was associated with alterations in ParC (Ser80Pro, Ser79Ala, Ser79Phe and Ala121Val), while high-level resistance was associated with alterations involving both ParC (Ser79Phe and Ala121Val) and GyrA (Ser81Tyr).

Els micobacteris són un grup de microorganismes de gran importància clínica, ja que existeixen múltiples espècies que són agents causals de diverses malalties humanes amb unes importants morbiditat i mortalitat. Entre aquest grup de micobacteris patògens cal destacar Mycobacterium tuberculosis i Mycobacterium leprae, agents causals de la tuberculosi i la lepra, respectivament. D'altra banda, a part dels microorganismes que constitueixen els complexes M. tuberculosis i M. leprae trobem un grup nombrós de micobacteris, format per micobacteris atípics o micobacteris ambientals (MNT). Aquest grup engloba la resta d'espècies micobacterianes no incloses en els dos grups anteriors. De les més de 130 espècies descrites de MNT, aproximadament un terç podrien estar relacionades amb malalties en humans i ser les responsables de les anomenades micobacteriosis, encara que, a diferència del complex M. tuberculosis i M. leprae, les espècies de MNT no són patògens obligats. Els MNT tenen una gran capacitat de prevalença en aigües de distribució i això és degut principalment a la seva capacitat de créixer en un ampli rang de condicions ambientals i, sobretot, a la seva capacitat de colonitzar superfícies. La motilitat i la capacitat d'adherir-se a superfícies són algunes de les respostes funcionals que es manifesten en el procés de colonització d'una superfície. Per tant l'estudi de la motilitat, la hidrofobicitat i la capacitat d'adhesió a diferents materials ens pot ajudar a entendre i determinar els mecanismes de colonització, persistència i transmissió dels MNT en el medi ambient.En el gènere Mycobacterium, els efectes de la morfologia colonial en les funcions biològiques són múltiples. Diferents estudis, en Mycobacterium avium, Mycobacterium abcessus i Mycobacterium smegmatis, mostren una relació directa entre la morfologia colonial, la motilitat, la hidrofobicitat, l'adhesió cel·lular i la formació de biopel·lícules en superfície, a més a més de relacionar aquestes funcions biològiques amb la presència en la paret cel·lular d'aquests micobacteris d'un tipus específic de glicolípids anomenats glicopeptidolípids.Aquesta tesi s'ha centrat a estudiar i relacionar la morfologia colonial amb les funcions biològiques (motilitat, hidrofobicitat, adhesió cel·lular i formació de biopel·lícules en superfície), descrites inicialment en M. avium, M. abcessus i M. smegmatis, en un altre grup de micobacteris ambientals, Mycobacterium aurum, Mycobacterium chubuense, Mycobacterium gilvum, Mycobacterium obuense, Mycobacterium parafortuitum i Mycobacterium vaccae. Aquestes espècies micobacterianes tenen en comú que són de creixement ràpid, presenten originàriament una morfologia colonial llisa i, segons els estudis comparatius del 16S ARN, són filogenèticament properes entre elles, a la vegada que filogenèticament distants de les espècies micobacterianes ja estudiades. En aquest sentit, ens vem proposar obtenir de forma espontània, a partir de les colònies llises de M. aurum, M. chubuense, M. gilvum, M. obuense, M. parafortuitum i M. vaccae, variants rugoses estables les quals van ser aïllades en cultiu pur. Posteriorment, ens vem centrar en analitzar els lípids i glicolípids de la paret cel·lular d'aquests micobacteris mitjançant cromatografia de capa fina per a comprovar si s'observaven diferències en la composició lipídica i glicolipídica entre les dues variants morfològiques. A més, es va dur a terme l'estudi comparatiu de la capacitat de motilitat, de les característiques hidrofòbiques, de l'adhesió cel·lular i de la formació de biopel·lícules en la interfase líquid-aire entre les dues morfologies colonials en les diferents espècies estudiades. I, finalment, es van fer estudis genètics per determinar les bases moleculars relacionades amb els canvis de morfologia colonial en M. vaccae. / Mycobacteria are a clinically important group of microorganisms due to the fact that there are some species which are causal agents of human diseases with high morbidity and mortality. Among this group of pathogenic mycobacteria it has to be highlighted Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae, which are, respectively, the causal agents for tuberculosis and leprosy. Besides, apart from the microorganisms which constitute the complexes M. tuberculosis and M. leprae, there is a large group of mycobacteria species which includes atypical or environmental mycobacteria (NTM). This group comprises the other mycobacteria species which have not been included in both groups before mentioned. At least a third out of the 130 NTM described could be related to human diseases and could be responsible for mycobacteriosis, although, unlike complex M. tuberculosis and M. leprae, NTM species are not obligated pathogens.NTM have a great capacity to remain in the environment, and this is mainly due to their capacity to grow in a wide range of environmental conditions and, overall, due to their capacity to colonize surfaces. The motility and the capacity to adhere to many different surfaces are some of the functional responses which appear in a surface colonization process. That is why the study of motility, hydrophobicity and adhesion to many materials can help us to understand and determine the colonization, persistence and transmission mechanisms of NTM in the environment.In Mycobacterium genus, the effects of colonial morphology in the biological functions are numerous. Different studies in Mycobacterium avium, Mycobacterium abcessus and Mycobacterium smegmatis, show a direct connection among colonial morphology, motility, hydrophobicity, cellular adhesion and biofilm formation. These biological functions are also connected with the presence in these mycobacteria cell wall of a specific type of glycosylated peptidolipids named glycopeptidolipids (GPLs).This thesis has been focused on studying and connecting colonial morphology with biological functions (motility, hydrophobity, cellular adhesion and the biofilm formation), which have been described previously in M. avium, M. abcessus and M. smegmatis, in another environmental mycobacteria group, Mycobacterium aurum, Mycobacterium chubuense, Mycobacterium gilvum, Mycobacterium obuense, Mycobacterium parafortuitum and Mycobacterium vaccae. These species have in common that they are fast growing, show an originally smooth colonial morphology and, according to comparative 16S ARN studies, they are phylogenetically nearby among them but phylogenetically distant of the other mycobacteria species already studied. Moreover, none of these last species possess GPLs in their cell wall.In this sense, we proposed to obtain spontaneous rough variants from the original smooth colonies of M. aurum, M. chubuense, M. gilvum, M. obuense, M. parafortuitum and M. vaccae. Afterwards, we analyzed and compared the lipid and glycolipid composition of the cell wall between both morphological variants by thin layer chromatography. In addition, we carried out the comparative study about the motility capacity, hydrophobical characteristics, cellular adhesion and biofilm formation in liquid-air interface between both colonial morphologies studied. And, finally, genetic studies were realized in order to determine the molecular bases connected with the changes in the colonial morphology in M. vaccae.

Salmonella enterica ser. Typhimurium (S. Typhimurium) és un enterobacteri patogen que afecta a diverses espècies de mamífers i que generalment causa infeccions lleus, com gastroenteritis, si bé pot arribar a generar malalties sistèmiques, produint septicèmia i, fins i tot, la mort de l'hoste infectat.Com molts altres enterobacteris, el seu genoma codifica per proteïnes que permeten reparar les lesions alquilants en el DNA, les quals són causades quan agents alquilants, siguin procedents de l'ambient extern o bé originats pel propi metabolisme cel·lular, introdueixen grups alquil a les bases nitrogenades. Entre els gens que les codifiquen cal destacar ada, alkA, alkB i aidB, que componen l'anomenada resposta adaptativa a agents alquilants (resposta Ada); i ogt i tag, que desenvolupen funcions similars als anteriors però que no formen part de la resposta Ada. Altres sistemes de reparació més genèrics també intervenen en l'eliminació de lesions alquilants, essent particularment rellevants els gens que constitueixen les vies GGR (realitzada pel complex enzimàtic) i TCR (dirigida a les zones transcripcionalment actives i portada a terme per la proteïna Mfd en conjunció amb el complex UvrABC o amb MutSL) de la reparació per escissió de nucleòtids (NER). Entre tots ells formen un grup molt ampli d'activitats de reparació que permeten reconèixer la gran varietat de dianes que poden ser generades per agents alquilants.Per comprendre el paper de cada un d'aquests gens durant el transcurs del procés infectiu es van construir soques defectives en un o en varis d'aquests gens. Seguidament es va analitzar la capacitat de supervivència de cadascuna d'elles al ser exposades a diferents agents alquilants. Malgrat de disposar de tantes proteïnes de reparació d'alquilacions, en la majoria de casos la manca d'una o vàries d'elles va suposar una disminució de la viabilitat cel·lular quan aquestes soques creixien en presència d'agents alquilants. A continuació es van realitzar assajos de competitivitat en ratolins BALB/c per a determinar la capacitat infectiva de cada un dels mutants construïts. Els resultats experimentals obtinguts demostren que, fins i tot en les soques defectives en múltiples gens, la manca de la majoria d'aquestes proteïnes no suposa una disminució de la capacitat infectiva de S. Typhimurium ja que, malgrat les dades recollides prèviament a partir dels assajos in vitro, tan sols el mutant UA1869, deficient en els gens ada, ogt, tag, uvrA i mfd, va presentar una reducció de la competitivitat en relació a la soca salvatge. Per consegüent, la concentració d'agents alquilants generats a l'organisme deu ser menor a la utilitzada durant els assajos in vitro, de manera que la conservació dels gens de reparació d'alquilacions a S. Typhimurium podria ser deguda a la supervivència fora de l'hoste.El fet que la disminució de la competitivitat s'hagi donat en la soca UA1869 i no en altres mutants, alguns amb un nombre major de mutacions, però on les funcions absents no eren tan diverses, fa pensar en l'existència d'activitats redundants entre diferents sistemes de reparació, de manera que la manca de proteïnes de reparació d'un mecanisme podria ser compensada per altres pertanyents a sistemes amb una activitat aparentment diferent. / Salmonella enterica ser. Typhimurium (S. Typhimurium) is an enteropathogen able to infect several mammalian species, generally causing mild diseases, such as gastroenteritis, although it can also become a systemic infection, producing septicaemia and even the death of the infected host.Like other enterobacteria, the genome of S. Typhimurium codes for alkylation damage repair proteins. This kind of damage appears when alkylating agents, which are present in the environment or are produced endogenously as byproducts of normal metabolism, introduce alkyl groups in the DNA bases. Some of the most important genes coding for these proteins are ada, alkA, alkB and aidB, which generate the adaptive response to alkylation damage (known as the Ada response); and ogt and tag, which are not included in this response but possess similar functions. Other repair systems with a wider range of activities can also repair alkylation damage, being especially important the genes belonging to the global genome repair (GGR, which is carried out by the UvrABC enzymatic complex) and the transcription-coupled DNA repair (TCR, focused on the transcriptionally active genes and directed by the Mfd protein, which recruits the UvrABC or the MutSL complexes) pathways of the nucleotide excision repair system (NER). Altogether compound a large variety of repair activities which allow the recognition of a broad diversity of targets generated by alkylating agents.In order to establish the role of each of these genes and the consequences of their lack during the infection process, strains defective in one or several of them were constructed. Afterwards, each strain was treated with alkylating agents to analyze its survival. Although S. Typhimurium possesses so many alkylation damage repair proteins, in most strains the survival decreased due to the absence of just one or some of those proteins. Moreover, competitive assays using BALB/c mice were performed to determine the fitness of each strain. The results show that, even in those strains defective in several genes, the in vivo fitness of S. Typhimurium is not affected by the lack of most of the alkylation damage repair proteins studied, since only the strain UA1869 defective in the ada, ogt, tag, uvrA, and mfd genes presented a reduction of its virulence when it was orally inoculated. Therefore, the amount of alkylating agents generated in the organism might be lower than that used in the in vitro assays. Thus, the evolutionary conservation of the alkylation damage repair genes in S. Typhimurium may be due to survival outside the host.The fact that the fitness decreased in the UA1869 strain and not in other mutants, some of them defective in a larger number of genes, suggests the existence of certain overlap between different repair systems. Thus, the absence of some repair proteins might be compensated by other belonging to other systems apparently different.