Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T16:33:37Z No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_AmandaCassette_CPqRR2016.pdf: 28401284 bytes, checksum: 5f5576e6c7cbda5f18321ed6b3dbad38 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2016-06-29T16:33:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_AmandaCassette_CPqRR2016.pdf: 28401284 bytes, checksum: 5f5576e6c7cbda5f18321ed6b3dbad38 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-29T16:33:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_BCM_AmandaCassette_CPqRR2016.pdf: 28401284 bytes, checksum: 5f5576e6c7cbda5f18321ed6b3dbad38 (MD5) Previous issue date: 2016 / Made available in DSpace on 2016-07-22T13:27:36Z (GMT). No. of bitstreams: 3 Tese_BCM_AmandaCassette_CPqRR2016.pdf.txt: 2885 bytes, checksum: 53b9b6cc9653fe21e615e546bbbab789 (MD5) Tese_BCM_AmandaCassette_CPqRR2016.pdf: 28401284 bytes, checksum: 5f5576e6c7cbda5f18321ed6b3dbad38 (MD5) license.txt: 2991 bytes, checksum: 5a560609d32a3863062d77ff32785d58 (MD5) Previous issue date: 2016 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / A hemofilia A (HA) congênita é um distúrbio hemorrágico com transmissão hereditária ligado a deficiência do fator VIII (FVIII). O tratamento da HA é baseado na reposição do FVIII, requerendo infusões intravenosas de concentrados de FVIII exógeno. Durante o tratamento, alguns pacientes desenvolvem uma resposta imune que produz anticorpos anti-FVIII (inibidores). Os inibidores neutralizam a atividade procoagulante do FVIII e diminuem a eficiência do tratamento. Apesar da relevância dos inibidores, os mecanismos imunológicos associados aos inibidores ainda não foram completamente elucidados. Neste trabalho analisou-se o perfil de citocinas intracitoplasmáticas de células do sistema imune inato e adaptativo de pacientes com HA e inibidores [HA-FVIII(+)] e com HA sem inibidores [HA-FVIII(−)]. Os resultados mostraram uma menor frequência de monócitos e neutrófilos TNF-, monócitos IL-5eneutrófilos IL-4e uma maior frequência de neutrófilos linfócitos T CD4+, T CD8+e T CD19+IL-10em pacientes do grupo HAα-FVIII(+). Em pacientes do grupo HAα-FVIII(−) observou-se uma maior frequência de monócitos TNF-elinfócitos B IL-4e uma menor frequência de linfócitos T CD4+e T CD8+IL-10. Observou-se o predomínio de um padrão anti-inflamatório/regulador no grupo HAα-FVIII(+) e um padrão pró-inflamatório no grupo HAα-FVIII(−), sugerindo que o microambiente celular pode ser um elemento importante associado à capacidade de desenvolvimento de inibidores. Analisou-se também a presença de micropartículas plasmáticas (MPs) em pacientes com HA. Os resultados mostraram uma maior frequência de MPs derivadas de células endoteliais, granulócitos e linfócitos T em pacientes do grupo HAα-FVIII(−) e uma maior frequência de MPs derivadas de hemácias em pacientes do grupo HAα-FVIII(+). O predomínio de MPs no grupo HAα-FVIII(−) pode ser relacionado ao aumento da ativação celular e influência do microambiente pró-inflamatório. MPs derivadas de hemácias induziram a investigação da presença de anticorpos em hemácias de pacientes com HA. Os resultados demonstraram que pacientes do grupo HAα-FVIII(+) têm uma maior frequência de anticorpos na superfície de hemácias. Em função deste resultado, investigou-se a presença de anticorpos anti-FVIII em concentrados de hemácias de pacientes do grupo HA-FVIII(+). Foi possível detectar anticorpos anti-FVIII em concentrados de hemácias, sugerindo que essas células podem interagir com anticorpos anti-FVIII. Determinou-se ainda, a avidez de anticorpos anti-FVIII de pacientes do grupo HAα-FVIII(+). Os resultados demonstraram avidez superior de anticorpos IgG total e IgG1 anti-FVIII quando comparados a IgG4. Foi observada também uma correlação negativa entre os índices de avidez de anticorpos IgG4 anti-FVIII de pacientes grave saos títulos de Bethesda, sugerindo que existem variações na avidez dos anticorpos anti-FVIII dependendo do perfil dos pacientes com HA. No contexto da avaliação da resposta imune contra o FVIII, foi possível identificar biomarcadores fenotípicos celulares e humorais característicos de pacientes com e sem inibidores que podem contribuir para o monitoramento do desenvolvimento e manutenção de anticorpos inibidores do FVIII / Congenital hemophilia A (HA) is a bleeding disorder with hereditary transmission associated to deficiency of factor VIII (FVIII). The treatment of HA is based on replacement of FVIII, requiring exogenous FVIII intravenous infusions. During the treatment some patients develop an immune response that produces anti-FVIII antibodies (inhibitors). Inhibitors neutralize the procoagulant activity of FVIII and affect the treatment efficiency. Despite the relevance of inhibitors, the immunological mechanisms associated to inhibitors are still unknown. In this work, the intracytoplasmic cytokine pattern of innate and adaptive cells from patients with HA and inhibitors [HAα-FVIII(+)] and with HA and without inhibitors [HAα-FVIII(−)] was analyzed. Results showed a lower frequency of TNF-α+monocytes and neutrophils, IL-5+ monocytes and IL-4+neutrophils and an increased frequency of IL-10+neutrophils, lymphocytes T CD4+, T CD8+and T CD19+in HAα-FVIII(+) group. In HAα-FVIII(−) group was observed an increased frequency of TNF-α+monocytes and IL-4+lymphocytes B and a lower frequency of IL-10+lymphocytes T CD4+and T CD8+. A predominance of an anti-inflammatory/regulatory pattern in HAα-FVIII(+) patients and a mixed pattern, with a bias toward inflammatory cytokine profile, in HAα-FVIII(−) patients was observed. The occurrence of these profiles seems to be associated to the capacity of inhibitors development. The presence of plasmatic microparticles (MPs) in HA patients was also analyzed. The results showed increased levels of circulating MPs derived from endothelial cells, granulocytes, and T lymphocytes in patients without FVIII inhibitors and MPs from erythrocytes were higher in patients with inhibitors. The predominance of MPs in HAα-FVIII(−) patients probably was provided by the increased of cellular activation due to an inflammatory microenvironment. MPs from erythrocytes induced to the investigation of the presence of antibodies in the surface of erythrocytes of HA patients. The results demonstrated that HAα-FVIII(+) patients have a higher frequency of antibodies in the surface of erythrocytes. Due to this result, the presence of anti-FVIII antibodies in erythrocytes concentrates in HAα-FVIII(+) patients was investigated. It was possible to detect anti-FVIII antibodies in erythrocytes concentrates, suggesting that FVIII can interact with anti-FVIII antibodies. The avidity of anti-FVIII antibodies in HAα-FVIII(+) patients was also determined. Results demonstrated a high avidity of anti-FVIII total IgG and IgG1 antibodies when compared to IgG4. A negative correlation between the avidity of anti-FVIII IgG4 antibodies in severe patients and Bethesda titer was observed, suggesting that there are variations in the avidity of anti-FVIII antibodies depending on the profile of HA patients. In the context of the evaluation of the immune response directed to FVIII, it was possible to identify phenotypic cellular and humoral biomarkers profiles of patients with and without inhibitors, thereby contributing to tracking the development and maintenance of FVIII inhibitors antibodies.

VIANA, Carolina de Araújo. Caracterização bioquímica da atividade pró-coagulante de proteases de fluidos laticíferos. 2011. 119 f. Dissertação (mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-03-31T18:14:07Z No. of bitstreams: 1 2016_dis_caviana.pdf: 8725116 bytes, checksum: 767aa06f3d14be0e807d03f424c5c370 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-05-18T19:57:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_dis_caviana.pdf: 8725116 bytes, checksum: 767aa06f3d14be0e807d03f424c5c370 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-18T19:57:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_dis_caviana.pdf: 8725116 bytes, checksum: 767aa06f3d14be0e807d03f424c5c370 (MD5) Previous issue date: 2011 / Latex proteases have grown in attention because of their ability to exhibit both thrombin and plasmin-like effects. In this study, the plant latex proteins Calotropis procera (CpLP), Cryptostegia grandiflora (CgLP) and Plumeria rubra (PrLP) were investigated in terms of these activities. For both samples were investigated for their fibrinogenolytic and fibrinolytic activity in human plasma and by incubation with human fibrinogen by measuring the clotting time, electrophoretic or spectrophotometric assays and diffusion in agarose gel. In vivo effect of CpLP on clot formation of plasma of healthy and septic mice that have been experimentally infected with Salmonella enterica serovar Typhimurium was also studied. Groups of five mice were treated with CpLP (30 mg/Kg), S. enterica (107 CFU/mL) or CpLP 24 h prior bacteria. After sacrificing animals, blood samples were examined for coagulation time, platelet content and protein profile. The protein fractions of C. procera exhibiting proteolytic activity were capable to hydrolyze fibrinogen similar to thrombin, while the protein fractions of Cr. grandiflora exhibiting proteolytic activity were capable to hydrolyze fibrinogen similar to plasmin. The samples exhibited fibrinogenolytic activity in a dose and time manner, but were not able to dissolve the fibrin clot. Procoagulant activity was eliminated by inhibition of latex proteases with cysteine proteinase inhibitor E-64. Pepstatin, PMSF and EDTA were not inhibitory. Time of clot formation of plasma in septic mice and platelet content were consistently reduced as compared to healthy animals. CpLP exhibited antagonistic effects. It statistically reversed the effects of sepsis on clot-time formation associated to preservation on platelet content. However, CpLP exhibited opposite effect on non-septic mice, inducing faster clot formation, compared to healthy animals but without changing platelet content. Results reported in this work confirm fibrinogenolytic activity associated to cysteine proteases of latex and show a very intriguing in vivo protective activity of CpLP on platelet content on septic animals with apparent benefit effect against disseminated vascular coagulation, a pivotal event associated to lethal sepsis. This effect was however not observed when CpLP was given to healthy animals. / As proteases de látex têm atraído atenção devido à habilidade de exibir atividades semelhantes à trombina e à plasmina. Neste estudo, as proteínas do látex das plantas Calotropis procera (CpPL), Cryptostegia grandiflora (CgPL) e Plumeria rubra (PrPL) foram avaliadas em termos destas atividades. Para tanto, as amostras foram investigadas quanto as suas atividades fibrinogenolíticas e fibrinolíticas, em plasma humano e por incubação com fibrinogênio humano através da medida do tempo de coagulação, ensaios eletroforéticos, espectrofotométricos, ou de difusão em gel de agarose. O efeito de CpPL in vivo, sobre o tempo de coagulação no plasma de camundongos saudáveis ou sépticos, que foram experimentalmente infectados com a bactéria Salmonella enterica sorotipo Typhimurium, também foi estudado. Grupos de cinco camundongos foram tratados com CpPL (30 mg/Kg), S. enterica (107 UFC/mL) ou CpPL 24 h antes da inoculação bacteriana. Depois do sacrifício dos animais, as amostras de sangue foram examinadas quanto ao tempo de coagulação, conteúdo de plaquetas e perfil protéico. As frações protéicas de C. procera exibindo atividade proteolítica foram capazes de hidrolisar o fibrinogênio de forma similar à trombina, enquanto que as frações protéicas de Cr. grandiflora exibindo atividade proteolítica foram capazes de hidrolisar o fibrinogênio de forma similar à plasmina. As amostras exibiram atividade fibrinogenolítica de forma dose e tempo dependente, mas não foram capazes de dissolver totalmente o coágulo de fibrina. As atividades fibrinogenolíticas foram eliminadas pela inibição das proteases dos látices com E-64, um inibidor de protease cisteínica. Pepstatina, PMSF e EDTA não se mostraram inibitórios. O tempo de formação do coágulo no plasma de camundongos sépticos e o conteúdo de plaquetas foram consistentemente reduzidos quando comparados aos animais saudáveis. CpPL exibiu efeitos antagonistas. Foi capaz de reverter, estatisticamente, o efeito da sepse no tempo de formação do coágulo associado à preservação do conteúdo de plaquetas. Contudo, CpPL exibiu efeito oposto em camundongos não sépticos, induzindo rápida formação do coágulo, comparado aos animais saudáveis, porém sem alterar o conteúdo de plaquetas. Os resultados relatados neste trabalho confirmam a atividade fibrinogenolítica associada a proteases cisteínicas de látex e mostram uma efeito protetor in vivo muito intrigante de CpPL no conteúdo de plaquetas em animais sépticos, com aparentes efeitos benéficos contra a coagulação intravascular disseminada, um evento crucial associado à sepse letal. Este efeito, porém, não foi observado quando CpPL foi dado aos animais saudáveis.

Foi realizada inicialmente uma revisão sobre o processo de hemostasia, as características da hemofilia A, e os fatores que influem na formação de inibidores contra o Fator VIII, um dos principais problemas na terapêutica de reposição do mesmo em hemofílicos A graves. Posteriormente, visando verificar possíveis suscetibilidades genéticas no desenvolvimento de tais anticorpos, foram descritos estudos envolvendo 154 hemofílicos A graves localizados no Rio Grande do Sul, 47 com e 107 sem inibidores. A pesquisa envolveu 10 polimorfismos em cinco sistemas relacionados à resposta imune (IL4, IL4R, IL10, TNFα e TNFR1). Três desses polimorfismos (IL4R 1902A>G, TNFα -863A>C, e TNFR1 303A>G) nunca haviam sido estudados dentro desse contexto. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas nas prevalências desses polimorfismos entre as duas séries, em concordância com algumas, mas não todas as investigações prévias. A questão de por que alguns pacientes desenvolvem tais inibidores, mas outros não, permanece em aberto. / A review was initially made on the hemostatic process, the characteristics of hemophilia A, and the factors that influence the formation of inhibitors against Factor VIII, one of the main problems that exist in the therapeutics of its replacement in severe hemophilia A patients. Afterwords, in an attempt to verify possible genetic susceptibilities in the development of such antibodies, a description was made of studies involving 154 severe hemophilia A subjects living in Rio Grande do Sul, 47 with and 107 without inhibitors. The research included 10 polymorphisms in five systems related to the immune response (IL4, IL4R, IL10, TNFα and TNFR1). Three of them (IL4R 1902A>G, TNFα -863A>C, and TNFR1 303A>G) had never been studied in this context. No statistical significant differences were found between the two series, in agreement with some, but not all previous investigations. The question of why some, but not all severe hemophilia A patients develop anti-Factor VIII antibodies remain open.

Base Teórica. Embora vários relatos de casos tenham sugerido uma associação entre a ingesta de vitamina K e a instabilidade da anticoagulação oral, o impacto clínico de diferentes quantidades de vitamina K dietética na anticoagulação oral crônica nunca foi prospectivamente estabelecido. Métodos. Características clínicas e estimativas semi-quantitativas sobre a ingesta de vitamina K foram avaliadas, prospectivamente, em 230 visitas ambulatoriais de pacientes anticoagulados em um hospital público universitário (protocolo observacional). Treze pacientes ambulatoriais anticoagulados cronicamente e estáveis foram arrolados em um ensaio clínico randomizado cruzado de intervenção dietética de 4 dias com aumento e diminuição de 5 vezes da sua ingesta habitual de vitamina K (protocolo experimental randomizado). Resultados. Protocolo observacional: Na análise univariada, identificamos uma associação estatisticamente significativa, progressiva e inversa entre um escore global de ingesta de vitamina K e diferentes níveis de anticoagulação. Na análise multivariada, a ingesta de vitamina K dietética foi independentemente associada com níveis subterapêuticos e anticoagulação excessiva (ambos valores de p =0,04), após ajuste para escolaridade, renda, uso de novos fármacos, aderência à anticoagulação oral e intercorrências clínicas. Protocolo randomizado: Após a dieta restrita em vitamina K, observamos um aumento significativo nos valores do INR (de 2,6 ± 0,5 para 3,3 ± 1,0, p=0,03; do início para o dia 7) enquanto, após a dieta enriquecida, identificamos uma diminuição significativa e mais precoce no INR (de 3,2 ± 0,9 para 2,8 ± 0,7, p=0,005; do início para o dia 4). O efeito da ingesta de vitamina K sobre a variação do INR foi particularmente influenciada pela ingesta média habitual da vitamina. Conclusões. Nossos dados prospectivos reforçam o conceito de que a interação vitamina K e fármacos cumarínicos é de fato real e clinicamente relevante, devendo ser reconhecida como um fator importante e independente que interfere com a estabilidade da anticoagulação oral crônica. / Background. Although several case reports suggest a potential association between vitamin K intake and coagulation instability, the clinical impact of different amounts of vitamin K intake on chronic oral anticoagulation has never been prospectively established. Methods. Clinical characteristics and semi-quantitative queries on vitamin K intake were prospectively evaluated in 230 outpatients’ visits in an anticoagulation clinic (observational protocol). Twelve stable chronically anticoagulated outpatients underwent a randomized crossover trial of 4-day in-hospital dietary intervention of 5-fold increase and 5-fold decrease of baseline vitamin K intake (randomized protocol). Results. Observational protocol: In univariate analysis, we identified a progressive and inverse statistically significant association between an aggregated score of vitamin K intake and different levels of anticoagulation. In multivariate logistic regression, dietary vitamin K intake was independently associated with both overcoagulation and undercoagulation, after adjustment for educational level, income, drug compliance, concurrent illness and clinical comorbidities. Randomized protocol: After the vitamin K depleted diet we observed a significant increase in INR values (from 2.6 ± 0.5 to 3.3 ± 0.9, p =0.005; from baseline to day 7), while after the 4-day enriched diet we identified a significant and earlier decrease in INRs (from 3.1 ± 0.8 to 2.8 ± 0.6, p =0.035; from baseline to day 4). The effect of vitamin K intake on INR variation was particularly influenced by the average baseline intake. Conclusions. Our prospective data strengthen the concept that the vitamin K-coumarin interaction is in fact operative and clinically relevant, and must be acknowledged as a major independent factor that interferes with anticoagulation stability.

Introdução: A Hemofilia A (HA) é a doença hemorrágica ligada ao X mais freqüente na população mundial, causada por alterações no fator VIII (FVIII), afetando 1:5000 nascimentos masculinos. A forma grave dessa doença é encontrada em 50% dos pacientes e é caracterizada por intensos episódios hemorrágicos. O principal problema no tratamento desses pacientes é o desenvolvimento de anticorpos que neutralizam o FVIII infundido, chamados de inibidores contra o FVIII. Alterações estruturais no gene do fator VIII são possíveis fatores de risco ao desenvolvimento de inibidores. Duas inversões (Inv1 e Inv22) são as mais freqüentes e ocorrem exclusivamente em famílias de pacientes com HA grave, afetando cerca de 50% das famílias. Outros fatores genéticos e ambientais estão descritos na literatura como candidatos a fatores de risco ou associados com a produção de anticorpos contra o FVIII. Objetivos: Estabelecer as freqüências dessas inversões em hemofílicos graves do Rio Grande do Sul e verificar a associação entre o desenvolvimento dos inibidores e a presença das inversões nos pacientes, bem como estudar outros fatores relacionados ao surgimento dos inibidores. Metodologia: Foram entrevistadas e estudadas 158 famílias não aparentadas, representadas por 229 pacientes com hemofilia A graves (<1% FVIII) provenientes dos centros de hemoterapia do Rio Grande do Sul (Hemocentro-RS) que aceitaram livremente participar desse estudo. A partir disso, os pacientes foram genotipados para as duas inversões. Desses, foram dosados inibidores de 136 famílias (168 pacientes). Resultados: As freqüências das inversões do intron 1 e 22 nas famílias foram de aproximadamente 4% e 45%, respectivamente, estando essas de acordo com as freqüências de outras populações mundiais. Não foi encontrada uma associação estatisticamente significativa entre o surgimento de inibidores e a presença das inversões nos pacientes. Outros possíveis fatores de risco como tipo de tratamento, a etnia e a idade dos pacientes, a dose administrada de FVIII, a duração do tratamento e a presença de infecções virais crônicas foram também estudados. Quando analisados em separado, o tempo de uso de FVIII, a utilização de crioprecipitado, a dose do fator e a idade dos pacientes estão associados com desenvolvimento de inibidores, porém quando analisados em conjunto em um modelo preditor da formação de inibidores esse modelo fornece resultados não significativos. Conclusões: Esse estudo constitui-se em uma primeira aproximação ao problema, que é complexo; a continuação das pesquisas, agora envolvendo também fatores específicos do sistema imune dos pacientes, poderá fornecer dados mais conclusivos. / Introduction: Hemophilia A (HA) is the most common sex-linked bleeding disorder caused by genetic changes in factor VIII, affecting 1:5000 male births. Severe HA is the most frequent form and occur in 50% of the patients and is characterized by intense hemorragic episodes. The main problem in the treatment of these patients is the development of FVIII antibodies that neutralize the infused FVIII, called FVIII inhibitors. Structural alterations in the factor VIII gene are possible risk factors for the development of inhibitors. Two inversions (Inv1 and Inv22) are the most frequent and they occur exclusively in patients of families with severe HA, affecting about 50% of the families. Other genetic and environmental factors are described in the literature as candidates to risk factors or as being associated with the production of FVIII antibodies. Objectives: To establish the frequencies of these inversions in Rio Grande do Sul and to verify the association between the development of the inhibitors and the presence of the inversions in the patients, as well as to study other factors related to the appearance of the inhibitors. Patients and Methods: The study was carried out on 158 unrelated families, represented by 229 patients with severe HA (<1% FVIII) ascertained from Rio Grande do Sul’s centers of hemotherapy (Hemocentro-RS) that freely accepted to participate in the investigation. The patients were genotyped for the two inversions, and their inhibitor levels tested in 136 families (168 patients). Results: Intronn 1 and 22 inversion frequencies were approximately 4% and 45%, in agreement with those reported for other world populations. No statistically significant association between the occurrence of inhibitors and the presence of these inversions in the patients was found. Other possible risk factors as the type of treatment, ethnic group, patients' age, administered FVIII dose, duration of treatment and the presence of chronic viral infections were also studied. When separately analyzed, duration of FVIII, treatment, cryoprecipitate use, the factor dose and the patients' age are associated with inhibitor development, but when analyzed together in a model of inhibitors formation prediction the model yields non-significant results. Conclusions: This study is a first approximation to this complex problem; the continuation of the research, now involving also specific factors of the patient’s immune system, could furnish more conclusive data.

O envenenamento causado pela lagarta Lonomia obliqua é um problema de saúde pública nas regiões do Sul do Brasil. As vítimas envenenadas apresentam uma síndrome hemorrágica grave que pode evoluir para insuficiência renal aguda, hemorragia intracraniana e óbito. Com o objetivo de compreender os mecanismos que levam à hemorragia, neste trabalho foram avaliados a função plaquetária e os parâmetros de coagulação sangüínea em um modelo experimental de envenenamento em ratos e também foram investigados os efeitos diretos do veneno de L. obliqua sobre plaquetas isoladas in vitro. Os ratos envenenados apresentaram hipofibrinogenemia e hipoagregação plaquetária. A produção intravascular de óxido nítrico e a geração dos produtos de degradação de fibrinogênio/fibrina parecem estar envolvidos na hipoagregação plaquetária. Os animais envenenados também apresentaram incoagulabilidade sangüínea e um aumento significativo na atividade de trombina, plasmina e uroquinase no plasma. Apesar desta geração intravascular de trombina, somente uma pequena redução na contagem de plaquetas foi detectada. Quando testado in vitro, o veneno de L. obliqua foi capaz de induzir diretamente agregação e adesão de plaquetas isoladas. A agregação plaquetária induzida pelo veneno foi significativamente inibida por brometo de p-bromofenacila (p-BPB), um inibidor específico de fosfolipases A2. Experimentos com diferentes antagonistas farmacológicos indicaram que a agregação plaquetária disparada pelo veneno ocorre por um mecanismo dependente de cálcio envolvendo a via das ciclooxigenases e a ativação da fosfodiesterase 3A, uma enzima que leva ao consumo dos níveis intracelulares de AMPc. Se analisados em conjunto, os resultados aqui apresentados são importantes para a compreensão da síndrome hemorrágica resultante do contato acidental com a lagarta L. obliqua e podem auxiliar na descoberta de novas formas de tratamento para o quadro clínico. / The envenomation caused by the caterpillar Lonomia obliqua is a public health hazard in Southern Brazil regions. Envenomed victims present a severe hemorrhagic syndrome that can progress to acute renal failure, intracranial hemorrhage and death. To understand the mechanisms that lead to hemorrhage, we evaluated the platelet function and blood coagulation parameters in an experimental model of envenomation in rats and investigated the direct effects of L. obliqua venom on isolated platelets in vitro. Envenomed rats presented hypofibrinogenemia and platelet hypoaggregation. The intravascular production of nitric oxide and generation of fibrinogen/fibrin degradation products seems to be involved in platelet hypoaggregation. Animals also showed intense blood incoagulability and a significant increase in thrombin, plasmin and urokinase plasmatic activities. Despite this intravascular thrombin generation, only a slight decrease in platelet numbers was detected. When tested in vitro, L. obliqua venom was able to directly induce aggregation and adhesion of isolated platelets. The venom-induced platelet aggregation was significativly inhibited by p-bromophenacyl bromide (p-BPB), a specific inhibitor of phospholipases A2. Experiments with different pharmacological antagonists indicate that the aggregation response triggered by venom occurs through a calcium-dependent mechanism involving the cyclooxygenase pathway and activation of phosphodiesterase 3A, an enzyme that leads to the consumption of intracellular cAMP content. Altogether, these findings may be important to the understanding of the complex hemorrhagic syndrome resulting from accidental contact with L. obliqua caterpillars and may give new insights in the management of the clinical profile.

Pacientes diabéticos tipo 2 apresentam risco de 3 à 5 vezes maior de sofrer infarto do miocárdio do que indivíduos não diabéticos, sendo que 75% desses pacientes morrem de complicações aterotrombóticas. Os mecanismos que levam o indivíduo a apresentar esse perfil pró-trombótico incluem danos ao endotélio, liberação de citocinas pró-inflamatórias, estresse oxidativo, ativação da cascata de coagulação e das plaquetas. As proteínas da cascata de coagulação e as plaquetas são os principais atores do controle do balanço anti/pró-coagulante. A cascata de coagulação pode ser ativada por dano ao endotélio ou por liberação de fatores, como o Fator Tecidual. Essa cascata culmina com a ativação da enzima trombina, que cliva o fibrinogênio e permite sua polimerização e deposição na forma de fibrina. A trombina também participa da ativação das plaquetas. Outros mecanismos têm sido propostos na tentativa de entender as causas do perfil pró-trombótico apresentado por indivíduos diabéticos. A geração Produtos Finais de Glicação Avançada (do inglês Advanced Glycation End-Products – AGE) nesses indivíduos tem sido frequentemente relatada como importante fator. Os AGE são modificações póstraducionais encontradas em proteínas e têm origem em uma reação nãoenzimática entre uma proteína e um açúcar redutor, ou com um aldeído reativo. Durante o diabetes a hiperglicemia é considerada a principal fonte de geração de AGE, mas a participação de outros aldeídos reativos, como o metilglioxal e o glicolaldeído (GA) também são de grande importância. O processo de glicação pode levar a duas situações no organismo: a) alteração na estrutura da proteína com consequente alteração da sua função; b) a geração de moléculas sinalizadoras (AGE) com potencial pró-inflamatório e pró-trombótico. Estudos recentes demonstraram que os AGE podem causar a ativação de plaquetas e promover a liberação de Fator Tecidual por monócitos e células endoteliais. Muitos estudos têm sido realizados com a intenção de entender o papel dos AGE sobre a coagulação, no entanto, faltam dados sobre os efeitos dos seus precursores (açucares e aldeídos reativos) na modulação da hemostasia. Nesta tese, demonstramos que o GA é capaz de reagir com proteínas plasmáticas in vitro, levando a um aumento nos níveis de carbonil. Os coágulos formados a partir de plasma incubado com GA apresentaram-se resistentes à ação proteolítica. O GA teve os mesmos efeitos quando incubado com o fibrinogênio purificado, indicando que essa proteína é um alvo importante no desequilíbrio hemostático causado pelo aldeído. Para avaliar se o aumento dos níveis do GA é relevante in vivo, ratos Wistar adultos foram injetados com esse aldeído. Verificou-se aumento na oxidação de proteínas (carbonil e sulfidril) e um encurtamento no tempo necessário para a coagulação do plasma, indicando um perfil pró-trombótico. Após o isolamento do fibrinogênio desses ratos, foi identificada a formação de CML e um atraso no tempo necessário para a fibrina polimerizar. Os nossos resultados indicam que o GA pode danificar diretamente o fibrinogênio e contribuir para os efeitos prótrombóticos vistos em algumas enfermidades. Ainda, os efeitos do GA in vivo não se restringem apenas às proteínas da cascata de coagulação sendo necessária a avaliação dos efeitos do GA sobre as células envolvidas com os processos de coagulação (plaquetas e células endoteliais). / The risk of myocardial infarction is 3-5 folds higher in type 2 diabetic patients than in healthy subjects. Seventy five percent of these patients die with atherothrombotic complications. The mechanisms behind this prothrombotic profile include endothelial damage, cytokine release, oxidative stress, coagulation and platelet activation. The balance between anti/pro-coagulant is controlled mainly by proteins of coagulation cascade and platelets. Coagulation can be triggered by endothelial damage or by factors release, such as Tissue Factor. This cascade ends with thrombin activation, which act upon fibrinogen and allows its polymerization in the insoluble form fibrin. Moreover, thrombin also may activate platelets. Several mechanisms have been proposed in order to explain the underlying factor responsible for prothrombotic profile seen in diabetes. The generation of Advanced Glycation End-products (AGE) in these patients has been often described as an important factor. AGE are posttranslational modifications found in proteins that have origin in a non-enzymatic reaction between a protein and a sugar (or reactive aldehydes). During the diabetes, the hyperglycaemia is believed to be the main agent of protein glycation. The role of reactive aldehydes, such as methylglyoxal and glycolaldehyde (GA) are important too. Glycation can lead to a two main events in organism: a) alteration in protein configuration, with change of function; b) generation of a class of signaling molecules (AGE), which may trigger the proinflammatory and pro-thrombotic events. Recent studies have revealed that AGE can cause platelet activation and induce Tissue Factor release from monocytes and endothelial cells. A lot of studies have been developed to understand the role of AGE in coagulation, although few have studied the glycation precursors on hemostasis. Here we show that GA is able in reacting with plasma proteins in vitro leading to generation of protein carbonyl. The clots generated from GA-incubated plasma were resistant to proteolysis. The incubation of purified fibrinogen in presence of GA revealed the same profile than we saw in whole plasma, suggesting the importance of this protein in the hemostatic dysfunction induced by GA. To evaluate if the increased levels of GA is relevant in vivo, Wistar rats were injected with the aldehyde and plasma was evaluated. Plasma proteins showed increase in oxidative damage (carbonyl and sulfhydryl) whereas the time necessary to plasma to clot shortened, suggesting a prothrombotic profile. The purification of fibrinogen from GA-injected rats revealed that there was an increase in generation of CML, evaluated by western blot. Moreover, there was a delay in the time necessary to fibrin polymerization in a system containing isolated fibrinogen. Our results suggest that GA can directly damage fibrinogen and thus, contribute to prothrombotic effects seen in some diseases. Moreover, the in vivo effects of GA are not only restricted to the coagulation cascade proteins. More studies are necessary to evaluate the effects of GA on cell that participate in coagulation regulation (e.g. platelets and endothelial cells).

A heparina foi isolada no início do século XX e permanece, até os dias atuais, como um dos mais importantes e eficientes agentes terapêuticos de ação antitrombótica. Sua atividade anticoagulante deve-se à ativação da antitrombina (AT), uma serpina responsável pela inibição fisiológica de serino-proteinases plasmáticas, tais como fIIa e fXa. Os esforços no sentido da elucidação dos aspectos estruturais e dinâmicos associados ao reconhecimento molecular da heparina pela AT, em nível atômico, vêm encontrando diversas dificuldades, principalmente associadas aos compostos sacarídicos. Em decorrência de sua elevada polaridade e flexibilidade, glicosaminoglicanos como a heparina são difíceis de estudar e modelar. Soma-se a isto o fato de que os resíduos de iduronato presentes na heparina (IdoA) apresentam um incomum equilíbrio conformacional entre estados de cadeira (1C4) e bote-torcido (2SO), sendo esta última estrutura postulada como a possível conformação bioativa. Sendo assim, este trabalho apresenta um estudo de modelagem molecular do perfil conformacional da heparina, tanto em solução quanto complexada à AT, utilizando cálculos ab initio e simulações de dinâmica molecular (DM) Em decorrência da ausência de parâmetros capazes de descrever polissacarídeos nos campos de força atualmente disponíveis, cargas atômicas foram geradas, utilizando-se os esquemas de Mulliken, Löwdin e cargas ajustadas ao Potencial Eletrostático, através de cálculos quantum-mecânicos na base 6-31G** e testadas na simulação de DM da heparina. Diversas condições de simulação, tais como modelos de água, concentrações de sais e as conformações 1C4 e 2SO do IdoA, foram avaliadas de forma a identificar as melhores condições para a descrição conformacional da heparina em solução. O protocolo de DM obtido foi então utilizado no estudo do complexo AT-heparina. Os resultados obtidos estão de acordo com os dados experimentais atualmente disponíveis acerca da conformação da heparina e da contribuição energética de cada resíduo de aminoácido da AT para a formação do complexo com a heparina. A partir dos cálculos ab initio realizados, foi proposto um refinamento na estrutura da heparina determinada por RMN, enquanto que as simulações de DM permitiram reinterpretar aspectos da estrutura tridimensional da AT determinada por cristalografia de raios-X. Adicionalmente, os dados obtidos sugerem que não há requerimento conformacional para a interação do IdoA com a AT Globalmente, os dados indicam que simulações de DM podem ser utilizadas para representar adequadamente a conformação da heparina, assim como para caracterizar e quantificar suas interações com a AT. Assim sendo, propomos o uso de simulações de DM do complexo entre a AT e a heparina, ou entre a AT e compostos derivados da heparina, como uma ferramenta útil no processo de desenvolvimento de novos agentes antitrombóticos e anticoagulantes.

A hemofilia A (HA) é uma doença hemorrágica hereditária ligada ao cromossomo X, causada pela atividade reduzida ou ausente do fator VIII da coagulação (FVIII). Essa doença é o resultado de mutações heterogêneas no gene do FVIII. A identificação das mutações patogênicas é importante para o aconselhamento genético e para a avaliação das manifestações clínicas. Embora mais de 700 mutações no gene já tenham sido descritas como responsáveis pela HA grave (nível de FVIII <1%), não existem dados a respeito na população do Rio Grande do Sul. O objetivo desse trabalho é a identificação das alterações genéticas em 48 pacientes hemofílicos graves, de diferentes famílias, com resultado negativo para a presença das inversões nos íntrons 22 e 1. Tais inversões são as mutações mais comumente encontradas (40-50% e 5%, respectivamente) em hemofílicos A graves. Todos os pacientes foram analisados para a presença de grandes deleções por PCR multiplex, utilizando-se 35 pares de primers que abrangem os 26 éxons e as regiões 5’ e 3’UTR do gene. Os pacientes que não apresentaram grandes deleções foram analisados por sequenciamento direto dos exons. As variações nas sequências foram verificadas com os softwares Codon Code Aligner e MEGA5.04, para realizar alinhamentos múltiplos e para analisar a tradução da proteína mutada. O software PolyPhen-2 foi utilizado para verificar se as mutações alterariam a estrutura e a função da proteína; o software SDM foi utilizado para verificar se as mutações alterariam a estabilidade da proteína. Uma figura com a localização das mutações no gene do FVIII foi desenhada com o programa Pymol. Foram encontradas em 70% dos pacientes: uma grande deleção (incluindo os éxons 4, 5 e 6), nove pequenas deleções, cinco pequenas inserções, oito mutações de sentido trocado e seis mutações sem sentido, das quais treze são recorrentes e dezesseis são novas mutações, não descritas no banco de dados online HAMSTeRS. Quarenta e quatro por cento dos indivíduos com mutação encontrada desenvolveram inibidores, sugerindo um maior risco de desenvolvimento de inibidores em pacientes com grandes deleções, mutações sem sentido e pequenas deleções/inserções, quando comparado com pacientes com mutações de troca de sentido. Entre outras mutações de efeito evidente, foram encontradas duas mutações (D542G e S109P) que podem interferir em sítios de ligação ao cálcio, uma mutação (P2205R) que pode ser prejudicial à interação entre o FVIII e o fator de von Willebrand (FvW) e uma mutação (L2297R), que altera a superfície eletrostática da proteína. Esses dados contribuem para o melhor entendimento da funcionalidade e da estrutura do FVIII. / Hemophilia A (HA) is an X-linked inherited bleeding disorder caused by reduced or absent clotting factor VIII (FVIII) activity, determined by heterogeneous mutations in the FVIII gene. Identification of these pathogenic mutations is important for genetic counseling and the assessment of clinical manifestations. Although more than 700 mutations of the FVIII gene have been reported as responsible for severe hemophilia (FVIII: C<1%), the corresponding data is currently insufficient for Southern Brazilian populations. The aim of this study was to identify genetic changes in 48 unrelated severe HA patients, who showed negative results for inversions in introns 22 and 1. These inversions are the most common mutations (40-50% and 5%, respectively) in severe HA patients. All patients were screened for gross deletions by multiplex PCR, with 35 pairs of primers for the 26 exons and 5’- and 3’- UTR of the gene. Those without any gross deletion were then analyzed by direct sequencing for all exons. Sequence variation was analyzed with the Codon Code Aligner and the Mega0.4 softwares for multiple alignments and protein translation. PolyPhen-2 was used to predict if the mutations would alter protein’s structure and function; SDM was used to verify if the mutations would alter the protein stability. One image with the location of FVIII mutations was drawn with the Pymol software. In 70% of the patients one gross deletion (including exons 4, 5 and 6), nine small deletions, five small insertions, eight missense and six nonsense mutations were found, of which thirteen were recurrent and sixteen were novel, never reported in the HAMSTeRS database. Forty-four per cent of these mutation carriers developed FVIII inhibitors, suggesting a higher risk of inhibitors development in patients with large deletions, small deletions/insertions, and nonsense mutations than in patients with missense mutations. Among mutations of clear effect, two mutations (D542G and S109P) that may interfere with calcium binding, a mutation that may affect FVIII and von Willebrand factor (FvW) interaction (P2205R), and L2297R, that clearly affects the molecule’s electrostatic surface were found. The results enable us to better understand structural and functional aspects of this protein.

Foi realizada inicialmente uma revisão sobre o processo de hemostasia, as características da hemofilia A, e os fatores que influem na formação de inibidores contra o Fator VIII, um dos principais problemas na terapêutica de reposição do mesmo em hemofílicos A graves. Posteriormente, visando verificar possíveis suscetibilidades genéticas no desenvolvimento de tais anticorpos, foram descritos estudos envolvendo 154 hemofílicos A graves localizados no Rio Grande do Sul, 47 com e 107 sem inibidores. A pesquisa envolveu 10 polimorfismos em cinco sistemas relacionados à resposta imune (IL4, IL4R, IL10, TNFα e TNFR1). Três desses polimorfismos (IL4R 1902A>G, TNFα -863A>C, e TNFR1 303A>G) nunca haviam sido estudados dentro desse contexto. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas nas prevalências desses polimorfismos entre as duas séries, em concordância com algumas, mas não todas as investigações prévias. A questão de por que alguns pacientes desenvolvem tais inibidores, mas outros não, permanece em aberto. / A review was initially made on the hemostatic process, the characteristics of hemophilia A, and the factors that influence the formation of inhibitors against Factor VIII, one of the main problems that exist in the therapeutics of its replacement in severe hemophilia A patients. Afterwords, in an attempt to verify possible genetic susceptibilities in the development of such antibodies, a description was made of studies involving 154 severe hemophilia A subjects living in Rio Grande do Sul, 47 with and 107 without inhibitors. The research included 10 polymorphisms in five systems related to the immune response (IL4, IL4R, IL10, TNFα and TNFR1). Three of them (IL4R 1902A>G, TNFα -863A>C, and TNFR1 303A>G) had never been studied in this context. No statistical significant differences were found between the two series, in agreement with some, but not all previous investigations. The question of why some, but not all severe hemophilia A patients develop anti-Factor VIII antibodies remain open.