No / The ω-3 polyunsaturated fatty acid eicosapentaenoic acid (EPA), in the free fatty acid (FFA) form, has been demonstrated,to reduce adenoma number and size in patients with familial adenomatous polyposis. However, the mechanistic basis of the antineoplastic activity of EPA in the colorectum remains unclear. We tested the hypothesis that EPAFFA negatively modulates synthesis of and signaling by prostaglandin (PG) E2 in human colorectal cancer (CRC) cells.,EPA-FFA induced apoptosis of cyclooxygenase (COX)-2-positive human HCA-7 CRC cells in vitro. EPA-FFA in cell,culture medium was incorporated rapidly into phospholipid membranes of HCA-7 human CRC cells and acted as,a substrate for COX-2, leading to reduced synthesis of PGE2 and generation of PGE3. Alone, PGE3 bound and activated,the PGE2 EP4 receptor but with reduced affinity and efficacy compared with its "natural" ligand PGE2. However,,in the presence of PGE2, PGE3 acted as an antagonist of EP4 receptor-dependent 3',5' cyclic adenosine,monophosphate induction in naturally EP4 receptor-positive LoVo human CRC cells and of resistance to apoptosis,in HT-29-EP4 human CRC cells overexpressing the EP4 receptor. We conclude that EPA-FFA drives a COX-2dependent "PGE2-to-PGE3 switch" in human CRC cells and that PGE3 acts as a partial agonist at the PGE2 EP4 receptor.

Yes / We investigated red blood cell (RBC) PUFA profiles, and the predictive value of RBC EPA content for tumour EPA exposure and clinical outcomes, in the EMT study, a randomised trial of EPA in patients awaiting colorectal cancer (CRC) liver metastasis surgery (A.J. Cockbain et al., 2014). There was a significant increase in RBC EPA in the EPA group (n=43; median intervention 30 days; mean absolute 1.26 [±0.14]% increase; P<0.001), but not in the placebo arm (n=45). EPA incorporation varied widely in EPA users and was not explained by treatment duration or compliance. There was little evidence of ‘contamination’ in the placebo group. The EPA level predicted tumour EPA content (r=0.36; P=0.03). Participants with post-treatment EPA ≥1.22% (n=49) had improved OS compared with EPA <1.22% (n=29; HR 0.42[95%CI 0.16–0.95]). RBC EPA content should be evaluated as a biomarker of tumour exposure and clinical outcomes in future EPA trials in CRC patients.

Yes / Objective The hypothesis that sleeve gastrectomy (SG) is not associated with an increase in mucosal colorectal cancer (CRC) biomarkers, unlike Roux-en-Y gastric bypass (RYGB), was tested. Design and Methods Rectal mucosa, blood, and urine were obtained from morbidly obese patients (n = 23) before and after (median 28 months) SG, as well as from nonobese controls (n = 20). Rectal epithelial cell mitosis and apoptosis, crypt size/fission, and pro-inflammatory gene expression were measured, as well as systemic inflammatory biomarkers, including C-reactive protein (CRP). Results The mean pre-operative body mass index in SG patients was 65.7 kg/m2 (24.7 kg/m2 in controls). Mean excess weight loss post-SG was 38.2%. There was a significant increase in mitosis frequency, crypt size, and crypt fission (all P < 0.01) in SG patients versus controls, as well as evidence of a chronic inflammatory state (raised CRP and mononuclear cell p65 NFκB binding), but there was no significant change in these biomarkers after SG, except CRP reduction. Macrophage migration inhibitory factor mRNA levels were increased by 39% post-SG (P = 0.038). Conclusions Mucosal biomarkers of CRC risk do not increase at 6 months following SG, unlike RYGB. Biomarkers of rectal crypt proliferation and systemic inflammation are increased in morbidly obese patients compared with controls.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2008-2009 / La glucuronidation médiée par les enzymes UDP-glucuronosyltransférases (UGT) est la voie majeure d'élimination de l'agent anticancéreux irinotécan. Selon plusieurs études, les variations interindividuelles observées au niveau de la pharmacocinétique du médicament influencent l'apparition d'effets secondaires et l'efficacité du traitement. Le but premier de mes travaux était d'étudier les variants génétiques des gènes UGT1A1 et UGT1A9 et d'évaluer leurs influences sur le métabolisme in-vitro du SN-38, le metabolite actif de l'irinotécan. L'étude du gène UGT1A9 a permis d'identifier de nouveaux polymorphismes associés à une augmentation de la glucuronidation hépatique du SN-38. De plus, nos résultats indiquent que les haplotypes du promoteur de Y UGT 1 Al seraient de meilleurs indicateurs du profil de glucuronidation du médicament que l'allèle UGT1A1*28 seul. En plus de leur rôle dans le métabolisme des médicaments, les UGT participent aussi à l'élimination des amines aromatiques hétérocycliques (AAH), une classe de carcinogènes formés lors de la cuisson des viandes et associés à une augmentation du risque de cancer colorectal. Nos études in-vitro démontrent l'importance de l'enzyme UGT1A1 dans la glucuronidation du JV-OH-PHIP, l'AAH la plus abondante dans les viandes bien cuites. De plus, une étude cas-témoins nous a permis de démontrer que des variations du promoteur de Y UGT 1 Al sont associées à une augmentation du risque de cancer colorectal lorsque les sujets sont stratifiés selon l'exposition aux carcinogènes. Finalement, l'étude de la structure du locus UGT1A révèle un nouveau mécanisme de modulation de la voie de glucuronidation via l'épissage alternatif d'un nouvel exon. En effet, des analyses fonctionnelles in-vitro démontrent que la coexpression d'une nouvelle forme de protéine UGT1A1 isoforme 2 et de la forme UGT1A1 isoforme 1 classique réduit la conjugaison de l'agent anticancéreux SN-38 et de l'immunosuppresseur MPA. En conclusion, nos résultats démontrent que les variations génétiques et d'épissages influencent la voie de glucuronidation et par conséquent pourraient modifier la susceptibilité et la réponse au traitement du cancer colorectal.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第25166号 / 医博第5052号 / 新制||医||1071(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 藤田 恭之, 教授 上野 英樹, 教授 河本 宏 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

L'activation de cathepsines et la présence de cellules cancéreuses dites souches (CSC) participeraient à l'évolution métastatique du cancer colorectal. L'effet d'inhibiteurs intracellulaire (CA-074 ME) et extracellulaire (CA-074) de la cathepsine B a été analysé dans un système de culture tridimensionnelle (3-D) reproduisant le potentiel métastatique des cellules cancéreuses du côlon. Le CA-074 ME a été le seul à inhiber de façon significative le processus métastatique. Pour l'étude des CSC, le marquage immunohistochimique de CD 133, CD44 et CD24 a été évalué qualitativement et quantitativement dans la culture 3-D et dans des spécimens histologiques provenant de patients porteurs de cancer du côlon. L'expression de ces marqueurs dans les cellules cultivées en 3-D était variable. Par contre, le marqueur CD 133 était fortement exprimé dans les métastases hépatiques associées à des ganglions lymphatiques envahis, tel que démontré en combinaison avec une coloration fluorescente des noyaux. La conclusion reflète les corrélations possibles de ces résultats.

Le gène du métabolisme des médicaments UDP-glucuronosyltransférase UGT1A est épissé alternativement entraînant la production d’enzymes actives nommées isoformes 1 ainsi que de protéines régulatrices (i2) plus courtes. Mon objectif principal était de développer un modèle cellulaire permettant de mieux caractériser l’impact des isoformes 2 sur l’activité de conjugaison des médicaments et sur la réponse cellulaire à un traitement pharmacologique, plus particulièrement à l’agent anticancéreux SN-38, un substrat des UGT1A utilisé dans le traitement du cancer colorectal. Par une approche d ’interférence à l’ARN (shRNA), nous avons réprimé significativement les formes endogènes i2 dans la lignée humaine dérivée d’une tumeur de côlon, HT115. La répression des isoformes i2 entraîne une augmentation significative de la formation de SN-38-glucuronide. De plus, la répression des i2 entraîne une augmentation significative de la viabilité cellulaire ainsi qu’une modification significative de l’expression génique de processus cellulaires tels que la prolifération et certains microARN, à la suite d ’une exposition au SN-38. Les résultats obtenus supportent que les isoformes i2 ont le potentiel de moduler la réponse pharmacologique à un médicament dont le métabolisme de phase II est effectué principalement par les enzymes UGT1A.

Résumé : L’adénocarcinome colorectal est parmi les plus importants cancers au Canada en terme de mortalité et morbidité. Cependant, nous n’en connaissons encore que peu, entres autres sur les voies cellulaires importantes et les protéines présentant un potentiel comme biomarqueur. Cette étude fut divisée en deux sous-projets. Sous-projet A. Il n’y a présentement aucun biomarqueur permettant de prédire la réponse à la radiothérapie comme modalité de traitement pour le cancer colorectal. Le but de ce sous-projet était de mettre au point les méthodes permettant d’effectuer une étude prospective ou rétrospective par spectrométrie de masse sur la réponse à la radiothérapie en utilisant des échantillons de tissu de patient. Des échantillons de tissu de souris et de tissu humains anonymisés ont été utilisés pour évaluer la faisabilité d’une telle étude. Différentes techniques d’extraction protéique ont été évaluées. Les extraits totaux et fractionnements subcellulaires de tissu frais ont permis une analyse appropriée des protéines cellulaires. Il en était de même pour l’extraction totale de tissus fixés. Cependant, les protéines extraites suite à microdissection au laser de tissu fixé étaient inadéquates et en nombre insuffisant. Sous-projet B. Afin d’investiguer l’importance de fonctions, voies ou protéines dans différents types de cancer colorectaux, neuf lignées cellulaires de cancer colorectal et de côlon normal ont été fractionnées en quatre compartiments subcellulaires et analysées par spectrométrie de masse. Aucun groupe de recherche n’avait analysé jusqu’à présent plus de cinq lignées et plus d’un compartiment subcellulaire à la fois. Les résultats montraient que certaines voies canoniques et fonctions cellulaires étaient de haute importance dans plusieurs des lignées analysées, dont la voie de signalisation par eIF2. De plus, les régulateurs de transcription TP53, MYC et TGFB1, pouvant être responsables des caractéristiques cellulaires observées, ont été identifiés. En conclusion, ce projet nous a permis d’améliorer nos connaissances sur les caractéristiques moléculaires d’importance dans le cancer colorectal et de mettre au point des techniques qui pourraient permettre la découverte de nouveaux biomarqueurs. / Abstract : Colorectal adenocarcinoma is one of the most important cancers in Canada in terms of mortality and morbidity. However, we still know very little on its molecular features. This study was divided into two sub-projects. Sub-project A. At this time, no biomarker has the capacity of predicting a patient’s response to radiotherapy, which is a commonly used treatment of colorectal cancer. The goal of this section was to develop the methods to conduct a prospective or retrospective mass spectrometry study on the patient response to radiotherapy, through the use of human tissues. Mouse tissues and tissues of an anonymous patient were obtained in order to evaluate the feasibility of such a study. Different protein extraction techniques were evaluated. Total lysates and subcellular fractionations of fresh tissues allowed for a successful analysis of the samples. The same was true of total lysates of fixed tissues. However, proteins extracted from cells isolated through laser capture microdissection were insufficient in numbers and their types were inconsistent with the expected results. Sub-project B. In order to study the importance of proteins and cellular functions or pathways in different types of colorectal cancers. nine cell lines originating from colorectal carcinoma and from normal colon were fractionated according to four subcellular compartments and analysed through mass spectrometry. Until now, no research group had analysed, in a single study more than 5 cell lines as well as more than one subcellular compartment at once. Some cellular functions and canonical pathways were shown to be of high importance in many of the studied cell lines, such as the signalling through eIF2 pathway. Furthermore, the transcription regulators TP53, MYC and TGFB1were identified as potentially responsible for the observed proteomic characteristics. In conclusion, this study allowed for a better understanding of important molecular caracteristics of colorectal cancer and allowed for the optimization of techniques that may serve in the discovery of new biomarkers relative to the use of radiotherapy as a treatment.

Mon travail de thèse consistait à étudier la signalisation oncogénique de la tyrosine kinase (TyrK) cytoplasmique Src dans les cellules de cancer colorectal (CCR) à un stade avancé par une approche globale de phosphoprotéomique quantitative de type SILAC puis d'évaluer l'efficacité du Nilotinib, un inhibiteur de la Tyrk oncogénique BCR-Abl, sur les propriétés invasives des cellules de CCR. Dans un premier temps, nos résultats ont confirmé le rôle clé joué par Src dans l'acquisition des propriétés invasives de la tumeur. Puis, l'approche phosphoprotéomique de type SILAC a permis de mettre en évidence 136 protéines substrats de Src parmi lesquelles nous retrouvons des protéines de signalisation, des protéines associées au cytosquelette ou des protéines du trafic vésiculaire. De manière intéressante, j'ai révélé l'implication d'un réseau de TyrK dans les propriétés invasives Src-dépendantes. Nos résultats suggèrent qu'une thérapie multi-TyrK pourrait s'avérer intéressante pour traiter les CCR à un stade avancé. En complément de l'analyse SILAC, j'ai initié une approche pharmacologique pour caractériser les TyrK impliquées dans l'invasion des cellules de CCR. De manière surprenante, j'ai observé que le Nilotinib inhibe l'activité invasive des cellules de CCR avec une efficacité comparable à celle observée sur la croissance des cellules de LMC (IC50=20nM). Des approches d'invalidation génétique et de mutagénèse couplées à des tests d'invasion in vitro et in vivo ont permis de démontrer que le Nilotinib exerce son activité anti-invasive en ciblant le récepteur au collagène DDR1. Mes résultats laissent présager un intérêt thérapeutique potentiel du Nilotinib dans le traitement du cancer colorectal métastasant. / My thesis work was devoted to decipher the oncogenic signaling of the cytoplasmic tyrosine kinase (TyrK) Src in advanced colorectal cancer (CRC) cells using SILAC quantitative phosphoproteomics and to evaluate the efficiency of the oncogenic BCR-Abl inhibitor, Nilotinib, on the CRC cell invasive activity. Firstable, our results confirmed the key role of Src in the induction of cell invasion. Then, the SILAC phosphoproteomic approach revealed 136 Src substrates among which signaling proteins, cytoskeleton associated proteins or vesicular trafficking associated proteins. Interestingly, I have identified a TyrK network involved in Src-dependent invasive properties. Taken together, our results suggest that a multi-TyrK therapy may be interesting in clinic for the treatment of advanced CRC. In addition to the SILAC analysis, a pharmacological approach was set up to characterize TyrK involved in CRC cell invasion. Surprisingly, I found that Nilotinib inhibits CRC cell invasive activity with a similar efficiency to the one observed on the growth of CML (IC50 = 20nM). Knock down and mutagenesis experiments together with in vitro and in vivo invasion assay revealed the collagen receptor DDR1 as the main Nilotinib target in its anti-invasive activity. Our results suggest that Nilotinib could be of therapeutic value in metastatic CRC.

Les ADN circulants extracellulaires (ADNcf) sont considérés comme des biomarqueurs potentiels non invasifs de la progression tumorale. Ils présentent l'avantage d'être porteurs des altérations génétiques des tumeurs dont ils sont issus. Les connaissances sur les formes, les mécanismes de libération et les actions biologiques des ADNcf sont cependant encore peu caractérisées.Nous avons émis l'hypothèse que se focaliser sur l'étude de la structure et des origines des ADNcf issus des tumeurs permettrait d'ouvrir de nouvelles perspectives d'applications en génomique personnalisée.Nos travaux ont démontré à l'aide d'un animal modèle que les ADNcf issus des tumeurs de cancers colorectaux sont hautement fragmentés à des tailles inférieures à 145 bp. Cette observation a été confirmée sur plasma humain en réalisant par AFM la première image directe d'ADNcf issu de tumeurs. Nous avons déterminé que les proportions d'ADNcf mutés varient fortement dans la circulation sanguine, mais que près d'un tiers des individus présentaient des proportions d'ADNcf mutés supérieures à 25 % de tous les ADNcf retrouvés dans le sang. Ces découvertes nous ont permis de participer au développement d'une méthode d'analyse spécifique des ADNcf du plasma permettant de déterminer par Q-PCR la concentration en ADNcf, sa fragmentation ainsi que la présence des mutations KRAS et BRAF. Cette méthode a été validée cliniquement sur 79 échantillons de patients atteints de cancer colorectal métastatique en la comparant avec une concordance de 96 % à la technique de référence clinique utilisant l'ADN de tissu tumoral. L'utilisation des ADNcf en tant que « biopsie liquide » devrait être un biomarqueur central dans l'approche de génomique personnalisée des années à venir et les résultats de ces travaux de thèse participer au développement de cette nouvelle approche. / Cell-free circulating DNA (cfDNA) are considered as potentials non invasive biomarkers of tumor progression. They present the advantage to exhibit the genetic alterations from their tumor of origin. Knowledge on the forms, mechanism of release, and biological effect of cfDNA are however still less characterized. We have hypothesized that focalizing on the study of cfDNA structure and origin will open new perspectives of application in personalized genomic. Our works demonstrated, with an animal model, that cfDNA from colorectal cancer tumor are highly fragmented at size lower than 145 bp. This observation was confirmed on human plasma with AFM by realizing the first direct picture of tumor-derived cfDNA. We have determined that cfDNA proportion highly varied in bloodstream, but more than a third of individual exhibit proportions larger than 25 % of blood total cfDNA.These discoveries let us participate to the development of a specific analysis method of plasma cfDNA owing to determinate by Q-PCR the cfDNA concentration, its fragmentation and the presence of KRAS and BRAF mutation. This method has been clinically validated on 79 samples of metastatic colorectal cancer patients by comparing it, with a concordance of 96 %, with the technique of reference using DNA from tumoral tissue.cfDNA could be used as « liquid biospy » and could be a central biomarker in the personalized genomic for the future years, and this thesis work participate to the development of this new approach.