Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:09Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-11-05Bitstream added on 2014-06-13T20:33:53Z : No. of bitstreams: 1 ferreira_rm_me_jabo.pdf: 510263 bytes, checksum: 543073ee3d6f55d77bb1607889dc966f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancro cítrico está entre as principais doenças que afetam a produção de laranjas no Brasil e é causado pela bactéria fitopatogênica gram-negativa Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). O presente trabalho teve por objetivo analisar a expressão diferencial de proteínas secretadas pela bactéria selvagem e por um mutante (02H02) assintomático, que teve a proteína HrpB4, que participa de seu sistema de secreção tipo III (SSTT) inativada, em condição de cultivo em meio rico CN e em meio XAM1 indutor de hipersensibilidade e patogenicidade (genes hrp). As proteínas secretadas em meio de cultura foram extraídas pela ação do ácido tricloroacético (TCA) e identificadas através de espectrometria de massas. Tais análises identificaram 55 proteínas diferentes secretadas em ambos os meios de cultura, tanto para Xac quanto para 02H02, de modo que 13 destas proteínas são comuns entre a Xac e seu mutante cultivados em XAM1 e 14 são exclusivas para Xac cultivada em XAM1, as quais deixaram de ser secretadas no 02H02. Proteínas relacionadas aos genes reguladores do SSTT foram detectadas em condição infectante para ambas as bactérias, demonstrando a eficácia do meio de cultura XAM1 em induzir Hrp. Foi observado que diversas proteínas secretadas pelo sistema de secreção tipo II (SSTD) em condição infectante para Xac e seu mutante possuem um papel ativo na degradação das paredes celulares do hospedeiro e podem ser reguladas por proteínas controladoras do SSTT. Fatores de sinalização difusíveis produzidos por Xac aparentemente sofreram alteração em sua secreção no mutante devido à inativação do pilus do SSTT, demonstrando a relação dessa molécula com o SSTT. A não detecção de proteínas secretadas diretamente pelo SSTT denota que as mesmas podem estar sendo secretadas no interior de vesículas lipídicas de membrana externa, assim como ocorre em Xanthomonas campestris / Citrus canker is among the major diseases which affect citrus production in Brazil and is caused by the gram-negative phytopathogenic bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (Xac). This work aimed to analyze the differential expression of secreted proteins by the wild bacterium and by an asymptomatic mutant (02H02), lacking the type III secretion system (TTSS) protein HrpB4, in rich cultivation medium NB and in the hrp inducing medium XAM1. The proteins secreted in all culture media have been extracted by trichloroacetic acid based protocols (TCA) and identified using mass spectrometry. The analysis identified 55 different proteins secreted in both culture medium for Xac and 02H02, of which 13 are common among Xac and its mutant cultivated in XAM1 and 14 proteins are exclusively secreted by Xac cultivated in XAM1. Proteins related to the TTSS regulatory genes have been detected in infecting condition in both bacteria, showing the effectiveness of XAM1 hrp inducing medium. It has been observed that several type II secretion system’s secreted proteins showed an active role in host cell wall degradation and may be regulated by type III secretion system’s proteins in Xac and 02H02 in infecting condition. Diffusible signal factors produced by wild Xac apparently suffered an altered secretion in the mutant due the inactivation of the type three secretion system’s pilus, showing the relationship of this molecule with this secretion system. The lack of detection of proteins secreted by the TTSS denote that these proteins may be secreted in the interior of outer membrane lipid vesicles, just like it was verified in Xanthomonas campestris

Submitted by Livia Mello (liviacmello@yahoo.com.br) on 2016-09-22T12:11:52Z No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T14:38:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-10-10T14:38:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-10T14:38:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissAVA.pdf: 2653238 bytes, checksum: 6ed4edf2962eb1273324c54a2e900fa6 (MD5) Previous issue date: 2015-03-03 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Citrus canker imposes damages to citriculture by causing drop in productivity and fruit quality and the absence of effective control and cure. Thus, the economic potential of citrus is limited in part by this disease mainly caused by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (XAC) that presents the greatest virulence and broad spectrum of citrus hosts, compared to bacteria Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii types B (XauB) and C (XauC). In a proteomic analysis previously performed by our research group, periplasmic trehalase was identified as a protein which expression differed between XAC e XauC in an in vitro induction of pathogenicity. Trehalase is an enzyme that catalyzes hydrolysis reaction of trehalose, a disaccharide composed of two glucose units, which role in the plant-pathogen interaction is poorly understood. One of the objectives of the study was to obtain this enzyme in purified form using an IPTG-inducible heterologous expression system in E. coli, for purposes of partial characterization of its structure and activity. The recombinant XAC periplasmic trehalase is a monomer bearing wide pH stability and showed Michaelian kinetics. The Michaelis-Menten constant (Km) for trehalose was 0,124 ± 0,015 mM and Vmax 17,319 ± 0,035 μMol glucose.min-1.mg protein-1 . Circular dichroism spectroscopy indicated the following composition of secondary structures: 42.7% α-helices and 13% β-sheets. A gene knockout method based on double homologous recombination between the genomic DNA and suicide vector pNPTS138 has made possible to obtain a strain deleted in the gene encoding the periplasmic trehalase (XACΔ0604), which enabled to evaluate the relationship between this gene and the XAC pathogenicity in Citrus aurantifolia. Infiltrated leaves with XACΔ0604 showed drenching and necrosis of plant tissue and intense brownish pustules compared with wild XAC, suggesting greater virulence of the mutant strain. The periplasmic trehalase activity was compared in XAC and XauC cell extracts from two culture mediums, non-pathogenicity-inducing (CN) and pathogenicity-inducing (XAM-M). Interestingly, XauC has showed higher enzyme activity compared to XAC in XAM-M. Thus, the noticeable higher XACΔ0604 pathogenicity and the greater activity of XauC periplasmic trehalase compared to XAC are indicatives that trehalose may promote pathogenicity. / O cancro cítrico impõe prejuízos ao setor citricultor por ocasionar queda na produtividade e qualidade dos frutos e pela ausência de medidas eficazes de controle e cura. Assim, o potencial econômico dos citros é limitado, em parte, por essa doença causada principalmente pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (XAC), que apresenta maior virulência e largo espectro de hospedeiros cítricos, comparativamente às bactérias Xanthomonas fuscans subsp. aurantifolii tipos B (XauB) e C (XauC). Em um trabalho de análise proteômica anteriormente realizado por nosso grupo de pesquisa, a trealase periplasmática foi identificada como uma proteína cuja expressão foi diferencial entre XAC e XauC, em condição de indução da patogenicidade in vitro. A trealase é uma enzima que catalisa a reação de hidrólise da trealose, um dissacarídeo formado por duas unidades de glicose, cujo papel na interação planta-patógeno é ainda pouco compreendido. Um dos objetivos do trabalho foi obter esta enzima purificada, utilizando um sistema de expressão heteróloga induzível por IPTG (isopropil-β-D-tiogalactosídeo) em E. coli, para fins de caracterização parcial da sua estrutura e atividade. A trealase periplasmática de XAC de origem heteróloga apresentou-se como um monômero relativamente estável em relação ao pH, e de cinética Michaeliana,. A constante de Michaelis-Menten (Km) da enzima para a trealose foi de 0,124 ± 0,015 mM e a Vmáx 17,319 ± 0,035 μMol de glicose.min-1.mg de proteína-1. Análise de dicroísmo circular resultou na seguinte composição de estruturas secundárias: 42,7 % de α-hélices e 13 % de folhas-β. Uma metodologia de nocaute gênico baseada na dupla recombinação homóloga entre o DNA genômico e o vetor suicida pNPTS138 viabilizou a obtenção de uma linhagem mutante deletada no gene que codifica a trealase periplasmática (XAC∆0604), o que possibilitou avaliar a relação entre tal gene e a patogenicidade de XAC em Citrus aurantifolia. Folhas infiltradas com a suspensão de XAC∆0604 apresentaram maior encharcamento e necrose do tecido vegetal, além de intensas pústulas acastanhadas quando comparadas com as folhas infiltradas com XAC selvagem, sugerindo maior virulência da linhagem mutante. A atividade da trealase periplasmática foi comparada em extratos celulares brutos provenientes de cultivos de XAC e XauC em dois meios de cultura, não-indutor de patogenicidade (CN) e indutor de patogenicidade (XAM- M). A bactéria XauC apresentou maior atividade enzimática de trealase em relação à XAC em XAM-M. Sendo assim, a acentuada patogenicidade de XAC∆0604 em relação à linhagem selvagem XAC e a maior atividade da trealase periplasmática de XauC em relação à XAC reforçam os recentes trabalhos que indicam a trealose como promotora da patogenicidade em fitopatógenos.

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-17T23:36:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Domingues_MarianeNoronha_D.pdf: 24489370 bytes, checksum: 8029060db192a79e81b19764465f2ca7 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O cancro cítrico, causado pelo fitopatógeno Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), constitui uma doença que afeta a maioria das espécies do gênero Citrus ocorrendo praticamente em todos os continentes e se destaca como uma ameaça à citricultura brasileira. A bactéria utiliza a proteína efetora do tipo III PthA para modular a transcrição na planta hospedeira e promover o desenvolvimento dos sintomas da doença. PthA pertence a família AvrBs3/PthA e contém um domínio central de repetições de 34 aminoácidos que media interações proteína-proteína e proteína-DNA. Elucidar como a PthA ativa a transcrição é de grande importância para o esclarecimento do seu modo de ação e da patogenicidade de Xac. Este trabalho teve como principal objetivo confirmar in vivo e in vitro interações entre PthA de Xac e proteínas de laranja doce selecionadas num screening de duplo-híbrido em leveduras. Além da interação com a proteína ?-importina, conhecida por mediar a importação nuclear de AvrBs3, são descritas neste trabalho interações de PthA com proteínas de citros envolvidas no enovelamento e ubiquitinação do tipo K63. PthAs 2 e 3 interagem preferencialmente com uma ciclofilina (Cyp) de citros e com TDX, uma proteína que contém um domínio tetratricopeptídeo (TPR) e um domínio tiorredoxina (TRX). Constatou-se que PthAs 2 e 3, e não 1 e 4, interagem com um complexo de conjugação a ubiquitina formado por Ubc13 e uma enzima de conjugação a ubiquitina variante (Uev) requerido para o processo de ubiquitinação K63 e no reparo de DNA lesionado. Cyp, TDX e Uev interagem entre si e as proteínas Cyp e Uev estão localizadas no núcleo de células de planta, assim como as variantes de PthA de Xac. Além disso, Ubc13 e Uev complementam o fenótipo de reparo no DNA de cepas de leveduras mutantes, indicando que estão envolvidas em processos de ubiquitinação K63 e reparo no DNA. Como PthA2 afetou o crescimento de cepas de levedura na presença de um agente alquilante do DNA, sugere-se que PthA2 inibe ubiquitinação K63 requerida em vias de reparo aos danos no DNA, e não é alvo deste processo como acreditava-se inicialmente. A proteína Cyp de citros também foi capaz de complementar o fenótipo de leveduras mutantes na maquinaria transcricional, de tal forma que PthAs poderiam aumentar as taxas de transcrição através da modulação da atividade de um complexo proteico associado com controle da transcrição / Abstract: Citrus canker, caused by the pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is a disease that affect most species of the genus Citrus occurring in virtually every continent, and stands as a threat to the Brazilian citrus industry. The bacterium uses a type III effector protein PthA to modulate transcription in the host plant and promote the development of disease symptoms. PthA proteins belong to the AvrBs3/PthA family and carry a domain comprising tandem repeats of 34 amino acids that mediates protein-protein and protein-DNA interactions. Elucidate how PthA activates transcription is of great importance for the elucidation of its mode of action and pathogenicity of Xac. This study aimed to confirm in vivo and in vitro interactions between Xac protein PthA and sweet orange proteins in a yeast two-hybrid screening. Here, in addition to the interaction with the ?- importin protein, known to mediate the nuclear import of AvrBs3, we described new interactions of PthAs with citrus proteins involved in folding and K63-linked ubiquitination. PthAs 2 and 3 preferentially interact with a citrus cyclophilin (Cyp) and with TDX, a tetratricopeptide domaincontaining thioredoxin. It was found that PthAs 2 and 3, but not 1 and 4, interact with the ubiquitinconjugating enzyme complex formed by Ubc13 and ubiquitin-conjugating enzyme variant (Uev), required for K63-linked ubiquitination and DNA repair. We show that Cyp, TDX and Uev interact with each other, and that Cyp and Uev localize to the nucleus of plant cells. Furthermore, the citrus Ubc13 and Uev proteins complement the DNA repair phenotype of the yeast mutants, strongly indicating that they are also involved in K63-linked ubiquitination and DNA repair. How PthA2 affected the growth of yeast cells in the presence of a DNA damage agent, suggests that PthA2 inhibits K63-linked ubiquitination required for DNA repair, and is not the target of this process as it was believed initially. The citrus protein Cyp was also able to complement the phenotype of yeast mutants in the transcriptional machinery, such that PthAs could increase the rates of transcription by modulating the activity of a protein complex associated with control of transcription / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-07T07:02:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camillo_LucianaRodrigues_M.pdf: 5919875 bytes, checksum: 5cf571ac0a143a68d6340c3ad3c97f49 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A doença cancro cítrico, causada pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), emergiu como uma das principais ameaças à citricultura brasileira pois afeta todas as variedades comerciais de citros, diminuindo a produção e qualidade dos frutos e podendo se dispersar rapidamente em áreas de cultivo de citros. Entre os gêneros de Xanthomonas, foram encontrados muitos genes associados com patogenicidade e virulência, entretanto, pouco se conhece sobre os mecanismos envolvidos nas interações entre Xac e laranjeira e os genes envolvidos no desenvolvimento dos sintomas do cancro cítrico em folhas de citros (Citrus sinensis) em resposta à infecção por Xac. Neste trabalho, foi analizada a expressão diferencial de genes envolvidos no desenvolvimento do cancro cítrico em folhas de laranja, em resposta à infecção por Xac. Para tanto foram construídas duas bibliotecas de Hibridização Subtrativa Suprimida (SSH) com mRNAs de folhas infiltradas com Xac ou H20 após 10 dias de inoculação. O "screnning" das bibliotecas foi feito por dot blot e 17 genes diferencialmente expressos foram sequenciados e identificados por homologia no banco de dados ncbi-BLAST contra o banco de dados de EST de citros. A expressão gênica diferencial foi analizada por Northern Blot e PCR em tempo real (qPCR). Para complementar nossos dados, a expressão dos 17 genes diferenciais foi aI).alisada a partir de cDNAs de folhas de citros que foram infiltradas com Xac, H20 ou Xanthomonas axonopodis pv. aurantifolii (Xaa), que não é patogênica à laranja, mas causa cancro no limão galego. Nossos resultados demonstraram que Xac e Xaa induzem e reprimem o mesmo grupo de genes, porém em diferentes níveis. Nós identificamos que ambos patóg;enos alteram as vias de transdução de sinal de auxina, tráfico e fusão de vesículas, resposta de defesa e doença, síntese de proteínas e ciclo celular, metabolismo de carbono-nitrogênio e metabolismo secundário. A análise desses genes poderá ser de grande importância para o entendimento dos eventos que levam ao desenvolvimento dos sintomas do cancro / Abstract: The citrus canker disease, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), has emerged as one of the major threats to the Brazilian citriculture because it affects all commercial citrus varieties, decreases the production and quality of the fruits and can spread rapidly in the citrus growing areas. The symptoms include canker lesions, leading to abscission of fruits and leaves and general tree decline. Within the genus Xanthomonas, several genes have been found associated with pathogenicity and virulence. However, little is known about the mechanisms involved in the Xac- citrus interaction and the development of the canker disease. In this work we analyzed the differential expression of genes involved in the development of the canker disease in sweet orange (Citrus sinensis) leaves in response to Xac infection. Therefore we constructed two Supression Subtracted Hybridization (SSH) libraries with mRNA from leaves infiltrated with Xac or water after 10 days of inoculation. The libraries were screnned by dot blot and the 17 differentially expressed genes were sequenced and identified through BLAST searches against the Citrus EST and protein databases. The differential gene expression was evaluated by Northem blot and Real Time PCR (qPCR). To complement our analysis, the expression of 17 genes was compared in cDNA samples from citrus leaves that had been infilt:r:ated with Xac, water or X axonopodis pv. aurantifolii (Xaa), wich is not pathogenic to orange but causes canker in key lime. Our results show that Xac and Xaa induce and repress a similar set of genes, however at different leveis. We found that both pathogens altered the pathways of auxin transport and signaling, vesicle trafficking and transport, cell cycle and protein synthesis, photorespiration and disease response. Further analysis of these genes will be of great importance to understand the events triggering the development of the canker symptoms / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

O cancro cítrico, causado por Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), é um dos mais graves problemas fitossanitário da citricultura brasileira. Com a introdução da lagarta minadora dos citros (Phyllocnistis citrella [LMC]), houve um aumento drástico do número de focos do cancro cítrico, além da mudança do padrão espacial de fortemente agregado para moderadamente agregado e ao acaso. Foram avaliados: (1) suscetibilidade de três condições foliares: folha intacta, ferimento mecânico e injúria de LMC nas fases ovo, 1º ínstar, 3º ínstar e pupa, inoculados em diferentes concentrações de Xac (101, 102, 104 e 106 ufc/ml); (2) período de suscetibilidade da folha intacta, do ferimento mecânico e injúria de LMC inoculados a 106 ufc/ml; e (3) efeito da temperatura (12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 e 42°C) e duração do molhamento foliar (0, 4, 8, 12, 16, 20 e 24 h) em folhas sem ferimento inoculadas a 106 ufc/ml. A concentração mínima de inóculo para causar sintomas da doença em folha intacta, injúria de LMC fase ovo e 1º ínstar foi de 104 ufc/ml; em ferimento mecânico e injúria de LMC fase 3º ínstar e pupa, 102 ufc/ml. Injúria da fase pupa resultou em grande severidade do que nos demais tratamentos a 106 ufc/ml (2 vezes maior do que em folha intacta).O período de suscetibilidade da injúria de LMC foi seis vezes mais longo do que do ferimento mecânico e a máxima suscetibilidade foi três vezes maior que em folha intacta. A LMC está relacionada com o aumento do dano que expõem mesofilo foliar à infecção direta de Xac, aumentando a suscetibilidade da folha por longo período. A faixa de temperatura ótima para o desenvolvimento do cancro cítrico foi de 25-35ºC. Entretanto, a severidade foi mais alta entre 30-35ºC. Sintomas de cancro não desenvolveram a 42ºC e na ausência de molhamento foliar. O efeito da temperatura foi maior do que a duração do molhamento foliar. A mínima duração de molhamento para infecção de Xac foi menor que 4 horas. / Asiatic citrus canker, caused by X. axonopodispv.citri (Xac), is one of the most serious phytosanitary problems in Brazilian citrus crops.The introduction of the citrus leafminer (Phyllocnistis citrella [CLM]), has resulted in an increase in the number of disease foci and has changed the spatial pattern of citrus canker symptomatic trees from strong aggregation to intermediate aggregation and random patterns. We evaluated: (1) susceptibility of three distinct leaf condition: intact leaves, mechanical wounding, and injury caused by CLM at the egg stage, 1st instar, 3rd instar, and pupal stage, inoculated at different concentration of Xac (101, 102, 104, and 106 cfu/ml); (2) susceptibility period of intact leaves, mechanical wounding, and CLM injury inoculated at 106 ufc/ml; and (3) effect of temperature (12, 15, 20, 25, 30, 35, 40 and 42°C) and leaf wetness durations (0, 4, 8, 12, 16, 20, and 24 h) on unwounded leaves inoculated at 106 ufc/ml. The minimum inoculum concentration to cause symptom development in intact leaves, CLM injury at the egg stage and 1st instar was 104 cfu/ml; in mechanically wounded leaves and CLM injuries at the 3rd instar and pupa stage, 102 cfu/ml. The injuries from pupa stage resulted in greater disease severity than other treatments at 106 cfu/ml (two times higher than in the intact leaf). Susceptibility period of CLM injury was six time longer than mechanical wounding and maximum observed susceptibility was three times higher than intact leaf. CLM is related to the amount of damage that exposes mesophyll cells to direct Xac infection, increasing the susceptibility of leaf for long period. Optimal temperature for development of citrus canker was 25–35°C. However, disease severity was highest in the range 30–35°C. Symptoms did not develop at 42°C and zero hour of leaf wetness duration. Effect of temperature was .greater than leaf wetness duration. The minimum wetness duration for Xac infection was as short as 4 h.

Molibdênio é um elemento traço envolvido na fixação de nitrogênio, enxofre e carbono. Oligopeptídeos estão envolvidos na nutrição bacteriana e diversos outros processos de sinalização intercelular. O objetivo do presente estudo foi investigar o papel funcional das proteínas ligadoras dos sistemas de captação de molibdato (ModA) e oligopeptídeo (OppA) em Xanthomonas axonopodis pv. citri em condições in vitro e in vivo. O mutante ModA mostrou uma produção diminuída de goma xantana, alteração do biofilme e adesão prejudicada em condições in vitro. In vivo a interação do mutante modA mostrou alterações nas lesões causadas em folhas de grapefruit possivelmente resultado da baixa expressão do gene gumB. O mutante na proteína OppA apresentou células mais co-agregadas alterando a estrutura do biofilme e consequentemente diminuindo sua capacidade de adesão. In vivo, a linhagem mutante não alterou o fenótipo de patogenicidade, mas a sua capacidade de crescimento foi afetada no início da fase estacionária sugerindo que o sistema Opp desempenha um papel nutricional. / Molybdenum is a trace element involved in nitrogen fixation, sulfur and carbon. Oligopeptides are involved in bacterial nutrition and several other intercellular signaling processes. The aim of this study was to investigate the functional role of binding proteins of molybdate (ModA) and oligopeptide (OppA) uptake systems of Xanthomonas campestris pv. citri in in vitro and in vivo conditions. ModA mutant showed a decreased production of xanthan gum, altered biofilm and adhesion impaired in vitro conditions. In vivo ModA mutant interaction showed changes in injuries on leaves of grapefruit possibly due to low expression of the gumB gene. The OppA mutant showed more cells co-aggregated by changing the structure of the biofilm and consequently reducing their capacity to adhere. In vivo, the mutant strain did not modify the phenotype of pathogenicity, but its ability for growth was affected at the early stationary phase suggesting that the Opp system plays a nutritional role.

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T05:56:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_AndreLuizAraujo_D.pdf: 43759919 bytes, checksum: 379266575f1db46c7d620232efb9ba13 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O cancro cítrico resulta da interação compatível entre a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri e Citrus spp. A doença não tem cura, é de fácil disseminação e difícil controle. O cenário é preocupante, pois a doença diminui drasticamente o rendimento e a qualidade dos frutos de plantas infectadas, ocasionando um forte impacto econômico na citricultura mundial. Os principais sintomas do cancro cítrico, resultantes dos processos de hipertrofia (aumento do volume celular) e hiperplasia (aumento da divisão celular), são dependentes da proteína efetora PthA de X. citri. PthA integra a família de fatores de transcrição conhecida como efetores ativadores de transcrição (transcription activator-like ou TAL). O principal homólogo de PthA é o efetor AvrBs3 de X. campestris pv. vesicatoria que atua regulando a transcrição de genes do hospedeiro em benefício do patógeno. A similaridade entre estas proteínas gira em torno de 97%, sugerindo, portanto, função semelhante para PthA. Através de uma série de microarranjos, investigou-se o perfil de expressão gênica de laranja doce (Citrus sinensis) dependente de PthA (X. citri) e de PthCs de X. aurantifolii, uma bactéria que causa cancro cítrico apenas no limão galego e que, em laranja doce, induz uma reação de hipersensibilidade. Desta forma, verificou-se a regulação positiva ou negativa de uma série de genes. Os PthCs regularam negativamente genes associados à sinalização por auxina e induziram a expressão de genes de defesa e silenciamento gênico. Em contrapartida, PthAs induziram uma série de genes intimamente relacionados aos sintomas de cancrose, incluindo: genes associados aos processos de aumento e divisão celular, síntese e remodelamento de parede celular, bem como genes envolvidos na sinalização por auxina e giberelina. Neste sentido, efetuou-se o isolamento de regiões promotoras de cinco genes, os quais são potencialmente regulados por PthA. A análise destas regiões revelou a presença de um possível TATA-box notavelmente semelhante àquele encontrado no gene upa20, denominado UPA-box (up-regulated por AvrBs3), sugerindo que estes genes poderiam ser transativados por PthA em citros. De fato, ensaios de retardamento de mobilidade eletroforética (electrophoretic mobility shift assay ou EMSA), demonstraram a ligação específica de PthA2 e 4 ao TATA-box encontrado na região promotora do gene que codifica uma proteínas relacionada à patogênese (pathogenesis-related proteins ou PR). Este resultado corrobora com a hipótese de que os efetores TAL atuam como proteínas ligadoras de elementos TATA. Finalmente, experimentos de co-imunoprecipitação de cromatina (ChIP) e cotransformação demonstraram, ainda que em resultados preliminares, que particularmente PthA4 é capaz de transativar pr5 in planta. Embora o cancro cítrico ainda não seja completamente entendido a nível molecular, os dados aqui apresentados sugerem fortemente a ação de PthAs como fatores de transcrição, bem como aponta candidatos à regulação positiva intimamente associados aos processos de hipertrofia e hiperplasia. Além disso, as regiões promotoras aqui isoladas podem ajudar no desenvolvimento de novas estratégias para a geração de plantas resistentes à cancrose / Abstract: Citrus canker is a result of a compatible interaction between Xanthomonas axonopodis pv. citri and Citrus spp. There is no cure for citrus canker, and the disease is easily spread and difficult to be managed. The scenario is threatening since the disease dramatically diminishes the quality of fruits in infected plants leading to great economic losses for the world citrus producers. The main citrus canker symptoms known as hypertrophy (cell enlargement) and hyperplasia (cell division) are PthA-dependent. PthA is an effector protein from X. citri which belongs to the TAL effectors (transcription activatorlike) family. The closest homologue of PthA is AvrBs3 from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, a TAL effector that acts as a transcriptional factor to modulate host transcription to the pathogen's benefit. Similarity shared by these two proteins is around 97%, suggesting that PthA plays a similar role in the citrus host. Through a number of microarray experiments, we investigate the gene transcription in sweet orange (Citrus sinensis) in response to the transient expression of PthA from X. citri or PthC from X. aurantifolii, pathotype C, a bacteria that causes citrus canker in Mexican lime but in orange trigger a hypersensitive response in sweet orange. We observed that PthCs down-regulated various auxin signaling genes and induced the expression of genes involved in defense and gene silencing. On the other hand, PthAs induces several genes implicated in canker development such as cell division and elongation, cell-wall synthesis and remodeling, synthesis, mobilization and signaling of auxin and gibberellin. Promoter regions of PthA-induced genes were isolated and shown to have predicted PthA and PthC binding sites at or near their putative TATA boxes. Moreover, competition gel shift assays confirmed that PthA4 shows preferential binding to the TATA box of the pathogenesis-related (pr5) gene promoter, supporting the idea that TAL effectors may act as general TATA-binding proteins. Finally, both chromatin immunoprecipitation (ChIP) and co-transformation assays demonstrated however as preliminary results, that PthA4 is able to transactivate pr5 in planta. Albeit the molecular mechanism by which citrus canker develop remains elusive at the molecular level, we provided data supporting the notion that PthA acts as a transcriptional factor, as well as identified PthA-induced genes associated with hypertrophy and hyperplasia. Furthermore, the promoter regions isolated here might be useful to obtain citrus plants resistant to the canker bacteria / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Le cuivre, souvent utilisé pour gérer les bactérioses en agriculture, est largement utilisé dans la lutte contre Xanthomonas citri pv. citri (Xcc), agent responsable du chancre asiatique des agrumes. La récente détection d’un phénotype résistant au cuivre (CuR) chez Xcc dans deux territoires ultramarins français a motivé une étude génomique qui a révélé, dans les génomes de souches CuR, la présence d’un plasmide conjugatif portant un transposon adaptatif de type Tn3. Sa conservation chez plusieurs espèces de Xanthomonas phytopathogènes suggère le rôle des transferts horizontaux (HGT) dans l’adaptation de Xcc. Nous avons donc analysé, dans l’océan Indien, les relations phylogénétiques de souches sensibles et CuR en prenant en compte à la fois les SNP et les variations de contenu en gènes. La datation de la phylogénie a permis de formuler des scenarii d’introduction de la bactérie dans la région. La phylogénie a montré une structure géographique forte à l’échelle de l’océan Indien, qui s’estompe à l’échelle de la Réunion et disparaît à l’échelle du verger. Au sein des vergers, l’admixture est un élément favorable aux HGT entre souches génétiquement différentes. Ils sont pourtant peu caractérisés chez les bactéries du genre Xanthomonas. Nous avons ainsi analysé la dispersion de l’ensemble des gènes plasmidiques connus de la famille des Xanthomonadaceae dans l’ensemble des génomes bactériens de NCBI, mettant en évidence à la fois la forte prévalence des gènes plasmidiques au sein des Xanthomonadaceae mais aussi la limite taxonomique forte à leur échange par conjugaison. L’importance du mosaïsme plasmidique, en partie lié aux éléments mobiles a aussi été illustrée. L’ensemble de nos résultats souligne l’importance des HGT dans l’évolution des bactéries du genre Xanthomonas, et la nécessité de caractériser finement le contenu et le fonctionnement du génome environnemental des Xanthomonadaceae pour appréhender au mieux l’adaptation de ces bactéries phytopathogènes. / Copper, frequently used in agriculture to control bacterial diseases, is commonly used against Xanthomonas citri pv. citri (Xcc), the bacterial agent of Asiatic citrus canker. The recent detection of a copper-resistant phenotype in two French overseas regions motivated a genomic study which revealed, in copper-resistant (CuR) strains, a conjugative plasmid encoding an adaptive transposon of the Tn3 family. Its conservation in several Xanthomonas species suggested the role of horizontal gene transfer (HGT) in Xcc adaptation. We therefore analyzed the evolutionary history of susceptible and CuR Xcc strains in the Indian Ocean using both SNP and gene content variations. The dating of the obtained phylogeny allowed us to hypothesize the history of Xcc introduction into the region. The phylogeny showed a strong geographic structure among islands of the Indian Ocean region, which faded at the Réunion scale and disappeared at the grove scale. Among the groves, admixture is a factor favoring HGT between genetically distinct strains. This form of evolution is however largely uncharacterized in the Xanthomonas genus. To fill this gap, we searched genetic homology between the whole known plasmid gene content of the Xanthomonadaceae family and the complete set of genomes hosted in NCBI databases. We highlighted both the ubiquity of plasmid genes in the Xanthomonadaceae family and the taxonomical barrier of their sharing by conjugation. The small fraction of genes that were exchanged through the complete sharing of plasmids also revealed the importance of plasmid mosaicism, partly due to mobile genetic elements. Taken together, our results highlight the importance of bacterial communities in the evolution of phytopathogenic bacteria of the Xanthomonas genus, and the need for a precise characterization of the content and the functioning of the Xanthomonadaceae environmental genome in order to fully apprehend the adaptation of these phytopathogenic bacteria.

Com clima diversificado e terras férteis, o Brasil tem vocação natural para o desenvolvimento agropecuário e todas as suas vertentes. Assim, o agronegócio é hoje a principal locomotiva da economia brasileira, representando cerca de um terço do nosso Produto Interno Bruto (PIB). Nesse contexto, o Brasil é o terceiro maior produtor de frutas do planeta, com destaque para a produção de laranjas. Particularmente, o país lidera a produção mundial de suco de laranja e conta com uma participação de 85% nas exportações deste produto. Porém, um dos principais fatores atuais que restringem os lucros e a expansão da citricultura é o controle fitossanitário. Atualmente, dentre as principais doenças podemos destacar o HLB e o cancro cítrico. Ambas, doenças bacterianas que não têm cura comprometem a produção e desenvolvimento da fruta e levam à morte da árvore. Dessa maneira, o monitoramento destas é fundamental para evitar danos aos frutos e a necessidade da erradicação de plantações inteiras. O presente trabalho avaliou o emprego das técnicas de Espectroscopia de Fluorescência Induzida por Laser (LIFS) e Espectroscopia de Emissão Óptica com Plasma Induzido por Laser (LIBS) como forma de diagnóstico destas doenças, se apresentando como uma alternativa às inspeções visuais e ao PCR utilizados atualmente. Para isso, folhas de citros in natura provenientes de plantas sadias, com HLB ou com cancro foram amostradas e medidas com ambos os sistemas. Através do sistema LIFS foi realizado um estudo de precocidade no diagnóstico do HLB. Este sistema fotônico pôde detectar a doença até 21 meses antes do aparecimento dos primeiros sintomas visuais. Foram utilizados classificadores sazonais, criados a partir de Regressão por Mínimos Quadrados Parciais (PLSR) e conjuntos de calibração previamente avaliados. Quanto ao cancro cítrico e o sistema LIFS, taxas de acerto superiores a 90% foram alcançadas nos melhores casos de validação cruzada dos dados. A diferenciação do cancro e do HLB também foi possível pela mesma técnica ao avaliar um conjunto pequeno de dados, que atingiu uma taxa de acerto de 82%. Através dos espectros obtidos pelo sistema LIBS, avaliou-se as variações nutricionais causadas na planta devido à doença. Por meio de tais variações e métodos de PLSR foi construído um modelo para o diagnóstico de HLB alcançando taxas de acerto da ordem de 75%. Em relação ao cancro cítrico e o sistema LIBS, um estudo preliminar foi realizado, e uma taxa de acerto superior a 90% foi atingida. Por fim, os resultados corroboraram com a ideia inicial de se realizar o diagnóstico do HLB e do cancro cítrico através de técnicas fotônicas. Dentre outras vantagens estas permitem uma análise rápida, in loco, sem a necessidade de preparo de amostra. Além disso, para o HLB, as técnicas fotônicas demonstraram menor sensibilidade à distribuição não homogênea da doença, quando comparada com a técnica de referência (qPCR). / The diverse climate and fertile soils make Brazil a country with a natural vocation for agricultural development. Thus, agribusiness is now the main locomotive of the Brazilian economy, accounting for about one-third of our Gross Domestic Product (GDP). In this context, Brazil is the third largest fruit producer in the world, with emphasis on the orange production. Particularly, the country leads the world production of orange juice, and with a stake of 85% in exports of this product. However, one of the main factors that restrict current profits and the expansion of citrus production is phytosanitary control. Currently, among the major diseases we highlight the HLB (Greening) and Citrus Canker, two bacterial diseases that have no cure and affect production and fruit development. Therefore, monitoring is essential to prevent damage to the fruits and the complete eradication of infected orchards. The present study evaluated the use of Laser-Induced Fluorescence Spectroscopy (LIFS) and Laser-Induced Breakdown Spectroscopy (LIBS) techniques as alternative diagnostic methods to visual inspection and PCR technique, currently used. For that, citrus leaves from healthy, HLB or citrus canker infected plants, were sampled and measured with both systems. Through LIFS system, a study of the HLB early diagnosis was done. This photonic system could detect the disease up to 21 months before the tree show the visual symptoms. Seasonal classifiers were used, which were designed from Partial Least Square Regression (PLSR) methods and calibration database previously acquired. Regarding citrus canker and LIFS system, success rates higher than 90% were achieved in the best cases. The differentiation between citrus canker and HLB was also possible using the same technique reaching a success rate around 82%. Through the spectrum obtained by LIBS system, it was evaluated the nutritional variations caused in the plant due to HLB, and based on these data, the diagnosis was done. The average success rate was 75%, which was achieved by PLSR model. Regarding on citrus canker and LIBS system, a preliminary study was carried out and a success rate greater than 90% was achieved. Finally, the results corroborated with the use of photonic techniques for the HLB and citrus canker diagnosis. Among other advantages, they allow rapid analysis, in loco and without the need of sample preparation. In addition, for the HLB, photonics techniques showed lower sensitivity to the non-homogeneous distribution of the disease when compared with the reference technique (qPCR).

Submitted by JULIE ANNE ESPÍNDOLA AMORIM (julie__anne@hotmail.com) on 2018-06-05T18:33:56Z No. of bitstreams: 1 Tese_23-03-18-final_corrigida_05-06-2018_Juliecorrigidapdf.pdf: 3073465 bytes, checksum: 1673cd431dca7fe8472ab9ce8185182f (MD5) / Approved for entry into archive by Alexandra Maria Donadon Lusser Segali null (alexmar@fcav.unesp.br) on 2018-06-05T18:59:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 amorim_jae_dr_jabo.pdf: 3073465 bytes, checksum: 1673cd431dca7fe8472ab9ce8185182f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-05T18:59:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amorim_jae_dr_jabo.pdf: 3073465 bytes, checksum: 1673cd431dca7fe8472ab9ce8185182f (MD5) Previous issue date: 2018-04-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O cancro cítrico tipo A, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (XccA), é uma das doenças de citros mais importantes, afetando todas as cultivares comerciais, para a qual não existem ainda estratégias de controle eficientes. Os genes ntrB e ntrC codificam, respectivamente, a histidina quinase (HK) e o regulador de respostas (RR), pertencentes a um sistema de dois componentes (TCSs), que atuam no sistema regulador de nitrogênio (NTR). Porém, o possível papel desses genes na virulência da XccA e de outros fitopatógenos ainda não foi elucidado. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos dos genes ntrB e ntrC no desenvolvimento do cancro cítrico em limão-cravo (Citrus limonia Osbeck), bem como a possível relação desses genes com a regulação da expressão de genes do sistema de secreção tipo 3 (SST3), considerado um dos principais fatores de virulência da XccA. Os mutantes ΔntrB e ΔntrC foram obtidos pela técnica de mutagênese sítio-dirigida por reação em cadeia da polimerase de extensão por sobreposição. A mutação dos genes causou redução na sintomatologia do cancro cítrico e diminuição da população bacteriana no espaço intercelular do tecido foliar da planta. A análise das curvas de crescimento in vitro revelou que a ausência do gene ntrB não alterou a viabilidade da bactéria, enquanto a mutação do gene ntrC afetou o “fitness” bacteriano em meio de cultura NB. Análises in vitro indicaram que o mutante ΔntrC formou duas vezes mais biofilme e produziu cinco vezes mais goma xantana do que a XccA 306 in vitro. A expressão dos genes (hpa1, hrpG, hrpX, hrpE, hrpW e hrpD6) do SST3 avaliados foi significativamente maior (p < 0,05) no mutante ΔntrC do que na XccA 306 e no ΔntrB, indicando que ntrC possa atuar na regulação do SST3. Porém, o nível de expressão desses genes no mutante ΔntrB não apresentou diferença significativa (p > 0,05) em relação à XccA 306. A modelagem molecular revelou semelhança estrutural entre as regiões receptoras de NtrC e HrpG, sugerindo que a fosforilação de HrpG por NtrB possa ocorrer in vivo. Em síntese, os resultados obtidos neste estudo indicam que a mutação dos genes ntrB e ntrC afeta o desenvolvimento do cancro cítrico em limão-cravo e que o gene ntrC pode atuar na regulação dos mecanismos de formação de biofilme, produção de goma xantana e expressão de genes do SST3 e/ou que a ausência desse gene ocasione um desequilíbrio celular na XccA 306, resultando na alteração desses mecanismos, enquanto NtrB pode apresentar papel na regulação de genes do SST3 por meio da fosforilação de HrpG. / The citrus canker type A, provoked by the bacterium Xanthomonas citri subsp. citri (XccA), is one of themost important citrus diseases, affecting all the commercial cultivars, for which there are no effective control strategies. The ntrB and ntrC genes encode a histidine kinase (HK) and the response regulator (RR), respectively, belong to a two-component system (TCSs), related to the nitrogen regulatory system (NTR). However, the possible role of ntrB and ntrC genes in the virulence of XccA and other phytopathogens has not yet been elucidated. Therefore, the aim of this study was to investigate the impact of the ntrB and ntrC genes on the development of citrus canker in rangpur lime (Citrus limonia Osbeck), as well as the possible relation of ntrB and ntrC genes with the regulation of the type 3 secretion system (T3SS) gene expression, which is considered one of the main virulence factors of XccA. The ΔntrB and ΔntrC were obtained by site-directed mutagenesis through overlap extension polymerase chain reaction. The mutation of the ntrB and ntrC genes caused a reduction of the citrus canker symptoms, and decrease of the bacterial population in the intracellular space of the foliar tissue of the plant. In vitro growth curves analysis revealed that the ΔntrB did not affect the viability of the bacterium, whereas the ΔntrC affected the bacterial fitness in NB culture medium. In vitro analysis indicated that the ΔntrC formed 2x more biofilm, and produced 5x xanthan gum compared to the XccA 306. The T3SS related genes (hpa1, hrpG, hrpX, hrpE, hrpW and hrpD6) expression was significantly higher (p <0.05) in the ΔntrC than in the XccA 306 and the ΔntrB, indicating that ntrC can modulate the regulation of T3SS. However, the level of expression of these genes in the ΔntrB did not differ (p> 0.05) in relation to the XccA 306. Molecular modeling revealed structural similarity between NtrC and HrpG receptors motifs, suggesting that phosphorylation of HrpG by NtrB may occur in vivo. Overall, the results obtained in this study strongly suggest that the mutation of the ntrB and ntrC genes affect the development of rangpur lime citrus canker and that ntrC gene may play an important role in the regulation of the mechanisms of biofilm formation, xanthan gum production and T3SS gene expression and/or that the absence of this gene causes a cellular imbalance in XccA 306 resulting in the alteration of these mechanism, whereas the NtrB may have a role with the regulation of T3SS genes by phosphorylation of HrpG. / 3385/2013