Made available in DSpace on 2015-03-26T13:52:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 297814 bytes, checksum: 8b9399570272dbe1ec41db69f73626b6 (MD5) Previous issue date: 2006-08-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The gene encoding nitrate reductase in Colletotrichum lindemuthianum, nit1, was isolated and characterized. Its nucleotide sequence and regulation in response to different nitrogen sources were analyzed. The gene nit1 has 2,787 base pairs (bp) bearing a single 696 bp intron starting at nucleotide 1,808. This intron is localized in a conserved region when compared to introns present in nitrate reductase genes of other fungi. Hovever, its similarity with them is restricted to the consensus splicing regions. Four TATC sequences, possibly related to binding of the general positive regulatory protein NIT2, were found in the upstream regulatory region of nit1, as well as other consensus sequences such as TATA and GC boxes. A putative binding site for NIT4, a specific regulatory protein, was also found in the 340 position. There is a putative mRNA polyadenilation site at the downstream 2,826 position. The protein translated from nit1 comprises 905 amino acid residues with a molecular mass of 101,1 kDa and presents high degree of identity with the cognate proteins in Metarhizium anisopliae (62,43 %), Magnaporte grisea (62,27%), Verticillium fungicola (60,15%), Botryotinia fuckchiana (58,30%), and Aspergillus fumigatus (51,93%). In mycelia cultivated in the presence of nitrate, nit1 was expressed after 15 min. Transcription was repressed in mycelia grown in medium containing either ammonium, urea, or glutamine. On glutamine, the level of transcription was apparently basal. / O gene que codifica para a nitrato redutase de Colletotrichum lindemuthianum, nit1, foi isolado e caracterizado. Sua seqüência e regulação em resposta a diferentes fontes de nitrogênio foram analisadas. A análise da seqüência do gene nit1 indicou que ele possui 2.787 pb com um único íntron de 69 pb iniciando no nucleotídeo 1.808. Este íntron está localizado numa região conservada de íntrons presentes no gene da nitrato redutase em outros fungos. No entanto, a identidade entre eles se restringe às regiões consenso responsáveis pela excisão. A região reguladora do gene nit1, além das seqüências consenso gerais, apresenta quatro seqüências TATC responsáveis pela ligação da proteína reguladora geral positiva NIT2. Um possível sítio da ligação da proteína reguladora da via específica, NIT4, também foi localizado nessa região, na posição -340. Além disso, na região 3 não traduzida foi encontrado um possível sítio para poliadenilação do mRNA localizado na posição 2.826. A proteína deduzida do gene nit1 gerou uma seqüência de 905 aminoácidos com massa molecular de 101,1 kDa e apresentou alta identidade com as proteínas correspondentes em Metarhizium anisopliae (62,43%), Magnaporthe grisea (62,27%), Verticillium fungicola (60,15%), Botryotinia fuckeliana (58,30%) e Aspergillus fumigatus (51,93%). A expressão do gene nit1 em C. lindemuthianum foi avaliada em micélios cultivados em diferentes fontes de nitrogênio, em condições de ativação e repressão. O gene foi expresso na presença de nitrato a partir de 15 minutos após entrar em contato com esta fonte de nitrogênio, tendo atingido a expressão máxima com 360 minutos. A transcrição foi reprimida em micélios cultivados em amônio, uréia e glutamina. Em glutamina, após 60 minutos de repressão, não foi possível detectar a presença de transcritos desse gene.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:44:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGPV10MA102.pdf: 27178752 bytes, checksum: 39b01ef3a94b25575ab96d69f1cc7b69 (MD5) Previous issue date: 2010-11-05 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / On 2008/09 and 2009/10 seasons, 21 bean materials were evaluated, in wich, four of them were commercial cultivation Pérola, SCS 202 Guará, IPR Uirapuru and |BRS Supremo and 17 were accesses from active germoplasma bean ban of Santa Catarina State University, BAF/UDESC, Lages. Two experiments were done. One experiment was realized in field of UDESC, where were made plant anthracnose incidence, analyzing 10 plants in random, on the two central lines of each parcel; leaflet incidence: collecting inside of the two central lines of each parcel, 60 leaflet lesions number evaluations: counting number of lesions by leaflet. The second experiment was realized at the plant pathology laboratory of UDESC, where the Colletotrichum lindemuthianum incidence were evaluated in three different seed sanity tests, in wich two culture environment BDA (potato-dextrose-agar) and V8 (tomato juice) and a Blotter Test detection method, where the 200 seeds lots of each material evaluated were disposed in gerbox boxes containing the respective tests, in a repetition of a 50 seeds by box to each experiment proportion. On field evaluations, 7 BAF accesses showed themselves more promising in relation to the commercial cultivation tested, showing better resistance, in which BAF s 02, 10 and 14 first experiment year and BAF s 07, 45, 60 and 148, in second experiment year. In seed sanity tests, the V8 media showed the best seed pathogen detection method and 7 accesses showed a biggest seed anthracnose incidence, related to the tested commercial cultivation. In 2008/09 season, the cultivar SCS 202 Guará presented a bigger seed anthracnose incidence, differing significantly of all tested material. In 2009/10 season, the BAF 07 showed a bigger seed anthracnose incidence, followed by cultivar IPR Uirapuru and BAF s 02, 10, 45 and 60. It s concluded that there are inside BAF/UDESC promising material showing resistance to anthracnose disease and the C. lindemuthianum was detected with more sensibility in V8 media / Nas safras 2008/09 e 2009/10, foram avaliados 21 materiais de feijão, sendo que destes, quatro cultivares comerciais: Pérola, SCS 202 Guará, IPR Uirapuru e BRS supremo e 17 acessos do banco Ativo de Germoplasma de Feijão da Universidade do Estado de Santa Catarina (BAF/UDESC), Lages, SC. Foram conduzidos dois experimentos, sendo um deles na área experimental da UDESC, onde foram feitas avaliações de incidência de antracnose em plantas, analisando-se 10 plantas aleatoriamente, nas duas linhas centrais de cada parcela; incidência em folíolos, coletando-se dentro das duas linhas centrais de cada parcela, 50 folíolos de número de lesões por folíolos; contando número de lesões por folíolo. Um segundo experimento foi realizado no laboratório de fitopatologia da UDESC, onde se quantificou a incidência de colletotrichum lindemuthianum em três diferentes testes de sanidade de sementes, sendo dois meios de cultura organizados BDA (Batata-Dextrose-Ágar) e V8 (Suco de tomate) e o método de detecção Blotter Test. Foram plaqueadas 2º sementes de cada acesso em caixas de gerbox contendo os respectivos testes, sendo quatro repetições de 50 sementes. Nas avaliações de campo, sete acessos do BAF foram mais promissores em relação às cultivares comerciais testadas, no que diz respeito à maior resistência, sendo os BAF s 02, 10 e 14 em 2008/09 e os BAF s 07, 45, 60 e 148, em 2009/10. Nos testes de sanidade de sementes o meio V8 foi o melhor método de detecção do patógeno. Sete acessos mostraram maior incidência de C. lindemuthianum em sementes em relação às cultivares comerciais testadas. Na safra 2008/09 a cultivar SCS 202 Guará apresentou maior incidência do patógeno em sementes, diferindo significativamente de todos os materiais testados. Em 2009/10 o BAF 07 mostrou maior incidência do fungo em sementes, seguidos da cultivar IPR Uirapuru e dos BAF s 02, 10, 45 e 60. Conclui-se que existem no BAF/UDESC materiais promissores quanto à reação à antracnose e que o fungo C. lindemuthianum é detectado com maior sensibilidade em sementes de feijão no meio de cultura V8

Made available in DSpace on 2017-07-25T19:30:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carlos E C Truylio.pdf: 2023652 bytes, checksum: f7445141bbdc3047ed1e8401c8bc1697 (MD5) Previous issue date: 2015-08-18 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / management of crop diseases. The objective of this study was to evaluate different alternative products against anthracnose, with the detached leaf assay method, and in field conditions in common beans. The experiment with detached leaf assay method was conducted in laboratory. The experimental design was completely factorial randomized in a factorial arrangement 10 (treatment) x 2 (application or not in half the leaf) with 5 repetitions. The evaluation of severity and area under the anthracnose progress curve was performed. The experiments under field conditions were conducted in 2013/2014 and 2014/2015 harvest, at Fazenda Escola Capão da Onça. The experimental had a randomized blocks design, with four repetitions. The evaluation of severity, area under the disease progress curve and anthracnose index in the pods, in addition to crop production components were performed. The treatments for the experiments were: 1- V- 6 (Meristem enzymes, 5,4%; Mn, 2,5%; Zn, 1,9%; Mo, 0,16%), 2- Wert plus (toxins produced by cultivating from different microorganisms, such as Bacillus subtilis, Gliocladium catenulatum, Trichoderma sp, Trichoderma harzianum, Azotobacter chroococcum, e micronutrients Cu, Zn e Mg), 3- High Roots (12% of seaweed; 4,8% of K2O; 0,2% of CaO), 4- Max Fruit (4,61% of calcium), 5- Rocksil (20,56% of Al2O3, 17,43% of SiO2; 9,82% of S; 1,31 of CaO; 0,34% of TiO2; 0,18 of MgO; 0,16% of Fe2O3; 0,1% of P2O5), 6- Herbagreem (36,7% of CaO; 17 to 20% of SiO2; 2,4% of MgO; 3,4% of Fe2O3; 0,7% of K2O; 0,5% of Na2O; 0,4% of SO3; 0,2% of P2O5; 0,1% of MnO; 1 mg kg-1 of B; 13 mg kg-1 of Co; 26 mg kg-1 of Cu; 34 mg kg-1 of Zn), 7-Fluisan (hop extract: 80,7 %), 8- Herbagreen + Fluisan, 9- trifloxystrobin + tebuconazol and 10- control. In the detached leaf assay, Wert Plus had a negatively influence, increasing the severity of the disease. At field conditions, there was no statistical difference in severity between treatments in both harvests. The Wert Plus treatment had a higher rate of anthracnose on pods in 2013/2014 harvest. The yield components of culture, number of plants per meter, number of pods per plant, number of seeds per pod, weight of 100 grains and productivity were not affected by treatments. / manejo das doenças de plantas cultivadas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito de diferentes produtos alternativos, contra a antracnose na cultura do feijão, em experimento em folha destacada e em condições de campo. O experimento em folha destacada foi conduzido em laboratório. O delineamento experimental foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 10 (produtos) x 2 (aplicação ou não em metade da folha) com 5 repetições. Foi realizada a avaliação de severidade e calculada a área abaixo da curva de progresso da antracnose. Os experimentos em condições de campo foram realizados nas safras 2013/2014 e 2014/2015, na Fazenda Escola Capão da Onça. O delineamento experimental foi de blocos ao acaso com 4 repetições. Foi realizada a avaliação da severidade, calculada a área abaixo da curva de progresso da doença e o índice de antracnose nas vagens, além dos componentes de rendimento da cultura. Os tratamentos realizados foram: 1 - V-6 (5,4% de enzimas de meristema;2,5% de Mn; 1,9% de Zn; 0,16% de Mo,), 2 - Wert plus (toxinas produzidas pelo cultivo de diferentes microrganismos: Bacillus subtilis, Gliocladium catenulatum, Trichoderma sp, Trichoderma harzianum, Azotobacter chroococcum, e micronutrientes (Cu, Zn e Mg), 3 - High Roots (algas marinhas a 12%; K2O a 4,8%; CaO a 0,2%), 4 - Max Fruit (4,61% de cálcio), 5 - Rocksil (20,56% de Al2O3, 17,43% de SiO2; 9,82% de S; 1,31 de CaO; 0,34% de TiO2; 0,18 de MgO; 0,16% de Fe2O3; 0,1% de P2O5), 6 - Herbagreem (36,7% de CaO; 17 a 20% de SiO2; 2,4% de MgO; 3,4% de Fe2O3; 0,7% de K2O; 0,5% de Na2O; 0,4% de SO3; 0,2% de P2O5; 0,1% de MnO; 1 mg kg-1 de B; 13 mg kg-1de Co; 26 mg kg-1 de Cu; 34 mg kg-1 de Zn), 7 - Fluisan (extrato de lúpulo: 80,7 % de planta e 19,3% de água), 8 - Herbagreen + Fluisan, 9 - trifloxistrobina + tebuconazole e 10 - testemunha. No teste da folha destacada, os tratamentos V-6, Wert Plus, High Roots, Max Fruit, Rocksil, Herbagreem, Fluisan, Herbagreen +Fluisan e trifloxistrobina + tebuconazole, não apresentaram potencial de induzir resistência contra C. lindemuthianum. O tratamento Wert Plus aumentou a severidade da doença. No experimento a campo, não se observou diferença estatística na severidade entre os tratamentos nas duas safras. O tratamento Wert Plus apresentou um maior índice de antracnose nas vagens na safra 2013/2014. Os componentes de rendimento da cultura, número de plantas por metro, número de vagens por planta, número de grãos por vagem, massa de 100 grãos e produtividade não foram afetados pelos tratamentos.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The massive use of chemicals to control plant diseases cause numerous negative impacts on agricultural production system on non-target organisms, consumers and farmers. Therefore, the use of biological control organisms such as Trichoderma harzianum and Bacillus subtilis, able to act on the control of plant pathogens and / or induce resistance in plants is characterized as an important and with great potential yet to be explored tool. The objective of this study was to identify metabolites produced by these organisms grown in liquid medium and test the use of filtered culture and of living organisms, applied via seed or leaf in the control of anthracnose in beans. Biological control organisms T. harzianum and B. subtilis were grown in liquid culture medium for 96 h and 12 h photoperiod. After incubation, the media were filtered through Millipore membrane extraction of the bacterial cells and spores. Metabolites were extracted with four organic solvents, ethanol, methanol, ethyl acetate and hexane and subjected to gas chromatography and mass spectrometry and the chromatograms generated for each organism and solvent used. The evaluation of the induction of defense responses in plants was held in cultivating Minuano with susceptibility reaction to the pathogen Colletotrichm lindemuthianum. The bean plants were evaluated for disease index, area under the disease progress curve and changes in peroxidase activity, β-1,3-glucanase and IAA - oxidase, as well as certain fresh and dry weight of plants in two stages, before and after inoculation of the challenging pathogen. The chromatographic identification of compounds from culture filtrates showed that both test organisms produce fatty acids and oxylipins in liquid medium with antifungal action and inducing defense responses, respectively. In the assessments performed in bean plants, both T. harzianum as B. subtilis reduced the severity and progress of the disease, and produced significant increases in the activities of peroxidase isozymes and β-1,3-glucanase after inoculation of the pathogen, indicating the activation of induced resistance. The induction of responses did not affect the dry mass of the plants, which shows no energy expenditure that could affect plant growth. The best answers to T. harzianum are observed in foliar applications, either spore suspension or culture filtrate, as for B. subtilis, the best answers are observed in the foliar application of culture filtrate. For ease of production, culture filtrates of Trichoderma harzianum and Bacillus subtilis can give bioproducts for agricultural use. / O uso massivo de produtos químicos para controle de doenças em plantas causa inúmeros impactos negativos no sistema de produção agrícola, sobre organismos não alvo, consumidores, agricultores e o ambiente. Diante disso, a utilização de organismos de controle biológico, como Trichoderma harzianum e Bacillus subtilis, capazes de agir no controle de fitopatógenos e/ou induzir resistência em plantas, se caracteriza como uma ferramenta importante e com muito potencial ainda a ser explorado. O objetivo deste trabalho foi identificar metabólitos produzidos por estes organismos cultivados em meio líquido e testar a utilização destes filtrados de cultura, bem como dos organismos vivos, aplicados via semente ou foliar, no controle da antracnose em feijoeiro. Os organismos de controle biológico T. harzianum e B. subtilis foram cultivados em meio de cultura líquido por 96h e fotoperíodo de 12h. Após a incubação, os meios foram filtrados em membrana milipore para extração dos esporos e das células bacterianas. Os metabólitos foram extraídos com quatro solventes orgânicos, etanol, metanol, acetato de etila e hexano e submetidos à cromatografia gasosa e espectrofotometria de massa e gerados cromatogramas para cada organismo e solvente utilizado. A avaliação da indução de respostas de defesa em plantas foi realizada na cultivar Minuano, com reação de suscetibilidade ao patógeno Colletotrichum lindemuthianum. As plantas de feijão foram avaliadas quanto ao índice de doença, área abaixo da curva de progresso da doença e às alterações nas atividades de peroxidase, β-1,3-glucanase e AIA oxidase, assim como determinada a massa fresca e seca das plantas em dois momentos, antes e após a inoculação do patógeno desafiante. A identificação cromatográfica dos compostos presentes nos filtrados de cultura demonstrou que ambos os organismos testados produzem ácidos graxos e oxilipinas em meio líquido, com ação antifúngica e indutoras de respostas de defesa, respectivamente. Nas avaliações realizadas em plantas de feijão, tanto T. harzianum quanto B. subtilis, reduziram a severidade e o progresso da doença, assim como produziram acréscimos significativos nas atividades das isoenzimas peroxidase e β-1,3-glucanase após a inoculação do patógeno, indicando a ativação da resistência induzida. As respostas de indução não comprometeram o acúmulo de massa seca das plantas, o que demonstra não haver gasto energético capaz de comprometer o crescimento das plantas. As melhores respostas para T. harzianum são observadas nas aplicações foliares, seja de suspensão de esporos ou filtrado de cultura, já para B. subtilis, as melhores respostas são observadas na aplicação foliar do filtrado de cultura. Pela facilidade de produção, filtrados de cultura de Trichoderma harzianum e Bacillus subtilis podem originar bioprodutos para uso agrícola.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1393738 bytes, checksum: a972ec00e49dcfa2c5d44a8c6f9480a0 (MD5) Previous issue date: 2009-02-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The plants produce antifungous proteins and specialized antibiotics (phytoanticipins and phytoalexins) in order to defend from phytopathogenic fungus. Only the pathogens able to avoid those defensive plant responses at the initial stages of the infection are able to cause disease. The fungus Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Briosi & Cavara is the etiological agent of the anthracnose in the common bean plant (Phaseolus vulgaris L.), that is an important disease contributing to reduce the productivity of the bean plant crop in Brazil. The genes abcCl1 and cypCl1 were isolated from this phytopathogen and their deduced aminoacid sequences have high similarity with ABC transporters and cytochromes P450, respectively. Those genes are found in unique copy and clustered in genome of the fungus, as revealed by either the sequencing of one DNA 8,4 kb fragment from the genomic library of C. lindemuthianum and the hybridization profile. Those genes also show an increased expression in response to different toxic compounds, mainly when the fungus is grown at the presence of eugenol, hygromycin and pisatin phytoalexin. Therefore, besides their genes to be physically linked, the proteins ABCCl1 and CYPCl1 can also be involved in the same functional process: the fungus resistance to the toxic compounds produced by plants or antagonistic microorganisms. In the functional analysis of the gene abcCl1, the mutants abcCl1− showed reduction in their virulence to the leaf of the common bean plant, compared with the wild line of C. lindemuthianum. Those results indicate the gene abcCl1 to codify an ABC transporter that is necessary to pathogenicity of C. lindemuthianum, probably because providing the fungus with the ability to overcome the defense mechanism of the plant. The cytochrome P450, that is codified by the gene cypCl1, can represent a complementary detoxification mechanism used by this fungus during the establishment of the disease. / Para se defenderem de fungos fitopatogênicos, as plantas produzem proteínas antifúngicas e antibióticos especializados (fitoanticipinas e fitoalexinas). Somente patógenos que conseguem evitar estas respostas defensivas da planta nos estágios iniciais da infecção são capazes de causar doença. O fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magnus) Briosi & Cavara é o agente etiológico da antracnose do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.), uma importante doença que contribui para redução da produtividade da cultura do feijoeiro no Brasil. Neste fitopatógeno foram isolados dois genes, abcCl1 e cypCl1, cujas sequências de aminoácidos deduzidas possuem alta similaridade com transportadores ABC e citocromos P450, respectivamente. Estes genes estão presentes em cópia única e agrupados no genoma do fungo, conforme revelado no sequenciamento de um fragmento de DNA de 8,4 kb da biblioteca genômica de C. lindemuthianum, bem como no perfil de hibridização. Estes genes também apresentam aumento de expressão em resposta a diferentes compostos tóxicos, principalmente quando o fungo é crescido na presença de eugenol, higromicina ou fitoalexina pisatina. Assim, além de seus genes estarem ligados fisicamente, as proteínas ABCCl1 e CYPCl1 podem, também, estarem envolvidas em um mesmo processo funcional: a resistência do fungo a compostos tóxicos produzidos por plantas ou microrganismos antagonistas. Na análise funcional do gene abcCl1, foi observado que mutantes abcCl1− apresentam redução na virulência a folhas de feijoeiro comum, em comparação com a linhagem selvagem de C. lindemuthianum. Estes resultados indicam que o gene abcCl1 codifica um transportador ABC, que é necessário para a patogenicidade de C. lindemuthianum, provavelmente por conferir ao fungo a capacidade de superar algum mecanismo de defesa da planta. O citocromo P450, codificado pelo gene cypCl1, pode representar um mecanismo complementar de destoxificação empregado por este fungo durante o estabelecimento da doença.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1830082 bytes, checksum: ec907521bfa48f79975e5fe22c20d972 (MD5) Previous issue date: 2009-10-01 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The filamentous fungus Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) Briosi & Cav., causal agent of anthracnose, is an important pathogen of common bean (Phaseolus vulgaris L.). This fungus is an excellent model organism for understanding the infection process of pathogenic fungi. A C. lindemuthianum non-pathogenic mutant (LVSa1) with partial deficiency in the production of melanin was obtained through plasmid insertional mutagenesis. The aim of this study was to isolate and characterize the interrupted gene in theLVSa1 mutant and demonstrate its importance in the plant infection process. The mutated gene was isolated from a C. lindemuthianum genomic bank and named slnCl1. The sequence analysis revealed that slnCl1 encodes a histidine kinase. The sequence presents an ORF of 3555 base pairs, interrupted by three putative introns, containing 51, 87 and 89 bp. The multiple alignment of the deduced sequence of the protein, including sequences of all histidine kinases classes available in the databases, grouped SlnCl1 in class VI; possessing highly conserved regions characteristic of histidine kinase, and related to its function. A mutant with partial deficiency for the production of melanin was obtained through site-directed insertional mutagenesis using a gene fragment. This mutant showed a significant reduction in the ability to infect bean leaves, demonstrating that SlnCl1 is important to the pathogenicity process of this fungus. As many histidines kinases already described in fungi, SlnCl1 is involved in osmoregulation and adaptation to different osmotic concentrations in C. lindemuthianum. Furthermore, through this sensor protein, the fungus can distinguish the osmotic stress caused by high concentrations of sugars and salts. The mutant was sensitive to fungicides that target a MAPK signaling pathway, probably regulated by slnCl1. The results suggest that C. lindemuthianum must have other histidines kinases involved in the osmoregulation process. The study of the signaling cascade regulated by slnCl1 may represent a major advance in understanding the pathogenicity and developing new methods to combat this disease. / O fungo filamentoso Colletotrichum lindemuthianum (Sacc & Magnus) Briosi & Cav., agente causal da antracnose, é um importante patógeno do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.). Esse fungo é um excelente modelo de estudo para o entendimento do processo de infecção de fungos fitopatogênicos. Por meio de mutagênese por inserção de plasmídeo foi obtido um mutante (LVSa1) não patogênico de C. lindemuthianum com deficiência parcial na produção de melanina. O objetivo desse trabalho foi isolar e caracterizar o gene interrompido no mutante LVSa1 e comprovar a sua importância no processo de infecção da planta. O gene mutado foi isolado de um banco genômico de C. lindemuthianum e denominado slnCl1. A análise da sequência revelou que slnCl1 codifica uma histidina quinase. A sequência apresenta uma ORF de 3555 pares de bases, interrompida por três íntrons putativos, contendo 51, 87 e 89 pb. O alinhamento múltiplo da sequência deduzida da proteína, com sequências de todas as classes de histidinas quinases disponíveis nos bancos de dados agrupou SlnCl1 na classe VI, possuindo regiões extremamente conservadas características de histidina quinases e relacionadas a sua função. Por meio de mutagênese insercional sítio dirigida utilizando um fragmento do gene, foi obtido um mutante que apresentou deficiência parcial na produção de melanina. Esse mutante apresentou uma redução significativa na capacidade de infectar folhas de feijoeiro, demonstrando que SlnCl1 é importante no processo de patogenicidade desse fungo. Como muitas histidinas quinases já descritas em fungos, SlnCl1 apresenta envolvimento no processo de osmorregulação e adaptação a diferentes concentrações osmóticas em C. lindemuthianum. Além disso, por meio dessa proteína sensora, o fungo pode distinguir o estresse osmótico causado por altas concentrações de açúcares e de sais. O mutante mostrou-se sensível a fungicidas que tem como alvo uma via de sinalização MAPK, provavelmente regulada por slnCl1. Os resultados obtidos sugerem que C. lindemuthianum deve possuir outras histidinas quinases envolvidas no processo de osmorregulação. O estudo da cascata de sinalização regulada por slnCl1 pode representar um grande avanço no entendimento do processo de patogenicidade e na elaboração de novos métodos de combate a doença.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 4267302 bytes, checksum: e9b9d7cbe9f5e7cfd714ca533302e571 (MD5) Previous issue date: 2011-02-18 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Colletotrichum lindemuthianum is the causal agent of common bean antracnose. This fungus, like other phytopatogens, is constantly exposed to several toxic compounds from many sources, what makes indispensable the development of protection strategies against these products. One of these strategies is related to membrane transporters proteins like the Major Facilitator Superfamily (MFS), that could provide protection against toxic compounds or minimizing its action, being essential for the fungal cellular viability maintenance. In this context, this work aimed to inactivate the mfs1 gene encoding a MFS membrane transporter and investigate the phenotypic alterations entailed in an isolate C. lindemuthianum mutant LV49 (race 89) for this gene. To obtain the mutant, it was necessary to confirm if mfs1 gene was organized as a single copy in the C. lindemuthianum genome. The mfs1 gene can be organized in a cluster in view that a second open reading frame, which corresponds to a transcription factor superfamily containing a Zn2-Cys6 domain, identified as clft1, was observed in 3` downstream region of this gene. The mfs1 promoter analysis revealed a putative mfs1 element that is recognized by proteins of this family, what suggests that this protein could be related to the mfs1 expression regulation. The Split-Marker technique proved to be efficient in C. lindemuthianum mfs1 gene inactivation enabling the study of mfs1 function in a mutant by specific integrations without ectopic integrations. The Δmfs1 mutant showed no differences in drug sensibility profile when commonly drugs employed in antracnose control was used and in relation to pathogenicity, the mutant symptoms started earlier on susceptible bean leaves, showing a stress situation due to the genic product absence. It was also observed that mfs1 presents a primordial role in C. lindemuthianum cellular viability maintenance, what was confirmed by the altered conidiation observed, confirming that this gene encodes for a specific hexose membrane transporter, specifically carbon sources like glucose, mannose and fructose. The protein Mfs1 phylogenetic analysis allow us to conclude that this transporter is a SP family member and the MFS proteins are strongly related with the transported substance. Studies conducted with MFS transporters are important to broaden the knowledge of these proteins and to understand the cell viability in C. lindemuthianum. / O fungo Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose do feijoeiro comum. Este fungo, assim como outros fungos fitopatógenos estão constantemente expostos a uma grande variedade de compostos tóxicos provenientes de várias fontes, o que torna imprescindível para estes o desenvolvimento de mecanismos de proteção contra estes produtos. Uma dessas estratégias está relacionada com a presença de proteínas transportadoras de membrana, como as pertencentes à Principal Superfamília Facilitadora (MFS), que podem fornecer aos fungos proteção contra compostos tóxicos evitando ou minimizando a ação destes, sendo em sua maioria essenciais para a manutenção da viabilidade celular. Este trabalho teve como objetivo inativar o gene mfs1 que codifica para um transportador de membrana da família MFS e investigar as alterações fenotípicas ocasionadas em um mutante C. lindemuthianum isolado LV49 (raça 89) para este gene. Para a obtenção do mutante foi necessário confirmar que o gene mfs1 encontrava-se presente em cópia única no genoma de C. lindemuthianum. O gene mfs1 pode estar organizado em um conjunto de genes com funções relacionadas, uma vez que downstream à região 3’ deste foi identificada uma segunda janela aberta de leitura correspondente a uma proteína da superfamília de fatores de transcrição contendo o domínio Zn2-Cys6, identificado como clft1. A análise do promotor do gene mfs1 revelou um putativo cis elemento de reconhecimento por proteínas desta família, o que sugere que esta proteína possa estar relacionada à regulação da expressão de mfs1. A técnica de Split- Marker mostrou-se eficiente na inativação do gene mfs1 de C. lindemuthianum, possibilitando o estudo da função do gene mfs1, em um mutante com integração específica e livre de integrações ectópicas. O mutante Δmfs1 não mostrou diferenças no perfil de sensibilidade a drogas comumente empregadas no controle da antracnose e em relação à patogenicidade, o mutante induziu mais precocemente os sintomas em folhas de feijoeiro susceptível, evidenciando uma situação de estresse decorrente da ausência do produto gênico. Foi observado também que o gene mfs1 exerce um papel primordial na manutenção da viabilidade celular de C. lindemuthianum, fato este confirmado pela conidiação alterada e pela confirmação de que este gene codifica para um transportador de membrana específico no transporte de hexoses, especificamente glicose, manose e frutose, uma vez que o mutante Δmfs1 mostrou crescimento reduzido quando cultivado em meios contendo apenas glicose, manose e frutose como fontes de carbono. A análise filogenética da proteína Mfs1 associada aos outros resultados obtidos nos sugere que este transportador é um membro da família SP, e que as proteínas MFS estão fortemente relacionadas com o tipo de substância que é transportada. Estudos de natureza básica sobre transportadores MFS são importantes para ampliar os conhecimentos sobre estas proteínas e a viabilidade celular em C. lindemuthianum.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 952076 bytes, checksum: 7fbcb43414ecacd3439620826b6172cd (MD5) Previous issue date: 2012-07-20 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Colletotrichum lindemuthianum is the causal agent of common bean anthracnose. Genes that encode cell wall-degrading enzymes are essential for the development of this disease. The pectinases are characterized as the most important group of cell wall- degrading enzymes produced by phytopathogen fungi. The gene coding for pectate lyase, pecCl1, was previously identified in a suppressive subtractive library of bean infected with C. lindemuthianum. Isolation of the gene pecCl1 made it possible to obtain mutants and to analyze the regulation of this gene during development of anthracnose, determining whether the pectate lyase is a pathogenic factor. Thus, the aim of our study was structurally and functionally characterize the gene encoding pectate lyase in C. lindemuthianum. Initially, was performed the structural analysis of the gene pecCl1. The complete nucleotide sequence of the gene pecCl1 was deposited in Genbank with accession number JX270683. The analysis of the promoter region revealed some putative cis-elements and potential binding motifs of transcription factors involved in the regulation of pectate lyase gene expression. The deduced amino acid sequence of pecCl1 showed sequence identity with the pectate lyase F of Colletotrichum higginsianum and the pectate lyase C of Glomerella graminicola M1.001. Furthermore, it was found putative conserved domain pfam03211 of the pectate lyases superfamily. The gene pecCl1 is represented by a single copy in the C. lindemuthianum genome. However, into the genome of Colletotrichum graminicola, three sequences encoding pectate lyase showed sequence identity with the gene pecCl1 of C. lindemuthianum, and into the genome of C. higginsianum seven sequences encoding pectate lyase showed sequence identity with the gene pecCl1 of C. lindemuthianum, indicating that the C. lindemuthianum genome can possess other genes encoding pectate lyase. Phylogenetic analysis of pectate lyase amino acid sequences of filamentous fungi exhibited the formation of two distinct groups which are grouped on the basis of members of the pectate lyases multigene family. The Split-Marker technique was effective in C. lindemuthianum pecCl1 gene inactivation, allowing the study of pecCl1 function in a mutant by specific integrations and without ectopic integrations. The pecCl1 gene inactivation did not lead to complete loss of the pectate lyase activity, and consequently only decreased anthracnose symptoms in its host, which is consistent with the presence of other genes coding pectate lyase, allowing greater flexibility in pathogen aggressiveness. The analysis of differential expression of gene pecCl1 by qPCR was performed at different stages of bean infection and were observed expression levels of pecCl1 at all stages of development of the fungus in the plant, but a significant increase was observed five days after infection, in the onset of necrotrophic stage. At this stage, secondary hyphae cause extensive degradation of plant cell wall through the secretion of wide range of depolymerases, among these, the pectate lyase. Thus, the pectate lyase encoded by the gene pecCl1 is important to aggressiveness of C. lindemuthianum. The analysis of pectate lyases in C. lindemuthianum can not only assist in understanding the disease, but may also lead to discovery of one more target for disease control. / Colletotrichum lindemuthianum é o agente causal da antracnose do feijoeiro comum. Genes que codificam enzimas que degradam a parede celular são essenciais para o desenvolvimento dessa doença. As pectinases são caracterizadas como o grupo de enzimas que hidrolisam a parede celular mais importante produzidas por fungos fitopatogênicos. O gene pecCl1, que codifica pectato liase, foi previamente identificado em uma biblioteca subtrativa supressiva de feijoeiro infectado com C. lindemuthianum. O isolamento do gene tornou possível a obtenção de mutantes e análise da regulação deste gene durante o desenvolvimento da antracnose, visando determinar se a pectato liase é um fator de patogenicidade. Desta forma, o objetivo do nosso trabalho foi caracterizar estruturalmente e funcionalmente o gene que codifica pectato liase em C. lindemuthianum. Inicialmente, foi realizada a análise estrutural do gene pecCl1. A sequência completa de nucleotídeos do gene pecCl1 foi deposita no Genbank com número de acesso JX270683. A análise da região promotora revelou alguns possíveis cis-elementos e sítios de ligação a fatores de transcrição envolvidos na regulação da expressão gênica da pectato liase. A sequência de aminoácidos deduzida de pecCl1 apresentou identidade de sequências com a pectato liase F de Colletotrichum higginsianum e a pectato liase C de Glomerella graminicola M1.001. Além disso, detectou-se um possível domínio conservado pfam03211 da superfamília de pectato liases. O gene pecCl1 encontra-se representado por uma cópia única no genoma de C. lindemuthianum. No entanto, no genoma de Colletotrichum graminicola, três sequências que codificam pectato liase apresentaram identidade de sequências com o gene pecCl1 de C. lindemuthianum, e no genoma de C. higginsianum sete sequências que codificam pectato liase apresentaram identidade de sequências com o gene pecCl1 de C. lindemuthianum, indicando que o genoma de C. lindemuthianum pode possuir além do gene pecCl1 outros genes que codificam pectato liase. A análise filogenética de sequências de aminoácidos de pectato liases de fungos filamentosos mostrou a formação de dois grupos distintos, que se agruparam com base nos membros da família multigênica de pectato liases. A técnica de Split-Marker mostrou-se eficiente na inativação do gene pecCl1 de C. lindemuthianum, possibilitando o estudo da função do gene pecCl1, em um mutante com integração específica e livre de integrações ectópicas. A inativação do gene pecCl1 não levou a perda completa da atividade de pectato liase, e consequentemente, somente diminuiu os sintomas de antracnose em seu hospedeiro, o que é consistente com a presença de outros genes que codificam pectato liase no fungo, permitindo ao patógeno uma maior flexibilidade em sua agressividade. Foi realizada a análise da expressão diferencial do gene pecCl1 por qPCR nos diferentes estágios de infecção no feijoeiro e foram observados transcritos de pecCl1 em todas as fases de desenvolvimento do fungo na planta, mas houve um aumento significativo destes transcritos cinco dias após a infecção, no início da fase necrotrófica do fungo. Nesta fase, as hifas secundárias causam degradação extensiva da parede celular vegetal por meio da secreção de vasta gama de despolimerases, dentre estas, a pectato liase. Portanto, a pectato liase codificada pelo gene pecCl1 é importante para agressividade de C. lindemuthianum. A análise de pectato liases poderá não somente auxiliar na compreensão da antracnose em feijoeiro comum, mas também poderá levar a descoberta de mais um alvo para o controle dessa doença.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-11-26T13:31:45Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Samara Rayane Pereira de Morais - 2018.pdf: 1662554 bytes, checksum: a507cd1d13ea851ee565f7b6064db936 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2018-11-26T13:34:37Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Samara Rayane Pereira de Morais - 2018.pdf: 1662554 bytes, checksum: a507cd1d13ea851ee565f7b6064db936 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-26T13:34:37Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Samara Rayane Pereira de Morais - 2018.pdf: 1662554 bytes, checksum: a507cd1d13ea851ee565f7b6064db936 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-04-17 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / The common bean anthracnose caused by the fungus Colletotrichum lindemuthianum is one of the main diseases that impacts negatively on crop yield. The use of resistant cultivars is an efficient tool to control this disease. However, the wide variability of C. lindemuthianum is a challenge for breeding programs. The pyramiding of different resistance alleles is a recommended strategy aiming to effective and durable resistance. Fourteen resistance loci to common bean anthracnose have been identified and described so far: Co-1, Co-2, Co-3, Co-4, Co-5, Co-6, co-8, Co-11, Co- 12, Co-13, Co-14, Co-15, Co16, and Co-17. This work has aimed to: (1) evaluate common bean resistance source based on their reaction to anthracnose in controlled environment and on the molecular analysis with molecular markers previously identified as linked to resistance loci; (2) test the allelic relationship among the anthracnose resistance loci present in the carioca seeded cultivars BRS Horizonte and BRS Cometa; and (3) study the genetic inheritance and mapping the anthracnose resistance in BRS Cometa. The phenotypic screening of the population F2 BRS Horizonte × BRS Cometa and F2 and F2:3 Rosinha G2 × BRS Cometa were carried out using the C. lindemuthianum pathotypes 89 and 91, respectively. The phenotypic and molecular characterization of 26 common bean lines were performed using two pathotypes (races 73 and 81) and seven SCAR and one STS markers. The evaluation of the reaction to disease was carried out using a 1-to-9 scale (resistant = 1 to 3, and susceptible = 4 to 9). The genotyping of the 104 F2 plants from the Rosinha G2 × BRS Cometa cross with SNP markers was carried out using the BARBean6K_3 Illumina Bead Chip on the Illumina Infinium HD Assay Ultra® genotyping platform. The genomic regions flanking the SNP markers were aligned against the reference genome of Phaseolus vulgaris, Andean variety (G19833) and Mesoamerican variety (BAT 93), using the BLASTN tool. As result from the phenotypic characterization, BRS Cometa and other thirteen common bean lines have been considered resistant to the races 73 and 81. The molecular characterization result has indicated that the resistance to anthracnose in BRS Cometa can be controlled by the Co-3 or other resistance locus in the chromosome Pv04, since BRS Cometa has showed amplification only for markers linked to the Co-3. Results from the phenotyping of the F2BRS Horizonte × BRS Cometa population indicated that the segregation ratio for the resistance to anthracnose has fit to the expected ratio of 15R_:1rr ( 2 = 1.24% and P = 26.41%). The segregation ratios in the F2 and F2:3 Rosinha G2 × BRS Cometa population has fit to expected ratio of 3R_:1rr ( 2 = 0.40% and P = 50.50%) and 1RR:2Rr:1rr ( 2 = 0.0% and P = 100%), respectively, indicating that the resistance to anthracnose in BRS Cometa is monogenic and dominant. The anthracnose resistance locus in BRS Cometa (Co-Cometa) was mapped on Pv04. Based on the genetic and physical distances observed between Co-Cometa and other resistance loci already described in Pv04 (Co-3, Co-15 and Co-16), the evidences indicate that Co-Cometa is a different locus. / A antracnose do feijoeiro, causada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum, é uma das principais doenças que impacta negativamente a produtividade da cultura. Para o manejo dessa doença, a utilização de cultivares resistentes é uma ferramenta eficiente. Porém, a ampla variabilidade de C. lindemuthianum representa um desafio para os programas de melhoramento genético. Deste modo, a piramidação de distintos alelos de resistência é uma estratégia recomendada. Atualmente, 14 locos de resistência à antracnose já foramcaracterizados e descritos: Co-1, Co-2, Co-3, Co-4, Co-5, Co-6, co-8, Co-11, Co-12, Co13, Co-14, Co-15, Co-16 e Co-17. O presente trabalho teve como objetivos: 1) avaliar linhagens fontes de resistência com base na reação à antracnose em ambiente controlado e análise molecular com marcadores moleculares identificados como ligados a locos de resistência; 2) testar a relação alélica entre os locos de resistência à antracnose presentes nas cultivares de feijão carioca BRS Horizonte e BRS Cometa; e 3) estudar a herança e mapear a resistência à antracnose na cultivar BRS Cometa. Foi realizada a fenotipagem das populações F2 BRS Horizonte × BRS Cometa e F2 e F2:3 Rosinha G2 × BRS Cometa, utilizando as raças 89 e 91, respectivamente. A caracterização fenotípica e molecular de 26 linhagens fontes de resistência foi realizada utilizando dois patótipos (raça 73 e 81) e sete marcadores SCAR e um STS. A avaliação da reação à doença foi realizada utilizando uma escala de notas contendo nove graus de reação (resistentes = 1 a 3 e suscetíveis = 4 a 9). Foi realizada a genotipagem de 104 plantas F2 Rosinha G2 × BRS Cometa com marcadores SNP, utilizando o BARBean6K_3 Illumina Bead Chip na plataforma de genotipagem Illumina Infinium HD Assay Ultra®. As regiões genômicas flanqueando os marcadores SNP foram alinhadas contra o genoma de referência de Phaseolus vulgaris, variedades Andina (G19833) e Mesoamericana (BAT 93), usando a ferramenta BLASTN. Como resultado da caracterização fenotípica, BRS Cometa e 13 linhagens foram consideradas resistentes às raças 73 e 81. A caracterização molecular indicou que a resistência à antracnose presente em BRS Cometa pode ser governada pelo loco Co-3 ou outro loco de resistência presente no cromossomo Pv04, uma vez que BRS Cometa apresentou amplificação apenas para marcadores ligados ao loco Co-3. Os resultados da fenotipagem da população F2 BRS Horizonte × BRS Cometa indicaram que a razão de segregação para resistência à antracnose se ajustou à proporção esperada de 15R_: 1rr ( 2 = 1,24 e P = 26,41%). As razões de segregação nas populações F2 e F2:3 Rosinha G2 × BRS Cometa se ajustaram à proporção esperada de 3R_:1rr ( 2 = 0,40 e P = 50,50%) e 1RR:2Rr:1rr ( 2 = 0,0 e P = 100%), respectivamente, evidenciando que a resistência em BRS Cometa é monogênica dominante. O loco de resistência à antracnose presente em BRS Cometa (CoCometa) foi mapeado no cromossomo Pv04. Com base nas distâncias genéticas e físicas observadas entre Co-Cometa e outros locos de resistência já descritos em Pv04 (Co-3, Co15 e Co-16), as evidencias são que Co-Cometa trata-se de um loco distinto.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-06-26T11:34:18Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 244166 bytes, checksum: 28b894d0c84b084bd5eff97592beb6a0 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-26T11:34:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 244166 bytes, checksum: 28b894d0c84b084bd5eff97592beb6a0 (MD5) Previous issue date: 2005-02-21 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O objetivo geral deste trabalho foi piramidar genes de resistência à antracnose em um cultivar de feijoeiro de grão tipo “carioca”. Em uma primeira etapa, 30 linhagens elite de feijoeiro com grãos tipo “carioca”, desenvolvidas por diversos centros de pesquisa do país, e que têm se destacado em ensaios de competição, foram inoculadas com 18 patótipos de Colletotrichum lindemuthianum. Os resultados das inoculações mostraram que a grande parte das linhagens é altamente suscetível à maioria dos patótipos avaliados. No entanto, de certa forma, os programas de melhoramento têm evoluído em relação ao desenvolvimento de cultivares de maior espectro de resistência, pois quatro das linhagens apresentaram resistência a todos os patótipos de ocorrência nacional avaliados. Para piramidar os dois principais genes de resistência à antracnose do cultivar G 2333, duas populações derivadas do cruzamento entre Rudá (recorrente) e G 2333 (doador) foram utilizadas. Uma população RC1F3 foi selecionada com base no marcador molecular OPAB3450C ligado ao gene Co-5, e outra população RC3F5 foi selecionada com base no marcador OPAS13950C ligado ao gene Co-42. Foram feitos testes de progênie por meio de inoculações com C. lindemuthianum; análises moleculares com primers RAPD para determinação das distâncias genéticas. Obteve-se 10 famílias homozigotas para o gene Co-42 e similares ao genitor recorrente, e sete famílias homozigotas para o gene Co-5 e com distância genética relativa em relação ao genitor recorrente variando de 40,9 a 27,8%, com todas as famílias, apresentando características de grãos similares às do cultivar Rudá. Estas 17 famílias foram inoculadas com 12 patótipos de C. lindemuthianum, sendo 10 de ocorrência freqüente no território nacional e outros dois de alta virulência, provenientes de outros países. As linhagens portadoras do gene Co-5 comportaram-se como suscetíveis apenas aos patótipos estrangeiros, enquanto as linhagens portadoras do gene Co-42 apresentaram resistência a todos os patótipos, inclusive ao 2047. Com base nos dados de distância genética e espectro de resistência, as linhagens 1-46-7 (Co-5) e 19-1-1-7 (Co-42) foram selecionadas para serem utilizadas na etapa final da piramidação. Essas duas linhagens foram cruzadas com a linhagem Rudá “R” portadora dos genes Co-4, Co-6, Co-10, Ur- ON e Phg-1. Plantas F1 provenientes de cada cruzamento foram intercruzadas e geraram sementes F1. Das plantas F1 obtidas destas sementes, foi extraído DNA para análise com marcadores moleculares estreitamente relacionados aos genes de resistência (SCAR Y20, AB3, AZ20, F10, BA8, H13 e RAPD AS13). Plantas F1 que apresentaram marcas relacionadas a todos os genes de resistência foram submetidas à autofecundação para gerar sementes F2. Destas, foram obtidas 505 plantas F2, das quais o DNA foi extraído para novas análises moleculares. A partir destas análises, foram selecionadas 52 plantas F2, contendo as sete marcas moleculares. Estas plantas foram autofecundadas, obtendo- se famílias F3 que foram abertas em teste de progênie com o patótipo 2047, a fim de se diferenciar as plantas que possuem o alelo Co-42 das que possuem o alelo Co-4. Das 52 famílias abertas no teste de progênie, 18 apresentaram resistência não segregante ao patótipo 2047, o que permite dizer que estas famílias apresentam o alelo Co-42 fixado. / This work aimed to pyramid anthracnose resistance genes in a "carioca-type" common bean line. Initially, 30 elite “carioca-type” common bean lines developed by several research centers in the country, with outstanding performance in official trials, were inoculated with 18 pathotypes of Colletotrichum lindemuthianum. The inoculation results showed that most of the lines were highly susceptible to most of the pathotypes. They also showed that the breeding programs have advanced lately in the development of lines with larger resistance spectrum. Four lines were resistant to all the pathotypes tested that occur in Brazil. To pyramid the two main anthracnose resistance genes present in cultivar G 2333, two populations derived from crosses between Rudá (recurent parent) and G 2333 (donor parent) were used. One population (BC1F3) underwent selection based on the presence of RAPD molecular marker OPB03450C linked to the allele Co-5. The other population (BC3F5) was selected based on the marker OPAS13950C linked to the allele Co-42. Progeny tests were performed by inoculations with C. lindemuthianum, and molecular analyses were done with RAPD primers for genetic distances determination. Ten homozygous families were obtained for the allele Co-42, all genetically similar to the recurrent parent. Seven homozygous families for the allele Co-5 with relative genetic distance in relation to the recurrent parent varying from 40.9 to 27.8% were also obtained. All the selected families presented “carioca-type” grains like the recurrent parent Rudá. These 17 lines were inoculated with 12 C. lindemuthianum pathotypes, 10 of which frequently detected in several growing regions in Brazil and two highly virulent pathotypes from other countries. The lines bearing the Co-5 allele were susceptible only to the foreign pathotypes, while the lines bearing the Co-42 allele were resistant to all pathotypes, including pathotype 2047. Based on the genetic distance and resistance spectrum data lines 1-46-7 (Co-5) and 19-1-1-7 (Co-42) were selected to be used in the final stage of the pyramiding process. These two lines were crossed with the line Rudá "R" bearing the alleles Co-4, Co-6, Co-10, Ur-ON and Phg-1. F1 plants derived from each cross were intercrossed producing F1 seeds. DNA was extracted from these plants for analyses with molecular markers closely linked to the resistance genes (SCAR Y20, AB3, AZ20, F10, BA8, H13 and RAPD AS13). F1 plants bearing all the markers were selfed and a total of 505 F2 plants were obtained. Molecular analyses of these plants revealed that 52 of them contained the seven molecular markers. These plants were selfed, and the resulting F3 families were inoculated with pathotype 2047, in order to allow the distinction of plants bearing the Co-42 allele from the ones with the Co-4 allele. From 52 F3 families, 18 did not segregate for resistance to pathotype 2047. This result allows to conclude that these families have fixed the Co-42.