La periodontitis crónica es la causa más común de pérdida de dientes en el mundo y muchos factores de riesgo tales como las infecciones, la respuesta inflamatoria, la higiene oral, la edad, los hábitos de fumar y las características genéticas individuales están involucrados en el desarrollo de esta enfermedad. La identificación de los factores genéticos que condicionan la inflamación oral puede ayudarnos a comprender la predisposición a desarrollar periodontitis. Las interleuquinas, en especial la IL-1, tienen mucha importancia en la evolución de la enfermedad periodontal, debido a que son proteínas solubles que median interacciones complejas entre los linfocitos, las células inflamatorias y otros elementos celulares del tejido conectivo. Por tal motivo, el propósito de este estudio fue determinar la asociación de los polimorfismos genéticos de la IL-1A C(-889)T, IL-1B C(+3953/4)T, con la periodontitis crónica en un grupo de peruanos. Para ello se reclutaron 94 personas con periodontitis crónica y 96 personas periodontalmente sanas, a quienes se les extrajo una muestra de sangre para obtener el ADN y realizar la genotipificación de la IL-1A e IL-1B, con la técnica de PCR-RFLP. Los datos fueron analizados con el test de 2, 2de tendencia lineal y regresión logística, con un 95% de intervalo de confianza. Los resultados muestran una asociación estadísticamente significativa entre el genotipo positivo de la IL-1B y el genotipo compuesto positivo, con la periodontitis crónica. Palabras clave: Interleuquinas, Citoquinas, Periodontitis Crónica, Polimorfismo Genético, PCR- RFLP. / --- Chronic periodontitis is the most common cause of tooth loss in the world and many risk factors such as infections, inflammatory response, oral hygiene, age, smoking habits and individual genetic characteristics are involved in the development of this disease. The identification of genetic factors that influence oral inflammation may help us understand the predisposition to developing periodontitis. Interleukins, in particular IL-1, are very important in the development of periodontal disease because they are soluble proteins that mediate complex interactions among cells, inflammatory cells and other cellular elements of connective tissue. Therefore the purpose of this study was to determine the association of genetic polymorphisms of the IL-1A C (-889) T, IL-1B C (+3953/4) T, with chronic periodontitis in a group of Peruvians. For this purpose, 94 people with chronic periodontitis and 96 periodontally healthy people were recruits and blood for DNA and perform genotyping of IL-1A and IL-1B, with the PCR-RFLP was extracted to them. Data were analyzed with the test 2, 2 of linear trend and logistic regression with 95% confidence interval. The results show a statistically significant association between positive genotype of the IL-1B and the positive composite genotype with chronic periodontitis. Keywords: Interleukins, cytokines, Chronic Periodontitis, Genetic Polymorphism, PCR-RFLP.

Magíster en Bioquímica Área de Especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología y optar al título de Bioquímico / Las hemocianinas de moluscos son enormes glicoproteínas que al ser inoculadas en mamíferos, generan una potente respuesta inmune del tipo Th1, caracterizada por la secreción de IFN-y. Es así que se han usado como carrier en el desarrollo de anticuerpos contra haptenos, como carrier/adyuvante en vacunas terapéuticas contra patógenos y cáncer y además, como inmunoestimulante no específico en la inmunoterapia del carcinoma superficial de vejiga. Sin embargo, los mecanismos inmunológicos involucrados en las etapas tempranas de la respuesta inmune anti-hemocianina, conducentes a sus notables propiedades inmunoestimulantes, son muy poco conocidos. Es así que ha sido escasamente abordado su efecto sobre las redes de comunicación coordinadas por citoquinas, las proteínas que median las interacciones entre las células del sistema inmune. Esta información, ampliará no solo el conocimiento básico para comprender los efectos inmunoestimulantes de las hemocianinas en mamíferos, sino que también contribuirá a nuevas aplicaciones. En esta tesis se propuso estudiar el efecto de tres hemocianinas sobre macrófagos peritoneales murinos, como modelo para entender la respuesta inmune innata que inducen en dichas células presentadoras de antígeno. Específicamente, se estudiaron la hemocianina clásica, originaria de California y conocida como KLH, obtenida de Megathura crenulata y dos descubiertas más recientemente que corresponde a CCH de Concholepas concholepas y FLH de Fissurella latimarginata, especies que habitan las costas de nuestro país. Se propuso que las hemocianinas al ser incorporadas por las células presentadoras de antígenos, inducen la expresión de citoquinas proinflamatorias, un evento fundamental para dar el inicio a una respuesta inmune. Para demostrarlo, cultivos in vitro de macrófagos peritoneales murinos, previamente caracterizados morfológicamente, fenotípicamente (F4/80+) y funcionalmente, fueron incubados con las distintas hemocianinas en concentraciones de hasta 1 mg/ml; LPS y medio de cultivo fueron usados como control positivo y negativo, respectivamente. Posteriormente, se estudió la correlación entre los niveles de mRNA y los niveles de proteína de un panel de citoquinas y quimioquinas proinflamatorias mediante dos tipos de PCR y ELISA, respectivamente. Los principales resultados demuestran que: 1. Las hemocianinas fueron fagocitadas por los macrófagos peritoneales cultivados in vitro. Sin embargo, FLH y KLH estimularon más tempranamente que CCH el aumento en la expresión de quimioquinas claves en la extravasación de leucocitos, tales como MIP-1α (CCL-3), KC (CXCL-1) y LIX (CXCL-5), las cuales son indicativas de un proceso inflamatorio agudo. 2. Las hemocianinas estimularon la expresión de IL-6, IL-12p40 y TNF-α en distintos tiempos e intensidades, como indican los resultados de RT-qPCR y ELISA, sugiriendo la inducción de mecanismos de señalización diferentes, cuya explicación es atribuible a las diferencias estructurales que presentan las hemocianinas entre ellas y especialmente, en aquellas que dicen relación con su composición de oligosacáridos. 3. Las hemocianinas muestran la inducción de un perfil inmunológico Th1 marcado, al mantener reguladas a la baja citoquinas claves de la respuesta Th2, como son IL-4, IL-5, IL-13, TGF-ß2. Finalmente, los resultados presentados en esta tesis permiten concluir que los macrófagos también participan en los mecanismos inmunológicos tempranos que acompañan el reconocimiento de las hemocianinas, induciendo un ambiente proinflamatorio que puede explicar sus notables propiedades inmunomoduladoras en los mamíferos / Molluskan hemocyanins are huge glycoproteinscapable of induce a potent Th1-dominant immune response, characterized by the secretion of IFN-y, when are inoculated in mammals. By this reason, they have been used as a carrier protein in the development of antibodies against pathogens and cancers and also, as non-specific immunostimulant in the immunotherapy of superficial bladder cancer. However, the immunological mechanisms involved in the early phases of the anti-hemocyanin immune response, that leads to its remarkable immunostimulatoryt effects, are scarcely known. Thus, it has been poorly addressed their effects on the communication network coordinated by cytokines, the proteins which mediate interactions between cells from the immune system. This information will allow expand the basic comprehension to understand its immunostimulatory effects, but also will contribute to new applications. In this thesis, we proposed to examine the effects of three hemocyanins on murine peritoneal macrophages, as a model for understanding the earliest immune responses induced by these antigen presenting cells (APC). Specifically, we studied the classical hemocyanin, native from California and obtained from Megathura crenulata, known as KLH and two recently discovered hemocyanins, CCH collected from Concholepas concholepas and FLH from Fissurella latimarginata, both species natives of our coasts. It was proposed that once hemocyanins are incorporated by APC, would induce the expression of proinflammatory cytokines, a key event in the initiation of an immune response. To demostrate this, in vitro cultures of murine peritoneal macrophages, previously characterized morphologically, phenotypically (F4/80+) and functionally, were incubated with hemocyanins in concentrations up to 1 mg/ml for different times; as positive and negative control, LPS and culture médium were used, respectively. Subsequently, we studied the correlation between mRNA and protein levels from a panel of proinflammatory cytokines and chemokines using two types of PCR and ELISA, respectively. The main results show that: 1. Hemocyanins were endocyted by peritoneal macrophages cultured in vitro, but only FLH and KLH and not CCH can induced an increased in the expression of key chemokines related to leukocyte extravasation, such as MIP-1α (CCL-3), KC (CXCL-1) and LIX (CXCL-5), wich are indicative of an acute inflammatory process. 2. Hemocyanins simulated the expression of IL-6, IL-12p40and TNF-α at different times and intensities, as indicated by the results of RT-qPCR and ELISA, suggesting different signaling pathways of induction, which can be explained by strutural differences between them, and specially those concerns to their oligosaccharides composition. 3. Hemocyanins showed induction of a Th1-dominant immune profile, maintaining downregulated key Th2 cytokines such as IL-4, IL-5, IL-13 and TGF-ß2. Finally, the results presented in this thesis, allow to conclude that macrophages are involved in the early phases of immunes recognition of hemocyanins, inducing a proinflammatory milieu that may explain its enhanced immunomodulatory properties in mammals / Fondecyt, Biosonda, Fucited

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / RESÚMEN Introducción. El virus respiratorio sincicial (VRS) es el principal agente de infección respiratoria aguda infantil a nivel mundial y nacional. Diversos estudios han asociado patologías previas como factores asociados a la gravedad del cuadro; sin embargo, algunos niños sanos también se enferman gravemente mientras que otros cursan con una enfermedad leve. Ciertos genotipos de VRS han sido asociados con cuadros más graves mientras que otros estudios no encuentran ninguna asociación en particular. Por otro lado la respuesta inmune del hospedero parece ser el factor más relevante en la evolución clínica de los lactantes, según estudios en modelos animales y otros estudios in vitro; pero existen muy poco estudios in vivo en los pacientes afectados. Este trabajo plantea como hipótesis que la gravedad de la primoinfección por VRS en lactantes menores de 1 año se asocia a un perfil de respuesta inmune celular Th1 disminuida y no al genotipo viral. Objetivos. Caracterizar el perfil de la respuesta inmune celular en lactantes hospitalizados por primoinfección respiratoria aguda baja por VRS adquirida en la comunidad en relación a la gravedad de la enfermedad y detectar genotipos virales involucrados. Material y métodos. Se estudiaron 83 lactantes sanos con primoinfección por VRS durante los brotes de invierno de los años 2005 y 2006, los cuales fueron clasificados según su evolución en pacientes graves o leves. Se efectuaron técnicas de inmunotipificación a través de citometría de flujo para cuantificar las subpoblaciones linfocitarias y se midieron algunos marcadores de activación de linfocitos T (LT) y natural killer. También se cuantificaron los niveles de citoquinas de la respuesta de tipo Th1 y Th2 a través de la técnica de ELISA. Las cepas de VRS fueron genotipificadas mediante PCR y análisis filogenéticos del gen G. Resultados. La inmunotipificación demostró una disminución de la población de LT en el grupo de pacientes graves con respecto a lactantes leves y controles sanos. Esta disminución fue manifiesta especialmente en la subpoblación de linfocitos T citotóxicos/supresores (LTc/s). TambienTambién estuvieron disminuidos en el grupo grave los marcadores de linfocitos de memoria CD45RO, el marcador de activación de LT CD25 y el antígeno CD94 en la población natural killer que se asocia al sistema MHC clase I. Los niveles de citoquinas fueron en general bajos, excepto los niveles de IL-6 que fueron mayores en lactantes graves y los niveles de IL-8 mayores en pacientes con VRS con respecto a los controles sanos. Los genotipos del grupo B fueron más prevalentes en el 2005, especialmente del genotipo BA 4 (76,6%) y del grupo A durante el 2006, especialmente el GA2 (77,2%). Sin embargo, no hubo asociación de algún genotipo viral con cuadros clínicos de mayor gravedad. Conclusión: La gravedad del cuadro clínico en la infección por VRS se asocia a una respuesta inmune celular deficiente con un perfil de citoquinas Th1 disminuido y no al genotipo viral. / ABSTRACT Introduction. The respiratory sincicial virus (RSV) is the principal agent of acute infantile respiratory infection on a global and national scale. Several studies have associated previous pathologies as factors associated with the gravity of the clinical disease; nevertheless, some healthy children also fall seriously ill whereas others have a slight illness. Certain genotypes of RSV have been associated with more serious clinical disease whereas other studies do not find any connection in particular. On the other hand the immune response of the host seems to be the most important factor in the clinical evolution of the infants, according to studies in animal models and other studies in vitro; but there are very few studies in vivo in the affected patients. This work raises as hypothesis that the gravity of the primoinfection for RSV in infants younger than 1-yearold is related to a profile of diminished Th1 cellular immune response and not to the viral genotype. Objectives. To characterize the profile of the cellular immune response in infants hospitalized for low acute respiratory primoinfection by RSV acquired in the community in relation to the gravity of the illness and to detect viral genotypes involved. Material and methods. 83 healthy infants with primoinfection by RSV were studied during the winter sprouts of the years 2005 and 2006, which were classified according to their evolution under severe or mild patients. Techniques of immune typification were carried out through flow cytometry to quantify the subpopulations of lymphocytes and some markers of activation of lymphocytes T (LT) and natural killers were measured. Also the levels of cytokines of the response of type Th1 and Th2 were quantified through the ELISA technique. The straines of RSV were genotyped by means of PCR and phylogenetics analysis of the gene G. Results. The immune typification demonstrated a decrease of the LT population in the group of severe patients in comparisson to mild infants and healthy control. This decrease was clear especially in the subpopulation of lymphocytes T cytotoxics/supresors (LTc/s). The markers of lymphocytes of memory CD45RO, the activation marker of LT CD25 and the antigen CD94 in the population of natural killer that is associated to the system MHC class I were also diminished in the severe group. The levels of cytokines were generally low, except the levels of IL-6 that were higher in severe infants and the levels of IL-8 higher in patients with RSV with regard to the healthy control. The genotypes of the group 6 B were more prevalents in 2005, especially of the genotype BA (76,6 %) and of the group A during the year 2006, especially the GA2 (77,2 %). Nevertheless, there was no association of any viral genotype with clinical disease of major gravity. Conclusion: The gravity of the clinical disease in the infection by RSV is associated to an deficient cellular immune response with a diminished profile of cytokines Th1 and not to the viral genotype.

Magister en biomedicina celular y molecular / El síndrome de Sjögren (SS) es una enfermedad autoinmune, inflamatoria, crónica y sistémica, de etiología desconocida y afecta principalmente a glándulas salivales y lagrimales. Se ha estudiado la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR= del inglés Unfolded protein response) en glándulas salivales labiales (GSL) de pacientes SS, evidenciando diferencias en la expresión de componentes de la vía de señalización IRE1α (Inositol-requiring enzyme 1a). En esta tesis se evaluó si los cambios de expresión de proteínas involucradas en la vía IRE1α podría deberse a cambios epigenéticos. En este contexto, se realizó el análisis de metilación global del DNA y de las regiones promotoras de genes de la vía IRE1α en GSL de pacientes SS y controles. También se estudió el efecto de citoquinas pro-inflamatorias, sobre el estado de metilación de promotores de genes de la vía IRE1α en cultivos de células de glándula submandibular humana (HSG). La metilación de los promotores se evaluó mediante PCR sensible a metilación o análisis de disociación de alta resolución sensible a metilación y la metilación global se determinó mediante inmunofluorescencia. Los resultados obtenidos mostraron un aumento significativo en la metilación de los promotores de los genes IRE1α, XBP-1 (del inglés X box-binding protein-1) y GRP78 (del inglés Glucose-Regulated Protein, 78kDa) en GSL de pacientes SS. Se observó una correlación positiva significativa del estado de metilación de los promotores mencionados con los niveles de citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α e IFN-γ) presentes en las GSL. La metilación global del DNA en cortes de GSL de pacientes SS mostró una disminución significativa comparada con los individuos controles. La metilación global del DNA se relacionó negativamente con el score de foco. La hipometilación global del DNA de GSL de pacientes SS podría explicar la sobre-expresión de ciertos genes, como se ha demostrado en otras enfermedades autoinmunes, como LES. En células HSG tratadas con TNF-α o IFN-γ (10 ng/mL) se evidenció un aumento en el índice de metilación del promotor de GRP78 luego de 24 hrs de tratamiento, mientras que para el promotor de IRE1α se encontró un aumento en el estado de metilación luego de 48 hrs de estimulación con TNF-α (1 ng/mL). El aumento de la metilación en los promotores de los genes de IRE1α, XBP-1 y GRP78 podría explicar, en parte, los niveles disminuidos de sus respectivos mRNAs en las GSL de pacientes SS. Los análisis de correlación sugieren que las citoquinas podrían regular el estado de metilación de los tres promotores estudiados en GSL de pacientes SS. Más aún, los estudios in vitro muestran que las citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α e IFN-γ) aumentan los niveles de metilación en los promotores de IRE1α y GRP78, resultados que validan los análisis de correlación entre los niveles de mRNAs de estas citoquinas y los índices de metilación de los promotores respectivos en GSL de pacientes SS.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / El cerezo (Prunus avium) y el durazno (Prunus persica) corresponden a cultivos de exportación de alta rentabilidad para Chile. Dentro de los diversos factores comerciales asociados al fruto, se encuentran parámetros fisiológicos como el tamaño del fruto, sólidos solubles y tiempo de maduración, algunos de los cuales se conocen como índices de maduración. Estos, son regulados en diversas especies por reguladores del crecimiento de plantas, entre los cuáles se encuentra citoquinina, una fitohormona involucrada en los procesos de división y diferenciación celular. Con el objetivo de estudiar los factores moleculares de cereza y durazno involucrados en la respuesta a citoquinina, en este trabajo se realizaron análisis cuyo objetivo es determinar si en frutos de cereza y durazno los “Top 25 de genes inducidos por citoquinina”, que son fuertemente inducidos por citoquinina en la planta modelo Arabidopsis, mantienen este patrón de expresión frente al tratamiento exógeno de citoquinina. Mediante BLAST bidireccionales, se identificaron 12 y 13 posibles ortólogos de este conjunto de genes en el genoma de Prunus avium y Prunus persica respectivamente, donde 11 de ellos se comparten entre ambas especies. De estos 11 posibles genes ortólogos analizados en la plataforma INTERPROSCAN, todos presentaron los dominios proteicos característicos de las proteínas codificadas por estos genes de Arabidopsis. Además, análisis a nivel genómico de estos posibles ortólogos mostraron que, algunos de estos genes conservan su estructura genómica, mientras que otros divergen entre las especies. Dentro del mismo análisis, se observó que todos los 11 genes presentan elementos en cis de respuesta a citoquinina a lo largo de sus loci. Adicionalmente, algunos presentanelementos en cis de respuesta a giberelina y ácido abscísico, sugiriendo que podrían estar regulados por más de una fitohormona. De estos 11 genes, la localización genética de cinco de ellos se encuentra dentro de algún QTL previamente descrito y localizado en el mapa TxE, mientras que tres de ellos están dentro de un QTL de Ripening, sugiriendo que estos genes podrían estar relacionados con este proceso. Los niveles de transcrito de siete de estos posibles ortólogos fueron medidos mediante RT-qPCR, mostrando que la expresión es inducida por la aplicación exógena de citoquinina en cereza y durazno, y lo hacen en una manera especie específica. Los resultados sugieren que estos genes estarían bajo los mecanismos moleculares por los cuáles la fitohormona citoquinina ejerce su regulación. / In Chile, Sweet cherry (Prunus avium) and Peach (Prunus persica) are high yield export crops. Among the diverse commercial factors associated with these fruits, physiological parameters such as fruit size, soluble solids and the ripening time, some of which are known as indicators for the ripening. These have been described to be regulated in various species by plant growth regulators such as cytokinin. With the aim of studying the molecular factors associated with cytokinin response of sweet cherry and peach, the present study focused on performing analyses to identify if the “Top 25 cytokinin induced genes”, which are strongly modulated by the phytohormones cytokinin in the model plant Arabidopsis thaliana, are conserved in sweet cherry and peach fruits. Using a bidirectional BLAST, 12 and 13, putative orthologous of this set of genes were identified in the Prunus avium and Prunus persica genomes, respectively, 11 of which are conserved between both species. Of these 11 putative orthologous genes analyzed in the INTERPROSCAN platform, they all presented the protein domains characteristic of the proteins encoded by Arabidopsis genes. Additionally, analysis of these putative orthologous at the genomic level revealed that, some of these genes are conserved in the genomic structure, while others diverge between the species. Within the same analysis, these 11 genes have cis-regulatory elements to cytokinin throughout their loci. Additionally, some have gibberellin and abscisic acid responsive cis-regulatory elements, suggesting that they could be regulated by more than one phytohormone. Of these 11 genes, five of them are located in a QTL previously described and positioned on the TxE map, while three of them are in a Ripening QTL, suggesting that these genes could be related to the ripening process. The transcript levels of seven of these putative orthologous were measured by RT-qPCR, showing that the expression is induced by exogenous application of cytokinin in sweet cherry and peach, and they do so in a species-specific manner. The results suggest that these genes are candidate genes possibly responsible for the underlying molecular mechanisms by which the phytohormone cytokinin exerts its regulation. / Los recursos materiales y el financiamiento fueron proporcionados por el Laboratorio de Genética Molecular Vegetal del Instituto de Nutrición y Tecnología en Alimentos (INTA) bajo el Proyecto FONDECYT #1171016 y bajo el Proyecto ENLACE, VID Universidad de Chile ENL006/2016.

La respuesta frente a lesiones traumáticas está orquestada por las citoquinas, grupo heterogéneo de proteínas de bajo peso molecular implicadas en la señalización intercelular, tales como la interleuquina-6 (IL-6) o el factor de necrosis tumoral alfa (TNF)-α. Pese a que estos dos factores fueron originalmente descritos como inductores y mediadores de la vertiente pro-apoptótica de la respuesta inflamatoria también se han observado implicaciones beneficiosas de estas citoquinas en la recuperación y supervivencia del parénquima nervioso frente a agresiones de diversa naturaleza. Entre los factores neuroprotectores inducidos por la IL-6 en respuesta a lesión se encuentran las metalotioneínas (MTs), proteínas de bajo peso molecular y ricas en cisteínas con un claro papel antioxidante, antiapoptótico y neurotrófico, pudiendo mediar en parte las acciones beneficiosas de esta citoquina, sugiriéndose por tanto un potencial uso terapéutico de estas proteínas.Mediante el uso de animales modificados genéticamente hemos aportado resultados sobre el papel que tanto la IL-6, como el TNF-α o las metalotioneínas pueden tener en procesos patológicos y/o daño en el sistema nervioso central, habiéndose usado ratones que sobreexpresan IL-6 específicamente a cerebro (ratones GFAP-IL6), ratones con una deleción en el gen de la IL-6 (ratones IL6KO) , ratones con deleciones bien del receptor 1 o del receptor 2 del TNF-α (ratones TNFR1KO y TNFR2KO respectivamente) y ratones con deleción en los genes de la metalotioneína 1 y 2 (MTKO) con o sin tratamiento exógeno de MTs nativas y recombinantes. Estos ratones han sido sometidos a un proceso lesivo como la criolesión, consistente en la aplicación de un pellet de nieve carbónica durante 30 segundos en el cráneo del animal.Se ha analizado neurohistológicamente los diferentes animales mediante técnicas immunohistoquímicas así como la expresión génica de diferentes marcadores de apoptosis, supervivencia y de reposta inflamatòria mediante técnicas de biología molecular tales como la hibridación in situ, microarrays y Ribonuclease Protection Assay (RPA). También hemos evaluado el estado funcional de los animales mediante técnicas conductuales como el elevated plus maze (EPM), el holeboard (HB) o el horizontal ladder beam (HLB). Los resultados obtenidos permiten concluir que si bien la sobreexpresión de IL-6 de manera crónica es perjudicial, estos animales presentan una reducida muerte celular y menor estrés oxidativo, sugiriendo la participación de esta citoquina en procesos de supervivencia, seguramente mediante la inducción de la síntesis de factores antioxidantes y antiapoptóticos. Los animales IL6KO presentan una reducida respuesta inflamatoria pero un incremento en los niveles de marcadores de estrés oxidativo y, probablemente por este motivo, un incremento en la muerto celular apoptótica tras la criolesión. En este sentido, los animales MTKO presentan un fenotipo muy similar tras lesión, mientras que la administración exógena de MTs revierte estos efectos, independientemente de la homologia con la especie de la cual se ha obtenido la MT, sugiriendo una acción independiente de receptor y abriendo posibles usos terapéuticos de las MTs.La deficiencia en la señalización del TNF-α, ya sea por el receptor 1 o 2 comporta una disminución del daño a nivel molecular, observándose una disminución tanto de genes implicados en la respuesta celular a lesiones, como de marcadores pro-inflamatorios y una menor activación de vías apoptóticas. Este menor daño se correlaciona con un menor daño a nivel funcional. A nivel conductual tanto los animales TNFR1KO como los TNFR2KO presentan una mayor actividad exploratoria respecto sus controles.Estos resultados aportan nuevas pruebas de la importancia del TNF-α y la IL-6 en procesos inflamatorios, y su papel dual, siendo mediadores tanto de procesos pro-apoptóticos como de supervivencia (mediados, en parte, por las MTs) dependiendo del nivel de expresión y, muy probablemente, de la célula en la cual está actuando. / Inflammatory response alter traumatic brain injury is orchestrated by cytokines, a complex group of proteins implicated in intercellular signalling, such as interleukin (IL)-6 or tumoral necrosis factor (TNF)-α. Although these two factors were originally described to mediate the pro-apoptotic responses of inflammation, they have recently been described to exert beneficial actions in both the cell survival and tissue recovery after injury. Among the factors induced by IL-6 one can find metallothioneins (MTs), low-weight, cysteine-rich proteins with antioxidant, antiapoptotic and neuroprotective actions; which could mediate, at least in part, the beneficial actions of IL-6.The use of genetically modified mice has allowed us to gain insight in the role of IL-6, TNF-α and MTs in the pathophysiology of the central nervous system. We have used animals lacking the IL-6 gene (IL6KO), mice overexpressing IL-6 in the brain (GFAP-IL6 mice), mice lacking either TNF-α receptor 1 or receptor 2 (TNFR1KO and TNFR2KO) and animals lacking MT-I and MT-II (MTKO mice) treated with saline solution or with exogenous MTs. All of these mice were subjected to a focal freeze injury such as cryolesion, placing a dry ice pellet for 30 seconds on the parietal bone.The neurohistological status of these animals was assessed by means of immunohistochemistry. Gene expression of several apoptotis, survival and inflammatory response markers was assessed by in situ hybridization, microarray and ribonuclease protection assay (RPA). The functional status of these mice was also assessed by behavioural tests, namely elevated plus maze (EPM), hole board (HB) and horizontal ladder beam (HLB).Our present results show that although chronic IL-6 expression is detrimental, GFAP-IL6 mice show reduced cell death and lower oxidative stress, suggesting a role for IL-6 in survival, which may be mediated by inducing antioxidant and antiapoptotic factors. IL6KO animals, on the other hand, show a decreased inflammatory response but an increase in cell death after lesion. In this regard, MTKO mice present a similar phenotype after injury which can be reverted by exogenous MT administration, an effect which does not depend on the homology of the different MT isoforms and mice, suggesting a receptor-independent action, opening a possible therapeutic use for MTs.Deficiency in TNF-α signalling, by lack of either receptor 1 or 2, involves a reduction in the tissue damage, with a reduction in genes involved in cellular response to lesion altogether with reduced pro-inflammatory markers and lower activation of pro-apoptotic pathways. This reduced damage correlates with a better functional response. Behaviourally, both TNFR1KO and TNFR2KO mice show an increased exploratory activity compared to the control mice.In conclusion, our results give new insights in the importance of TNF-α and IL-6 in inflammatory processes, and their dual role, being mediators both of pro-apoptotic and survival responses, being the alter in part mediated by MTs. This dual response may depend on the level of expression and, very likely, on the cell where it is acting.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Grado de Magister en Ciencias Biológicas. / El sistema nervioso y el sistema inmune se encuentran íntimamente relacionados comunicándose bidireccionalmente mediante citoquinas, neuropéptidos y neurotransmisores, como la dopamina. Este neurotransmisor ejerce su efecto a través de cinco receptores dopaminérgicos que poseen diferentes grados de afinidad, contando con la mayor afinidad el receptor 3 (D3R). Su presencia se ha reportado en diferentes células del sistema inmune. La estimulación del D3R promueve la producción de IFN-γ en linfocitos T CD4+, favoreciendo su diferenciación a un perfil Th1. Sin embargo, el rol de este receptor en los linfocitos T CD8+ aún no se ha estudiado a cabalidad. En esta tesis se estudió la incidencia del D3R en la formación del perfil citotóxico en linfocitos T CD8+, que poseen un TCR transgénico específico para el péptido OVA(257-264) alojado sobre el MHC de clase I H2-Kb (linfocitos OT-I). La diferenciación in vitro muestra que la carencia del D3R en linfocitos OT-I (OT-I D3RKO) resulta en una reducción significativa en la producción de IFN-γ, TNF-α, IL-2 y en la expresión de CD25 (cadena α del receptor de IL-2) en respuesta a la estimulación con péptido OVA(257-264). Estas deficiencias se revierten al añadir IL-2 exógena a los cultivos, sugiriendo que el mecanismo de acción por el cual el D3R favorece la diferenciación hacia un fenotipo efector productor de IFN-γ y TNF- α ocurre a través de la producción de IL-2. Concordante con lo anterior, se observó que la expresión del D3R en linfocitos OT-I promueve la expansión clonal y la protección antitumoral frente a melanoma. En conjunto los resultados obtenidos en linfocitos T CD8+ sugieren que el D3R promueve la formación de un perfil citotóxico, induciendo la producción de IFN-γ y favoreciendo una alta tasa de expansión clonal, lo que conlleva a una mayor sobrevida frente a un desafío tumoral. / The nervous system and the immune system are intimately related, communicating bi-directionally through cytokines, neuropeptides and neurotransmitters. Dopamine is a neurotransmitter that exerts its effect through five dopaminergic receptors which display different degrees of affinity. The D3R, which display the highest affinity for dopamine, has been found expressed in CD4+ T cells, where its stimulation promotes high production of IFN-γ, favoring the acquisition of the Th1 profile. However, the role of this receptor in CD8+ T lymphocytes has not yet been fully studied. In this thesis the role of D3R in the acquisition of the cytotoxic profile by CD8+ T lymphocytes was studied. For this purpose, in this thesis CD8+ T-cells bearing a transgenic TCR specific for the recognition of the OVA peptide(257-264) over the class I MHC H2-Kb (OT-I lymphocytes) were used. In vitro differentiation experiments show that lack of D3R in OT-I lymphocytes (OT-I D3RKO) results in a significant reduction in the production of IFN-γ, TNF-α and on the expression of CD25 (α chain of the IL-2 receptor) in response to the stimulation with OVA peptide(257-264). These effects were reversed by adding exogenous IL-2 into the cultures, suggesting a mechanism by which D3R favors the differentiation towards an effector phenotype through the production of IL-2. In vivo experiments show that D3R expressed on OT-I lymphocytes favors a higher clonal expansion and thereby an stronger protection against melanoma tumors. The results obtained suggest that D3R promotes the formation of a more efficient cytotoxic profile capable of producing higher percentages of IFN-γ and higher rates of clonal expansion, which leads to greater survival in the face of a tumor challenge. / Junio 2020

Grado de magíster en biomedicina celular y molecular / síndrome de Sjögren (SS) es una exocrinopatía autoinmune crónica, inflamatoria y sistémica que afecta principalmente a las glándulas salivales (GS) y lagrimales. Resultados de nuestro laboratorio demuestran que las células acinares de las GS de pacientes SS presentan estrés de retículo endoplásmico (RER) y un aumento en la expresión del sensor ATF6α y del factor de transcripción ATF4 de la vía PERK de la respuesta a proteínas mal plegadas. También, se ha determinado niveles variables de transcrito de la chaperona calreticulina (CALR). Considerando el rol relevante que se le ha atribuido a la epigenética en la patogénesis de otras enfermedades autoinmunes surge la pregunta: ¿Es posible que la expresión diferencial de ATF4, ATF6α y CALR en GS de pacientes SS pueda estar regulada por mecanismos epigenéticos, tal como la metilación del DNA? Para determinarlo se evaluó el porcentaje de metilación del DNA de los respectivos promotores utilizando MS-HRM y los resultados se correlacionaron con los datos clínicos de los pacientes SS. Interesantemente, las GS de pacientes SS han mostrado que las células epiteliales contribuyen con el ambiente inflamatorio al sobreexpresar citoquinas pro-inflamatorias como TNF-α e IFN-. En esta tesis se determinó el efecto de IFN- y TNF-α en la metilación de los promotores de los genes de interés en acinos 3D. Con el propósito de averiguar si los cambios observados se relacionaron con las enzimas metilasas y desmetilasas, es que se determinaron los niveles de transcrito de DNMT1, DNMT3A y TET2. Los resultados obtenidos en GS labiales de pacientes SS comparado con controles mostraron: 1. un aumento significativo en la metilación del DNA para el promotor del gen de ATF4 que se correlacionó positivamente con los niveles de transcritos de TNF-α e IFN-, 2. una disminución de la metilación del promotor del gen de ATF6α que se correlacionó negativamente con los niveles de los transcritos de las citoquinas evaluadas, y 3. no se encontraron cambios en la metilación del promotor de CALR. Paralelamente, se determinó que el porcentaje de metilación del promotor de ATF6α correlacionó negativamente con los autoanticuerpos ANA. Sin embargo, es complejo establecer cuáles son los blancos antigénicos que dan cuenta de esta correlación. Asimismo, las correlaciones clínicas obtenidas validan la muestra de pacientes utilizada en este estudio, mostrando que la inflamación se asocia al daño glandular y consecuentemente a la alteración de la función de las GS. En los acinos 3D estimulados por 24 h con TNF-α o IFN- (1 y 10 ng/mL) se corroboró lo observado en GSL de pacientes SS, evidenciando un aumento del porcentaje de metilación del promotor del gen de ATF4, una disminución del promotor del gen de ATF6α y no cambios en CALR. Por otra parte, la metilación del promotor de los genes de ATF4 y de ATF6α correlacionó negativamente con los niveles de transcritos respectivos. Paralelamente, los niveles de transcritos de DNA-metiltransferasas (DNMT1, DNMT3A) y la desmetilasa TET2 aumentaron significativamente en acinos 3D estimulados con citoquinas. Este aumento en los niveles de transcritos explicaría, en parte, la metilación diferencial del promotor de ATF4 y de ATF6α bajo las condiciones de estudio. Por lo tanto, las citoquinas proinflamatorias promueven cambios en la metilación del DNA de los promotores de los genes estudiados. Además, los niveles de transcritos de metilasas y desmetilasa se podrían incidir en la metilación diferencial de los promotores de ATF4 y ATF6α bajo las condiciones del estudio. En conclusión, las citoquinas pro-inflamatorias promueven cambios en la metilación del DNA de los promotores génicos ATF4 y ATF6α y, estos cambios en la metilación de los promotores podrían contribuir a la regulación de la UPR en las GSL de pacientes con SS. / Sjögren's syndrome (SS) is a chronic, autoimmune, inflammatory and systemic exocrinopathy that mainly affects salivary glands (SG) and lacrimal glands. Results from our laboratory demonstrate that SG acinar cells from SS patients show stress in the endoplasmic reticulum and an increased expression of ATF6α sensor and ATF4 transcription factor, member of the PERK pathway of the unfolded protein response. Also, SS patients showed variable levels calreticulin transcript levels (CALR). Considering the relevant role attributed to epigenetics in the pathogenesis of autoimmune diseases, the question arises: Is it possible that the differential expression of ATF4, ATF6α and CALR in SG from SS-patients could be regulated by epigenetic mechanisms, such as DNA methylation? The percentage of DNA methylation of the ATF4, ATF6α and CALR gene promoters were evaluated using methylation-sensitive high resolution melting (MS-HRM). Results were correlated with the clinical data of SS patients. Interestingly, SG from SS-patients has shown that epithelial cells contribute to the inflammatory environment by overexpressing relevant pro-inflammatory cytokines such as TNF-α and IFN-γ. In this thesis we determined the effect of IFN-γ and TNF-α on methylation of promoters of the genes of interest in 3D acini. To determine if the observed changes were related to the levels of methylase and demethylase enzymes, transcript levels of DNMT1, DNMT3A and TET2 were determined. The results obtained in labial SG (LSG) of SS patients compared with controls showed: 1. a significant increase of DNA methylation in ATF4 gene promoter that positively correlated with TNF -α and IFN-γ transcript levels, 2. a significant decrease in DNA methylation in ATF6α gene promoter that negatively correlated with TNF-α and IFN-γ transcript levels, 3. no changes were found in the methylation of the CALR promoter. The methylation of the ATF6α promoter correlated negatively with ANA antibodies levels. However, it is complex to establish the antigenic targets that account for this correlation. Aditionally, the clinical correlations obtained validate the set of patients used in this study showing that the inflammation is associated with the glandular damage and consequently to the alteration of the GS function. Results observed in LSG of SS patients were confirmed in 3D acini stimulated with TNF-α or IFN-γ (1 and 10 ng/mL) for 24 h, showing an increase in the methylation percentage of the ATF4 gene promoter, a decrease of the ATF6α gene promoter and no changes in CALR. On the other hand, promoter methylation of the ATF4 and ATF6α genes negatively correlated with their respective transcript levels. In parallel, levels of DNA-methyltransferase transcripts (DNMT1, DNMT3A) and TET2 desmethylase increased significantly in cytokine-stimulated 3D acini. These results could partly explain the differential methylation of the ATF4 promoter and ATF6α under the present experimental conditions. Therefore, proinflammatory cytokines promote changes of promoter DNA methylation of the studied genes. Comparatively, levels of methylase and desmethylase transcripts could influence the differential methylation of ATF4 and ATF6α promoters under conditions studied. In conclusion, proinflammatory cytokines promote changes in the methylation of ATF4 and ATF6α promoters and these changes in DNA methylation would contribute to the regulation of UPR in the LSG of patients with SS.

El objetivo del estudio fue caracterizar la expresión de citoquinas características de la respuesta inmune adaptativa celular (Th1) y humoral (Th2) en mucosa intestinal de crías de alpaca sanas y enfermas con enteropatía de cero a 45 días de edad. Se evaluó la expresión de ARNm de IFNγ e IL2 (Th1) junto a IL4 e IL10 (Th2) a través de RT-PCR Tiempo Real y cuantificación relativa según el método 2-ΔΔCt empleando el gen GAPDH como gen interno y en relación a animales calibradores recién nacidos que no han consumido calostro. Se encontró que la expresión de estas citoquinas es detectable a partir del nacimiento y que poseen una cinética ascendente y gradual que alcanza su máxima expresión entre la tercera y quinta semanas de edad en todas las citoquinas evaluadas en el grupo de animales sanos. Asimismo, se encontró pobre expresión de IL2 y una aparente polarización de la respuesta Th1 a través de expresión de IFNγ por encima del resto de citoquinas. Existió diferencia estadística significativa en las comparaciones hechas de acuerdo a grupo sanitarios y edad, así como correlación positiva entre edad y expresión de citoquinas, soportando la observación de la cinética ascendente y el establecimiento de esta cinética como patrón de expresión en los animales sanos. En los animales enfermos, se observó expresión aumentada de todas las citoquinas con respecto a los animales sanos y calibradores, particularmente en el caso de IFNγ e IL4, las que se regulan mutuamente y polarizan la respuesta inmune. No se halló un patrón específico ni correlación entre edad y expresión de citoquinas en este grupo. -- Palabras clave: crías de alpaca, mucosa intestinal, Th1, Th2, ARNm, RT-PCR Tiempo Real, cuantificación relativa. / -- The aim of this study was to characterize expression of cytokines belonging to the immune cellular (Th1) and humoral (Th2) adaptative responses in intestinal mucosa tissue from healthy and from sick newborn alpacas showing clinical signs of enteropathy, ages ranging from zero to 45 days. We assessed expression of mRNA levels of IFNγ and IL2 (Th1) along with IL4 and IL10 (Th2) by means of Real Time RT-PCR and relative quantization according to the 2-ΔΔCt method using the GAPDH gene as internal control and in relation to newborn animals which had not consumed any colostrum right after birth (calibrators). We found that expression of all these cytokines is detectable at the time of birth and it varies according to a gradual ascendant kinetics reaching its maximum expression between the third and fourth weeks of age in healthy animals. Also, IL2 is expressed poorly in this tissue while there is an apparent polarization towards Th1 responses, mainly due to high expression of IFNγ which levels are always higher than the rest of cytokines. There was significant statistic difference when health status and age were compared, also positive correlation between age and levels of expression, supporting our observations regarding gradual ascendant kinetics as a pattern of cytokine expression in healthy animals. Enteropathic animals showed very elevated levels of cytokine expression when compared to healthy animals and calibrators, particularly in the case of IFNγ and IL4, which in turn regulate each other and polarize immune responses towards Th1 and Th2, respectively. We could not find any specific expression pattern or positive correlation between age and cytokine expression in this group of animals. -- Key words: newborn alpaca, intestinal mucosa, Th1, Th2, mRNA, Real Time RT-PCR, relative quantization.

Evalúa la expresión génica de las citoquinas IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, TGF- y el factor transcripcional GATA3 en la mucosa intestinal de crías de alpacas clínicamente sanas de 2 a 47 días de edad. Para lo cual se formaron grupos etarios conformados por alpacas de 2 a 8 días (grupo 1), 10 a 21 días (grupo 2) y 26 a 47 días de edad (grupo 3) sin importar sexo, raza y desprovistos de signos clínicos de enfermedad. Se tomó la porción media del yeyuno de cada animal de las cuales se extrajeron el ARN total y se realizó la técnica RT-PCR en tiempo real con cebadores específicos para los genes en estudio. La expresión de genes fue determinado por el método comparativo 2-ΔΔ Ct usando como gen endógeno a Gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y como calibrador fetos de 11 meses. La expresión de los genes de las citoquinas y el factor de transcripción se caracterizó por un temprano incremento de la expresión en todos los genes en evaluación en los animales de 2 a 8 días de edad y una mayor expresión en los animales de 10 a 21 días, asociándose al desarrollo del sistema inmune y a una respuesta estimulada por la colonización de microorganismos del ambiente. En los animales de 26 a 47 días de edad la expresión de los genes de IL-4, IL-5 y GATA3 se vio reducida ligeramente y la expresión de los genes de IL-10 y TGF-β siguió incrementándose; ambas respuestas inmunes estarían asociadas a un proceso de adaptación y regulación frente a los microorganismos saprófitos y antígenos alimenticios. Sin embargo, IL-6 sigue aumentando su expresión en los animales de 26 a 47 días de edad, asociándose a una respuesta inflamatoria contra patógenos del ambiente. El análisis histopatológico mostró un aumento de individuos con presencia de leve enteritis catarral aguda difusa al aumentar la edad, alcanzando un 84% (5/6) en los animales de 26 a 47 días de edad, asociado a la presencia de patógenos como Cryptosporidium spp y Eimeria spp encontrados en este análisis, influyendo en la expresión de los genes de las citoquinas en estudio.