El objeto de estudio de esta tesis ha sido dilucidar los diferentes mecanismos a partir de los cuales las serina proteasa activadoras del plasminógeno, uPA y tPA, llevan a cabo sus efectos en la progresión tumoral del cáncer de colon y de páncreas. Los resultados descritos muestran de forma detallada las vías de transducción de señal utilizadas por estos PAs. Se muestra por un lado como uPA, proteolíticamente activo, estimula el efecto de scatter en las células de cáncer de colon HT29-M6, y por otro como tPA mediante la unión a anexina II y la transactivación de EGFR estimula la invasión y la proliferación en células de cáncer de páncreas. / The object of study of this thesis was to elucidate the different mechanisms from which serine proteases plasminogen activators, uPA and tPA, carry out their effects in tumor progression of colon cancer and pancreatic cancer.The results described show in detail the signal transduction pathways used by these APs. It shows the one hand as uPA, proteolytically active, enhance the effect of scatter in colon cancer cells HT29-M6, and by another as tPA by binding to annexin II and EGFR transactivation stimulated invasion and proliferation in pancreatic cancer cells.

Els adenovirus oncolítics són uns nous agents antitumorals molt prometedors gràcies a la seva capacitat d'autoamplificar-se selectivament a la massa tumoral. Els assajos clínics realitzats fins a la data amb una primera generació d'aquests agents han indicat la necessitat d'una millora substancial de la capacitat antitumoral, sense descuidar però els possibles efectes adversos de la replicació als teixits normals. Una de les limitacions més importants d'aquesta teràpia és la incapacitat del virus per travessar les barreres estructurals que imposen les cèl·lules de l'estroma i la matriu extracel·lular del tumor. L'expressió de transgens que destrueixin aquestes barreres és una estratègia que s'ha mostrat molt prometedora per superar aquesta limitació i augmentar així l'activitat antitumoral. Per aconseguir aquest propòsit, cal optimitzar la maquinària d'expressió i el genoma de l'adenovirus oncolític on els transgens seran inserits per compatibilitzar l'expressió del transgen amb el cicle viral de l'adenovirus, i mantenir la mida del genoma dintre del límit que imposa la capacitat d'encapsidació dels adenovirus. En aquest treball, s'explora l'ús de caixes palindròmiques d'unió del factor de transcripció E2F per augmentar la selectivitat i la potència d'adenovirus oncolítics. En un primer virus construït, aquestes caixes van aconseguir augmentar significativament l'activitat antitumoral, tant in vitro com in vivo, però la combinació d'elements genètics presents en aquest virus augmentava molt la mida del genoma i no va permetre la introducció d'un transgen per superar les barreres presents als tumors. En un segon virus, l'optimització dels elements genètics va permetre aconseguir un virus que, gràcies a les caixes d'unió d'E2F, presentava un baix perfil de toxicitat i una gran potència antitumoral, fins i tot superior a la dels adenovirus salvatges. A més, la mida tan reduïda del seu genoma permet una expressió eficient i potent de transgens. Addicionalment, en aquest treball també s'analitzen els possibles beneficis de selectivitat i potència que poden tenir dos modificacions genètiques, la mutació T1 i la fibra RGDK, descrites amb anterioritat pel nostre grup. Tot plegat, aquest treball analitza la millor combinació possible d'elements genètics per aconseguir una bona base que permeti la construcció d'un futur adenovirus potent, selectiu i amb capacitat per destruir les barreres estromals dels tumors, superant així les limitacions més importants de la teràpia adenoviral del càncer i presentant-se com un ferm candidat a ser testat en futurs assajos clínics. / Conditionally Replicating Adenoviruses (CRADs) are novel antitumor agents due to their ability to self-amplify at the tumour site. Clinical trials performed with a first generation of these agents pointed out a critical need of improved antitumor activity, without overlooking concerning adverse effects of replication in normal tissues. However, one of the main limitations of this therapy is the inability of CRADs to overcome the barriers imposed by tumour stroma, including stromal cells and extracellular matrix. Transgene expression is valuable strategy to counteract these limitations and to enhance antitumor activity. For this purpose, the genetic backbone in which the transgene is inserted should be optimized to render transgene expression compatible with the adenovirus replication cycle and to keep genome size within the encapsidation size limit. In this work, we explore the use of palindromic E2F-binding sites to enhance the selectivity and the potency of CRADs. In a first virus, the insertion of these sites in an E2F-1 promoter controlling the expression of the E1A protein resulted in a significant increment in the oncolytic activity, both in vitro and in vivo. However, the unique combination of genetic elements present in this virus hindered the incorporation of transgenes to overcome stromal barriers. In a second virus, the insertion of E2F-binding sites into the endogenous E1A promoter allowed to solve this limitation. The insertion of these sites results in a low systemic toxicity profile in mice. Importantly, the E2F-binding sites also increased the cytotoxicity and the systemic antitumor activity relative to wild-type adenovirus in all cancer models tested. Furthermore, the constrained genome size of this backbone allows an efficient and potent expression of transgenes. In addition to this, in this work we also test the benefits in selectivity and potency of two previous mutations reported by our group, the T1 mutation and the RGDK fibre. All together, this thesis analyzes the best possible combination of genetic elements to achieve an adenoviral backbone that permits the design of a future CRAD, potent, selective and capable of destroy tumour stromal barriers, overcoming the main limitations of cancer virotherapy and constructing a firm candidate to be tested in future clinical trials.

La necesidad de establecer metodologías idóneas que permitan el control de calidad de los productos destinados a la alimentación o de aquellos íntimamente en contacto con alimentos y bebidas es de capital importancia y determina el planteamiento de esta investigación. Es por ello, que el objetivo general de este estudio es evaluar los factores que inciden en la calidad microbiológica de tapones de corcho natural para vinos espumosos y vinos tranquilos producidos en fábricas elaboradoras de este producto en Catalunya.Se utilizó como método de referencia la Norma Catalana Nº 0.20/95 que establece la metodología para el análisis microbiológico de tapones de corcho para vinos. La evaluación de dicha Norma se realizó utilizando tapones de corcho control inoculados experimentalmente con suspensiones de conidios fúngicos, levaduras y bacterias de concentración conocida. Posteriormente, se ensayaron diferentes soluciones de lavado, diversos tipos y tiempos de agitación mecánica, diferentes medios de cutlivo, así como tiempos y temperaturas de incubación.Los resultados obtenidos indican que se pueden utilizar solución fisiológica o solución Ringer _ como solución de lavado, lavar los tapones por 30 minutos a 150 o 200 r.p.m., los filtros se deben sembrar en triptona de soja agar (TSA) a 37 ºC + 2 ºC por 24 horas para la recuperación y recuento de bacterias y en Sabouraud dextrosa agar adicionado de antibiótico a 28 ºC + 2 ºC por 48 horas para la recuperación y recuento de hongos filamentosos y levaduras.Así mismo, los resultados obtenidos aplicando esta metodología se compararon con los resultados obtenidos al aplicar las establecidas por la Norma ISO 10718:1993, el método de las diluciones decimales seriadas y el método Sistema Miliflex-100 . Se observó que el crecimiento invasivo de los microorganismos al aplicar la Norma ISO 10718:1993 impide el recuento de los mismos, que el método de las diluciones decimales seriadas es apropiado para muestras muy contaminadas y que los recuentos de microorganismos son similares cuando se aplica el Sistema Miliflex-100 .Se realizó el recuento, aislamiento e identificación de los microorganismos presentes en muestras de tapones de corcho para vinos tranquilos y vinos espumosos aplicando la metodología propuesta en este estudio, estableciéndose que los recuentos de las UFC/tapón de las bacterias en las muestras analizadas se ajustan a los límites de aceptabilidad de la Norma Catalana Nº 0.20/95, no así a los límites aceptables para hongos filamentosos y levaduras. Así mismo, los géneros y especies de los microorganismos aislados coinciden con la microbiota descrita previamente para este substrato.Se determinó la actividad enzimática y la actividad inhibitoria de los microorganismos aislados, observándose que todos presentan actividad enzimática naftol-A-S-BI-fosfohidrolasa. Los microorganismos que presentan mayor actividad enzimática son: Alternaria alternata, Aspergillus niger y Monilia sitophila. Los microorganismos que presentan mayor actividad inhibitoria contra los hongos filamentosos, levaduras y bacterias estudiadas son: Penicillium citrinum y Trichoderma viride.Finalmente, se estudió la producción de micotoxinas elaboradas y acumuladas por hongos filamentosos aislados de las muestras. Los ensayos realizados muestran que A. alternata produce altertoxina I, altenueno, alternariol y alternariol monometil éter; P. citrinum produce citrinina y Fusarium moniliforme produce fumonisina B1. / The need to establish suitable methods that allow for quality control in alimentary products, or for items that are to be in close contact with food and drink products is of primary importance, and determines the approach adopted by this discussion. For this reason, the general purpose of this study is to evaluate the factors that affect the microbiological quality of natural cork bottle stoppers for sparkling and still wines produced in wine-making factories within Catalonia.The method of reference taken by this work is the "Norma Catalana Nº 0.20/95", which establishes the methodology for the microbiological analysis of cork bottle stoppers for wines. The assessment of this regulation was undertaken by using control cork stoppers experimentally inoculated with fungal conidia, yeast and bacteria of known concentration. Subsequently, different washing solutions were tested, along with various types of and timings for mechanical shaking, different culturing media as well as incubation times and temperatures. The results obtained indicate that physiological or Ringer _ solution can be used as washing solution; stoppers should be washed for 30 minutes at 150 or 200 rpm, filters should be sown in agar soya tryptone (TSA) at 37ºC+ 2ºC for 24 hours for the recuperation and recount of bacteria, and Sabouraud agar dextrose (SDA) at 28ºC + 2ºC for 48 hours for the recuperation and recount of filamentous fungi and yeast.Additionally, the results obtained in applying this methodology were compared with the results obtained in applying the methodologies established by ISO regulation 10718:1993, the method of serialised decimal dilution and the Miliflex-100® System. It was observed that the invasive micro-organism growth upon application of ISO regulation 10718:1993 impedes their recount, that the method of serialised decimal dilution is appropriate for highly contaminated samples and that micro-organism recounts are similar when the Miliflex-100® System is applied.The recount, isolating and identification was undertaken of organisms present in samples of cork bottle stoppers for wines appliying the methodology proposed in this study, establishing that the recount of UFC/stopper for bacteria in the samples analysed are within the limits of acceptability set out by the Norma Catalana Nº 0.20/95, but not to the acceptable limits for filamentous fungi and yeast. Furthermore, the type and species of isolated micro-organisms coincide with the microbiota previously described for this substrate.The enzymatic and inhibitory activity of the isolated micro-organisms was determined, and it was observed that they all presented naphthol-A-S-BI-phosphohydrolase activity. Micro-organisms presenting greatest enzymatic activity are: Alternaria alternata, Aspergillus niger and Monilia sitophila. Micro-organisms presenting greatest inhibitory activity against filamentous fungi, yeast and bacteria studied are: Penicillium citrinum and Trichoderma viride.Finally, the production was studied of micotoxins developed and accumulated by the samples' isolated filamentous fungi. Tests undertaken show that A. alternata produces altertoxine I, altenuene, alternariol and alternariol monomethylic ether; P. citrinum produces citrinine and Fusarium moniliforme produces fumonisine B1.

La alta incidencia de las enfermedades infecciosas, la importancia de las enterobacterias como agentes causales más frecuentes y el surgimiento de cepas resistentes a los antibióticos son factores que concurren en uno de los mayores problemas de la medicina actual y del futuro: la multiresistencia. En esta Tesis se aborda el problema de las cepas de enterobacterias portadores de b-lactamasas de espectro extendido (BLEAs) y cefamicinasas, en el ámbito de la población atendida en el Hospital de la Santa Creu y Sant Pau de Barcelona.De 1997 a 1999 se han obtenido en el Hospital de la Santa Creu i Sant Pau, 13800 cepas de enterobacterias, entre las cuales se identificaron y caracterizaron las portadoras de BLEAs y cefamicinasas. Después de una primera selección, en función al patrón de resistencia por la técnica de disco difusión y la posterior caracterización fenotípica y genotípica de las b-lactamasas, fueron identificadas 35 cepas de Escherichia coli (0.45% de las cepas aisladas de esta especie bacteriana); 9 de Klebsiella pneumoniae (1.83%); 2 cepas de Salmonella enterica (0.11%); y una de Proteus mirabilis (0.11%) portadoras de las enzimas investigadas. Además del patrón de resistencia, la caracterización incluyó ensayos de sinergia, biotipado, punto isoeléctrico e identificación del gen respectivo mediante PCR. Las b-lactamasas de espectro extendido en E. coli han sido CTX-M-9 (27 cepas); SHV-2 (6 cepas); TEM-10 (1 cepa) y TEM-12 (1 cepa). CTX-M-9, actualmente predominante, ha aumentado su incidencia cinco veces (0.45%) respecto al trienio anterior (0.08% en 1994-1996). Por otra parte, se ha observado por primera vez en el ámbito de nuestro hospital, la presencia de cefamicinasas plasmídicas tipo CMY-2 en una cepa de cada una de las siguientes especies Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica y Proteus mirabilis. Respecto a las características de los pacientes y naturaleza de la infección, en el 73% de los casos la infección estaba localizada a nivel del tracto urinario y en el 61% de los casos, el paciente era mayor de 60 años; el 80% de los pacientes fue de sexo femenino y la enfermedad de base predominante fue la neoplasia sólida.Como dato relevante para efectos de vigilancia epidemiológica, se constata que la incidencia de b-lactamasas de espectro extendido y cefamicinasas plasmídicas en el ámbito de nuestro hospital aunque es pequeña ha aumentado tres veces (0.48%) respecto al trienio anterior (0.14%), no evidenciándose en ningún caso la presencia de brotes epidémicos intrahospitalarios. / Factors as high incidence of infectious diseases, the enterobacterias as infectious agent and the development of antibiotic frecuence of resistant strains, meets in one of the bigger problems of the actual medicine: the multiresistance. These Thesis deals about specific problem of carrier strains of extended spectrum b-lactamases (BLEAs) and cephamcynases, in the scope of the population attended in the Hospital de la Santa Creu i Sant Pau.In this hospital, from 1997 to 1999, 13,800 isolates of enterobacterias were obtained. In these, were identified and characterized the carrier of BLEAs and cephamycinases. After a first selection, using diffusion disk technique in function to its pattern resistance, and continuing with genotypic and phenotypic characterization of BLEA, were identified the following strains: 35 strains of E. coli (0.45% of the E. coli isolates); 9 Klebsiella pneumoniae (1.83%); 2 Salmonella enterica (0.11%); and one of Proteus mirabilis (0.11%). Characterization includes assays of sinergy, biotyping, pI and identification of the respective gene using PCR.In E. coli the BLEAs were CTX-M-9 (27 isolates), SHV-2 (6 isolates); TEM-10 (1 isolate); and TEM-12 (1 isolate). Actual predominance of CTX-M-9 has increased its incidence five fold (0.45%) in respect of the period 1994-1996 (0.08%). In our hospital, the presence of plasmidic cephamycinase CMY-2 in one isolated of the following species Klebsiella pneumoniae, Salmonella enterica and Proteus mirabilis, were by first time observed.In relation to the patients characteristics and the origin of infections, 73% of cases were localized in the urinary tract; while in 61% of the cases, the patients were older than 60, 80% were female and the predisposing base prevalent disease was solid neoplasia.As a relevant data, in order to the epidemiological alert, deserves mention that BLEAs incidences and plasmidic cephamycinases were increased three folded (0.48%) respect to past period (0.14%). There were no evidences in any case of the intrahospitalary epidemic outbreak.

Los picoeucariontes que, junto con los procariontes heterotróficos y fototróficos, forman el picoplancton, pueden constituir una parte importante de la biomasa del mismo e incluso de todo el sistema. Su contribución a la producción primaria del ecosistema es también muy significativa. Pero hasta el momento la diversidad de la fracción eucariótica que forma la comunidad picoplanctónica marina era muy desconocida.La identificación de la fracción eucariótica del picoplancton en comunidades naturales es a menudo una tarea difícil, debido a su similar morfología y pequeño tamaño (< 5 mm). Algunos de ellos pueden ser discriminados a nivel de Clase mediante microscopía electrónica o cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), pero en la mayoría de los casos no es posible hacer una identificación a más bajos niveles taxonómicos. Por otro lado, solo un pequeño porcentaje de estas especies picoplanctónicas puede crecer en cultivo, y además no hay garantía de que estos organismos aislados en cultivo sean los dominantes en la comunidad natural.La aproximación por técnicas moleculares basadas en análisis filogenéticos de secuencias de rRNA tales como la clonación y secuenciación, y técnicas de fingerprinting como la Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) o la Terminal Restriction Fragemnt Length Polymorphism (T-RFLP), han sido una alternativa que nos ha permitido caracterizar con más detalle la diversidad del picoplancton eucariótico en muestras naturales de diferentes sistemas marinos. Se ha muestreado una gran variedad de sistemas, desde mar abierto a zonas costeras, gracias a diferentes campañas oceanográficas: Mar de Weddel-Scotia (campaña DOVETAIL; Paso Drake (campaña DHARMA); Atlántico Norte (campaña ACSOE-NAE); Mar de Alborán (campaña MATER´97, 98 y 99). En ellas se obtuvieron muestras que abarcaban tanto la variabilidad espacial como la variabilidad temporal de las comunidades del picoplancton eucariótico marino.Gracias a la realización de bibliotecas genéticas de algunas de estas muestras (pertenecientes a la Antártida, al Mar de Alborán y al Atlántico Norte), mediante secuenciación y comparación con el banco de datos, se obtuvo información acerca de la diversidad de los grupos filogenéticos presentes en estos diferentes ambientes. Los resultados mostraron una elevada diversidad filogenética incluyendo muchos grupos taxónomicos diferentes y miembros de grupos filogenéticos distantes. La mayoría de estos grupos taxónomicos se afiliaban a organismos conocidos del picoplancton eucariótico fototrófico como las prasinofíceas, que fueron las más representadas, así como también las primnesiofíceas. Otra fracción, menos frecuente, pudo afiliarse a grupos claramente heterotróficos tales como ciliados, algunas crisofíceas, cercomonadales y hongos. Pero también apareció otro elevado número de secuencias distintas a cualquier secuencia conocida y que correspondían a nuevos linajes tales como los nuevos estramenópilos y los nuevos alveolados. Estos nuevos linajes aparecieron ampliamente distribuidos tanto filogenética como geográficamente. Algunos de ellos pueden constituir una fracción importante de los microorganismos heterotróficos y jugar un papel crucial en la red trófica microbiana.Técnicas de fingerprinting como la DGGE y la T-RFLP, fueron usadas para el estudio en paralelo de la diversidad de picoeucariontes en estas muestras marinas. Gracias a la optimización de la DGGE usando cebadores específicos para amplificar un fragmento del gen rRNA 18S de eucariontes, se pudo estudiar la diversidad y variabilidad a gran escala, de una manera detallada, de las comunidades del picoplancton eucariótico marino presentes en muestras de la Antártida y del Mar de Alborán. Esto nos permitió observar cambios en su distribución y composición no sólo a lo largo de gradientes verticales, sino en relación con escalas espaciales y temporales. / Picoeukaryotes together with the heterotrophic and phototrophic prokaryotes, constitute the picoplankton. Picoeukaryotes can contribute an important part the picoplankton biomass and even to the total biomas of the system. Also, their contribution to the primary productivity of the ecosystem is very significant. However, very little is known about the diversity of the eukaryotic fraction of the marine picoplanktonic assemblages. The identification of picoeukaryotes in natural communities is difficult, principally due at their similar morphology and small size (< 5 mm). Some of them can be discriminated at the Class taxonomic level by electron microscopy or by HPLC pigment analyses, but most of them cannot be identified at lower taxonomic levels. Also, only a small percentage of the picoeukaryotes species grow in culture, and there is no guaranty that organisms currently available in pure culture are dominant in natural communities. The approximation with molecular techniques offers a promising alternative. The phylogenetic analyses of the rRNA sequences uses techniques such as cloning and sequencing, and/or fingerprinting techniques such as Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) and Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism (T-RFLP). With these techniques I have characterized the diversity of eukaryotic picoplankton in natural samples from different marine systems. A wide variety of systems had been sampled from coast to open sea in different oceanographic cruises: Weddel-Scotia Sea (cruise DOVETAIL); Drake Passage (cruise DHARMA); North Atlantic Ocean (cruise ACSOE-NAE); Alborán Sea (cruises MATER´97, 98 y 99). Samples to study spatial and temporal variability of the marine eukaryotic picoplankton were obtained in all these cruises.Five genetic libraries were generated (two from the Southern Ocean, two from the North Atlantic Ocean and one from the Alborán Sea). By sequencing and comparison with the database I obtained information about the diversity of the phylogenetic groups present in the different marine systems. Results showed a high phylogenetic diversity. Most of these taxonomic groups were affiliated with known phototrophic picoeukaryotes such as prasinophytes (the most frequently represented) and prymnesiophytes. Other clones could be assigned to the heterotropic organisms such as ciliates, some crysophytes, cercomonads and fungi. But a significant number of sequences in the libraries did not show a close affiliation with any know class of organisms and formed two novel lineages: novel stramenopiles and novel alveolates. These novel lineages were abundant and widely distributed. Some of them may account for a large fraction of the heterotrophic microorganisms in the sea and could play an important role in the marine food webs.Fingerprinting techniques such as DGGE and T-RFLP were used to study de diversity of picoeukaryotes in these same samples. With the optimization of DGGE by using specific primers to amplify the 18S rRNA from eukaryotes we studied diversity and variability of the marine eukaryotic picoplankton assemblages present in samples from the Southern Ocean and the Alborán Sea. With these studies we obtained information about changes in their distribution and composition along the vertical gradient but also at larger spatial and temporal scales.

La tuberculosi mata anualment entre 2 i 3 milions de persones a tot el món, malgrat és una malaltia curable. Una de les causes de l'elevada incidència de la malaltia és la manca d'un mètode diagnòstic ràpid, econòmic i específic que es pugui dur a terme a qualsevol laboratori del món. La serologia seria una eina alternativa o complementària als mètodes actuals.En la present tesi s'ha evaluat la capacitat serodiagnòstica de quatre glicolípids purificats de la paret de Mycobacterium tuberculosis (Diaciltrealoses, Triaciltrealoses, Cord Factor i Sulfolípid-I), i s'han comparat amb 9 kits serològics comercialitzats per al diagnòstic de la tuberculosi, que utilitzen altres tipus d'antígens. / The tuberculosis (TB) kills between 2 and 3 milions of persons in the world, in spite of being a curable disease. One the reasons for this high disease incidence in the lack of a rapid, economic and specific diagnostic method that could be used in any laboratory of the world. Serology could be and alternative or complementary tool to the current methods.In the present thesis we have evaluated the serodiagnostical ability of four purified glycolipids fromt the Mycobacterium tuberculosis cell wall (Diacyltrehaloses, Triacyltrehaloses, Cord Factor and Sulpholipid-I), These results have been compared with tose obtained using 9 commercially available kits that use other types of antigens for the serodiagnosis of TB.

El eje central de la presente Tesis Doctoral ha sido la conexión existente entre la capacidad infectiva de Salmonella typhimurium y el mantenimiento de sus concentraciones intracelulares óptimas de hierro y zinc. El estudio de la relación entre el hierro y la virulencia se realizó mediante la construcción y caracterización de un mutante fur. La proteína Fur es el regulador de los sistemas vinculados con la captación, transporte y almacenamiento de este elemento. La desregulación de estos sistemas en la cepa mutante provoca el aumento de la concentración intracelular de Fe2+ libre, lo que incrementa la actividad de algunas enzimas como la 3',5'-cAMP fosfodiesterasa codificada por el gen cpdA. Este hecho determina una disminución de la concentración de cAMP intracelular y, por consiguiente, una reducción de aquellos genes y regulones que están bajo el control del complejo CRP-cAMP, entre los que se encuentra el sistema de síntesis y ensamblaje de flagelos. Así mismo, se ha demostrado que existe una vinculación adicional entre la proteína Fur y la síntesis flagelar a través del control por parte de ésta del promotor flhDC, conocido también como master operon, y que se encuentra en la cúspide de la cascada de activación de todo el regulón. La reducción de la concentración intracelular de cAMP puede ser la causa de la menor virulencia de los mutantes fur cuando son inoculados intraperitonealmente en ratones BALB/c o Swiss.La vinculación entre el zinc y la capacidad infectiva de S. typhimurium se abordó mediante la construcción de mutantes que tuvieran afectado el gen zur, que codifica el regulador transcripcional relacionado con este elemento, o el gen znuC, que forma parte de un sistema de transporte de alta afinidad. En el primer caso, cuando los sistemas de transporte de zinc de la cepa mutante están desregulados, se observa un ligero descenso de la capacidad infectiva cuando se inocula por vía intraperitoneal dicho mutante en ratones BALB/c. Sin embargo, es la inactivación del sistema de alta afinidad la que comporta una reducción más drástica de la virulencia de la cepa cuando se inocula ya sea por vía oral o intraperitoneal en el huésped. De acuerdo con estos datos, la cepa ZnuC- es excluida por la salvaje a lo largo del proceso infectivo cuando se lleva a cabo una inoculación conjunta con ambas. Finalmente, y mediante la construcción de una cepa mutS de S. typhimurium así como de otra portadora de un plásmido con los genes umuDC de Escherichia coli, se ha comprobado que el incremento de la frecuencia de mutagénesis, tanto espontánea como inducida, no confiere una ventaja selectiva a lo largo del proceso infectivo. En concordancia con ello, también se ha podido constatar que el DNA de las células de S. typhimurium no sufre un nivel de lesiones lo suficientemente elevado como para inducir el sistema de reparación de emergencia durante la infección.Los artículos que se adjuntan en los anexos I, II y III de la presente memoria de Tesis Doctoral contienen los resultados en los que se basa este trabajo.Anexo I: Campoy, S., A. M. Pérez de Rozas, J. Barbé e I. Badiola. 2000. Virulence and mutation rates of Salmonella typhimurium strains with increased mutagenic strength in a mouse model. FEMS Microbiol. Lett. 187:145-150Anexo II: Campoy, S., M. Jara, N. Busquets, A. M. Pérez de Rozas, I. Badiola y J. Barbé. 2002. Intracellular cyclic AMP concentration in decreased in Salmonella typhimurium fur mutants. Microbiology 148:1039-1048Anexo III: Campoy, S., M. Jara, N. Busquets, A. M. Pérez de Rozas, I. Badiola y J. Barbé. 2002. Role of the high-affinity zinc uptake znuABC system in Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence. Infect. Immun. 70:4721-4725. / In this work we pretend to elucidate the relation that could be established between Salmonella typhimurium virulence and the zinc or iron intracellular concentrations.The Fur protein is involved in either iron-uptake or iron-storage regulation. In a fur mutant these systems are deregulated, giving raise an increased free Fe2+ concentration. In this situation the enzymic activity of some proteins like 3',5'- cAMP phosphodiesterase, encoded by cpdA gene, may be stimulated, decreasing the fur mutant final cAMP intracellular concentration. This lower cAMP level altered the expression of all the genes that are under the CRP-cAMP regulation like flagellar system. In this work, we also demonstrate that there is a direct relationship between Fur protein and the flagellar synthesis, in fact, Fur can regulate this system by controlling the expression of flhDC operon, also called master operon, which is the starting point of all the activation cascade.The reduction of the cAMP intracellular concentration could be the responsible of the lower fur mutants virulence when this strain is inoculated in BALB/c or Swiss mice.To study the relation between zinc and virulence two mutants were constructed a zur and a znuC mutant. The first one has its zinc-uptake systems deregulated, and we observed that in this case the virulence was lower when this strain was intraperitoneally inoculated in BALB/c mice. But is in the znuC mutant, where the high-affinity zinc uptake system was affected, when it was, either in an oral or an intraperitoneal inoculation, the greatest reduction of virulence capacity.Finally, the relation of mutation rates and virulence was also tested. To do that, two strains of S. typhimurium presenting increased mutation rates, either spontaneous or mediated by DNA damage have been constructed. One of the strains carries a null mutS mutation, while the other harbours a plasmid which contains the Escherichia coli umuDC operon. The virulence of these strains has been determined by inoculated in BALB/c or Swiss mice. Strains with either increased spontaneous or DNA damage mediated mutation rates have the same LD50 than the wild type strain. Moreover, our work point out that the DNA damage level during mouse infection it is not enough to activate the S. typhimurium SOS response. The papers that are included in anexos I, II and III contained the main results that are the basis for this work.Anexo I: Campoy, S., A. M. Pérez de Rozas, J. Barbé e I. Badiola. 2000. Virulence and mutation rates of Salmonella typhimurium strains with increased mutagenic strength in a mouse model. FEMS Microbiol. Lett. 187:145-150Anexo II: Campoy, S., M. Jara, N. Busquets, A. M. Pérez de Rozas, I. Badiola y J. Barbé. 2002. Intracellular cyclic AMP concentration in decreased in Salmonella typhimurium fur mutants. Microbiology 148:1039-1048Anexo III: Campoy, S., M. Jara, N. Busquets, A. M. Pérez de Rozas, I. Badiola y J. Barbé. 2002. Role of the high-affinity zinc uptake znuABC system in Salmonella enterica serovar Typhimurium virulence. Infect. Immun. 70:4721-4725.

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La criptococosis es una micosis profunda que puede afectar al ser humano y a diversos animales. Tiene un curso crónico ó subagudo. El agente causal es una levadura capsulada llamada Cryptococcus neoformans. Este proceso puede presentarse en personas sanas, pero afecta sobre todo a sujetos inmunodeprimidos. La infección se inicia por la inhalación de las levaduras y diseminación por vía hematógena al sistema nervioso central.El objetivo principal de este trabajo ha sido de disponer de datos para conocer la epidemiología de la criptococosis en España.- Se han recopilado 184 cepas de 8 diferentes áreas geográficas de España, 128 de orígen clínico humano ( 95 % VIH + y ADVP), 13 de orígen animal, y 43 de muestras ambientales. - Se han estudiado muestras de polvo doméstico de 79 domicilios para comprobar si podían ser una fuente de infección. Seis muestras provenían de domicilios de pacientes con SIDA y criptococosis, 11 de pacientes VIH(+) sin criptococosis, y 62 de personas sanas. No se ha aislado C. neoformans en niguna muestra. El polvo doméstico no parece ser un reservorio de importancia para la transmisión de la criptococosis.- El estudio de las biovariedades mediante el crecimiento en medio de L-canavanina-glicina-azul de bromotimol (CGB) junto con la asimilación de D-prolina y D-triptófano ha permitido demostrar por primera vez, la presencia en nuestro país de la variedad gattii de C. neoformans. Esta variedad produjo 5 brotes epidémicos de criptococosis en cabras en la provincia de Cáceres, con un alto porcentaje de animales afectados. Todas sufrían de síntomas respiratorios severos asociados a caquexia y síntomas neurológicos, y con un 100 % de mortalidad en los animales enfermos. Todas las cepas pertenecían al serotipo B.- Se obtuvieron sueros policlonales de los diferentes serotipos mediante inmunización de conejos. Se procedió por técnica de aglutinación al estudio del serotipado de todas las cepas. La distribución de los serotipos no es homogénea, varía según las regiones geográficas. El serotipo A es predominante, sin embargo hay una elevada tasa del serotipo D en las muestras clínicas y ambientales.- El estudio de las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) mediante la técnica de microdilución ha mostrado que el nivel global de resistencias es muy bajo. No se ha hallado ninguna cepa con CIM>1 mg/ml para anfotericina B. Las cepas del serotipo A mostraron menor sensibilidad. La 5-fluorocitosina ha resultado el antifúngico menos activo. El fluconazol ha mostrado menor actividad que el itraconazol. Tres cepas tenían CIM>64 mg/ml. El serotipo D mostró menor sensibilidad a los dos triazoles que el resto de los serotipos (P<0.00001). Las cepas de la var. gattii mostraron una sensibilidad uniformemente baja, y las ambientales tenían sensibilidades similares a las clínicas.- El método colorimétrico Sensititre utilizado para el estudio de las sensibilidades de 42 cepas de C. neoformans fué útil por su fácil ejecución y lectura de puntos de corte, sin embargo es un sistema que proporciona valores más bajos de CIM que el método de referencia.- Se determinaron las CIM de un nuevo antifúngico derivado de las sordarinas (GM 237354) en 190 cepas de C. neoformans. Se obtuvieron 5 cepas con valores de 2 mg/ml. La var. gattii es la que mostró menor sensibilidad. Se obtuvieron diferencias significativas entre los serotipos A y AD con respecto al serotipo B.- La aplicación de la técnica molecular del RAPD ha permitido demostrar que por lo menos coexisten 2 genotipos diferentes de la var. gattii aislada en cabras. Uno de los patrones parece ser el dominante, se ha hallado en todas los brotes epidémicos, mientras que el otro sólo se detectó en una zona. Con la misma técnica se ha podido discriminar entre diferentes aislamientos de un mismo paciente con criptococosis. / Cryptococcosis is a deep mycosis that can affect human beings and several types of animals. It can have either a chronic or a subacute course. Its causal agent is an encapsulated yeast called Cryptococcus neoformans. This process can appear in healthy humans although it mainly affects immunodepressed individuals. The infection begins by inhalation of the yeast and dissemination to the central nervous system by the haematogenous route.The main purpose of this study was to obtain information on the epidemiology of cryptococcosis in Spain.- One hundred and eighty-four strains were collected from eight different geographical areas in Spain. One hundred and twenty-eight strains were of human clinical origin (95% HIV + IDU), 13 of animal origin and 43 were environmental samples. - Samples of household dust proceeding from 79 homes were studied to check whether they could be a source of infection. Six samples proceeded from the homes of patients with AIDS and cryptococcosis, 11 from HIV(+) patients without cryptococcosis and 62 from healthy individuals. C. neoformans was not isolated in any of the samples. Domestic dust does not appear to be a reservoir of importance in the transmission of cryptococcosis.- The study of biovarieties using growth in L-canavanine-glycine-bromothymol blue (CGB) medium together with D-proline and D-tryptophan assimilation made it possible to prove, for the first time, the presence in our country of the Cryptococcus neoformans variety gattii. In the province of Cáceres, this variety produced five epidemic cryptococcosis outbreaks in goats, with a high percentage of affected animals. All the animals had severe respiratory symptoms associated with cachexia and neurological symptoms, with 100% mortality in sick animals. All were serotype-B strains.- Polyclonal serums of the various serotypes were obtained by immunisation of rabbits. The agglutination technique was used to carry out a serotyped study of all the strains. The distribution of the serotypes was not homogeneous but varied depending on the geographical regions. Serotype A was predominant although there was a high rate of serotype D in the clinical and environmental samples.- The study of the minimal inhibitory concentrations (MIC) using the microdilution technique proved that the global resistance level was very low. No strain with a MIC > 1 mg/ml was found for amphotericin B. Serotype-A strains showed less sensitivity. 5-fluorocytosine proved to be the least active antifungal agent. Fluconazol proved to be less active than itraconazole. Three strains had a MIC > 64 mg/ml. Serotype D showed less sensitivity to the two triazoles than the rest of the serotypes (P < 0.00001). All the strains of the gattii variety showed uniformly low sensitivity and the sensitivity of the environmental strains was similar to that of the clinical ones.- The colorimetric method Sensititre used for sensitivity testing in 42 strains of C. neoformans was useful because of its ease of implementation and breakpoint reading. However, this system gave lower values of MIC than the reference method. - The MICs of the new antifungal agent derived from sordarins (GM 237354) were determined in 190 strains of C. neoformans. Five strains with values of 2 mg/ml were obtained. The variety gattii is that which showed least sensitivity. Significant differences were obtained between serotypes A and D with respect to serotype B.- Application of the molecular technique RAPD demonstrated the coexistence of at least two different genotypes of the var. gattii isolated in goats. One of the patterns appears to be dominant, it is found in all epidemic outbreaks, whereas the other was only detected in one area. It was possible to distinguish between different isolations of a same patient with cryptococcosis using the same technique.

En aquest treball s'han estudiat diferents sistemes estratificats, un de bentònic (tapissos microbians del delta de l'Ebre) i tres de planctònics (estanyols d'en Cisó i el Vilar i el llac Gran d'Estanya), mitjançant l'ús combinat de tècniques de microbiologia moleculars (RFLP, DGGE i FISH) i clàssiques (microscòpia òptica i anàlisi dels paràmetres fisicoquímics). L'aplicació de les tècniques moleculars ens ha permès demostrar que genèticament hi ha variacions, tant en fondària com al llarg del temps, en l'estructura i la dinàmica de les poblacions microbianes que habiten en aquests ecosistemes. Les tècniques clàssiques aplicades, en canvi, s'han emprat per a relacionar aquests canvis genètics amb les fluctuacions ambientals i biològiques.Inicialment, es va determinar la distribució en fondària i al llarg del temps de diferents paràmetres fisicoquímics que s'estableixen en els sistemes estratificats estudiats. A continuació, es van caracteritzar mitjançant microscòpia òptica el gruix, el color i les poblacions dominants presents en cadascuna de les laminacions dels tapissos microbians. De la mateixa forma, al llac Gran d'Estanya es van descriure les poblacions dominants presents en les diferents fondàries. L'anàlisi preliminar de tots els sistemes estratificats estudiats ens va permetre demostrar que, en general, les condicions i les poblacions dominants es mantenien força semblants a les descrites en treballs anteriors. Posteriorment, es dugué a terme l'anàlisi molecular amb tècniques de caracterització genètica (RFLP i DGGE) i d'hibridació in situ (FISH), basades en l'estudi dels 16S ADNr i 16S ARNr, respectivament.En cadascuna de les laminacions i fondàries dels diferents sistemes estratificats estudiats, els gens dels 16S ARNr foren amplificats per PCR amb encebadors universals per als dominis Bacteria i Archaea. El primer dels dominis es va trobar àmpliament distribuït en tots els sistemes estratificats i es va detectar al llarg de totes les laminacions i fondàries estudiades. En canvi, el domini Archaea presentava una distribució més heterogènia i es detectava en el sediment negre dels tapissos microbians i en les fondàries dels llacs on les concentracions de sulfur d'hidrogen eren més elevades. A l'estanyol del Vilar i al llac Gran d'Estanya, a més, es van detectar membres d'aquest darrer domini en algunes fondàries de la part oxigènica.Seguidament, els productes de la PCR van ser digerits amb enzims de restricció d'alta freqüència de tall (AluI, HinfI i RsaI) i es van analitzar els patrons dels 16S ADNr-RFLP bacterians obtinguts per electroforesi en cadascun dels sistemes estratificats.Aplicant els mètodes UPGMA i MDS, la similitud entre els patrons dels 16S ADNr-RFLP ens va permetre obtenir les corresponents matrius a partir de les quals es va poder concloure que les mostres presentaven una distribució estacional en tots els sistemes estudiats, exceptuant les del llac Gran d'Estanya. Malgrat aquest fet, les diferències estacionals quant al nombre de fragments de restricció només foren estadísticament significatives als tapissos microbians del delta de l'Ebre i a l'estanyol del Vilar. En tots els sistemes estratificats estudiats, les diferents submostres es van subagrupar, majoritàriament, en funció de dos paràmetres abiòtics, la llum i la presència d'oxigen.Una vegada visualitzats els patrons de restricció, s'observà que els obtinguts en el període de barreja al llac Gran d'Estanya mostraven una gran similitud amb els de la part més fonda del llac en el període d'estratificació. Per a corroborar aquesta observació, es va decidir aplicar al llac Gran d'Estanya un altra tècnica de caracterització genètica: la DGGE. Els patrons resultants dels 16S ADNr-DGGE, igual que els dels 16S ADNr-RFLP, van confirmar aquesta similitud. L'aplicació d'aquesta tècnica, a més a més, ens va permetre obtenir una visió general de la diversitat bacteriana per escissió i seqüenciació de les bandes dominants. Les seqüències obtingudes foren afiliades dintre dels quatre fílums del domini Bacteria: Cianobacteria, Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), Proteobacteria (classes a i b) i Chlorobi. L'anàlisi de les seqüències obtingudes demostrà que les diferències espacials eren degudes a variacions de les poblacions bacterianes dominants (Cianobacteria, Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides i a-Proteobacteria) detectades en cadascuna de les fondàries del llac. En canvi, les diferències estacionals existents eren degudes, principalment, a l'aparició del grup b-Proteobacteria a l'hivern i a l'aparició de Chlorobi a l'estiu.Al llac Gran d'Estanya, a més de la informació qualitativa obtinguda amb les tècniques de caracterització genètica, per primera vegada s'ha estudiat quantitativament com es distribueixen en fondària i al llarg del temps les poblacions d'organismes actius mitjançant l'aplicació de la hibridació in situ. Tot i estar limitada per la presència de partícules de naturalesa inorgànica i per una elevada proporció d'organismes fototròfics autofluorescents, la informació obtinguda amb aquesta tècnica ens va permetre descriure canvis espaciotemporals de les poblacions bacterianes (sondes Eub338, Non338, Srb338, Dsv698, Dss658, Alf968, Bet42a i Gam42a) i d'Archaeas (sonda Arch915) analitzades. Els percentatges d'hibridació obtinguts pel domini Bacteria foren superiors en la part superficial del llac en el període d'estratificació, mentre que el domini Archaea fou més abundant en la part més fonda del llac del mateix període. Pertanyents al domini Bacteria, i detectats en ambdós períodes de l'any estudiats, la distribució dels percentatges d'hibridació dels bacteris sulfatoreductors i dels a-, b- i g-Proteobacteria varià en fondària. La comparació entre els percentatges d'hibridació obtinguts i els patrons dels 16S ADNr-RFLP determinà que, en alguns casos, tot i haver-hi diferències quantitatives, aquestes no es reflectien qualitativament.Finalment, per a esbrinar com podien quedar afectats els RFLP obtinguts en mostres naturals per dos factors que influencien l'eficiència de la PCR, la presència de mals aparellaments entre els encebadors i les seqüències diana d'aquests i el diferent nombre d'operons d'ADNr, es va desenvolupar una aproximació teoricopràctica. Amb aquest propòsit, es van seleccionar quatre soques bacterianes de les quals es coneixien ambdós paràmetres i es van analitzar els RFLP de diferents mescles. Els resultats obtinguts van demostrar que tots dos factors contribuïen significativament a l'hora d'obtenir els perfils genètics. D'aquesta forma, un nombre alt d'operons d'ADNr permetia una eficiència de detecció més gran, i un grau d'homologia més baix entre els encebadors i les seves seqüències diana implicava una disminució d'aquesta. / At this work, it has been studied different stratified ecosystems (microbial mats from Tarragona; Lakes Cisó and Vilar from Girona and Lake Estanya from Osca) by combining molecular (RFLP, DGGE and FISH) and classic (microscopic analysis and physicochemical parameter analyses) microbiological techniques. The application of molecular techniques has demonstrated that spatial and seasonal changes in the microbial composition are occurring in these ecosystems, whilst the second ones have been important to relate these genetic variations to biotic and abiotic fluctuations.Initially, spatio-temporal distribution of different physico-chemical parameters was determined in the ecosystems. Microbial mats were macroscopically (thickness and colour of each layer) and microscopically (dominant microbial populations) characterised. In Lake Estanya, microscopic analysis was also performed. The results obtained showed that conditions and dominant populations were very similar as previously described. Finally, it was performed the molecular analysis by applying genetic fingerprinting techniques (RFLP and DGGE) and fluorescence in situ hybridisation (FISH), based on the study of 16S rDNA and 16S rRNA, respectively.Genomic DNA extracted from standard strains, microbial mats and lake samples were approximately 23 kb size. Specific primers for Bacteria and Archaea domains were used to amplify by PCR the 16S rRNA genes from the whole microbial community present in each layer or depth in the ecosystems. Eubacteria domain was detected in all sampling times and depths or layers. Archaea primers yielded positive for all sampling times but mainly gave detectable product in the deeper part of the ecosystems (the black horizon in the microbial mat and the part of the lakes were sulphide concentration was high). The last domain was also detected in Lakes Vilar and Estanya in oxygenic depths.Then, bacterial PCR products that were obtained from the different ecosystems were digested with three separate restriction enzymes (AluI, HinfI, and RsaI) and then 16S rDNA-RFLP patterns were analysed by electrophoresis. Scoring similarities using the Jaccard coefficient performed RFLP patterns comparison. Applying the unweighted pair group method (UPGMA) and multidimensional scaling (MDS) analysis, afterwards, results showed a seasonal distribution with exception of Lake Estanya. In each seasonal cluster, subsamples also grouped together depending on the presence or absence of two abiotic parameters, light and/or oxygen.By PCR-RFLP analysis, restriction patterns from the entire water column in Lake Estanya were very similar to the patterns obtained in the deeper part of this lake in the stratified period. DGGE was used to corroborate the results obtained by RFLP fingerprinting. As happened by RFLP analysis, DGGE patterns showed the same distribution. Later amplification of 16S rRNA genes, the number of DGGE bands was compared and dominant bands were excised, sequenced, and identified. It was useful to obtain a preliminary overview of the dominant bacterial diversity in this ecosystem. By DGGE analysis and sequencing, sequences from dominant bands were affiliated into four major phyla of the Bacteria domain: Cyanobacteria, Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB), Proteobacteria (a and b) and Chlorobium. In this lake, bacterial composition was changeable with depth, being differences displayed by the Cyanobacteria, Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB) and a-Proteobacteria. Also, bacterial composition showed a seasonal variation, being these changes related to the b-Proteobacteria and Chlorobi.Using FISH we obtained quantitative information throughout the entire water column in Lake Estanya. However, this information was limited due to the high fraction of autofluorescent phototrophic organisms. Although the percentages of cells hybridising with specific probes (Bacteria domain: probes Eub338, Non338, Srb338, Dsv698, Dss658, Alf968, Bet42a and Gam42a; Archaea domain: probe Arch915) were low, intrasample and intersample variations were detected in this lake. The comparison of the hybridisation percentages in both periods showed that Bacteria and Archaea domains were at higher concentrations in the stratified period than in the other one, being their maximum concentration located in the upper part of the lake and in the deeper ones, respectively. Belong to Bacteria domain, sulphate-reducing bacteria and Proteobacteria (a, b and g) concentrations were different depending on the depth and period analysed.In this study, we have also developed a theoretic and practical approximation to elucidate how the presence of mismatches at the primers annealing regions and the different number of rDNA operons per cell can influence PCR and subsequent restriction fragment length polymorphism (RFLP) analyses from bacterial populations. We have performed RFLP analyses of 16S rRNA genes amplified by PCR from mixed bacterial cultures showing different primers identity and number of rDNA operons. Our results clearly corroborate that both factors, number of rDNA operons and primers identity, clearly influence the 16S rDNA-RFLP estimations. It has been demonstrated that higher number of operons leads to a higher efficiency of detection, but a lower degree of primer complementarity implies a decrease in such efficiency.