A Hemofilia B (HB) é uma doença hemorrágica causada pela redução ou ausência da atividade do Fator IX da coagulação (FIX), devido a mutações no gene que codifica a proteína. O padrão de herança é recessivo ligado ao sexo. O FIX ativado, em complexo com o fator VIII (FVIII) ativado, forma o complexo Xase intrínseco, o qual leva à ativação do fator X (FX). O FX ativado transforma a protrombina em trombina, a qual converte fibrinogênio em fibrina, formando o coágulo sanguíneo. O gene do FIX localiza-se no cromossomo Xq27.1, ele compreende 33kb e está organizado em 8 éxons (a-h). Existem 1.094 mutações descritas que resultam em hemofilia B nas formas grave, moderada ou leve, sendo que mais da metade dessas mutações estão associadas à forma grave da hemofilia B. O presente estudo tem por objetivo geral a caracterização molecular das mutações em pacientes diagnosticados com hemofilia B residentes no Rio Grande do Sul. Esse estudo das mutações possibilita uma melhor compreensão da genética molecular da doença na população estudada; fornece ferramentas importantes para análises bioquímicas e predição de alterações na estrutura tridimensional da molécula do FIX e melhora o entendimento da relação genótipo/fenótipo. Um total de 52 pacientes masculinos com hemofilia B está incluído no estudo. A estratégia utilizada para a detecção de mutações na hemofilia B foi iniciada pela investigação da presença de grandes deleções, utilizando-se a técnica de PCR. Não foram encontradas, porém, quaisquer grandes deleções. A seguir, foi feito o sequenciamento direto dos 8 éxons do gene do fator IX e suas regiões flanqueadoras. Os produtos de PCR foram purificados para o sequenciamento e, após, essas amostras foram encaminhadas a uma empresa terceirizada para o sequenciamento. Serão apresentados resultados dos éxons 1 a 8, nos quais foram encontradas 19 diferentes mutações, sendo 15 mutações de sentido trocado, 1 pequena deleção de dois nucleotídeos e 3 mutações sem sentido. Esses resultados foram comparados com as informações existentes no banco de dados mundial e estudos específicos anteriores desenvolvidos no Brasil, Argentina e México. / Hemophilia B (HB) is a hemorrhagic disorder caused by the reduction or absence of activity from the coagulation Factor IX (FIX), due to mutations in the protein encoding gene. The pattern of inheritance is sex-linked recessive. The activated FIX, along with the activated Factor VIII (FVIII), originates the intrinsic Xase complex, which leads to the activation of Factor X (FX). The activated FX transforms prothrombin into thrombin, which converts fibrinogen into fibrin, resulting in blood clot. The FIX gene is located on chromosome Xq27.1, comprises 33kb and is arranged in 8 exons (a-h). There are 1,094 described mutations that result in Hemophilia B in its severe, moderate or mild forms, and more than half of these mutations are associated with Hemophilia B’s severe form. The overall purpose of the present study is to present the molecular characterization of mutations in patients diagnosed with Hemophilia B who are residents in Rio Grande do Sul. This study on mutations allows a better understanding of molecular genetics of the disease in the analyzed population; it also provides important tools for biochemical analyses and for the prediction of changes in the three-dimensional structure of the FIX molecule, and it improves the understanding of the genotype/phenotype relationship. A total of 52 male patients diagnosed with Hemophilia B, is included in the study. The strategy used to detect mutations in Hemophilia B was first to examine the presence of major deletions, using PCR methods. No large deletions, however, were found. Afterwards, we performed the direct sequencing of the 8 exons of the Factor IX gene and its flanking regions. The PCR products were purified for the sequencing process, and then these samples were sent to a third-party company for sequencing. The results for exons 1 to 8 are presented; we found 19 different mutations, from which 15 are missense mutations, 1 is a small deletion of two nucleotides and 3 are non-sense mutations. These results were compared with those of the world database and specific previous studies performed in Brazil, Argentina and Mexico.

A Hemofilia B (HB) é uma doença hemorrágica causada pela redução ou ausência da atividade do Fator IX da coagulação (FIX), devido a mutações no gene que codifica a proteína. O padrão de herança é recessivo ligado ao sexo. O FIX ativado, em complexo com o fator VIII (FVIII) ativado, forma o complexo Xase intrínseco, o qual leva à ativação do fator X (FX). O FX ativado transforma a protrombina em trombina, a qual converte fibrinogênio em fibrina, formando o coágulo sanguíneo. O gene do FIX localiza-se no cromossomo Xq27.1, ele compreende 33kb e está organizado em 8 éxons (a-h). Existem 1.094 mutações descritas que resultam em hemofilia B nas formas grave, moderada ou leve, sendo que mais da metade dessas mutações estão associadas à forma grave da hemofilia B. O presente estudo tem por objetivo geral a caracterização molecular das mutações em pacientes diagnosticados com hemofilia B residentes no Rio Grande do Sul. Esse estudo das mutações possibilita uma melhor compreensão da genética molecular da doença na população estudada; fornece ferramentas importantes para análises bioquímicas e predição de alterações na estrutura tridimensional da molécula do FIX e melhora o entendimento da relação genótipo/fenótipo. Um total de 52 pacientes masculinos com hemofilia B está incluído no estudo. A estratégia utilizada para a detecção de mutações na hemofilia B foi iniciada pela investigação da presença de grandes deleções, utilizando-se a técnica de PCR. Não foram encontradas, porém, quaisquer grandes deleções. A seguir, foi feito o sequenciamento direto dos 8 éxons do gene do fator IX e suas regiões flanqueadoras. Os produtos de PCR foram purificados para o sequenciamento e, após, essas amostras foram encaminhadas a uma empresa terceirizada para o sequenciamento. Serão apresentados resultados dos éxons 1 a 8, nos quais foram encontradas 19 diferentes mutações, sendo 15 mutações de sentido trocado, 1 pequena deleção de dois nucleotídeos e 3 mutações sem sentido. Esses resultados foram comparados com as informações existentes no banco de dados mundial e estudos específicos anteriores desenvolvidos no Brasil, Argentina e México. / Hemophilia B (HB) is a hemorrhagic disorder caused by the reduction or absence of activity from the coagulation Factor IX (FIX), due to mutations in the protein encoding gene. The pattern of inheritance is sex-linked recessive. The activated FIX, along with the activated Factor VIII (FVIII), originates the intrinsic Xase complex, which leads to the activation of Factor X (FX). The activated FX transforms prothrombin into thrombin, which converts fibrinogen into fibrin, resulting in blood clot. The FIX gene is located on chromosome Xq27.1, comprises 33kb and is arranged in 8 exons (a-h). There are 1,094 described mutations that result in Hemophilia B in its severe, moderate or mild forms, and more than half of these mutations are associated with Hemophilia B’s severe form. The overall purpose of the present study is to present the molecular characterization of mutations in patients diagnosed with Hemophilia B who are residents in Rio Grande do Sul. This study on mutations allows a better understanding of molecular genetics of the disease in the analyzed population; it also provides important tools for biochemical analyses and for the prediction of changes in the three-dimensional structure of the FIX molecule, and it improves the understanding of the genotype/phenotype relationship. A total of 52 male patients diagnosed with Hemophilia B, is included in the study. The strategy used to detect mutations in Hemophilia B was first to examine the presence of major deletions, using PCR methods. No large deletions, however, were found. Afterwards, we performed the direct sequencing of the 8 exons of the Factor IX gene and its flanking regions. The PCR products were purified for the sequencing process, and then these samples were sent to a third-party company for sequencing. The results for exons 1 to 8 are presented; we found 19 different mutations, from which 15 are missense mutations, 1 is a small deletion of two nucleotides and 3 are non-sense mutations. These results were compared with those of the world database and specific previous studies performed in Brazil, Argentina and Mexico.

A hemofilia A (HA) é uma doença hemorrágica hereditária ligada ao cromossomo X, causada pela atividade reduzida ou ausente do fator VIII da coagulação (FVIII). Essa doença é o resultado de mutações heterogêneas no gene do FVIII. A identificação das mutações patogênicas é importante para o aconselhamento genético e para a avaliação das manifestações clínicas. Embora mais de 700 mutações no gene já tenham sido descritas como responsáveis pela HA grave (nível de FVIII <1%), não existem dados a respeito na população do Rio Grande do Sul. O objetivo desse trabalho é a identificação das alterações genéticas em 48 pacientes hemofílicos graves, de diferentes famílias, com resultado negativo para a presença das inversões nos íntrons 22 e 1. Tais inversões são as mutações mais comumente encontradas (40-50% e 5%, respectivamente) em hemofílicos A graves. Todos os pacientes foram analisados para a presença de grandes deleções por PCR multiplex, utilizando-se 35 pares de primers que abrangem os 26 éxons e as regiões 5’ e 3’UTR do gene. Os pacientes que não apresentaram grandes deleções foram analisados por sequenciamento direto dos exons. As variações nas sequências foram verificadas com os softwares Codon Code Aligner e MEGA5.04, para realizar alinhamentos múltiplos e para analisar a tradução da proteína mutada. O software PolyPhen-2 foi utilizado para verificar se as mutações alterariam a estrutura e a função da proteína; o software SDM foi utilizado para verificar se as mutações alterariam a estabilidade da proteína. Uma figura com a localização das mutações no gene do FVIII foi desenhada com o programa Pymol. Foram encontradas em 70% dos pacientes: uma grande deleção (incluindo os éxons 4, 5 e 6), nove pequenas deleções, cinco pequenas inserções, oito mutações de sentido trocado e seis mutações sem sentido, das quais treze são recorrentes e dezesseis são novas mutações, não descritas no banco de dados online HAMSTeRS. Quarenta e quatro por cento dos indivíduos com mutação encontrada desenvolveram inibidores, sugerindo um maior risco de desenvolvimento de inibidores em pacientes com grandes deleções, mutações sem sentido e pequenas deleções/inserções, quando comparado com pacientes com mutações de troca de sentido. Entre outras mutações de efeito evidente, foram encontradas duas mutações (D542G e S109P) que podem interferir em sítios de ligação ao cálcio, uma mutação (P2205R) que pode ser prejudicial à interação entre o FVIII e o fator de von Willebrand (FvW) e uma mutação (L2297R), que altera a superfície eletrostática da proteína. Esses dados contribuem para o melhor entendimento da funcionalidade e da estrutura do FVIII. / Hemophilia A (HA) is an X-linked inherited bleeding disorder caused by reduced or absent clotting factor VIII (FVIII) activity, determined by heterogeneous mutations in the FVIII gene. Identification of these pathogenic mutations is important for genetic counseling and the assessment of clinical manifestations. Although more than 700 mutations of the FVIII gene have been reported as responsible for severe hemophilia (FVIII: C<1%), the corresponding data is currently insufficient for Southern Brazilian populations. The aim of this study was to identify genetic changes in 48 unrelated severe HA patients, who showed negative results for inversions in introns 22 and 1. These inversions are the most common mutations (40-50% and 5%, respectively) in severe HA patients. All patients were screened for gross deletions by multiplex PCR, with 35 pairs of primers for the 26 exons and 5’- and 3’- UTR of the gene. Those without any gross deletion were then analyzed by direct sequencing for all exons. Sequence variation was analyzed with the Codon Code Aligner and the Mega0.4 softwares for multiple alignments and protein translation. PolyPhen-2 was used to predict if the mutations would alter protein’s structure and function; SDM was used to verify if the mutations would alter the protein stability. One image with the location of FVIII mutations was drawn with the Pymol software. In 70% of the patients one gross deletion (including exons 4, 5 and 6), nine small deletions, five small insertions, eight missense and six nonsense mutations were found, of which thirteen were recurrent and sixteen were novel, never reported in the HAMSTeRS database. Forty-four per cent of these mutation carriers developed FVIII inhibitors, suggesting a higher risk of inhibitors development in patients with large deletions, small deletions/insertions, and nonsense mutations than in patients with missense mutations. Among mutations of clear effect, two mutations (D542G and S109P) that may interfere with calcium binding, a mutation that may affect FVIII and von Willebrand factor (FvW) interaction (P2205R), and L2297R, that clearly affects the molecule’s electrostatic surface were found. The results enable us to better understand structural and functional aspects of this protein.

Introdução: A Hemofilia A (HA) é a doença hemorrágica ligada ao X mais freqüente na população mundial, causada por alterações no fator VIII (FVIII), afetando 1:5000 nascimentos masculinos. A forma grave dessa doença é encontrada em 50% dos pacientes e é caracterizada por intensos episódios hemorrágicos. O principal problema no tratamento desses pacientes é o desenvolvimento de anticorpos que neutralizam o FVIII infundido, chamados de inibidores contra o FVIII. Alterações estruturais no gene do fator VIII são possíveis fatores de risco ao desenvolvimento de inibidores. Duas inversões (Inv1 e Inv22) são as mais freqüentes e ocorrem exclusivamente em famílias de pacientes com HA grave, afetando cerca de 50% das famílias. Outros fatores genéticos e ambientais estão descritos na literatura como candidatos a fatores de risco ou associados com a produção de anticorpos contra o FVIII. Objetivos: Estabelecer as freqüências dessas inversões em hemofílicos graves do Rio Grande do Sul e verificar a associação entre o desenvolvimento dos inibidores e a presença das inversões nos pacientes, bem como estudar outros fatores relacionados ao surgimento dos inibidores. Metodologia: Foram entrevistadas e estudadas 158 famílias não aparentadas, representadas por 229 pacientes com hemofilia A graves (<1% FVIII) provenientes dos centros de hemoterapia do Rio Grande do Sul (Hemocentro-RS) que aceitaram livremente participar desse estudo. A partir disso, os pacientes foram genotipados para as duas inversões. Desses, foram dosados inibidores de 136 famílias (168 pacientes). Resultados: As freqüências das inversões do intron 1 e 22 nas famílias foram de aproximadamente 4% e 45%, respectivamente, estando essas de acordo com as freqüências de outras populações mundiais. Não foi encontrada uma associação estatisticamente significativa entre o surgimento de inibidores e a presença das inversões nos pacientes. Outros possíveis fatores de risco como tipo de tratamento, a etnia e a idade dos pacientes, a dose administrada de FVIII, a duração do tratamento e a presença de infecções virais crônicas foram também estudados. Quando analisados em separado, o tempo de uso de FVIII, a utilização de crioprecipitado, a dose do fator e a idade dos pacientes estão associados com desenvolvimento de inibidores, porém quando analisados em conjunto em um modelo preditor da formação de inibidores esse modelo fornece resultados não significativos. Conclusões: Esse estudo constitui-se em uma primeira aproximação ao problema, que é complexo; a continuação das pesquisas, agora envolvendo também fatores específicos do sistema imune dos pacientes, poderá fornecer dados mais conclusivos. / Introduction: Hemophilia A (HA) is the most common sex-linked bleeding disorder caused by genetic changes in factor VIII, affecting 1:5000 male births. Severe HA is the most frequent form and occur in 50% of the patients and is characterized by intense hemorragic episodes. The main problem in the treatment of these patients is the development of FVIII antibodies that neutralize the infused FVIII, called FVIII inhibitors. Structural alterations in the factor VIII gene are possible risk factors for the development of inhibitors. Two inversions (Inv1 and Inv22) are the most frequent and they occur exclusively in patients of families with severe HA, affecting about 50% of the families. Other genetic and environmental factors are described in the literature as candidates to risk factors or as being associated with the production of FVIII antibodies. Objectives: To establish the frequencies of these inversions in Rio Grande do Sul and to verify the association between the development of the inhibitors and the presence of the inversions in the patients, as well as to study other factors related to the appearance of the inhibitors. Patients and Methods: The study was carried out on 158 unrelated families, represented by 229 patients with severe HA (<1% FVIII) ascertained from Rio Grande do Sul’s centers of hemotherapy (Hemocentro-RS) that freely accepted to participate in the investigation. The patients were genotyped for the two inversions, and their inhibitor levels tested in 136 families (168 patients). Results: Intronn 1 and 22 inversion frequencies were approximately 4% and 45%, in agreement with those reported for other world populations. No statistically significant association between the occurrence of inhibitors and the presence of these inversions in the patients was found. Other possible risk factors as the type of treatment, ethnic group, patients' age, administered FVIII dose, duration of treatment and the presence of chronic viral infections were also studied. When separately analyzed, duration of FVIII, treatment, cryoprecipitate use, the factor dose and the patients' age are associated with inhibitor development, but when analyzed together in a model of inhibitors formation prediction the model yields non-significant results. Conclusions: This study is a first approximation to this complex problem; the continuation of the research, now involving also specific factors of the patient’s immune system, could furnish more conclusive data.

Foi realizada inicialmente uma revisão sobre o processo de hemostasia, as características da hemofilia A, e os fatores que influem na formação de inibidores contra o Fator VIII, um dos principais problemas na terapêutica de reposição do mesmo em hemofílicos A graves. Posteriormente, visando verificar possíveis suscetibilidades genéticas no desenvolvimento de tais anticorpos, foram descritos estudos envolvendo 154 hemofílicos A graves localizados no Rio Grande do Sul, 47 com e 107 sem inibidores. A pesquisa envolveu 10 polimorfismos em cinco sistemas relacionados à resposta imune (IL4, IL4R, IL10, TNFα e TNFR1). Três desses polimorfismos (IL4R 1902A>G, TNFα -863A>C, e TNFR1 303A>G) nunca haviam sido estudados dentro desse contexto. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas nas prevalências desses polimorfismos entre as duas séries, em concordância com algumas, mas não todas as investigações prévias. A questão de por que alguns pacientes desenvolvem tais inibidores, mas outros não, permanece em aberto. / A review was initially made on the hemostatic process, the characteristics of hemophilia A, and the factors that influence the formation of inhibitors against Factor VIII, one of the main problems that exist in the therapeutics of its replacement in severe hemophilia A patients. Afterwords, in an attempt to verify possible genetic susceptibilities in the development of such antibodies, a description was made of studies involving 154 severe hemophilia A subjects living in Rio Grande do Sul, 47 with and 107 without inhibitors. The research included 10 polymorphisms in five systems related to the immune response (IL4, IL4R, IL10, TNFα and TNFR1). Three of them (IL4R 1902A>G, TNFα -863A>C, and TNFR1 303A>G) had never been studied in this context. No statistical significant differences were found between the two series, in agreement with some, but not all previous investigations. The question of why some, but not all severe hemophilia A patients develop anti-Factor VIII antibodies remain open.

A heparina foi isolada no início do século XX e permanece, até os dias atuais, como um dos mais importantes e eficientes agentes terapêuticos de ação antitrombótica. Sua atividade anticoagulante deve-se à ativação da antitrombina (AT), uma serpina responsável pela inibição fisiológica de serino-proteinases plasmáticas, tais como fIIa e fXa. Os esforços no sentido da elucidação dos aspectos estruturais e dinâmicos associados ao reconhecimento molecular da heparina pela AT, em nível atômico, vêm encontrando diversas dificuldades, principalmente associadas aos compostos sacarídicos. Em decorrência de sua elevada polaridade e flexibilidade, glicosaminoglicanos como a heparina são difíceis de estudar e modelar. Soma-se a isto o fato de que os resíduos de iduronato presentes na heparina (IdoA) apresentam um incomum equilíbrio conformacional entre estados de cadeira (1C4) e bote-torcido (2SO), sendo esta última estrutura postulada como a possível conformação bioativa. Sendo assim, este trabalho apresenta um estudo de modelagem molecular do perfil conformacional da heparina, tanto em solução quanto complexada à AT, utilizando cálculos ab initio e simulações de dinâmica molecular (DM) Em decorrência da ausência de parâmetros capazes de descrever polissacarídeos nos campos de força atualmente disponíveis, cargas atômicas foram geradas, utilizando-se os esquemas de Mulliken, Löwdin e cargas ajustadas ao Potencial Eletrostático, através de cálculos quantum-mecânicos na base 6-31G** e testadas na simulação de DM da heparina. Diversas condições de simulação, tais como modelos de água, concentrações de sais e as conformações 1C4 e 2SO do IdoA, foram avaliadas de forma a identificar as melhores condições para a descrição conformacional da heparina em solução. O protocolo de DM obtido foi então utilizado no estudo do complexo AT-heparina. Os resultados obtidos estão de acordo com os dados experimentais atualmente disponíveis acerca da conformação da heparina e da contribuição energética de cada resíduo de aminoácido da AT para a formação do complexo com a heparina. A partir dos cálculos ab initio realizados, foi proposto um refinamento na estrutura da heparina determinada por RMN, enquanto que as simulações de DM permitiram reinterpretar aspectos da estrutura tridimensional da AT determinada por cristalografia de raios-X. Adicionalmente, os dados obtidos sugerem que não há requerimento conformacional para a interação do IdoA com a AT Globalmente, os dados indicam que simulações de DM podem ser utilizadas para representar adequadamente a conformação da heparina, assim como para caracterizar e quantificar suas interações com a AT. Assim sendo, propomos o uso de simulações de DM do complexo entre a AT e a heparina, ou entre a AT e compostos derivados da heparina, como uma ferramenta útil no processo de desenvolvimento de novos agentes antitrombóticos e anticoagulantes.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:50:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1542_1.pdf: 2141227 bytes, checksum: 88cfe6fc5518f1ac8f94e30f84348dd6 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Lectinas são proteínas ou glicoproteínas de origem não imune cuja ligação reversível e específica a carboidratos resulta em aglutinação celular. Estas proteínas, presentes em bactérias, invertebrados, vertebrados e plantas são detectadas por ensaio de hemaglutinação. Crataeva tapia L. pertence à família das Capparaceae. Uma lectina de entrecasca de C. tapia, CrataBL, foi purificada à homogeneidade através de fracionamento com sulfato de amônio (Fração 30-60%), seguida por cromatografia de troca iônica (CMCelulose). CrataBL aglutinou eritrócitos de humanos, galinha e coelho (atividade hemaglutinante específica, AHE, 102) e principalmente inibida por glicoproteínas. CrataBL foi termoestável e tratamento com EDTA não afetou a atividade hemaglutinante (AH); atividade não foi alterada após adição de Ca2+, Mn2+, Mg2+ e após tratamento com as enzimas proteolíticas tripsina e quimiotripsina sua AH manteve-se estável. CrataBL migrou como uma única banda após eletroforese para proteínas nativas básicas e duas bandas polipeptídicas de massas moleculares 21.000 e 40.000 Da após SDS-PAGE com ou sem agente redutor; os polipeptídeos foram também detectados usando reagente para glicoproteína e sua porção carboidrato foi estimada em 12,8%. A natureza glicoprotéica de CrataBL foi também revelada por sua interação com lectina glicose/manose em gel de agarose. A massa molecular da lectina por cromatografia de filtração em gel foi de 40.000 Da. CrataBL imobilizada em Sepharose CL-4B adsorveu bioseletivamente caseína, fetuína, ovoalbumina e isolou glicoproteínas de plasma sanguíneo humano. O efeito da lectina na coagulação sanguínea foi avaliado através do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA), tempo de protrombina (TP) e tempo de trombina (TT). CrataBL apresentou atividade anticoagulante somente na via intrínseca, onde o TTPA apresentou-se prolongado (dose-dependente) a partir de uma concentração de 1,25 &#956;g da lectina. CrataBL apresentou toxicidade para Artemia salina com LC50 de 71,7 &#956;g/mL. A atividade antitumoral de CrataBL (20 mg/kg) foi avaliada utilizando Sarcoma 180 implantado em camundongos albinos Swiss (Mus muscullus) e foi detectada por redução do peso do tumor de 50,7%. A atividade antiinflamatória de CrataBL foi avaliada pelo modelo de edema de pata induzido por carragenina e a lectina apresentou efeito antiinflamatório significativo evidenciado pela redução (35,4%) do número de neutrófilos no exsudato inflamatório. CrataBL também apresentou atividade analgésica reduzindo em 34,8% o número de contorções induzidas por ácido acético

Orientador: Gilberto Di Nucci / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T17:30:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_Renata_D.pdf: 3731269 bytes, checksum: ef00e8c346cabde2a33e5eea29d6f2c1 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Desde 1986 acidentes causados pelo contato com lagartas de mariposas da espécie Lonomia obliqua vêm sendo notificados na Região Sul do Brasil. O envenenamento humano por esta espécie resulta em alterações do sistema de coagulação, caracterizando um quadro de coagulação intravascular disseminada, associado a uma síndrome fibrinolítica severa. Estudos demonstraram que o veneno da Lonomia obliqua contém um ativador de fator X e um ativador de protrombina. Uma proteína ativadora de protrombina, denominada LOPAP (¿Lonomia obliqua prothrombin activator protease¿) foi isolada e caracterizada bioquímica e fisiologicamente. Esta enzima é uma serino protease de 69 kDa. Quando testada in vivo, a LOPAP leva à formação de microcoágulos, hemorragia microvascular e pulmonar, sangue incoagulável e uma infiltração leucocitária pulmonar em ratos. Neste trabalho, através de cromatografia de exclusão, seguida por cromatografia de fase reversa (HPLC) isolou-se uma proteína de 20745.7 Da do extrato de cerdas de L. obliqua. Durante o processo, foi avaliada a atividade ativadora de fator X humano purificado in vitro, através de ensaio de cinética enzimática com o uso de substratos cromogênicos. A proteína ativa isolada apresentou imunorreatividade com o soro-antilonômico, produzido pelo Instituto Butantan. Com o uso de técnicas aplicadas a proteômica, determinou-se a seqüência de aminoácidos da proteína com atividade tipo fator Xa. Trata-se de uma proteína nova, ainda não seqüenciada, a qual apresenta grande identidade com proteínas da família das lipocalinas / Abstract: Since 1986 accidents caused by contact with caterpillars of butterflies of the Lonomia obliqua species comes being notified in the South Region of Brazil. The human envenoming for this species results in alterations of the coagulation system, characterizing a disseminated intravascular coagulation, associated to a severe fibrinolytic syndrome. Studies had demonstrated that the venom of the Lonomia obliqua contains a factor X and a prothrombin activator. An activator protein of prothrombin, called LOPAP (¿Lonomia obliqua prothrombin activator protease¿) was isolated and biochemist and physiologically characterized. This enzyme is a serine protease of 69 kDa. When tested in vivo, the LOPAP leads to thrombus formation, microvasculary and pulmonary hemorrhage, unclottable blood and leukocyte infiltration in the lungs at rats. In this work, through chromatography of exclusion, followed by phase reverse chromatography (HPLC), it was isolated a 20745.7 Da protein of the spicules extract of L. obliqua. During the process, it was evaluated the purified human factor X activator activity in vitro, through kinetic assay with the chromogenic substrate use. The isolated protein presented factor Xa like activity and presented immunorreactivity with the antilonomic serum, produced by Butantan Institute. Using techniques applied to the proteomic studies, it was determined the amino acid sequence of the protein with factor Xa like activity. It is a new protein, not yet sequenced, which has large identity with lipocalins family protein / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Base Teórica. Embora vários relatos de casos tenham sugerido uma associação entre a ingesta de vitamina K e a instabilidade da anticoagulação oral, o impacto clínico de diferentes quantidades de vitamina K dietética na anticoagulação oral crônica nunca foi prospectivamente estabelecido. Métodos. Características clínicas e estimativas semi-quantitativas sobre a ingesta de vitamina K foram avaliadas, prospectivamente, em 230 visitas ambulatoriais de pacientes anticoagulados em um hospital público universitário (protocolo observacional). Treze pacientes ambulatoriais anticoagulados cronicamente e estáveis foram arrolados em um ensaio clínico randomizado cruzado de intervenção dietética de 4 dias com aumento e diminuição de 5 vezes da sua ingesta habitual de vitamina K (protocolo experimental randomizado). Resultados. Protocolo observacional: Na análise univariada, identificamos uma associação estatisticamente significativa, progressiva e inversa entre um escore global de ingesta de vitamina K e diferentes níveis de anticoagulação. Na análise multivariada, a ingesta de vitamina K dietética foi independentemente associada com níveis subterapêuticos e anticoagulação excessiva (ambos valores de p =0,04), após ajuste para escolaridade, renda, uso de novos fármacos, aderência à anticoagulação oral e intercorrências clínicas. Protocolo randomizado: Após a dieta restrita em vitamina K, observamos um aumento significativo nos valores do INR (de 2,6 ± 0,5 para 3,3 ± 1,0, p=0,03; do início para o dia 7) enquanto, após a dieta enriquecida, identificamos uma diminuição significativa e mais precoce no INR (de 3,2 ± 0,9 para 2,8 ± 0,7, p=0,005; do início para o dia 4). O efeito da ingesta de vitamina K sobre a variação do INR foi particularmente influenciada pela ingesta média habitual da vitamina. Conclusões. Nossos dados prospectivos reforçam o conceito de que a interação vitamina K e fármacos cumarínicos é de fato real e clinicamente relevante, devendo ser reconhecida como um fator importante e independente que interfere com a estabilidade da anticoagulação oral crônica. / Background. Although several case reports suggest a potential association between vitamin K intake and coagulation instability, the clinical impact of different amounts of vitamin K intake on chronic oral anticoagulation has never been prospectively established. Methods. Clinical characteristics and semi-quantitative queries on vitamin K intake were prospectively evaluated in 230 outpatients’ visits in an anticoagulation clinic (observational protocol). Twelve stable chronically anticoagulated outpatients underwent a randomized crossover trial of 4-day in-hospital dietary intervention of 5-fold increase and 5-fold decrease of baseline vitamin K intake (randomized protocol). Results. Observational protocol: In univariate analysis, we identified a progressive and inverse statistically significant association between an aggregated score of vitamin K intake and different levels of anticoagulation. In multivariate logistic regression, dietary vitamin K intake was independently associated with both overcoagulation and undercoagulation, after adjustment for educational level, income, drug compliance, concurrent illness and clinical comorbidities. Randomized protocol: After the vitamin K depleted diet we observed a significant increase in INR values (from 2.6 ± 0.5 to 3.3 ± 0.9, p =0.005; from baseline to day 7), while after the 4-day enriched diet we identified a significant and earlier decrease in INRs (from 3.1 ± 0.8 to 2.8 ± 0.6, p =0.035; from baseline to day 4). The effect of vitamin K intake on INR variation was particularly influenced by the average baseline intake. Conclusions. Our prospective data strengthen the concept that the vitamin K-coumarin interaction is in fact operative and clinically relevant, and must be acknowledged as a major independent factor that interferes with anticoagulation stability.

Orientador: Joyce Maria Annichino-Bizzacchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T01:02:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DePaula_LaisIvinaSilva_M.pdf: 1198632 bytes, checksum: 0ba443fa4dbfb9c64ad09eacb865b1bb (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Problemas associados à aterosclerose são a causa mais comum de morte na população ocidental. A aterosclerose é uma doença inflamatória, e existe uma associação da coagulação com processos inflamatórios e complicações da doença arterial. Estudos populacionais inicialmente demonstraram uma diminuição do risco de infarto agudo do miocárdio em homens hemofílicos, quando comparados com controles pareados por idade e sexo. Contudo estudos subsequentes não confirmaram esses achados, havendo inclusive um estudo que mostrou aumento do risco de doença aterosclerótica e infarto em pacientes hemofílicos. Um dos fatores que deve ter tido importante papel nessa mudança foi o aumento da sobrevida dos pacientes a partir de 1999, com o advento de terapêuticas mais eficazes. Este estudo teve como objetivo investigar o papel da deficiência grave de fator IX (FIX), no desenvolvimento da doença aterosclerótica, em um modelo de dislipidemia, utilizando animais da linhagem C57Bl/6 deficientes de apolipoproteína E (APOE -/-). Comparamos grupos de animais com deficiência de apoE com ou sem deficiência de FIX (hemofílicos B - HB), através da avaliação quantitativa das lesões, na raiz e em toda sua extensão aórtica; e caracterização histológica das lesões na raiz aórtica por imunofluorecência. Nossos resultados mostraram que os animais com hemofilia B e deficiência de apoE apresentaram o mesmo grau de formação de placa aterosclerótica quando comparados com o grupo controle (APOE -/-), com 8 e 22 semanas de dieta. Portanto, a deficiência do fator IX não protegeu contra a formação de lesões ateroscleróticas na raiz e em toda extensão aórtica. O mesmo ocorreu na avaliação qualitativa, quando comparamos a porcentagem total de macrófagos e de células musculares lisas. Independente dos seus elevados níveis de colesterol e triglicerídeos. Contudo, foi evidente a diminuição na quantidade de macrófagos M1, através da produção de IL - 1?, em comparação aos camundongos controles, deficientes apenas de apoE. Um dado intrigante é que apesar de termos observado uma diminuição de macrófagos M1 nos animais hemofílicos, isso não foi acompanhado por uma diminuição nas lesões ateroscleróticas. Portanto, apesar da hipocoagulabilidade e do perfil de resposta dos macrófagos, nossos resultados sugerem que outros fatores foram mais importantes no desenvolvimento da aterosclerose. Nossos resultados corroboram os achados mais recentes de que pacientes hemofílicos também são susceptíveis ao desenvolvimento de doença aterosclerótica, incluindo doença coronariana / Abstract: Problems associated with atherosclerosis are the most common cause of death in the western population. Atherosclerosis is an inflammatory disease, and there is a coagulation associated with inflammatory processes and complications of arterial disease. Population studies initially demonstrated a decreased risk of acute myocardial infarction in men hemophiliacs compared with controls matched for age and sex. But subsequent studies have not confirmed these findings, including having a study that showed increased risk of atherosclerotic disease and stroke in hemophilia patients. One of the factors that must have played an important role in this change was the increased survival of patients since 1999, with the advent of more effective therapies. This study aimed to investigate the role of severe deficiency of factor IX (FIX), in the development of atherosclerosis, dyslipidemia in a model using animals C57BL strain / 6 deficient apolipoprotein E (APOE - / -). Groups of animals compared with apoE-deficient or without FIX deficiency (hemophilia B - HB) by quantitative evaluation of lesions in the root and aortic its entire extension; and histological characterization of the lesions in the aortic root by immunofluorescence. Our results showed that animals with hemophilia B and apoE deficiency showed the same degree of atherosclerotic plaque formation when compared with the control group (APOE - / -), with 8 and 22 weeks of diet. Therefore, factor IX deficiency does not protect against the formation of atherosclerotic lesions in the aortic root and throughout extension. The same occurred in the qualitative evaluation, when comparing the total percentage of macrophages and smooth muscle cells. Whatever your high cholesterol and triglycerides. However, it was apparent decrease in the amount of M1 macrophages by IL - 1? compared to control mice, apoE deficient only. A given intriguing is that although we observed a decrease of M1 macrophages in hemophiliacs animals, this was not accompanied by a decrease in atherosclerotic lesions. Therefore, despite the hypocoagulability and macrophage response profile, our results suggest that other factors are more important in the development of atherosclerosis. Our results support the latest findings that hemophilia patients are also susceptible to developing atherosclerosis, including coronary heart disease / Mestrado / Fisiopatologia Médica / Mestra em Ciências