Made available in DSpace on 2014-06-12T15:49:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo123_1.pdf: 9082048 bytes, checksum: df73be80cc40f533d6cf694221691a0e (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Faculdade de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / O objetivo do presente trabalho foi inicialmente extrair e purificar o polissacarídeo fucana proveniente do Sargassum cymosum e utilizá-lo como agente de direcionamento de nanopartículas para macrófagos. A caracterização do material extraído e purificado foi efetuada utilizando análise elementar, espectroscopia de infravermelho (IV), ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN H1) e análise térmica e a determinação da massa molecular foi efetuada por cromatografia de permeação em gel. Em seguida, o material obtido foi utilizado na preparação das novas nanopartículas de Poli(cianoacrilato de isobutila) revestidas de fucana (FC-PIBCA-NP). As nanopartículas foram obtidas através da polimerização por emulsão aniônica (AEP) e polimerização por radicais redox (RREP) utilizando mistura de dextrana e fucana em diferentes proporções. As nanopartículas foram caracterizadas através do tamanho, potencial zeta, morfologia e estabilidade a longo prazo. Nanopartículas estáveis foram obtidas com até 100% de fucana pelo método AEP. Por outro lado, suspensões estáveis de nanopartículas foram obtidas com no máximo 25% de fucana por RREP. As suspensões obtidas com porcentagem mais elevadas de fucana não permaneceram estáveis. O potencial zeta das nanopartículas diminuiu com o aumento da quantidade de fucana, alcançando o valor de 44 mV para as nanopartículas preparadas por AEP com 100% de fucana. Estes resultados indicam que a fucana permanece localizada na superfície das nanopartículas. A análise morfológica por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (MET) mostrou nanopartículas com forma esférica. A estrutura interna das nanopartículas do tipo núcleo-coroa foi mostrada claramente por análise MET o que está de acordo com os resultados do potencial zeta que sugerem a localização do polissacarídeo na superfície das nanopartículas. As interações das nanopartículas com a linhagem celular de macrófagos J774 e com fibroblastos NIH-3T3 foram investigadas pela avaliação da citotoxicidade e pela observação da captura celular por microscopia confocal de fluorescência. As nanopartículas preparadas pelo método AEP mostraram uma maior citotoxicidade em macrófagos. Por exemplo, as nanopartículas obtidas pelo método AEP contendo 25% de fucana mostraram-se 3 vezes mais citotóxicas em macrófagos J774 comparadas às nanopartículas RREP (IC50 = 4 ± 2μg/mL e IC50 11 ± 3μg/mL, respectivamente). As observações efetuadas por microscopia confocal de fluorescência para avaliar a captura e a distribuição das nanopartículas nas células não permitiram explicar o aumento da citotoxicidade das nanopartículas obtidas pelo método AEP nos macrófagos. Todos os tipos de nanopartículas foram encontradas nos dois tipos de células, demonstrando que elas podem ser capturadas independentemente pelos macrófagos e fibroblastos. As diferenças na aparência da fluorescência no interior das células, i.e., pontual ou difusa, sugerem que as nanopartículas penetraram nas células por mecanismos distintos. No entanto, nenhuma correlação pode ser estabelecida entre o tipo de nanopartículas (AEP ou RREP) e o teor de fucana. As nanopartículas foram administradas em ratos por via oral com objetivo de investigar se elas poderiam ser direcionadas para os macrófagos do tecido linfóide intestinal. As propriedades bioadesivas e localização no tecido intestinal das nanopartículas fluorescentes foram investigadas por microscopia de fluorescência. Somente as nanopartículas revestidas com fucana obtidas pelo método RREP apresentaram uma redução na bioadesão comparada aos outros tipos de nanopartículas. A análise por microscopia de fluorescência revelou que as nanopartículas foram principalmente encontradas associadas ao muco residual. Apenas uma pequena quantidade de nanopartículas pôde ser visualizada na superfície das células epiteliais, do lado da luz intestinal onde estão localizadas as vilosidades e as placas de Peyer. Esses resultados sugerem a retenção das nanopartículas no muco e que uma pequena quantidade de nanopartículas chega à superfície do epitélio para ser eventualmente capturada pelos macrófagos. Embora o presente trabalho tenha permitido realizar a extração da fucana e a preparação de nanopartículas de PIBCA revestidas com fucana, não foi capaz, no entanto, de demonstrar que as novas nanopartículas podem ser utilizadas para aumentar a especificidade e direcionamento para macrófagos. Experimentos complementares serão, portanto, necessários para melhor compreender a origem da citotoxicidade das nanopartículas obtidas pelo método AEP em macrófagos J774. Além do mais, para o direcionamento das nanopartículas para macrófagos presentes em mucosas, as propriedades bioadesivas precisam ser ajustadas com vistas a reduzir a retenção pelo muco e de permitir um maior alcance na quantidade de nanopartículas a atingir a superfície das células epiteliais

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:55:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo63_1.pdf: 4136765 bytes, checksum: 9f736b02baae973e37352ef4f9ae03a2 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Os derivados acridínicos são drogas capazes de interagir com moléculas nucleares, como DNA e inibir enzimas nucleares, como as topoisomerases, sendo assim, fortes candidatos ao desenvolvimento de novos fármacos com atividade antitumoral. Dentre os derivados acridínicos, a Amsacrina se encontra na clinica medica e apresenta boa atividade antineoplásica, principalmente contra leucemias. A síntese dos derivados acridínicos, ocorre de forma paralela e convergente, onde os núcleos são construídos separadamente e depois condensados. Assim, temos por objetivo, além da obtenção dos novos derivados acridínicos, o aperfeiçoamento das técnicas de obtenção dos intermediários essenciais na construção de novas moléculas farmacologicamente ativas, buscando maior rendimento, estabilidade, diminuindo assim o número de etapas no desenvolvimento das mesmas e o custo. O método utilizado parte da obtenção da 9-metilacridina através da reação da difenilamina com acido acético glacial, em seguida é oxidada à aldeído por duas etapas, a primeira consiste na formação de um intermediário reativo através da reação da 9-metilacridina acridina com N,N-dimetil-4-nitrosoaniline em meio alcoólico. A segunda etapa consiste em uma oxidação em meio ácido conduzindo à formação do aldeído. O núcleo isoquinolínico substituído foi obtido através de uma reação do anidrido homoftálico com benzilaminas, conduzindo à formação da 2-benzil-isoquinolina-1,3-diona, que foram posteriormente condensados em meio básico com aldeídos acridínicos, levando aos compostos finais. Os núcleos pirimidínicos e quinazolínicos são comerciais e sofrem reações de N-alquilações sucessivas com haletos de benzila e 9-bromo-benzilacridina, obtidos através de uma reação de halogenação partindo-se da 9-metilacridina usando-se N-bromossucinamida (NBS) como doador de halogênio. E assim foram obtidos 5 novos derivados acridinicos com heterociclos diferentes, que foram caracterizados por RMN1H e Espectrometria de massa, apresentado rendimentos entre 55 e 75% e testados frente a quatro linhagens celulares de câncer diferentes, através de analise colorimétrica baseada na conversão do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2H-brometo de tetrazolio (MTT) em azul formazan, a partir de substratos de enzimas microssomais e mitocondriais presentes somente nas células metabolicamente ativas, na dose de 25μg/mL. Os compostos que apresentaram melhores resultados foram os derivados isoquinolinicos, o 4-acridin-9-il-metileno-4H-isoquinolina-1,3-diona com redução de 96 e 63% do crescimento celular em HL-60 e HCT-8 respectivamente e o 4-acridin-9-il-metileno-2-benzil-4H-isoquinolina-1,3-diona com redução de 98 e 78% do crescimento celular em HL-60 e HCT-8 respectivamente

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-10-08T21:48:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Charles Fernandes dos Santos Simões.pdf: 1267840 bytes, checksum: fd5cd699bcc0a35150281d99cfaa2efc (MD5) / Approved for entry into archive by Alice Araujo (alice.caraujo@ufpe.br) on 2018-11-22T17:34:06Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Charles Fernandes dos Santos Simões.pdf: 1267840 bytes, checksum: fd5cd699bcc0a35150281d99cfaa2efc (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-22T17:34:06Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Charles Fernandes dos Santos Simões.pdf: 1267840 bytes, checksum: fd5cd699bcc0a35150281d99cfaa2efc (MD5) Previous issue date: 2015-09-11 / Nos últimos anos, novos desafios têm surgido para os pesquisadores no âmbito das ciências médicas; sobretudo, destacam-se: a procura por novas terapias contra câncer, a busca por novos agentes anti-inflamatórios que não apresentem as reações adversas típicas e o combate à multirresistência microbiana. Annona muricata L. (Annonaceae), conhecida vulgarmente como gravioleira e na medicina popular, tem sido empregado no tratamento de inflamações, febres, infecções e diabetes. Além disso, tem demonstrado ser potencialmente eficaz na terapia contra o câncer. Com base nisso, objetivou-se, nesse trabalho, analisar o perfil fitoquímico de extratos obtidos das folhas de A. muricata L. e executar uma triagem farmacológica visando a avaliação do seu potencial antimicrobiano, citotóxico e anti-inflamatório. Primeiramente, foi realizada a extração das folhas de A. muricata L., utilizando os solventes hexano, acetato de etila, etanol e água, através da técnica de Soxhlet e obteve-se como respostas os respectivos rendimentos (3,37%, 3,20%, 6,22% e 9,09%). Em seguida, através da técnica de Cromatografia em Camada Delgada (CCD), foram identificados os grupos de metabólitos secundários. Posteriormente, avaliou-se a atividade antimicrobiana dos quatro diferentes extratos em questão frente a cepas de bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e de fungos leveduriformes, assim como as atividades citotóxicas frente à três diferentes linhagens de células tumorais e as atividades anti-inflamatórias através da avaliação da produção de óxido nítrico (NO). A triagem fitoquímica revelou a presença de mono e sesquiterpenos, triterpenos e esteroides, flavanoides, taninos, cumarinas e alcaloides. Os extratos hexânico e acetato de etila não apresentaram atividade frente às cepas testadas, já os extratos etanólico e aquoso exibiram atividade frente a cepas Gram-positivas, com halos de 19 mm frente a Micrococcus luteus, para o extrato etanólico, e 18 mm frente a Staphylococcus coagulase-negativa para o extrato aquoso, e em algumas Gram-negativas, 11 mm frente a Proteus mirabilis para o extrato etanólico, porém sem atividade frente aos fungos. A respeito da atividade citotóxica, todos os extratos apresentaram atividades inibitórias frente às linhagens testadas, sobretudo a linhagem HEp-2 onde todos apresentaram inibição de 100% na concentração avaliada. A ação anti-inflamatória dos extratos também foi efetiva, todos os extratos analisados reduziram a produção de NO induzida a níveis basais em todas as concentrações estudadas, especialmente os extratos etanólico e aquoso. Pode-se considerar que A. muricata trata-se de uma opção para a busca de novos agentes terapêuticos e como fonte de moléculas de grande interesse científico. Os resultados corroboraram com o seu uso tradicional, reforçando mais ainda sua comprovação científica a respeito de suas propriedades, possibilitando assim maiores estudos para a sua viabilidade terapêutica. / In the recent years, new challenges have arisen for researchers in the field of medical science such as the quest for new therapies against cancer, the search for new anti- inflammatory agents that do not represent the typical adverse reactions and also the the struggle against microbial multidrug resistance. Annona muricata L. (Annonaceae), commonly known as soursop and famous for its therapeutic properties in folk medicine, has been employed in the treatment of inflammations, fevers, infections and diabetes. Moreover, it has shown to be potentially effective in cancer therapy. On this basis, the goal of this work was to analyze the phytochemical profile of extracts obtained from the leaves of A. muricata L. and run a pharmacological screening aimed at assessing its antimicrobial, cytotoxic and anti-inflammatory potential. Firstly, the extraction process was employed in the leaves of A. muricata L., using several solvents such as hexane, ethyl acetate, ethanol and water by Soxhlet extractor and were obtained their respective yields as responses (3.37%, 3.20%, 6.22% and 9.09%). Then, through Thin Layer Chromatography (TLC), the groups of secondary metabolites were identified. Subsequently, the four different extracts were evaluated concerning the antimicrobial activity against strains of Gram-positive bacteria, Gram-negative, and yeast fungi, as well as the cytotoxic activity against three different tumor cell lines and also the anti-inflammatory activities by assessing the production of nitric oxide (NO). The phytochemical screening revealed the presence of mono and sesquiterpenes, triterpenes and steroids, flavonoids, tannins, alkaloids and coumarins. The hexane extracts and ethyl acetate showed no activity against the strains tested, since the ethanol and aqueous extracts showed activity against Gram-positive strains, with halos of 19 mm against Micrococcus luteus for ethanolic extract, and 18 mm against Staphylococcus coagulase-negative for the aqueous extract, and in some Gram-negative strains, 11 mm against Proteus mirabilis for the ethanolic extract, but without activity against the yeasts. Regarding the cytotoxic activity, all extracts showed inhibitory activities across the tested strains, especially Hep-2 line where all showed inhibition of 100% in the assessed concentration. The anti-inflammatory action of the extracts was also effective, since all analyzed extracts reduced NO production induced levels at all the concentrations studied, especially ethanol and aqueous extracts. It can be considered that A. muricata is an alternative to the search for new therapeutic and as a source of great scientific interest molecules agents. The results corroborate with its traditional use, further strengthening its scientific evidence regarding their properties, thus enabling further study for its therapeutic viability.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-06-12Bitstream added on 2014-06-13T20:24:25Z : No. of bitstreams: 1 majewski_m_dr_sjc.pdf: 368417 bytes, checksum: abb039d29f6c3474a49eaf77b2977d69 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro a atividade antifúngica e a citotoxicidade do ácido peracético e extrato vegetal de Camellia sinensis a (chá verde) e também avaliar o efeito antifúngico da anfotericina B e fluconazol em 22 cepas de Candida spp. isoladas da cavidade bucal de pacientes HIV positivos. Para determinação da concentração fungicida mínima e concentração inibitória mínima (CFM e CIM) em células planctônicas, foram realizadas diluições seriadas do extrato e do ácido peracético em placas de 96 poços em caldo RPMI tamponado, em suspensões padronizadas de cada cepa de Candida (106 células/mL). Após determinação da concentração do extrato e do ácido peracético no CIM e CFM, foi preparado o biofilme de cada cepa em placas de 24 poços utilizando-se corpos-de-prova de resina acrílica (n=10), as quais foi adicionado 0,1 mL da suspensão de Candida e 2mL caldo BHI sacarosado. As placas foram incubadas e mantidas a 37° por 5 dias. Após a incubação, os corpos-de-prova foram lavados em solução fisiológica e colocados em imersão por 5 minutos no ácido peracético ou no extrato vegetal. Os corpos-de-prova foram sonicados e realizadas diluições seriadas, 0,1 ml de cada diluição foi semeada em placas de ágar Sabouraud em duplicata e incubadas em estufa bacteriológica (37ºC/48 h). Posteriormente foi realizada a contagem das unidades formadoras de colônia (UFC/mL). Os dados foram avaliados estatisticamente utilizando-se teste de Mann Whitney (p<0,05) para o biofilme, observação visual para CIM e CFM, Tukey e Anova para citotoxicidade. Foi avaliada a citotoxicidade do ácido peracético e extrato de chá verde em macrófagos de camundongos (RAW 264.7), para verificar a viabilidade celular... / The objective of this study was to evaluate the in vitro antifungal activity and cytotoxicity of peracetic acid and plant extract from the Camellia sinensis (green tea) and also to evaluate the antifungal effect of amphotericin B and fluconazole in 22 strains of Candida spp. isolated from the oral cavity of HIV positive patients. To determine the minimum fungicidal concentration and minimum inhibitory concentration (CFM and CIM) in planktonic cells, were performed serial dilutions of the extract and peracetic acid in 96-well plates in RPMI broth buffered in standardized suspensions of each strain of Candida (106 cells / mL). After determining the concentration of the extract and peracetic acid in CIM and CFM, the biofilm was prepared for each strain in 24-well plates using body-of-proof acrylic resin (n = 10), which was added 0, 1 mL of the suspension of Candida sucrose and 2 ml BHI broth. The plates were incubated at 37 ° and maintained for 5 days. After incubation, the bodies of the test piece was washed in saline and placed for 5 minutes immersion in peracetic acid or the plant extract. The bodies of the test piece were sonicated and serial dilutions performed, 0.1 ml of each dilution was seeded on Sabouraud agar plates in duplicate and incubated in a bacteriological incubator (37 º C/48 h). Was subsequently performed the counting of colony forming units (CFU / mL). The data were statistically analyzed using Mann Whitney test (p <0.05) for the biofilm, visual observation for CIM and CFM, ANOVA and Tukey for cytotoxicity. We evaluated the cytotoxicity of peracetic acid and green tea extract in mouse macrophages (RAW 264.7) to verify the cell viability of these substances. The results showed that there was feasibility of peracetic acid and green tea extract in the cells analyzed. The antifungal agents have... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-10-13Bitstream added on 2015-03-03T12:07:04Z : No. of bitstreams: 1 000806944_20151210.pdf: 209568 bytes, checksum: 5bea09dcdfa1d8c01a664c66d6bd2f7e (MD5) Bitstreams deleted on 2015-12-11T11:22:37Z: 000806944_20151210.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-11T11:23:15Z : No. of bitstreams: 1 000806944.pdf: 1712440 bytes, checksum: 0469e534a938c844721a175be77e6aae (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os compostos fenólicos ocorrem de maneira universal no reino vegetal, sendo os ácidos cinâmicos integrantes desse grupo de compostos orgânicos. O ácido cafeico (AC) é um desses representantes, com potente ação antioxidante e induz a produção de colágeno, prevenindo o envelhecimento precoce da pele. As clássicas emulsões são muito utilizadas pelo consumidor pelo sensorial agradável e refrescante que proporcionam, no entanto, preparações desenvolvidas na forma de filme ou película seca apresentam-se como uma alternativa tecnológica pela sua facilidade e segurança no transporte, já que o peso e risco de vazamento são inconvenientes praticamente eliminados. O objetivo deste trabalho foi estudar da eficácia, citotoxicidade, estabilidade, liberação, permeação e retenção do ácido cafeico veiculado em um filme e uma emulsão através de experimentos in vitro. Dentre os estudos realizados constam as avaliações do Fator de Proteção Solar in vitro, da atividade inibidora da tirosinase, da atividade antioxidante através de duas metodologias analíticas (DPPH e ABTS), avaliação do potencial citotóxico, caracterização qualitativa do AC por ultravioleta e infravermelho, validação de uma metodologia analítica para quantificação de AC por CLAE e espectrofotometria no UV e estudos de liberação, permeação e retenção cutânea in vitro. O AC apresentou elevada atividade antioxidante, pode ser usado como um aditivo para incremento do FPS de formulações e sua atividade despigmentante poderia até ser considerada quando for aplicado em elevadas concentrações. Pelos estudos de citotoxicidade in vitro realizados verificou-se que o AC é seguro nas concentrações utilizadas. Também foi observada uma elevada liberação do ativo da formulação e permeação reduzida, indicando que ele foi capaz de permanecer retido na epiderme/derme, local onde deve ter ação. Os métodos analíticos desenvolvidos foram validados ... / Phenolic compounds occur universally in the plant kingdom and cinnamic acids are part of this group of organic compounds. The caffeic acid is one of these representatives with powerful antioxidant activity, increasing collagen production and preventing premature aging of the skin. The classic emulsions are widely used by the consumer by providing pleasant refreshing sensorial, however, preparations developed in the form of dry film are presented as a technological alternative for its ease and safety in transportation. The aim of this study was to evaluate the efficacy, cytotoxicity, stability, release, permeation and retention of caffeic acid in a film and an emulsion through in vitro experiments. Among the studies are the evaluations of the Sun Protection Factor, the inhibiting tyrosinase activity, antioxidant activity using two analytical methodologies (DPPH and ABTS), evaluation of the cytotoxic potential, qualitative characterization of caffeic acid by ultraviolet and infrared absorptions, validation of analytical methods for quantification of caffeic acid by HPLC and UV spectrophotometry, and release studies, skin permeation and retention in vitro. Caffeic acid showed high antioxidant activity. It can be used as an additive to increase the SPF of formulations and its depigmenting activity could even be considered when applied at high concentrations. It was found that the caffeic acid is safe in the concentrations used, for in vitro cytotoxicity studies. A high release of active compound and reduced permeation was also observed, indicating that it was able to remain retained in the epidermis/dermis, where it should have action. The analytical methods developed were validated ensuring all parameters of linearity, specificity, precision, accuracy and robustness established. The emulsion was subjected to various stress conditions and remained stable throughout the 90 days in the accelerated stability study.

O acúmulo de mutações, alterações incorporadas ao patrimônio genético de células somáticas e germinais, pode causar redução de populações naturais que são críticas para a cadeia alimentar, pondo em risco a sobrevivência de determinadas espécies. Embora o dano causado pela contaminação química ocorra em nível molecular, existem efeitos emergentes nas populações, tais como perda da diversidade genética, que não é previsível com base somente no conhecimento dos mecanismos de toxicidade não genéticos. Alguns compostos de origem antrópica tendem a adsorver no material orgânico do sedimento, sendo concentrados ao longo do tempo. Contaminantes ambientais podem ser mais associados com a porção fina dos sedimentos (silte ou argila) do que com a grosseira (areia ou cascalho). O presente estudo avaliou a atividade mutagênica e citotóxica de extratos moderadamente polares de sedimento em três pontos durante 5 coletas realizadas nos anos de 1999 e 2000 no arroio Bom Jardim, que drena a região do Complexo Petroquímico, localizado no município de Triunfo, Rio Grande do Sul. Foi utilizado na avaliação da mutagenicidade e citotoxicidade o ensaio Salmonella/microssoma, método de microssuspensão. A análise de granulometria mostrou um conteúdo de partículas finas em média menor no ponto em frente ao complexo, sendo este também o ponto amostral com menor percentual de material orgânico extraído. Observou-se baixa atividade mutagênica nos diferentes locais estudados, variando de 3,3% até 8,3%, sendo a citototoxicidade o mais importante efeito biológico observado na região, variando de 20% até 40%, somados os resultados dos ensaios em presença e ausência de metabolização externa. Os pontos com maior contaminação estão localizados em frente e a jusante da área industrial, havendo uma distribuição gradativa e sazonal das respostas à medida que o local se aproxima da foz do arroio. Em ensaios com ausência de fração de metabolização hepática, as respostas para mutagênese e citotoxicidade foram mais freqüentes, sendo os danos do tipo erro no quadro de leitura os mais presentes. A determinação da atividade mutagênica e citotóxica em amostras de sedimento mostrou-se importante na determinação da qualidade ambiental, apesar da composição química desta matriz ser bastante complexa. O ensaio Salmonella/microssoma monitorando danos moleculares e, principalmente citotoxicidade, foi uma ferramenta importante no diagnóstico da presença de poluentes. A possibilidade de avaliar danos precoces, através deste ensaio, promove a melhoria da qualidade ambiental e motiva ações de preservação do patrimônio genético da fauna e flora atingidas pela atividade antrópica.

Submitted by Lucas Pires Garcia Oliveira (pires081@hotmail.com) on 2018-08-21T18:41:21Z No. of bitstreams: 1 dissertação Lucas_P_G_Oliveira.pdf: 2241331 bytes, checksum: 52bfd0bd55f75641925f261173e0ce0d (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-08-22T18:26:50Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oliveira_lpg_me_bot.pdf: 2241331 bytes, checksum: 52bfd0bd55f75641925f261173e0ce0d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-22T18:26:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oliveira_lpg_me_bot.pdf: 2241331 bytes, checksum: 52bfd0bd55f75641925f261173e0ce0d (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O câncer é uma doença que atinge pessoas em diversos continentes, acarretando milhões de mortes anualmente. Os tratamentos antineoplásicos são conhecidos por sua ampla lista de efeitos colaterais como toxicidade, indução de resistência em células tumorais, falta de seletividade entre células normais e tumorais, além de acometimento do sistema imunológico com consequente aparecimento de infecções. Com o intuito de atenuar os efeitos colaterais causados pelos agentes antitumorais, a administração de produtos naturais concomitantemente com fármacos tem sido investigada. O presente trabalho foi delineado visando elucidar a possível ação citotóxica e imunomoduladora da geoprópolis (GEO) associada à doxorrubicina (DOX) em menor concentração sobre monócitos de indivíduos saudáveis. A análise da viabilidade celular foi realizada pelo método do MTT, a produção de citocinas (IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-10) por ELISA, a expressão de marcadores de superfície (HLA-DR, CD80, CD40, TLR-2, TLR-4) por citometria de fluxo. Também foi avaliada a atividade microbicida de monócitos frente ao desafio com Candida albicans, Escherichia coli e Streptococcus mutans, a expressão gênica por RT-PCR e a produção de proteínas por western blot. O ensaio de MTT demonstrou que nenhum dos tratamentos apresentou ação citotóxica. Monócitos incubados com GEO e com a associação GEO + DOX apresentaram produção de TNF-α e IL-10 aumentada, e produção de IL-1β e IL-6 diminuídas. Houve aumento na expressão de TLR-4 e CD80 após incubação com a associação, enquanto a GEO isoladamente induziu somente aumento da expressão de TLR-4. A ação bactericida dos monócitos foi aumentada frente ao desafio com E. coli. A atividade fungicida não sofreu alterações significativas pelos diferentes tratamentos, assim como a atividade microbicida contra S. mutans. A expressão gênica de LC3 e NF-κB foi inibida por todos os tratamentos, enquanto a expressão de fosfo-ΙκBα foi diminuída pela GEO, mas a associação manteve os níveis basais. Nossos dados permitem concluir que a associação não é citotóxica para monócitos humanos e possui ação imunomoduladora quanto à expressão de marcadores de superfície celular e produção de citocinas, sugerindo um possível perfil ativador da associação. Como implicações práticas, a utilização da associação permitiria reduzir a concentração de uso da doxorrubicina e os efeitos adversos causados pelo tratamento quimioterápico. / Cancer is a disease that strikes people on many continents, resulting in millions of deaths annually. The antineoplastic treatments are known for their wide range of side effects such as toxicity, induction of resistance in tumor cells, lack of selectivity between normal and tumor cells, as well as immunosuppression with consequent onset of infections. In order to mitigate the side effects caused by antitumor agents, the administration of natural products concomitantly with drugs has been investigated. The present work was designed to elucidate a possible cytotoxic and immunomodulatory action of geopropolis (GEO) combined with doxorubicin (DOX) in a lower concentration on monocytes of healthy individuals. Cell viability was analyzed by the MTT method, the expression of surface markers (HLA-DR, CD80, CD40 , TLR-2, TLR-4) by flow cytometry, the production of cytokines (IL-1β, TNF-α, IL-6 and IL-10) by ELISA, gene expression by RT-PCR, protein production by western blot. The microbicidal activity of monocytes was evaluated against Candida albicans, Escherichia coli and Streptococcus mutans, as well as hydrogen peroxide production. MTT assay showed that none of the treatments exerted a cytotoxic action. Monocytes incubated with GEO and the GEO + DOX had an increased TNF-α and IL-10 production, while IL-1β and IL-6 production decreased when compared to control. An increased TLR-4 and CD80 expression was seen after incubation with the combination, whereas GEO alone increased TLR-4 expression. The combination increased the bactericidal action of monocytes against E. coli. No alterations were found in the fungicidal activity nor in the bactericidal activity against S. mutans. Gene expression of LC3 and NF-κB were decreased by all treatments, whereas phospho-ΙκBα expression was decreased by GEO but the association maintained baseline levels. Our findings indicated that the combination was not cytotoxic for monocytes and exerted an immunomodulatory action on the expression of cell surface markers and cytokine production, suggesting an activator profile of GEO + DOX. The use of this combination could reduce the concentration of DOX and the side effects caused by chemotherapy. / 2016/02249-4

O 5-Fluorouracil (5-FU) é um agente antitumoral amplamente empregado no tratamento de diversos tipos de cânceres. Embora haja muitos trabalhos publicados com este antineoplásico, estudos sobre seus mecanismos de ação ainda tornam-se necessários a fim de se obter protocolos clínicos mais eficazes. Desta forma, novos aspectos sobre seu mecanismo de citotoxicidade foram investigados neste trabalho. Na primeira parte foram avaliadas as vias de reparação de DNA que participam em resposta a danos induzidos pelo 5-FU e seus efeitos comparados com o seu metabólito ativo FdUMP em Saccharomyces cerevisiae. Os resultados apontam que as lesões induzidas pelo 5-FU podem ser processadas pela vias de reparo por excisão de bases (BER), reparação de bases mal-emparelhadas (MMR), reparo pós-replicativo (PRR) e recombinação homóloga (HR), enquanto que os danos induzidos pelo FdUMP seriam reconhecidos e removidos apenas pelas vias BER e MMR. Estas diferenças no recrutamento das vias de reparo relacionam-se aos diferentes tipos de lesões que são geradas pelos antimetabólitos: o 5-FU induz quebras de fita simples (SSBs) e duplas (DSBs), enquanto que o FdUMP forma principalmente SSBs. Na segunda parte foi investigada a participação de modeladores da cromatina na citotoxicidade do 5-FU em S. cerevisiae. Os resultados em conjunto sugerem que os remodeladores da cromatina dependentes de ATP e algumas acetiltransferases de histona podem influenciar na citotoxicidade do agente 5-FU, possivelmente atuando no relaxamento da cromatina, e assim facilitando os processos de reparação de DNA por HR e PRR. Na terceira parte foi avaliada a resposta ao dano no DNA por ATR/Chk1 e ATM/Chk2 em células tumorais humanas. Os resultados mostraram que o 5-FU ativa principalmente a via ATR/Chk1. Ao se investigar os efeitos do 5-FU em combinação com o AZD7762, um inibidor de Chk1/2, observou-se aumento de sensibilidade ao agente antitumoral, diretamente relacionado ao aumento de células em sub-G1, diminuição em G2/M e indução de mitose prematura. Os resultados em conjunto obtidos neste trabalho nos permitem uma melhor compreensão destes mecanismos de ação do 5-FU, e fornece subsídios para melhora de protocolos terapêuticos. / 5-Fluorouracil (5-FU) is an antitumor drug employed in the treatment of several cancer types. Despite many studies have been conduced with this antineoplasic drug, investigations concerning on its action mechanism become necessary in order to obtain more efficient clinical protocols. Therefore, new aspects about its cytotoxicity mechanism were investigated in this work. First, DNA repair pathways involved in the repair of 5-FU-induced lesions were evaluated and compared to the effects of its active metabolite FdUMP in Saccharomyces cerevisiae. Our data showed that lesions induced by 5-FU may be processed by base excision repair (BER), mismatch repair (MMR), post-replication repair (PRR) and homologous recombination (HR), while FdUMP lesions are recognized and removed only by BER and MMR. These differences in repair pathways recruitment are related to the different lesion types induced by the antimetabolites: 5-FU induces single- and double stranded breaks (SSBs and DSBs), while FdUMP induces mainly SSBs. In the second part we investigated the participation of chromatin remodeling in the 5- FU cytotoxicity in S. cerevisiae. Together, our data suggest that ATP-dependent chromatin remodeling and some histone acetyltransferases may influence 5-FU cytotoxicity, probably acting in chromatin relaxation and facilitating DNA repair process by HR and PRR. In the third part, the DNA damage response by ATR/Chk1 and ATM/Chk2 were evaluated in human tumor cells. The data showed that 5-FU activates mainly ATR/Chk1 pathway. When we investigate the effects of 5-FU in combination with AZD7762, the Chk1/2 inhibitor, we observed increased sensitivity to this antitumor agent, directly related to enhanced number of sub-G1 cells, decrease in the G2/M cells, and premature mitose induction. Our data permit a better comprehension of 5-FU action mechanisms and provide clues to improve the current therapeutics protocols.

O 5-fluorouracil (5-FU) é um antineoplásico análogo pirimídico empregado no tratamento de muitos tipos de cânceres. Três diferentes mecanismos de citotoxicidade são atribuídos a este agente: incorporação de fluoronucleotídeos no DNA ou RNA e a inibição da enzima timidilato sintase. O 5-FU pode ser convertido ao seu metabólito ativo, o 5-fluoro-2´-deoxiuridina-5´-monofosfato (FdUMP), que por sua vez, pode inibir a enzima timidilato sintase (TS), responsável pela síntese de timidina monofosfato a partir de uridina monofosfato; a inibição de TS leva ao desbalanço do pool de nucleotídeos, diminuindo a concentração de dTTP, aumentando a de dUTP e, como conseqüência, levando à incorporação de uracil na cadeia de DNA. No presente estudo comparamos a atividade citotóxica de 5-FU e de seu metabólito FdUMP e as vias de reparação de DNA envolvidas na eliminação das lesões induzidas por estas substâncias. A atividade citotóxica foi avaliada em células de adenocarcinoma de cólon humano, linhagem SW620. As vias de reparação foram estudadas em linhagens de Saccharomyces cerevisiae deficientes em genes de reparo para excisão de bases (BER), excisão de nucleotídeos (NER), recombinação homóloga (HR), recombinação não-homóloga (NHEJ) e síntese translesão (TLS). Para se investigar a possível sobreposição das vias de reparo, foram empregados quádruplos mutantes em BER e NER, HR ou TLS. Os resultados em células tumorais humanas mostraram que tanto 5-FU, quanto FdUMP desencadeiam morte celular por apoptose. Ao avaliar a progressão do ciclo celular, observou-se que 5-FU leva a parada em G1, enquanto que FdUMP, parada em G2. Com a finalidade de se investigar se estas paradas de ciclo celular estariam relacionadas a quebras de DNA, foram empregados ensaios de fosforilação da histona H2AX e os testes de cometa alcalino e de micronúcleos. Observou-se que ambas as drogas induzem fragmentação no DNA, uma vez que foram observadas quebras de fita simples e formação de micronúcleos. Logo, a diferença na progressão do ciclo celular não está relacionada com a habilidade das drogas em induzir quebras. Desta forma, sugere-se que o efeito diferencial de 5-FU e FdUMP na progressão do ciclo celular depende do tipo de lesão induzida pelas drogas e as vias de reparação de DNA implicadas no reconhecimento das mesmas. Ao empregar linhagens de S. cerevisiae proficientes e deficientes em reparo tratadas com 5-FU e FdUMP, observou-se que a proteína Apn1 é de extrema importância no reparo das mesmas, uma vez que apn1Δ foi o mais sensível de todos mutantes e ntg1Δntg2Δapn1Δ apresentou grande sensibilidade aos tratamentos com ambas as drogas. As lesões causadas por 5-FU seriam reconhecidas principalmente pela Ntg2, o que resulta em significativa sensibilidade em ntg2Δ e ntg1Δntg2Δ. Entretanto, para o reconhecimento dos danos por FdUMP são necessárias a participação tanto de Ntg1 quanto Ntg2, como visto na elevada sensibilidade do duplo mutante ntg1Δntg2Δ. As deficiências em Ung1 e Rad27 não revelaram diferenças significativas em relação às linhagens selvagens, bem como nos mutantes em NER (rad1Δ e rad10Δ), HR (rad52Δ), NHEJ (rad50Δ) e TLS (rev1Δ e rev3Δ), para ambas as drogas. No emprego de quádruplos mutantes, verificou-se que ntg1Δntg2Δapn1Δrad52Δ mostrou uma acentuada sensibilidade quando tratado com 5-FU. Estes resultados sugerem que os danos gerados por 5-FU poderiam ser reconhecidos e removidos pela DNA glicosilase Ntg2 e AP endonucleases Apn1 do BER, levando a quebras de fita simples e dupla de DNA, que seriam reparadas por HR (Tipo RAD52). Entretanto, para o tratamento com FdUMP não foram observadas diferenças significativas quando comparado com a linhagem selvagem. Ao analisar a sensibilidade dos mutantes ntg1Δntg2Δapn1Δrad1Δ e ntg1Δntg2Δapn1Δrev3Δ, verificou-se que os mesmos não foram sensíveis ao tratamento com FdUMP, entretanto apresentaram moderada sensibilidade quando tratados com 5-FU. O conjunto desses resultados nos leva a sugerir que uma pequena parte dos sítios AP produzidos pelo tratamento com 5-FU poderia ser processada por NER e TLS, sendo a participação de HR a mais importante. As lesões geradas por FdUMP seriam reparadas principalmente por BER, com a participação de Ntg1, Ntg2 e Apn1, porém não pode ser descartado o possível envolvimento da reparação de bases mal-emparelhadas - MMR, uma vez que se observou previamente, uma parada no ciclo celular em G2 em células de adenocarcinoma de cólon humano SW620. / 5-fluorouracil (5-FU) is an antineoplastic drug pyrimidic analogue employed in the treatment of several cancers. Three different mechanisms of cytotoxicity are attributed to this agent: misincorporation of fluoronucleotides in DNA or RNA and inhibition of thymidilate sintase enzime. 5-FU could be converted to its active metabolite, 5-fluoro-2´-deoxiuridina-5´-monofosfato (FdUMP), that could inhibit the thymidilate sintase (TS), related to thymidine synthesis from uridine; TS inhibition leads to nucleotide pool imbalance, decreasing thymine concentration and increasing uracil, as consequence, it leads to uracil incorporation into DNA. The present study compared the cytotoxic activity of 5-FU and its active metabolite FdUMP, and the DNA repair pathways involved in removing lesions induced by these substances. Cytotoxicity was evaluated in human colon adenocarcinoma cells, SW620. DNA repair pathwayas were studied in Saccharomyces cerevisiae deficient in base excision repair (BER), nucleotide excision repair (NER), homologous recombination (HR), non-homologous end joining (NHEJ) and translesion synthesis (TLS). To investigate the overlapping of DNA repair pathways, we employed quadruple mutants in BER and NER, HR or TLS. Results in human tumor cells showed that both 5-FU and FdUMP induce cell death by apoptosis. When we investigated the cell cycle progression, we observed that 5-FU lead G1 arrest, while FdUMP induced G2 arrest. In order to investigate if these arrests would be related to DNA breaks, alkaline comet assay, fosforilation of H2AX histone and micronucleus assay were employed. We observed that both drugs induce DNA fragmentation, since single strand breaks and micronucleus were evidenced. Thus, the difference in cell cycle progression is not related to the ability of 5-FU and FdUMP in induce breaks. This way, we suggest that the differential effect of 5-FU and FdUMP in cell cycle progression depends on the type of lesion originated by drugs and the DNA repair pathways implicated in recognize them. By employing S. cerevisiae strains proficient and deficient in DNA repair treated with 5-FU and FdUMP, it was observed that Apn1 protein is extremely important in repairing these lesions, since apn1Δ was the most sensitive of all mutants employed and ntg1Δntg2Δapn1Δ showed high sensitivity to treatments with both drugs. Lesions caused by 5-FU would be recognized mainly by Ntg2, what results in significant sensitivity in ntg2Δ and ntg1Δntg2Δ. However, for recognition of FdUMP damage it is necessary the participation of both Ntg1 and Ntg2, as observed in high sensitivity of ntg1Δntg2Δ double mutant. Deficiencies in Ung1 and Rad27 did not reveal significant differences in relation to WT, as well as mutants in NER (rad1Δ e rad10Δ), HR (rad52Δ), NHEJ (rad50Δ) e TLS (rev1Δ e rev3Δ), for both drugs. When we employed quadruple mutants, we verified that ntg1Δntg2Δapn1Δrad52Δ showed higher sensitivity when treated with 5-FU. These data suggest that damage generated by 5-FU could be recognized and removed by DNA glycosylases Ntg2 and AP endonuclease Apn1 from BER, generating DNA single and double strand breaks, that could be repaired by HR (RAD52 Type). However, for FdUMP, we did not observe significant differences in comparison to WT. By investigating the sensitivity of ntg1Δntg2Δapn1Δrad1Δ and ntg1Δntg2Δapn1Δrev3Δ, we observed that they were not sensitized by FdUMP, however, they present a slight sensitivity when treated with 5-FU. These results lead us to suggest that a small part of AP sites generated by 5-FU could be processed by NER and TLS, and HR would be the most significant. Lesions by FdUMP would be repaired mainly by BER, with participation of Ntg1, Ntg2 and Apn1, however, we can not discharge the possible involvement of mismatch repair pathway - MMR, since we previous observed G2 arrest in SW620 human colon adenocarcinoma cells.

FLORÊNCIO, K. G. D. Piericidina A1 de Streptomyces SP. recuperada de sedimento do arquipélago Fernando de Noronha altera fenótipo de células tumorais. 2017. 100 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Faculdade de Farmácia, Odontologia e Enfermagem, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. / Submitted by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-02-14T15:52:00Z No. of bitstreams: 1 2017_dis_kgdflorencio.pdf: 2180779 bytes, checksum: 81aa72b2692c21ed2525d3bbcdec95ec (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes (erikaleitefernandes@gmail.com) on 2017-02-14T15:52:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_dis_kgdflorencio.pdf: 2180779 bytes, checksum: 81aa72b2692c21ed2525d3bbcdec95ec (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-14T15:52:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_dis_kgdflorencio.pdf: 2180779 bytes, checksum: 81aa72b2692c21ed2525d3bbcdec95ec (MD5) Previous issue date: 2017-01-30 / Cancer is a major health problem and presents great biological complexity, making it extremely difficult to develop effective therapeutic strategies to treatment of the disease, especially in advanced stages. Natural products play an important role in pharmacology because of the notorious contribution to the development of drugs as pharmacological tools. The marine sediment is a profitable source of microorganisms that produce secondary metabolites with biomedical properties, and the actinomycetes, Gram-positive bacteria, are excellent producers of compounds with diverse biological activities. In this work, the pharmacological potential of the microbiota recovered from the marine sediment collected in Fernando de Noronha Archipelago was investigated in tumor cells in culture. Sixteen actinomycete lineages were isolated, 7 of which yielded cytotoxic crude extracts (inhibition of growth > 75%) in human colorectal cancer cells HCT-116. The mean inhibitory concentration (IC50) values of the crude extracts varied from 0.06 to 10g/mL. The BRA-399 strain, identified as Streptomyces sp., presented the highest potency (IC50 = 0.06g/mL) and was selected to proceed with the purification of the active principle and characterization of the biological effect in tumor cells. Through a bioguided chemical fractionation, Piericidin A1 (PA1) was isolated, and other molecules of the same class were identified. The cytotoxicity of PA1 was then investigated in 2 tumoral lineages, HCT-116 and in murine metastatic melanoma (B16-F10). The MTT, SRB, cell count and membrane integrity by cytometry assays were performed with both cell lines to obtain a cell proliferation inhibition profile caused by PA1 at 24, 48 and 72h. The results showed cell proliferation inhibition in both lineages at the highest tested concentrations (between 3.8nM and 12M). Lower concentrations (0.1 to 24pM) inhibited proliferation in HCT-116 cells, but not in B16-F10 cells. Despite the unique potency, cells had the membrane integrity preserved at almost all concentrations, except the greater, 12M. PA1 blocks the complex I of the electron transport chain, and the change in the energy metabolism is a hallmark of tumor cells involved in tumor agressiveness. From these observations, some experiments were carried out to evaluate the influence of PA1 on the agressiveness of tumor cells (HCT-116 and B16-F10) in the concentration of 500fM. Cells pretreated with PA1 showed an increase in IC50 compared to treatment with the chemotherapeutic doxorubicin. Treatment with PA1 also increased the cell migration rate in B16-F10, as well as induced morphological alterations compatible with greater migratory activity cells, reinforcing the hypothesis that the alteration caused by PA1 in the tumor cell metabolism may induce alteration in their phenotype. / O câncer é um grande problema de saúde e apresenta grande complexidade biológica, tornando extremamente difícil o desenvolvimento de estratégias terapêuticas eficazes para tratamento da doença sobretudo em estados avançados. Os produtos naturais desempenham um papel relevante na farmacologia pela notória contribuição para desenvolvimento de fármacos como de ferramentas farmacológicas. O sedimento marinho é uma fonte profícua de microrganismos produtores de metabólitos secundários com propriedades biomédicas e os actinomicetos, bactérias Gram-positivas, são excelentes produtores de compostos com diversas atividades biológicas. Neste trabalho, o potencial farmacológico da microbiota recuperada do sedimento marinho coletado no Arquipélago Fernando de Noronha foi investigado em células tumorais em cultura. Dezesseis linhagens de actinomicetos foram isoladas, sendo que 7 renderam extratos brutos (EB) citotóxicos (inibição do crescimento > 75%) em células de câncer colorretal humano HCT-116. Os valores de concentração inibitória média (CI50) dos EBs variaram de 0,06 a 10 µg/mL. A linhagem BRA-399, identificada como Streptomyces sp., apresentou a maior potência (CI50 = 0,06 µg/mL) e foi selecionada para prosseguir com a purificação do princípio ativo e caracterização do efeito biológico em células tumorais. Através de um fracionamento químico bioguiado com diferentes polaridades, isolou-se a Piericidina A1 (PA1), e outras moléculas da mesma classe foram identificadas. A citotoxicidade da PA1 foi então investigada em 2 linhagens tumorais, HCT-116 e em melanoma metastático murino (B16-F10). Os ensaios do MTT, do SRB e de contagem de células e integridade de membrana por citometria foram realizados com ambas linhagens celulares para se obter um perfil de inibição da proliferação celular causado pela PA1 após 24, 48 e 72h. Os resultados mostraram inibição da proliferação celular em ambas linhagens nas concentrações mais altas testadas (entre 3,8 nM e 12 µM). Nas concentrações mais baixas (entre 0,1 aM e 24 pM) houve inibição da proliferação na linhagem HCT-116, mas não em B16-F10. Apesar da potência singular, as células tinham a integridade da membrana preservada em quase todas as concentrações, exceto a maior de 12 µM. A PA1 é um bloqueador do complexo I da cadeia transportadora de elétrons e a alteração do metabolismo energético é uma característica das células tumorais envolvida com a agressividade do tumor. A partir destas observações alguns experimentos foram realizados para avaliar a influência da PA1 na indução de alterações fenotípicas associadas à agressividade nas duas linhagens tumorais utilizadas (HCT-116 e B16-F10) na concentração de 500 fM. As células pré-tratadas com PA1 apresentaram aumento da CI50 frente ao tratamento com o quimioterápico doxorrubicina. O tratamento com PA1 também aumentou a taxa de migração celular em B16-F10, bem como induziu alterações morfológicas compatíveis com células com maior atividade migratória, reforçando a hipótese de que a alteração causada pela PA1 no metabolismo da célula tumoral pode induzir alteração no fenótipo destas.