Aquesta tesi té com a principals objectius:1- Identificació de nous substrats de cdk2 en diferents models cel·lulars: cèl·lules HeLa, hepatòcits normals activats a proliferar mitjançant una hepatectomia parcial, limfòcits humans normals activats a proliferar, i la línia limfoide Namalwa.2- Localització intranuclear de proteïnes que participen en el control del cicle cel·lular en dos models de proliferació un normal i l'altre transformat: hepatòcits normals activats a proliferar mitjançant una hepatectomia parcial, i la línia cel·lular transformada d'origen humà HeLa.3- Anàlisi dels mecanismes d'activació de la cdk4 i la cdk2 durant la regeneració hepàtica.

Els complexes ciclina-CDK són elements clau perquè el cicle cel·lular es doni de manera ordenada. Estan regulats a diferents nivells ja que les seves funcions són essencials per a la correcta progressió del cicle. El primer nivell de regulació és la interacció entre la ciclina i la CDK. En segon lloc, aquestes proteïnes poden experimentar fosforilacions i defosforilacions activadores i inhibidores. En tercer lloc, aquests complexes poden ser inhibits per la interacció amb CKIs (CDK Inhibitors). Finalment, la localització subcel·lular també és una manera de regular l'activitat d'aquests complexes, ja que només són actius al nucli de la cèl·lula.En aquest treball presentem un nou mecanisme de regulació dels complexes ciclina-CDK. Concretament hem observat que els membres del complex ciclina A-CDK2 interaccionen amb l'acetilasa PCAF. Aquesta proteïna ha estat generalment considerada com a un co-activador transcripcional gràcies a la seva capacitat d'acetilar histones i activar la transcripció gènica. Tanmateix, també s'ha vist que és capaç d'acetilar proteïnes no-histones com ara p53 o MyoD, i com a conseqüència està implicada en altres funcions cel·lulars com la diferenciació o la resposta a dany al DNA. L'acetilasa PCAF s'uneix al complex ciclina A-CDK2 tot inhibint la seva activitat quinasa. A més, acetila la ciclina A, cosa que comporta la seva degradació pel sistema ubiquitina-proteasoma. PCAF també acetila CDK2 a la lisina 33, la qual es troba molt conservada a la família de les CDKs, ja que és un aminoàcid crucial per a la interacció amb l'ATP. L'acetilació de CDK2 a la lisina 33 comporta la inhibició de la seva activitat quinasa i la seva separació de la ciclina A.En conclusió, els resultats d'aquesta tesi aporten un nou nivell de regulació dels complexes ciclina-CDK desconegut fins ara, i que cal tenir en compte com a possible mecanisme d'acció dels fàrmacs basats en compostos inhibidors de deacetilases els quals, d'altra banda, estan donant bons resultats en el tractament de malalties hematològiques i tumors sòlids. / "REGULATION OF CYCLIN A-CDK2 COMPLEX BY ACETYLATION"TEXT:Cell cycle proteins are regulated in different ways, being phosphorylation one of the most important and more studied mechanisms of regulation. On the other hand, acetylation is another kind of post-translational modification that was discovered in histones and initially it was associated with transcriptionally active chromatin. However, different studies indicate that acetylation can also play a role in the regulation of non-histone proteins and it has been linked to oncogenesis and cardiovascular and neurodegenerative diseases.In this work we report that cyclin A/cdk2 complex, which is crucial for cell cycle progression during S phase, is acetylated by the acetyltransferase P/CAF. Cyclin A directly interacts with P/CAF and is acetylated at lysines 54, 68, 95 and 112. Maximal acetylation occurs simultaneously to ubiquitylation at mitosis, indicating a role of acetylation on cyclin A stability. A non-acetylatable mutant in which these lysines were substituted by arginines (cycA 4R) cannot be ubiquitylated, is more stable than cycA wild-type and arrests cell cycle at mitosis.Increased expression of cyclin A has been detected in many types of cancers and it has a prognostic value to predict survival or early relapse. Our results indicate that acetylation is able to cause a decrease in the levels of cyclin A, suggesting that treatment with HDAC inhibitors (which potentiate acetylation in the cell) could be considered to treat this kind of tumors.

El cicle cel•lular consta d’una sèrie de fases que donen lloc a dues cèl•lules filles genèticament idèntiques. Les diferents fases del cicle cel•lular (G1, S, G2, la mitosi i la citocinesi) són regulades per diferents complexes CDKs/ciclines. Aquests complexes estan formats per una subunitat catalítica, CDK i una subunitat reguladora, la ciclina. Els complexes CDK4-6/ciclina D regulen la transició G1/S, els complexes CDK2/ciclina A-E regulen la fase S i els complexes CDK1/ciclina A-B regulen la fase M. En aquesta tesi s’ha estudiat la regulació d’una d’aquestes ciclines, la ciclina A. Aquesta proteïna realitza funcions durant la fase S i la fase G2/M del cicle cel•lular, com per exemple, la seva implicació en l’inici i progressió de la replicació del DNA, evitar la re-replicació, regular la formació dels centrosomes, la condensació dels cromosomes i el trencament de l’embolcall nuclear. També, però s’han descrit funcions independents de CDKs, com per exemple la regulació de la invasió cel•lular a través de la via de senyalització de RhoA. La inhibició de la ciclina A provoca un retard en la metafase i anafase, causant un retard en la separació de les cromàtides germanes. En canvi, la sobreexpressió de la ciclina A provoca un avançament en la fase S. De la mateixa manera, s’han trobat nivells elevats de la ciclina A en certs tumors de mama, colon, pròstata,… A més, l’obtenció de ratolins knockout de ciclina A causa letalitat embrionària. En resum l’alteració de l’expressió de la ciclina A causa un desajustament durant el cicle cel•lular. Així doncs, els mecanismes que controlen la regulació de la ciclina A són importants pell bon funcionament de la proteïna a cada fase del cicle cel•lular. La ciclina A es degrada durant la prometafase. La causa de la seva degradació és l’acetilació per l’acetilasa P/CAF a quatre residus de lisina, els quals causen la seva ubiquitinització i posterior degradació per la via del proteasoma. El balanç acetilació/deacetilació està controlat per l’acció oposada d’acetilases i deacetilases. L’actual treball ha demostrat que la ciclina A interacciona amb la HDAC3, un proteïna que pertany a la classe I de la família de les HDACs clàssiques. Hem comprovat la interacció directa de la ciclina A i la HDAC3 a través del domini N-terminal de la ciclina A, el qual és important per a la degradació de la ciclina A. A més, aquestes proteïnes interaccionen durant les fases G1/S i G2/M. La sobreexpressió de la HDAC3 causa una disminució de l’acetilació de la ciclina A, així com la deleció de la HDAC3, provoca un increment en el seu estat d’acetilació, i per tant, una disminució de la vida mitra de la ciclina A. Finalment, hem comprovat que la HDAC3, a la vegada, també es degrada durant la mitosi, i estudis inicials en indiquen que possiblement la fosforilació de la HDAC3 regularia la seva estabilitat.

Dorsoventral patterning of the vertebrate nervous system is achieved by the combined activity of morphogenetic signals secreted from dorsal and ventral signalling centres. The Shh/Gli pathway plays a major role in patterning the ventral neural tube; however, the molecular mechanisms that limit target gene responses to specific progenitor domains remain unclear. Here, we show that Wnt1 and Wnt3a, by signalling through the canonical β-catenin/Tcf pathway, control expression of dorsal genes and suppression of the ventral programme, and thatthis role in DV patterning depends on Gli activity. Additionally, we show that Gli3 expression is controlled by Wnt activity. Identification and characterization of highly conserved non-coding DNA regions around the human Gli3 gene revealed the presence of transcriptionally active Tcf-binding sequences. These indicated that dorsal Gli3 expression might be directly regulated by canonical Wnt activity. In turn, Gli3, by acting as a transcriptional repressor, restricted graded Shh/Gli ventral activity to properly pattern the spinal cord.Additionally, the Wnt canonical pathway and Hedgehog signalling have been linked to cell proliferation in a variety of systems, however interaction of these pathways to control cell cycle progression have not been studied. In the developing vertebrate nervous system, although Shh and Wnt ligands are expressed at the opposite ventral and dorsal signalling centres, reports demonstrate that proliferation of neural progenitors require both activities throughout the dorsoventral axis. Here we demonstrate the integration of both pathways to control the length of G1 phase, and the absolute requirement of an upstream Hedgehog activity for the Wnt-mediated regulation of the key cell cycle activator CyclinD1 expression and for G1 progression. Although Wnt canonical activity appeared restricted to the control of G1 phase, Hedgehog activity additionally regulates the length of G2 phase through the regulation of ate cell cycle activators such as CyclinA2 and CyclinB2/3. These findings support a key role for Hedgehog in growth control, as a regulator of G1 and G2 phases of cell cycle and importantly as an upstream regulator of the canonical Wnt activity.KEY WORDS: SHH, WNT, Neural Tube, Patterning, CNS, Cell Cycle. / "La integración de las vías de señalización de Shh y Wnt controla la morfogénesis del SNC"TEXTO: La formación del patrón dorsoventral del sistema nervioso central en vertebrados está controlada por la acción de señales morfogenéticas. Estasseñales son secretadas por centros de señalización situados en el extremo dorsal, ectodermo y placa del techo, y ventral, notocorda y placa del suelo, del tubo neural. La vía de señalización de Shh/Gli juega un papel principal en el establecimiento temprano de la región ventral del tubo neural. Sin embargo, losmecanismos moleculares que restringen la expresión de los genes responsables de establecer este patrón a un dominio concreto no son del todo conocidos. En este trabajo mostramos que las señales morphogenéticas Wnt1y Wnt3a, activando la vía de señalización canónica mediada por β-catenina/Tcf, regulan la expresión de genes dorsales y reprimen el programa ventral, mediante un mecanismo que depende de la actividad Gli. Además, mostramosque la expresión de Gli3 está controlada por la vía de Wnt. La identificación y caracterización de regiones no codificantes altamente conservadas alrededor del locus de Gli3 humano revela que contienen sitios de unión consenso para los factores Tcf/Lef-1 activos. Esto indica que la expresión dorsal de Gli3 está controlada directamente por la actividad de la vía canónica de Wnt. A su vez, Gli3, actuando como un represor transcripcional, restringe la actividad del gradiente ventral Shh/Gli para establecer el patrón dorsoventral del tubo neural correctamente.Por otro lado, las vías canónicas de señalización celular de Wnt y Hedgehog regulan la proliferación celular en varios contextos de forma conjunta, Sin embargo, posiblesm interacciones de estas vías de señalización en el control del ciclo celular no han siso estudiadas. Durante el desarrollo del sistema nervioso de vertebrados, aunque las proteínas Shh y Wnts se expresan en extremos dorso-ventralmente opuestos del tubo neural, varios trabajos demuestran que la proliferación de los progenitores neuronales requiere ambas actividades a lo largo de todo el eje dorsoventral. En este trabajo, demostramos que esnecesaria la integración de ambas vías de señalización para controlar la duración de la fase G1 del ciclo celular. Además, mostramos el requerimiento de la actividad Hedgehog para la regulación mediada por Wnt de la expresión del activador de ciclo celular ciclina D1, componente clave para la progresión através de G1. Aunque la actividad de la vía canónica de Wnt se limita al control de la transición G1/S, adicionalmente, la actividad Hedgehog regula la duración de la fase G2 mediante la regulación de las ciclinas de fase G2 ciclina A2 y Ciclinas B2/B3. En conjunto, estos resultados proponen un papel fundamentalen el control del crecimiento para la actividad Shh/Gli como reguladora de las fases G1 y G2 del ciclo celular y además como reguladora por encima de la actividad canónica de Wnt.

Flotillin-1 és una proteïna associada a membrana plasmàtica implicada en processos de trànsit de vesícules, reordenació del citoesquelet i transducció de senyals. Estudis previs en el laboratori han demostrat que Flotillin-1 és capaç de translocar-se a nucli en resposta a un estímul mitogènic i afavorir la proliferació de diverses línies cel·lulars. Els mecanismes mitjançant els quals provoca aquests efectes són desconeguts i objecte del present estudi.D'una banda demostrem que Flotillin-1 és un factor regulador de la cinasa Aurora B, una proteïna que intervé en el control de la mitosi i més concretament en el anaphase checkpoint. El knock-down de Flotillin-1 provoca events mitòtics aberrants, acompanyats del descens tant en l'expressió d'Aurora B com de la seva activitat mesurada com els nivells de fosforilació de la histona H3. Flotillin-1 interacciona amb Aurora B i evita la seva degradació per la via del proteasoma.D'altra banda, Flotillin-1 interacciona amb el receptor transmembrana Notch1, implicat en nombrosos processos de regulació de proliferació, diferenciació, apoptosi, etc. Flotillin-1 regula la localització subcel·lular de Notch1 així com la seva capacitat com activador transcripcional. La depleció o mutació de Flotillin-1 dificulta l'entrada de Notch1 a nucli i l'expressió dels gens diana de les famílies Hes/Hrt. En conjunt, es presenta a Flotillin-1 com una proteïna capaç d'actuar a diferents nivells i regular processos i vies de senyalització cel·lular que li confereixen un paper com a regulador de la proliferació cel·lular. / Flotillin-1 is a protein associated to plasma membrane involved in vesicle trafficking, cyotskeleton reorganization and signal transduction. Previous findings in our laboratory has shown that Flotillin-1 is able to translocate the nucleus under mitogenic stimulus and increase proliferation rates of several cell lines. The mechanisms of action are unknown and object of the present study.First, we show that Flotillin-1 is a regulator factor of the mitotic kinase Aurora B, a protein involved in control of mitosis and, specifically, in the anaphase checkpoint. The knock-down of Flotillin-1 causes aberrant mitotic events, decrease in Aurora B levels and its activity, measured as protein levels of phosporilated histone H3. Flotillin-1 interacts with Aurora B and avoid its degradation by the proteasome pathway.In addition, Flotillin-1 interacts with the transmembrane receptor Notch1, involved in many regulatory processes of proliferation, differentiation, apoptosis, etc. Flotillin-1 regulates the subcellular localization of Notch1 and its activity as transcriptional activator. The mutation or depletion of Flotillin-1 difficult the entry of Notch1 in the nucleus and the expression of its target genes Hes/ HRT. Overall, Flotillin-1 is a protein capable of acting at different levels, processes and signaling pathways in order to be a regulator of cell proliferation.

La medicina personalitzada i les teràpies dirigides són, avui dia, estratègies emergents en les companyies farmacèutiques. L’objectiu global, a llarg termini, és desenvolupar tractaments dirigits cap a mecanismes moleculars desregulats únicament en les cèl•lules afectades, reduint així els problemes de toxicitat d’aquests compostos. Aquest procés és llarg i costós però la introducció de les tècniques de disseny racional de fàrmacs ha permès reduir de manera considerable el temps d’identificació de molècules actives, agilitzant així les etapes inicials. Les teràpies antitumorals dirigides a promoure l’apoptosi i/o a controlar el procés de proliferació cel•lular es troben avui dia en ple desenvolupament. A més, les oportunitats d’intervenció terapèutiques en aquesta línia s’incrementen a mesura que augmenta el coneixement de les proteïnes involucrades en aquests processos. Avui dia els principals problemes dels compostos identificats radiquen però en la seva selectivitat i el gran nombre d’efectes secundaris que presenten, pel que el disseny del molècules selectives és un camp de recerca molt actiu. El present projecte es basa en la cerca de nous fàrmacs anticancerígens mitjançant la modelització molecular. D’una banda es tracta d’identificar inhibidors per a les proteïnes de la família Bcl-2 per a restablir els nivells normals d’apoptosi i, de l’altra, per a les proteïnes CDK4 i CDK6, importants reguladores del cicle cel•lular. L’objectiu plantejat a llarg termini en aquesta tesi és identificar compostos actius amb potència i selectivitat cap a aquestes proteïnes per tal de convertir-los en caps de sèrie que finalment puguin arribar a ser fàrmacs comercials. La utilització de compostos mimètics del domini BH3 per inhibir la funció dels membres antiapoptòtics de la família Bcl-2 és una de les estratègies més emprades per al control de l’apoptosi. En aquest marc, en funció de la selectivitat que presenten envers els pèptids BH3, podem trobar dues subfamílies de proteïnes antiapoptòtiques: Bcl-2, Bcl-xL i Bcl-w d’una banda i Mcl-1 i A-1 de l’altra. Diferents estudis suggereixen que per a produir la mort cel•lular és necessari intervenir al menys un membre de cadascuna de les subfamílies. Per tant, sota aquesta premissa, es van analitzar les interaccions establertes entre les proteïnes antiapoptòtiques i dominis BH3 tant pel cas de pèptids que s’uneixen amb igual afinitat a tota la família, com per a pèptids selectius de cadascun dels subgrups. Nombrosos estudis apunten a que la helicitat en els pèptids mimètics dels domini BH3 incrementa notablement l’afinitat d’enllaç. Sota aquesta premissa s’ha tractat de dissenyar pèptids derivats de la proteïna proapoptòtica Bak substituint alguns dels residus prescindibles per l’aminoàcid no natural Aib, inductor de conformacions helicoïdals. Actualment tots els inhibidors coneguts per a les CDKs, actuen sobre el lloc d’unió de l’ATP. Donat que existeix una gran quantitat de dades experimentals sobre aquests compostos es va decidir avaluar diferents algoritmes de docking i predicció d’afinitats experimentals amb cinc inhibidors coneguts de CDK6. Finalment, s’ha proposat també un desenvolupament metodològic que enfoca el problema del disseny de fàrmacs des d’una perspectiva més amplia: la quimiogenòmica. Amb la seqüenciació del genoma humà s’ha pres consciència de que resulta inviable avaluar el gran número de compostos químics coneguts actualment sobre totes les possibles dianes terapèutiques identificades en el genoma humà. Per aquest motiu és imprescindible desenvolupar mètodes teòrics més senzills per a la caracterització i comparació de molècules que permetin predir la seva activitat biològica. Així doncs, amb la realització d’aquesta tesi, queda patent que l’aplicació de mètodes teòrics pot contribuir de manera eficient al disseny de fàrmacs. D’aquesta manera es possible reduir el cost i temps necessari per al descobriment de compostos actius. / Nowadays, personalized medicine and directed therapies have emerged as appealing strategies for pharmaceutical companies. The long-term goal is developing new treatments to target molecular pathways altered only in affected cells, thus reducing undesired side effects and toxicity problems. This is a tedious and long process although the incorporation in its framework of rational drug design techniques has reduced the time needed to identify new active molecules. The knowledge of molecular mechanisms involved in a given pathology allows finding a point of the process that can be targeted, usually a protein, restoring the normal cell behavior. Once identified the therapeutic target it is possible to find compounds that reproduce interactions between this protein and the corresponding natural regulations by means of molecular modeling techniques. In principle, these compounds are expected to mimic the biological effect of the natural regulators. Antitumoral therapies oriented to promote apopotosis or control the cell proliferation process are gaining importance nowadays. In addition, opportunities for therapeutic intervention in this context are growing with the discovery of new proteins involved in these pathways. In fact, the drawback of compounds known at date relies on selectivity problems and, thus, the huge number of undesired side effects of these treatments. Hence, development of selective treatments is a very active research field. The goal of the present PhD project is to identify new anticancer agents using molecular modeling techniques. On the one hand, it has been tried to identify inhibitors of the Bcl-2 protein family in order to restore normal apoptosis levels in tumoral cells and, on the other hand, for the CDK4 and CDK6 proteins, key regulators of eukaryotic cell cycle. All these proteins are deregulated in many types of cancer and thus, are presented as interesting targets for the cancer treatment. The identification of compounds with potency and selectivity for these proteins that can be used as lead compounds that finally will become commercial drugs is seeked.

L´apoptosi, o mort cel.lular programada, és un procés actiu que mobilitza els recursos cel.lulars amb l´objectiu de mantenir l´homeostasi de l´organisme a expenses del suïcidi de cèl.lules individuals. Diferents estudis han mostrat un increment de l´activiat d´algunes cdk, especialment Cdk1 i Cdk2, en correlació amb la progressió dels primers estadis apoptòtics. En el nostre laboratori l´estudi de l´apoptosi en timòcits, els quals no tenen una activitat cdk significativa degut a l´aturada del cicle cel.lular en G1, demostren que la inducció de l´activitat de Cdk2 després del tractament amb radiació gamma o amb glucocorticoides és necessària per l´inici de l´apoptosi. Mentre cap de les ciclines conegudes sembla ser la proteïna activadora de Cdk2 en apoptosi, en el nostre laboratori hem identificat un nou membre de la família de les ciclines, denominada Ciclina O, capaç d´activar aquesta kinasa in vivo en línies cel.lulars. L´expressió d´aquesta nova ciclina en el timus, i altres teixits, s´indueix ràpidament després del tractament amb radiació gamma i coincideix amb l´aparició de l´apoptosi. Aquests resultats posicionen la Ciclina O com a millor candidat a ser l´activador de Cdk2 necessari per induïr la mort cel.lular programada en el timus, i probablement també en altres òrgans. / The apoptosis, also called programmed cell death, is an active process able to use the cellular mechanisms to kill individual cells in order to keep the functional homeostasis of the whole organism. Different studies had shown a correlation between the first apoptotic events and the induction of some cdk proteins, particularly Cdk1 and Cdk2. The studies of thymocytes in our laboratory, wich lacks the most amount of cdk activity related to the cell cycle because of its arrest in G1, had shown that the induction of Cdk2 activity after the treatment with gamma radiation or glucocorticoids is a necessary step for the apoptosis induction. While any of the cyclins described at the moment seems to be the Cdk2 activator for apoptosis a new member of the cyclin family able to activate the kinase Cdk2 in vivo in cell lines has been identified in our laboratory. The expresion of this cyclin, known as Cyclin O, is quickly induced in the thymus after the treatment with gamma radiation and correlates with the induction of apoptosis. These results position Cyclin O as the best candidate to activate Cdk2 and inuce the programmed cell death in the thymus, and probably other tissues.