La necesidad de establecer metodologías idóneas que permitan el control de calidad de los productos destinados a la alimentación o de aquellos íntimamente en contacto con alimentos y bebidas es de capital importancia y determina el planteamiento de esta investigación. Es por ello, que el objetivo general de este estudio es evaluar los factores que inciden en la calidad microbiológica de tapones de corcho natural para vinos espumosos y vinos tranquilos producidos en fábricas elaboradoras de este producto en Catalunya.Se utilizó como método de referencia la Norma Catalana Nº 0.20/95 que establece la metodología para el análisis microbiológico de tapones de corcho para vinos. La evaluación de dicha Norma se realizó utilizando tapones de corcho control inoculados experimentalmente con suspensiones de conidios fúngicos, levaduras y bacterias de concentración conocida. Posteriormente, se ensayaron diferentes soluciones de lavado, diversos tipos y tiempos de agitación mecánica, diferentes medios de cutlivo, así como tiempos y temperaturas de incubación.Los resultados obtenidos indican que se pueden utilizar solución fisiológica o solución Ringer _ como solución de lavado, lavar los tapones por 30 minutos a 150 o 200 r.p.m., los filtros se deben sembrar en triptona de soja agar (TSA) a 37 ºC + 2 ºC por 24 horas para la recuperación y recuento de bacterias y en Sabouraud dextrosa agar adicionado de antibiótico a 28 ºC + 2 ºC por 48 horas para la recuperación y recuento de hongos filamentosos y levaduras.Así mismo, los resultados obtenidos aplicando esta metodología se compararon con los resultados obtenidos al aplicar las establecidas por la Norma ISO 10718:1993, el método de las diluciones decimales seriadas y el método Sistema Miliflex-100 . Se observó que el crecimiento invasivo de los microorganismos al aplicar la Norma ISO 10718:1993 impide el recuento de los mismos, que el método de las diluciones decimales seriadas es apropiado para muestras muy contaminadas y que los recuentos de microorganismos son similares cuando se aplica el Sistema Miliflex-100 .Se realizó el recuento, aislamiento e identificación de los microorganismos presentes en muestras de tapones de corcho para vinos tranquilos y vinos espumosos aplicando la metodología propuesta en este estudio, estableciéndose que los recuentos de las UFC/tapón de las bacterias en las muestras analizadas se ajustan a los límites de aceptabilidad de la Norma Catalana Nº 0.20/95, no así a los límites aceptables para hongos filamentosos y levaduras. Así mismo, los géneros y especies de los microorganismos aislados coinciden con la microbiota descrita previamente para este substrato.Se determinó la actividad enzimática y la actividad inhibitoria de los microorganismos aislados, observándose que todos presentan actividad enzimática naftol-A-S-BI-fosfohidrolasa. Los microorganismos que presentan mayor actividad enzimática son: Alternaria alternata, Aspergillus niger y Monilia sitophila. Los microorganismos que presentan mayor actividad inhibitoria contra los hongos filamentosos, levaduras y bacterias estudiadas son: Penicillium citrinum y Trichoderma viride.Finalmente, se estudió la producción de micotoxinas elaboradas y acumuladas por hongos filamentosos aislados de las muestras. Los ensayos realizados muestran que A. alternata produce altertoxina I, altenueno, alternariol y alternariol monometil éter; P. citrinum produce citrinina y Fusarium moniliforme produce fumonisina B1. / The need to establish suitable methods that allow for quality control in alimentary products, or for items that are to be in close contact with food and drink products is of primary importance, and determines the approach adopted by this discussion. For this reason, the general purpose of this study is to evaluate the factors that affect the microbiological quality of natural cork bottle stoppers for sparkling and still wines produced in wine-making factories within Catalonia.The method of reference taken by this work is the "Norma Catalana Nº 0.20/95", which establishes the methodology for the microbiological analysis of cork bottle stoppers for wines. The assessment of this regulation was undertaken by using control cork stoppers experimentally inoculated with fungal conidia, yeast and bacteria of known concentration. Subsequently, different washing solutions were tested, along with various types of and timings for mechanical shaking, different culturing media as well as incubation times and temperatures. The results obtained indicate that physiological or Ringer _ solution can be used as washing solution; stoppers should be washed for 30 minutes at 150 or 200 rpm, filters should be sown in agar soya tryptone (TSA) at 37ºC+ 2ºC for 24 hours for the recuperation and recount of bacteria, and Sabouraud agar dextrose (SDA) at 28ºC + 2ºC for 48 hours for the recuperation and recount of filamentous fungi and yeast.Additionally, the results obtained in applying this methodology were compared with the results obtained in applying the methodologies established by ISO regulation 10718:1993, the method of serialised decimal dilution and the Miliflex-100® System. It was observed that the invasive micro-organism growth upon application of ISO regulation 10718:1993 impedes their recount, that the method of serialised decimal dilution is appropriate for highly contaminated samples and that micro-organism recounts are similar when the Miliflex-100® System is applied.The recount, isolating and identification was undertaken of organisms present in samples of cork bottle stoppers for wines appliying the methodology proposed in this study, establishing that the recount of UFC/stopper for bacteria in the samples analysed are within the limits of acceptability set out by the Norma Catalana Nº 0.20/95, but not to the acceptable limits for filamentous fungi and yeast. Furthermore, the type and species of isolated micro-organisms coincide with the microbiota previously described for this substrate.The enzymatic and inhibitory activity of the isolated micro-organisms was determined, and it was observed that they all presented naphthol-A-S-BI-phosphohydrolase activity. Micro-organisms presenting greatest enzymatic activity are: Alternaria alternata, Aspergillus niger and Monilia sitophila. Micro-organisms presenting greatest inhibitory activity against filamentous fungi, yeast and bacteria studied are: Penicillium citrinum and Trichoderma viride.Finally, the production was studied of micotoxins developed and accumulated by the samples' isolated filamentous fungi. Tests undertaken show that A. alternata produces altertoxine I, altenuene, alternariol and alternariol monomethylic ether; P. citrinum produces citrinine and Fusarium moniliforme produces fumonisine B1.

Los tapones de corcho se utilizan desde hace muchos años para cerrar botellas que contienen diferentes tipos de vinos. Por este motivo, los tapones de corcho deben ser considerados productos en contacto con bebidas de consumo humano y en consecuencia deberían estar legislados los límites aceptables para cumplir con la seguridad alimentaria. Las normativas existentes, para tapones de corcho, hasta hoy, en el ámbito microbiológico solo exigen recuentos totales de hongos filamentosos y levaduras y de bacterias aerobias mesófilas. El principal objetivo de este trabajo es determinar si los hongos presentes en los tapones de corcho son capaces de elaborar y acumular micotoxinas que difundan a los vinos y en consecuencia proponer si es preciso, los límites tanto de recuentos fúngicos como de especies fúngicas y de sus micotoxinas en estos productos Para desarrollar este objetivo se ha realizado una identificación de las cepas de hongos existentes en los tapones de corcho y se han separado las que a nivel bibliográfico se citan como capaces de elaborar las micotoxinas legisladas.A partir de cultivos específicos se han realizado recuentos y extracciones a los 7, 14 y 21 días con el fin de llevar a cabo cromatografías en capa fina y poder verificar si las cepas seleccionadas son productoras de micotoxinas. Asimismo se ha estudiado la actividad inhibitoria y se ha evaluado la actividad enzimática de estas cepas.Posteriormente se ha esterilizado diferentes tipos de tapones de corcho y se ha comprobado si se han modificado sus características. Tras la esterilización, se procedió a inocular las ocho cepas de hongos productoras de micotoxinas, objeto de este estudio. Se ha calculado el porcentaje de recuperación de los hongos inoculados y se han realizado extracciones para verificar por medio de la cromatografía en capa fina, la producción de micotoxinas.A continuación, se ha procedido a adaptar una técnica ELISA para determinar y cuantificar las micotoxinas legisladas (aflatoxinas, ochratoxinas, fumonisinas, DON5/5, zearalenona y toxina T-2) en estos tapones de corcho inoculados con las cepas de hongos productores.Para reflejar la realidad del sector corchero se han seleccionado tapones de mercado que han sido sometidos a un proceso de extracción y posterior evaluación por la técnica ELISA para cuantificar las posibles micotoxinas existentes.Finalmente se han realizado inoculaciones de micotoxinas en diferentes tipos de tapones de corcho y se han introducido en botellas de vino, para poder determinar el grado de migración de estas micotoxinas al vino.A partir de los resultados obtenidos se proponen valores límite de presencia en los diferentes tipos de tapones de corcho de las cepas de hongos productores de micotoxinas y de las micotoxinas legisladas. / The cork plugs are utilized since many years ago to close bottles that contain different types of wines. For that reason, the cork plugs should be you considered products in contact with beverages of human consumption and consequently they should be legislated the acceptable limits to comply with the eating security. The existing regulations, for cork plugs, until today, in the environment microbiological alone they require total recounts of filamentous mushrooms and yeasts and of bacteria aerobics mesófilasThe main objective of this work is to determine if the present mushrooms in the cork plugs are capable of devising and to accumulate micotoxins that diffuse to the wines and consequently to propose if is to be exact, the so much limits of recounts funguses as of species funguses and of its micotoxinas in these products.To develop this objective has been carried out an identification of the stumps of existing mushrooms in the cork plugs and the ones have been separated that to bibliographical level are cited like capable of devise the micotoxins legislated. From specific cultivations recounts they have been carried out and extractions to the 7, 14 and 21 days in order to carry out chromatography in fine layer and to be able to verify if the stumps selected are producers of micotoxinsLikewise the inhibitory activity has been studied and the enzymatic activity of these stumps has been evaluated. Subsequently it has been sterilized different types of cork plugs and has been verified if its characteristics have been modified. After the sterilization, proceeded to inoculate the eight stumps of producing mushrooms of micotoxins, object of this study. The percentage of recovery of the mushrooms has been calculated inoculated and extractions have been carried out to verify through the chromatography in fine layer, the production of micotoxins. Subsequently, it has proceeded to adapt a technical one ELISA to determine and to quantify the micotoxins legislated (aflatoxins, ochratoxins, fumonisins, DON, zearalenone and toxin T-2) in these cork plugs inoculated with the stumps of producing mushrooms. To reflect the reality of the cork sector plugs of market they have been selected that have been submitted to a process of extraction and subsequent evaluation by the technical one ELISA for quantify the possible micotoxins existing. Finally inoculations have been carried out of micotoxins in different types of cork plugs and they have been introduced in bottles of wine, to be able to determine the degree of migration of these micotoxins al came. From the results obtained presence limit values in the different types of cork plugs of the stumps of producing mushrooms are proposed of micotoxins and of the micotoxins they legislated.

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La incidència sobre el suro de defectes sensorials amb descriptors de florit-humitat és un dels principals problemes amb què s'enfronta la indústria surera. Els principals compostos relacionats amb aquest defecte son cloroanisoles, metoxipirazines, geosmina i metilisoborneol. Aquesta recerca s'ha fet amb l'objectiu principal d'aprofundir en els mètodes de determinació de compostos volàtils en suro. S'ha desenvolupat una metodologia basada en la microextracció en fase sòlida i la cromatografia de gasos per a l'anàlisi conjunta d'aquests compostos en macerats de suro. El fet que la majoria dels compostos d'interès tingui un origen microbià ha fet necessari completar les anàlisis químiques amb mètodes de detecció i aïllament dels microorganismes susceptibles de produir-los. S'ha utilitzat un mètode per a l'estudi de la diversitat de fongs i bacteris en mostres de suro basat en l'estudi de marcadors genètics mitjançant l'anàlisi en gradients electroforètics desnaturalitzants. Per últim s'ha avaluat la capacitat de producció de defectes sensorials per microorganismes aïllats de suro utilitzant tècniques olfactomètriques. / The incidence of musty-earthy sensory deviations on cork is one of the main problems that the cork industry faces. The main compounds related to this defect are chloroanisoles, methoxypyrazines, geosmin and methylisoborneol. The aim of this research work was to develop analytical methods to simultaneously determine a large set of volatile compounds in cork samples. A methodology based on solid phase microextraction (SPME) and gas chromatography for the determination of TCA, 3-isopropyl-2-methoxypyrazine, geosmin and methylisoborneol in cork aqueous macerates has been developed and validated. Moreover, the microbial origin of most of these compounds makes necessary to complement the chemical analysis with the detection and isolation of microorganisms that may be involved in the production of off-odours. Regular fingerprinting techniques for the analysis of microbial diversity such as Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) have been applied to the study of microorganism potentially responsible for off-odour formation in cork, in order to complement the chemical characterization of the volatile fraction. Finally we have evaluated the off-odour production capacity of microorganisms isolated from cork using olfactometry techniques.

D'entre els defectes organolèptics associats al vi, en destaca l'anomenat "gust de suro" habitualment vinculat a la presència de cloroanisoles, els quals són productes de l'activitat microbiana formats a partir dels corresponents clorofenols. La present tesi doctoral recull, en primer lloc, metodologies analítiques adreçades principalment a la determinació dels compostos clorofenòlics (2,4,6-triclorofenol, 2,3,4,6-tetraclorofenol i pentaclorofenol) en el control de qualitat dels taps suro, emprant dissolucions hidroalcohòliques com a medi de maceració o d'extracció i utilitzant les tècniques d'extracció en fase sòlida (SPE) i microextracció en fase sòlida (SPME) acoblades a la cromatografia de gasos (GC).En segon lloc, per tal de dur a terme l'anàlisi de cloroanisoles juntament amb els seus precursors en matrius de suro s'ha avaluat un mètode basat en l'extracció amb dissolvent orgànic, el qual ha estat aplicat per a l'estudi de diferents sistemes d'eliminació d'aquests anàlits en la matriu citada. En darrer lloc, s'han proposat metodologies per l'anàlisi de mostres de vi, en les quals d'una banda s'han determinat els compostos clorofenòlics utilitzant la SPME i de l'altra el 2,4,6-tricloroanisole i el 2,4,6-tribromoanisole mitjançant l'acoblament de la SPE i la injecció de grans volums (LVI) en el sistema cromatogràfic. / The organoleptic defect known as cork taint is associated with a musty or mouldy aroma in wine. Chloroanisoles, which are produced through a process of detoxification by fungal methylation of chlorophenolic compounds, are considered to be the main contributory substances. In the present work, analytical methods for the determination of chlorophenols (2,4,6-trichlorophenol, 2,3,4,6-tetrachloropheol and pentachlorophenol) in cork matrices using the solid-phase extraction (SPE) and the solid-phase microextraction (SPME) as preconcentration techniques were evaluated. Therefore, hydroalcoholic solutions have been proposed as extractant solvent in order to test the quality of cork stoppers.Furthermore, a methodology based on extraction with an organic solvent for the simultaneous determination of chloroanisoles and chlorophenols in cork matrices was proposed. This methodology was applied with the aim of checking the efficiency of several washing treatments to remove the target analytes in naturally contaminated cork samples.Finally, different procedures have been developed for the analysis of wine samples. On one hand, chlorophenols were quantified by employing a SPME method. On the other hand, a reliable SPE method coupled to large volume injection was proposed for the determination of both 2,4,6-trichloroanisole and 2,4,6-tribromoanisole.