Orientador: Ricardo de Lima Zollner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T10:18:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ashimine_Rika_M.pdf: 5750364 bytes, checksum: 6e356464e821f803ab86ff8474edb56f (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A insulite está presente em ambos os sexos do camundongo NOD (non obese diabetic), enquanto a incidência do diabetes tem alta prevalência em fêmeas. O diabetes manifesta-se em 90% das fêmeas e aproximadamente em 20% nos machos. Neste estudo, investigamos o efeito da testosterona na incidência do diabetes e no perfil de citocinas Th1 no pâncreas e em células esplênicas do camundongo fêmea NOD. Nós utilizamos diferentes doses in vitro (5, 10, 20 e 30nM) e in vivo (174JlMe 348JlM)com administração semanal e mensal. Os camundongos fêmeas foram mantidos em tratamento durante 28 semanas, iniciando na 48 semana de vida. Para os estudos in vivo o tratamento semanal e mensal com 174JlM de testosterona reduziu a incidência do diabetes em 40%, enquanto o tratamento semanal com 348JlMreduziu a incidência do diabetes a 20%, índice semelhante ao do macho, com menor índice de insulite. No pâncreas, o perfil de citocinas Th1 estava aumentado no grupo de animais tratados diabéticos que no grupo de camundongos não diabéticos. Semelhante aos resultados do estudo in vivo, os efeitos da testosterona in vitro sobre as citocinas Th1 de células esplênicas exibiram tempo e dose-dependência. Contudo, o efeito da testosterona in vivo sobre a diminuição do IFN-y foi mais proeminente. O efeito da testosterona sobre a ativação da Stat3, Stat4, Jak2 e Tyk2 evidenciou que o estímulo a fosforilação de Jak2 e a fosforilação de Stat3 reduzida é dose-dependente. Estes resultados reforçam os efeitos da testosterona sobre a incidência do diabetes tipo 1 e sua modulação nos níveis de citocinas Th1e na fosforilação dos fatores de transcrição no pâncreas e em células esplênicas no camundongo NOD / Abstract: Insulitis is present in both gender of non-obese diabetic (NOD) mice, where as the incidence of diabetes is much higher in females; overt diabetes appears in 90% of females and approximately 20% of males. In this study, we investigated the effect of testosterone on the incidence of diabetes and the Th1 cytokine profile in pancreas and spleen cells in female NOD mice. Testosterone was employed at different doses (in vivo 174uM and 348uM; and 5, 10, 20 or 30nM in vitro) and with variable frequencies (weekly and monthly) of administration., Female mice were maintained under treatment for 28 weeks, starting from the 4thweek of life. Diabetes was diagnosed by two consecutive blood glucose levels > 250mg/dL. For in vivo studies, the weekly and monthly schedule of 174J..lM testosterone treatment reduced the incidence of diabetes to 40% whilst the weekly dose of 348J..lMreduced the incidence to 20%, an incidence similar that of male diabetes with a lower insulitis index. In pancreas, the Th1 cytokine profile was higher in treated diabetic than non-diabetic mice. Similarly to in vivo studies, the in vitro effects of testosterone on spleen cells Th1 cytokine were time and dose dependent. However, in vivo, decrease in IFN-y was more prominent. Testosterone activation of Stat3, Stat4, Jak2 and Tyk2 induced a dose dependent increase in Jak2/Py and a decrease in Stat3/Py. These results demonstrate the effect of testosterone on the incidence type 1 diabetes and its modulation of the Th1 cytokine and transcription factor phosphorylation in NOD mice / Mestrado / Ciencias Basicas / Mestre em Clinica Medica

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-09-20T04:10:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 341096.pdf: 2936966 bytes, checksum: 935577bec836eb461f4854e3cc51d7e7 (MD5) Previous issue date: 2016 / Inúmeros estudos demonstram que a inflamação em indivíduos obesos está fortemente associada com um maior risco de desenvolvimento e progressão tumoral. O fator de necrose tumoral alfa (TNF-a) é uma das citocinas responsáveis pela iniciação e progressão de tumores, como também a amiloide sérica A (SAA), proteína produzida pelo fígado e pelo tecido adiposo em condições de inflamação. Além disso, ligantes do receptor de fator de crescimento epidermal (EGFR), como o EGF, demonstraram efeitos no favorecimento da proliferação celular e metástase. Neste sentido, analisamos se o soro de pacientes obesos e meio de cultura suplementado com citocinas poderiam criar um microambiente favorável ao crescimento tumoral com células de melanoma, além de verificar alterações na expressão gênica relacionada à progressão tumoral (B-RAF e N-RAS). Realizamos o ensaio clonogênico, o ensaio de migração 2D e ciclo celular em três linhagens de melanoma, SK-mel-19, SK-mel-28 e SK-mel-147. Uma delas, a SK-mel-28, demonstrou uma resposta mais intensa em relação à migração e capacidade clonogênica quando tratada com TNF-a e EGF. Deste modo, as células com mutação em B-RAF (SK-mel-28) foram tratadas com soro de 10 pacientes com IMC acima de 30 kg/m2, e 6 indivíduos com IMC abaixo de 25kg/m2, TNF-a (25 e 50 pg/mL), EGF (100 ng/mL), IL-1ß (10 pg/mL), IL-6 (10 pg/mL), MCP-1 (25 pg/mL) e SAA (75 ng/mL) a fim de avaliar os efeitos de componentes inflamatórios na migração pelo ensaio de migração 2D, e na expressão de B-RAF e N-RAS por PCR em tempo real. Também analisamos estes tratamentos na co-cultura de SK-mel-28 e mononucleares isolados do sangue periférico (PBMC). Foi observado um aumento na capacidade migratória das células de melanoma quando tratadas com soro dos obesos, rico em SAA (soros com concentração de SAA 50 vezes maior do valor de referência), além do tratamento com TNF-a. O soro dos obesos aumentou a expressão de N-RAS nas células de melanoma, fato também observado após tratamento com IL-6. As citocinas IL-1ß e IL-6 ampliaram a expressão de B-RAF. No ensaio clonogênico, os tratamentos com EGF e TNF-a aumentaram a capacidade clonogênica. Além disso, na co-cultura de melanoma com mononucleares, as células foram capazes de liberar citocinas no sobrenadante após tratamento com proteínas inflamatórias. Os resultados demonstraram uma associação entre as citocinas envolvidas em situação de obesidade (TNF-a, EGF, IL-1ß, IL-6, MCP-1 e SAA) e progressão tumoral, e sugerem que as citocinas pró-inflamatórias podem servir como alvo secundário no tratamento do melanoma. É necessário um aperfeiçoamento no entendimento dos efeitos das citocinas nas células de melanoma a fim de desenvolver novas abordagens terapêuticas para o tratamento do câncer.<br> / Abstract : It has been shown that low-grade inflammation on obese patients is strongly associated with an increased risk of cancer development and tumor progression. Tumor necrosis factor-a (TNF-a) is one of the cytokines that are responsible for both initiation and progression of tumors, as well as serum amyloid A (SAA), a cytokine produced by both liver and adipose tissue in inflammatory conditions. In addition, epidermal growth factor receptor (EGFR) ligands, such as EGF, have also demonstrated effect on fostering cell proliferation, tumor resistance and metastasis. Therefore, we examined whether serum from obese patients and cytokine-supplemented medium could create a growth-enhancing microenvironment in melanoma cells and gene expression alterations regarding tumor progression in melanoma (B-RAF and N-RAS). We performed clonogenic assay, scratch assay and cell cycle analysis in three different melanoma cell lines. One of them (SK-mel-28) demonstrated a major improvement regarding migration and clonogenicity when treated with TNF-a and EGF. Therefore, B-RAF mutated melanoma cells (SK-mel-28) were treated with serum from 10 patients with BMI > 30 kg/m2, and 6 individuals with BMI < 25 kg/m2, TNF-a (25 and 50 pg/mL), EGF (100 ng/mL), IL-1ß (10 pg/mL), IL-6 (10 pg/mL), MCP-1 (25 pg/mL) and SAA (75 ng/mL) in order to evaluate the effect of these cytokines on 2D cell migration, along with B-RAF and N-RAS gene expression by real-time PCR. We also analyzed these treatments in co-culture of SK-mel-28 and peripheral blood mononuclear cells (PBMC). An improve in melanoma cell migration was observed on cells treated with SAA-rich serum of obese patients (sera with a 50-fold increment of SAA above reference value), along with TNF-a?treated cells. Likewise, SAA-rich serum increased N-RAS gene expression in melanoma cells, fact observed with treatment with IL-6 as well. Cytokines such as IL-1ß and IL-6 increased the expression of B-RAF. In clonogenic assay, treatment with EGF increased the colony-forming potential, as well as TNF-a. Furthermore, when in co-culture of melanoma with PBMC, cells were able to release cytokines in supernatant after treatment with inflammatory proteins. The results demonstrated an association between cytokines involved in obesity (TNF-a, EGF, IL-1ß, IL-6, MCP-1 and SAA) and tumor progression, moreover, these cytokines may be target for melanoma treatment. The improvement in the understanding of the effects of cytokines in tumor cells is important in order to pave the way for new therapeutic approaches for cancer treatment.

Made available in DSpace on 2015-11-11T12:04:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 13.pdf: 4014102 bytes, checksum: dd3f18f96a005efc5ed89596951f797c (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães. Recife, PE, Brasil / Estudos indicam que citocinas Th1 (IL-2, TNF-alfa e IFN-gama) reduzem a fibrose na esquistossomose mansônica, enquanto que as Th2 (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13) tem papel crítico na patogênese da doença. O desenvolvimento da resposta Th2 é dependente de IL-4, mas estudos revelaram a IL-13 como a mediadora da fibrose. Os mecanismos de controle da IL-13 estão ligados aos receptores desta citocina. O receptor IL-13Ra2, conhecida como receptor antagonista se liga com alta afinidade a IL-13, e estudos identificaram a sua participação na diminuição da fibrose e tamanho do granuloma. O principal objetivo desse projeto é avaliar o papel do IL-13Ra2 e da resposta imune celular nos diferentes graus de fibrose hepática e nas formas clínicas da esquistossomose mansônica humana. Os pacientes com diversas formas clínicas foram selecionados no Ambulatório de Gastroenterologia do HC- UFPE e avaliados através da ultrassonografia. As citocinas Th1 e Th2 foram dosadas através de citometria de fluxo e ELISA (IL-13 e IFN-gama), para a análise estatística foram utilizados testes de Mann-Whitney e Kruskal-Wallis e o teste de correlação de Spearman considerando um p 0,05 como significativo. Foi encontrado uma correlação negativa (p 0,05) entre o IL-13Ra2 e a IL-13, sugerindo um aumento da citocina no início da fibrose. Foi encontrada correlação inicialmente negativa nos pacientes sem fibrose e posteriormente positiva, nos pacientes com fibrose grave, entre IFN-gama e IL-13, salientando um novo mecanismo de regulação no processo de fibrose periportal na doença. Houve correlação positiva entre as citocinas do perfil Th1 e entre as citocinas do perfil Th2, sugerindo falta de supressão imunológica e presença de ambas às respostas, regulando a doença, com diferentes graus de fibrose periportal. Os resultados contribuirão para um melhor entendimento sobre os mecanismos imunes que controlam o processo de fibrogênese hepática em humanos e poderão ainda permitir um melhor entendimento da relação entre resposta imune celular e esquistossomose mansônica

Orientador : Alexandra Ivo de Medeiros / Banca: Vania Luiza Deperon Bonato / Banca: Carlos Rossa Junior / Resumo: A fagocitose de células apoptóticas é um processo dinâmico importante para a homeostase dos tecidos após injúria. Os macrófagos além de atuarem na remoção de células apoptóticas, também colaboram na defesa contra microrganismos. Existem ao menos duas populações de macrófagos classificadas como macrófagos M1 (pró-inflamatórios) e macrófagos M2 (anti-inflamatórios). Estes leucócitos diferem quanto ao fenótipo e funções efetoras dependendo, primordialmente, do microambiente e dos microrganismos com que interagem no tecido. Em uma situação de injúria pulmonar estéril (inalação de agentes tóxicos), há acúmulo de células apoptóticas sem a presença de agente microbiano. Por outro lado, durante uma infecção pulmonar bacteriana, ocorre intensa migração de células para o local da infecção na tentativa de conter a proliferação bacteriana, resultando em intenso acúmulo de células apoptóticas infectadas neste tecido. Portanto, nesse trabalho foi avaliado, in vitro e in vivo, o efeito da fagocitose de células apoptóticas infectadas (AC-Sp) ou estéreis (AC) na polarização de macrófagos M1/M2, bem como suas funções efetoras, e o efeito da PGE2 nesse contexto de eferocitose. Macrófagos M0 co-cultivados com AC ou AC-Sp apresentam um fenótipo intermediário entre M1 e M2, com secreção de altos níveis de IL-6, TNF-α, PGE2, TGF-β e NO e a expressão de genes relacionados ao perfil M1, iNOS, e ao perfil M2, Arginase 1. Além disso, macrófagos M0 cultivados com AC ou AC-Sp, apresentam supressão da função microbicida quando desafiados com S. pneumoniae. A presença de PGE2 dirige a polarização de macrófagos M0 a um perfil M2 e a presença de inibidores de COX promove a reversão do fenótipo de polarização destes macrófagos. Os resultados in vivo demonstram que a instilação de AC ou AC-Sp promove distintos microambientes no pulmão destes animais, que influenciam na resolução da infecção..... / Abstract: The phagocytosis of apoptotic cells is dynamic and crucial for homeostasis after injury. Macrophages act on the clearance of apoptotic cells and collaborate with defense against microorganisms. There are at least two distinct macrophage populations classified as M1 macrophages (pro-inflammatory) and M2 macrophages (anti-inflammatory). Both cells differ on the state of polarization and effectors function depending primarily on the microenvironment and microorganisms that interact into the tissue. In a situation of sterile lung injury (inhalation of toxic agents), there are accumulation of apoptotic cells without the presence of pathogen. On the other hand, during a bacterial pulmonary infection there is intense cell migration to the infection site in an attempt to impair bacterial growth, resulting in a large accumulation of infected-apoptotic cells in the tissue. Therefore, this study has evaluated in vitro and in vivo, the effect of the phagocytosis of infected-apoptotic cells (AC-Sp) or sterile cells (AC) on the polarization of M1/M2 macrophages, as well as in their effector functions and the effect of PGE2 in the context of efferocytosis. M0 macrophages co-cultured with AC or AC-Sp show an intermediate phenotype between M1 and M2 with high secretion levels of IL-6, TNF-α, PGE2, NO and TGF-β, and gene expression profile related to M1, iNOS, and M2, arginase 1. Furthermore, M0 macrophages cultured with AC or AC-Sp show strong suppression of the macrophage microbicidal function when challenged with S. pneumonia. The presence of PGE2 drives the polarization of M0 macrophages to a M2 profile, and in the presence of COX inhibitors, it reverses the polarization of this macrophage phenotype. The in vivo results demonstrate that the instillation of AC or AC-Sp promotes distinct microenvironments in the lungs of these animals, which influence the resolution of the infection. All these results suggest that the presence of AC or AC-Sp promotes, ... / Mestre

Orientador: Josimeri Hebling / Banca: Pedro Paulo Chaves de Souza / Banca: Adriano Fonseca de Lima / Resumo: Objetivo: Avaliar o efeito do LED infravermelho (855 nm), aplicado em diferentes doses de energia, na produção e expressão de mediadores inflamatórios por células pulpares humanas (HDPC) em cultura. Metodologia: HDPC obtidas de dentes decíduos foram semeadas (105 células/well) e após 24 h foram colocadas em contato com LPS (10 μg/mL α-MEM) ou TNF-α (25 ng/mL α-MEM). Em seguida, as células foram submetidas a uma única irradiação com LED infravermelho (855 nm) nas diferentes doses de energia: 2, 4, 8, 15 ou 30 J/cm2. Gupos não irradiados, com e sem LPS/TNF-α, serviram como controles. Decorridas 24 h, as células estimuladas com LPS foram avaliadas quanto à produção de óxido nítrico (NO), de espécies reativas de oxigênio (EROs) e viabilidade celular (ensaio de MTT) (n=8 por grupo). As células estimuladas com TNF-α foram avaliadas quanto à produção de citocinas pelos métodos de antibody array e q-PCR (n=5 por grupo). Os dados foram submetidos aos testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney (α=0,05). Resultados: O contato com LPS resultou em aumento significativo da produção de NO sem causar qualquer dano ao metabolismo respiratório das células. Independentemente da dose de energia aplicada, a produção de NO foi significativamente reduzida quando as células foram irradiadas. O melhor efeito foi observado para a dose de 15 J/cm2. A irradiação também promoveu uma diminuição na produção de EROs, enquanto o metabolismo das HDPC não foi alterado. Nas células em contato com TNF-α verificou-se que as citocinas mais produzidas foram: GROα, IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1 e Serpin E1. Na análise por q-PCR redução foi observada para a expressão de IL-1 β, quando as células foram irradiadas com 4 J/cm2. Conclusão: O estresse oxidativo de HDPC pode ser biomodulado por uma única dose de irradiação com LED infravermelho. Quanto a expressão de citocinas inflamatórias... / Abstract: Aim: To investigate the effect of infrared light emitting diode (LED) irradiation (855nm), at different energy doses, on the production and expression of inflammatory mediators by cultured human dental pulp cells (HDPC). Methodology: HDPC were harvested from sound, near-exfoliation primary teeth. Cells were seeded (105 cells/well) using α-MEM supplemented with 10% FBS and after 24h, were exposed to LPS (10 μg/mL α-MEM) or TNF-α (25ng/mL α- MEM). Then, HDPC were submitted to a single irradiation with an infrared LED (855 nm) delivering different doses of energy: 0, 2, 4, 8, 15 or 30 J/cm2. Nonirradiated cells, with and without LPS/TNF-α, served as controls. Followed 24h, the cells stimulated with LPS were tested for nitric oxide (NO) quantification, cell viability (MTT assay), and reactive oxygen species (ROS) production (n=8 per group). Cells stimulated with TNF-α were analyzed regarding cytokine production and expression using antibody array and q-PCR (n=5 per group). Data were submitted to Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests (α=0.05). Results: LPSinduced stress resulted in significant increase in NO production by HDPC without causing any damage to cell respiratory metabolism. Irrespective of the energy dose delivered, NO production was significantly reduced when LPS-stressed cells were irradiated. The best effect was observed when 15 J/cm2 were delivered to cells. Infrared LED irradiation also promoted decrease in ROS production, while HDPC metabolism was not significantly affected. The most produced cytokines in cells stimulated with TNF-α were: GROα, IL-6, IL-8, TNF α, MCP-1 and E1 Serpin. qPCR analysis showed a decrease in expression of IL- 1 β when the cells were irradiated with the dose of 4 J/cm2. Conclusion: The oxidative stress of HDPC can be biomodulated by a single irradiation of an infrared LED. Regarding the expression of inflammatory cytokines, the delivery of 4 J/cm2 was... / Mestre

Orientador: Benedito Barravieira / Coorientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Banca: Lucilene Delazari dos Santos / Banca: Jean-Philippe Chippaux / Banca: Debora de Mello Gonçalves Sant Ana / Banca: Daniel C. Pimenta / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da melitina natural na infecção experimental por Leishmania (L.) infantum chagasi, bem como seu efeito sobre a produção de citocinas pró e antinflamatórias e metabólitos do oxigênio e do nitrogênio. O fracionamento do veneno foi realizado por meio de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC-RP) usando-se colunas C8 e C18. As frações foram identificadas por sequenciamento peptídico pela química degradativa de Edman e espectrometria de massas do tipo eletrospray. A determinação da atividade anti-leishmania, contra formas promastigotas foi realizada de forma seriada partindo-se de uma concentração inicial de melitina de 100 μg/mL observando-se o valor de CE50 de 28,29 μg/mL. Foi realizado estudo de citotoxicidade em macrófagos peritoniais isolados de camundongos BALB/c, obtendo-se um valor de CE50 de 5,73 μg/mL. A viabilidade celular de ambos os ensaios foi avaliada por meio do estudo da atividade oxidativa mitocondrial (MTT). Os estudos em formas amastigotas intracelulares demostraram um valor de CE50 de 1,47 μg/mL. Quanto a produção de citocinas por celulas desafiadas com o parasita e tratados com a melitina observou-se que houve tendência de aumento para as citocinas inflamatórias IL12 e TNF-α nas concentrações utilizadas e nos respectivos períodos de tempo. A melitina não interferiu na produção de IFN-γ e TGF-β, porém observamos diminuição significativa nos níveis de IL-10, fato semelhante observado na produção de H2O2 e NO. Conclui-se que a melitina demonstrou eficácia in vitro contra a espécie Leishmania (L.) infantum chagasi, podendo ter atuado de forma direta contra o parasita intracelular e/ou por meio da modulação da resposta imune levando a ativação de macrófagos, em que estes produziram outras substâncias que não NO e H2O2, proporcionando uma redução da carga parasitária dentro do macrófago, ... / Abstract: The purpose of this research was to evaluate the effect of natural melittin extracted and purified from the venom of Apis mellifera over an in vitro infection with Leishmania (L.) infantum chagasi, well as their effects on the production of proinflammatory and anti-inflammatory, and metabolites of oxygen and nitrogen. The fractionation of the venom was accomplished by high-performance liquid chromatography system (RP-HPLC) using C18 and C8 columns. These fractions were determined by peptide sequence using a combination of Edman degradation sequence analysis and electrospray ionization (ESI) mass spectrometry. The ascertainment of anti-leishmania activity against promastigote forms was conducted in a seriate form, beginning with an initial melittin concentration of 100μg/mL, noting an EC50 value of 28.29 μg/mL. Cytotoxicity study was conducted in isolated peritoneal macrophages from BALB/c mice, obtaining an EC50 value of 5.73μg/mL. The cell viability of both trials was assessed by means of the study of mitochondrial oxidative activity (MTT). The studies demonstrated an EC50 value of 1.47μg/mL on intracellular amastigotes. As the cytokines production by cells challenged with parasite and treated with melittin, was observed that there was an increased tendency for inflammatory cytokines IL-12 and TNF-α at used concentrations and in the respective periods of time analyzed. The melittin did not interfered in the IFN-γ and TGF-β production, however were observed a significant decrease in the IL- 10 levels, which was similarly observed in the H2O2 and NO production. It is concluded that melittin has shown in vitro efficacy against Leishmania (L.) infantum chagasi and may have a directly behavior against the intracellular parasite and/or by the immune response modulation, leading to an macrophages activation, and after, a production of other substances than NO and H2O2, providing a reduction in ... / Doutor

Órgãos provenientes de doadores em morte encefálica (ME) apresentam piores desfechos nos receptores transplantados quando comparados a órgãos de doadores vivos, relacionados ou não relacionados. A lesão desses órgãos dá-se pelos processos relacionados à sua retirada e estocagem e também pela intensa atividade inflamatória presente na ME. Os efeitos dessa inflamação, com aumento da expressão de citocinas, já foram comprovados em rins, fígado, pulmão, coração e pâncreas. A maioria dos estudos avaliou os níveis de citocinas após ter sido estabelecido o diagnóstico de ME ou durante a cirurgia de retirada de órgãos para transplante. Porém, acredita-se que a intensa liberação de catecolaminas que ocorre no momento da instalação da ME possa relacionar-se com elevação precoce desses marcadores. Os pacientes em ME frequentemente apresentam outros insultos que podem desencadear resposta inflamatória sistêmica, como ventilação mecânica, choque hemorrágico, parada cardíaca e sepse. Portanto, o objetivo deste estudo foi comparar o nível de inflamação, por meio de dosagem plasmática de citocinas, entre pacientes em ME e pacientes criticamente doentes, com ou sem sepse, além de avaliar o comportamento das citocinas ao longo do tempo. Demonstramos que a ME está associada a um maior nível de inflamação do que a induzida pela doença crítica e a um nível semelhante à inflamação induzida pela sepse. Mesmo excluindo da análise os pacientes em ME que apresentavam sepse, os achados não se modificaram, corroborando com a hipótese de que a ME, per se, desencadeia uma resposta inflamatória sistêmica. / Grafts from brain death (BD) donors in have worse outcomes as compared to grafts from living donors, even HLA-unmatched living donors. Besides the injuries related to organ retrieval and transplantation procedure, organs are also exposed to the intense systemic inflammatory response that occurs in BD. The deleterious effects of inflammation, with upregulation of cytokine expression, have already been documented in kidney, liver, lung, heart and pancreas. Most of these studies evaluated cytokine levels after BD confirmation or before organ retrieval. However, it is possible that the massive catecholamine release present at the time of BD installation might lead to a precocious cytokine increase. Moreover, brain-dead patients frequently suffer from other injuries that might also trigger an inflammatory cascade, such as mechanical ventilation, hemorrhagic shock, cardiac arrest and sepsis. Therefore, the purpose of this study was to compare, by means of plasmatic cytokines measurement, the level of inflammation in braindead patients and in critically ill patients, septic and non-septic, and to evaluate plasmatic cytokine kinetics in BD. We demonstrated that BD is associated with a higher level of inflammation than that induced by critical illness, which was similar to the induced by sepsis. Even when brain-dead patients with sepsis were excluded from the analysis, the results remain, corroborating the hypothesis that BD itself triggers a systemic inflammatory response.

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Coorientador: João Paulo Elsen Saut / Banca: Ricarda Maria dos Santos / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Banca: Maria Emília Franco Oliveira / Banca: Érica Azevedo Costa / Resumo: De modo geral, o objetivo deste estudo foi determinar se as células endometriais bovinas responderam a análogos virais de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) mediante a produção de citocinas pró-inflamatórias após ativadas pelos receptores "Toll-Like" (TLRs) no endossoma celular e no citoplasma celular pelo genes indutores de ácido retinóico tipo I (RIG-I). No primeiro experimento, amostras uterinas de vacas de corte mestiças pós-púberes foram dissectadas para obtenção de células endometriais epiteliais e estromais. Um controle negativo e quatro PAMPs: LPS, ssRNA, Poly I:C (LMW), Poly (I:C) HMW foram utilizados. Dois grupos de tratamentos (transfectados e não transfectados) foram analisados durante 24 horas. Em outro experimento, células endometriais foram tratadas apenas com o PAMP Poly (I:C) LMW e um grupo Controle Negativo. Neste, os grupos foram incubados às 0, 2, 6, 12, 24, 36, 48 e 72 horas. Sobrenadantes foram colhidos para desenvolver o teste de ELISA para IL-6 e IL-8. Células epiteliais produziram IL-6 em resposta ao Poly I:C (HMW) quando comparadas com o Controle (Grupo DOTAP positivo; P< 0.05), enquanto que o LPS induziu produção de IL-6 e IL-8 em células estromais (P< 0.05). O uso de um reagente de transfecção entre as células e tratamentos demonstrou efeito (P> 0.05). Ainda, células estromais tratadas por Poly I:C (LMW) demonstraram uma maior produção de IL-6 às 48 e 72 horas (P< 0.05), e para o IL-8 às 6, 12, 24, 36, 48 e72 horas quando comparadas com o grupo Controle (P< 0.05). No segundo experimento, outras amostras uterinas de vacas de corte pós-púberes foram utilizadas. A obtenção de células endometriais estromais e epiteliais foram isoladas pelo mesmo protocolo do primeiro experimento. O PAMP Poly (I:C) LMW e um controle negativo foram utilizados. Proteínas para o RIG-I e p65 foram colhidas após 12, 24, 48 e 72 horas de tratamento / Abstract: In general, the objective of this study was to determine if bovine endometrial cells replied to virus analogs of pathogen associated molecular pattern (PAMPs) by production of proinflammatory cytokines after Toll-Like Receptor (TLR) activation in the cell endosome and after retinoic acid inducible gene - I (RIG-I) stimulation in the cell cytoplasm. In the first experiment, uterine samples from post pubertal cross-breed beef cows were dissected using a protocol to obtain epithelial and stromal cells. A negative control and four different PAMPs: LPS, ssRNA, Poly I:C (LMW), Poly (I:C) HMW were used. Two treatments (transfected and non-transfected) groups were investigated during 24 hours. In the other experiment, endometrial cells were treated with only Poly (I:C) LMW and a negative Control group. All incubated at 0, 2, 6, 12, 24, 36, 48 and 72 hours. Supernatants were collected to develop Elisa for IL-6 and IL-8. Epithelial cells produced IL-6 in response do Poly I:C (HMW) compared to Control (P< 0.05), otherwise, LPS induced IL-6 and IL-8 in stromal (P< 0.05). The transfection Reagent differ between cells and treatments (P> 0.05). Still, in stromal cells treated by Poly I:C (LMW) the production of IL-6 was higher at 48 and 72 hours (P< 0.05), and for IL-8 at 6, 12, 24, 36, 48 and 72 hours when compared to the Control (P< 0.05). In the second experiment, uterine samples from others post pubertal mixed-breed beef cows were used. To obtain stromal and epithelial cells, uterine samples were dissected with the same protocol as the first experiment. The PAMP Poly (I:C) LMW and a negative control were used. Proteins for RIG-I and p65 were collected after 12, 24, 48 and 72 hours. In response to Poly (I:C) LMW induction, stromal cells activated RIG-I at 48 hours (P< 0.05) were compared to the Control group. On the other hand, epithelial cells were not sufficient stimulated Poly (I:C) LMW to activate ... / Doutor

O extrato de Ascaris suum (Asc total), preparado a partir de uma mistura de vermes machos e fêmeas (albergando ovos), suprime a resposta imune específica a ovalbumina (OA). A partir do fracionamento deste extrato por gel filtração demonstrou-se que componentes protéicos de alto peso molecular (PM), eluídos no primeiro pico (PI), eram supressores da resposta a OA e os eluídos no terceiro pico (PIII) estimularam uma resposta maior de anticorpos IgE anti-Asc. Uma resposta do tipo Th2 foi preferencialmente estimulada por este extrato, sendo as citocinas IL-4 e IL-10 atuantes na supressão dos parâmetros da resposta anti-OA mediados por células Th1. Em algumas espécies de helmintos a resposta Th2 é estimulada de forma estágio-específica. Assim, analisamos neste trabalho quais dos componentes do Asc total seriam responsáveis pelo efeito supressor. Verificamos que os extratos dos vermes adultos apresentaram perfis cromatográficos semelhantes ao do extrato total. O perfil cromatográfico do Asc O foi distinto, com um segundo pico (PII) mais evidente e apresentou um quarto pico de menor PM. O fracionamento eletroforético confirmou uma concentração de proteínas com PM entre 107 e 52 kDa e a presença de proteínas adicionais entre 27,2 e 19 kDa neste extrato. Os extratos de vermes e dos ovos suprimiram a resposta imune celular específica a OA, avaliada por reações de hipersensibilidade tardia, resposta proliferativa de células de linfonodos drenantes e secreção de citocinas por estas células. A produção de anticorpos IgG1 e IgG2a anti-OA foi também diminuída acentuadamente pelos mesmos extratos. Observamos, ainda, que as citocinas predominantes na resposta aos extratos dos vermes e dos ovos foram diferentes, com maior secreção de IL-4 e IL-10 nos primeiros e IFN-g no segundo. Com relação às diferentes frações do Asc O, a produção de anticorpos IgE anti-OA foi suprimida por componentes de PI e PIII, enquanto que os de PII estimularam a síntese maior de IgE anti-Asc O. Os componentes de PIV não tiveram nenhum efeito. Nossos resultados indicam que o efeito supressivo do Asc total é uma propriedade que pode ser atribuída aos vermes machos e fêmeas. No entanto, o extrato preparado a partir dos ovos também apresenta este efeito, o qual parece ser mediado por mecanismos diferentes. / The extract of Ascaris suum (whole Asc), prepared from male and female worms (with stored eggs) suppress the specific immune response to ovalbumin (OA). This extract was fractionated by gel filtration and high and low molecular weight (MW) proteins were obtained in the first (PI) and third peak (PIII), respectively. PI suppressed the OA-specific cellular and humoral responses and PIII stimulated more anti-Asc IgE antibodies. The whole Asc stimulated a Th2 response predominantly, with high levels of IL-4 and IL-10. These cytokines had an important role in the down-regulation of the Th1 response to OA. In some helminthic infections the Th2 response is stimulated by specific stages of the life cycle. Thus, in this work we investigated which components of whole Asc were responsible for immunosuppression. The worm extracts presented similar chromatographic profiles. The profile of Asc O was distinct, with the second peak being more evident and showing a fourth peak with much lower MW components. By polyacrylamide gel electrophoresis we observed a high concentration of proteins between 107 and 52 kDa. In addition, some bands between 27,2 and 19 kDa were only present in this extract. The extracts from worms and eggs suppressed the cell-mediated immune response to OA, measured by delayed-type hypersensitivity, proliferative response of draining lymph node cells and cytokine secretion. The anti-OA IgG1 and IgG2a antibody production were as drastically reduced by these extracts. The cytokines IL-4 and IL-10 were mainly secreted in response to worm extracts, whereas the egg extract stimulated more IFN-g. Regarding the different fraction of Asc O, PI and PIII components diminished the anti-OA IgE antibody production, whereas PII components stimulated higher anti-Asc O IgE synthesis. PIV components did not display any effect. Our results indicate that the immunosuppressive effect of whole Asc is due to male and female body components. However, extracts prepared from eggs do also display this effect, that seems to be mediated by different mechanisms.

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-16Bitstream added on 2014-08-13T18:01:37Z : No. of bitstreams: 1 000741517_20141216.pdf: 699498 bytes, checksum: 2434505afb00e9d5ad399ba36a38470a (MD5) Bitstreams deleted on 2014-12-19T18:32:49Z: 000741517_20141216.pdf,Bitstream added on 2014-12-19T18:33:36Z : No. of bitstreams: 1 000741517.pdf: 1188792 bytes, checksum: 76b9d56cb27251ea24b1fcd75de2ea6e (MD5) / Objetivo: Avaliar o efeito do LED infravermelho (855 nm), aplicado em diferentes doses de energia, na produção e expressão de mediadores inflamatórios por células pulpares humanas (HDPC) em cultura. Metodologia: HDPC obtidas de dentes decíduos foram semeadas (105 células/well) e após 24 h foram colocadas em contato com LPS (10 μg/mL α-MEM) ou TNF-α (25 ng/mL α-MEM). Em seguida, as células foram submetidas a uma única irradiação com LED infravermelho (855 nm) nas diferentes doses de energia: 2, 4, 8, 15 ou 30 J/cm2. Gupos não irradiados, com e sem LPS/TNF-α, serviram como controles. Decorridas 24 h, as células estimuladas com LPS foram avaliadas quanto à produção de óxido nítrico (NO), de espécies reativas de oxigênio (EROs) e viabilidade celular (ensaio de MTT) (n=8 por grupo). As células estimuladas com TNF-α foram avaliadas quanto à produção de citocinas pelos métodos de antibody array e q-PCR (n=5 por grupo). Os dados foram submetidos aos testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney (α=0,05). Resultados: O contato com LPS resultou em aumento significativo da produção de NO sem causar qualquer dano ao metabolismo respiratório das células. Independentemente da dose de energia aplicada, a produção de NO foi significativamente reduzida quando as células foram irradiadas. O melhor efeito foi observado para a dose de 15 J/cm2. A irradiação também promoveu uma diminuição na produção de EROs, enquanto o metabolismo das HDPC não foi alterado. Nas células em contato com TNF-α verificou-se que as citocinas mais produzidas foram: GROα, IL-6, IL-8, TNF-α, MCP-1 e Serpin E1. Na análise por q-PCR redução foi observada para a expressão de IL-1 β, quando as células foram irradiadas com 4 J/cm2. Conclusão: O estresse oxidativo de HDPC pode ser biomodulado por uma única dose de irradiação com LED infravermelho. Quanto a expressão de citocinas inflamatórias... / Aim: To investigate the effect of infrared light emitting diode (LED) irradiation (855nm), at different energy doses, on the production and expression of inflammatory mediators by cultured human dental pulp cells (HDPC). Methodology: HDPC were harvested from sound, near-exfoliation primary teeth. Cells were seeded (105 cells/well) using α-MEM supplemented with 10% FBS and after 24h, were exposed to LPS (10 μg/mL α-MEM) or TNF-α (25ng/mL α- MEM). Then, HDPC were submitted to a single irradiation with an infrared LED (855 nm) delivering different doses of energy: 0, 2, 4, 8, 15 or 30 J/cm2. Nonirradiated cells, with and without LPS/TNF-α, served as controls. Followed 24h, the cells stimulated with LPS were tested for nitric oxide (NO) quantification, cell viability (MTT assay), and reactive oxygen species (ROS) production (n=8 per group). Cells stimulated with TNF-α were analyzed regarding cytokine production and expression using antibody array and q-PCR (n=5 per group). Data were submitted to Kruskal-Wallis and Mann-Whitney tests (α=0.05). Results: LPSinduced stress resulted in significant increase in NO production by HDPC without causing any damage to cell respiratory metabolism. Irrespective of the energy dose delivered, NO production was significantly reduced when LPS-stressed cells were irradiated. The best effect was observed when 15 J/cm2 were delivered to cells. Infrared LED irradiation also promoted decrease in ROS production, while HDPC metabolism was not significantly affected. The most produced cytokines in cells stimulated with TNF-α were: GROα, IL-6, IL-8, TNF α, MCP-1 and E1 Serpin. qPCR analysis showed a decrease in expression of IL- 1 β when the cells were irradiated with the dose of 4 J/cm2. Conclusion: The oxidative stress of HDPC can be biomodulated by a single irradiation of an infrared LED. Regarding the expression of inflammatory cytokines, the delivery of 4 J/cm2 was...