Le virus de l'hépatite C (HCV) infecte environ 180 millions de personnes à travers le monde. De nouveaux antiviraux ont récemment été mis sur le marché mais ils présentent des effets indésirables. La recherche de nouvelles cibles thérapeutiques reste donc d'actualité. Mes principaux travaux ont consisté à développer des approches de biochimie et d'imagerie sur cellules vivantes pour étudier les mécanismes moléculaires d'action des antiviraux silibinine (SbN) et arbidol (ARB) sur HCV. Nous avons montré que SbN et ARB inhibent des vésicules entourées de clathrine et ne sont pas délivrés aux endosomes précoces. SbN et ARB inhibent également l'infection d'autres virus entrant par endocytose clathrine-dépendante, ce qui expliquerait leur activité à large spectre. J'ai également contribué à un projet initié depuis quelques mois au sein de l'équipe. L'hypothèse était qu'un élément présent dans le microenvironnement hépatique (MEH) jouerait un rôle essentiel dans l'infection par HCV. Nous nous sommes intéressés au syndécan-1 (SDC1) car il est fortement exprimé à la surface des hépatocytes. Nos travaux montrent que la déplétion de SDC1 diminue fortement l'infection. SDC1 colocalise à la surface des hépatocytes non infectés avec CD81, un récepteur connu de HCV. Dans les jours suivant l'infection, cette colocalisation est perturbée. Ces données suggèrent que SDC1 serait un co-facteur d'entrée de HCV, agissant en combinaison avec CD81, et que l'infection réorganiserait les molécules du MEH, ce qui pourrait à long terme contribuer à la persistance de l'infection / Hepatitis C virus (HCV) is a global health concern infecting 170 million people worldwide. New antivirals recently received the approval for the treatment against HCV infection but they display many side effects. Research for new therapeutic targets therefore remains an important topic. My main work was to develop approaches in biochemistry and live cell imaging to study the molecular mechanisms of action of antivirals silibinin (SbN) and arbidol (ARB) on HCV infection. We show that SbN and ARB alter clathrin-mediated endocytosis. Viral particles are trapped in clathrin-positive structures and cannot be delivered to the early endosomal compartment, thereby preventing infection. SbN and ARB also prevent cell infection by viruses that enter through clathrin-mediated endocytosis, which could explain their broad spectrum activity. I also contribute to a project initiated for a few months in the lab. We hypothsized that a molecule present in the immediate surrouding of the hepatocyte microenvironment could play a role in HCV infection. We focused on the syndecan-1 (SDC1) because it is essentially anchored on the surface of hepatocytes. We show that SDC1 depletion leads to a drastic decrease of the viral infectivity. SDC1 colocalizes on the unfected hepatocyte surface with the already identified HCV recptor CD81. This colocalization vanished within days in infected cells. These data suggest that SDC1 could act as a cellular co-factor for HCV entry, in combination with CD81; thus infection could reorganized molecules of the hepatocyte microenvironment and contribute to HCV hepatotropism and the peristence of infection

La microspectroscopie Raman confocale apparait comme un outil à fort potentiel pour l'analyse in vivo de la peau, avec des applications innovantes en dermatologie et cosmétologie. Cette technique biophotonique permet d'accéder à des informations moléculaires très spécifiques d'un échantillon ; et ceci de façon totalement non destructive et sans aucun marquage ni préparation particulière. Les travaux référencés ont porté sur la caractérisation des constituants cutanés, l'évaluation du taux d'hydratation, le suivi de la perméation d'actif ou encore le diagnostic des lésions tumorales de la peau. Ces études ont été réalisées avec des configurations instrumentales très diverses. En vue de la conception d'une nouvelle micro-sonde Raman confocale, cette thèse a permis d'établir un cahier des charges précis ; les paramètres instrumentaux ont été définis et leurs effets sur la qualité des enregistrements Raman (fluorescence parasite, rapport signal sur bruit, atténuation du signal en profondeur) ont été évalués. En particulier, l'effet de la longueur d'onde d'excitation, paramètre clé en spectroscopie Raman, a été analysé. Dans nos expérimentations, la répétabilité et la variabilité du signal Raman ont également été prises en compte. Dans le but d'évaluer l'approche Raman pour l'analyse de la perméation cutanée d'actif, la diffusion cutanée de deux molécules (caféine et resvératrol) appliquées en faibles concentrations a été suivie sur un microspectromètre Raman confocal avec des paramètres d'acquisition similaires à ceux définis pour la micro-sonde. Nous avons montré la possibilité d'enregistrer des cinétiques de diffusion, et également mis en évidence des points limitatifs spécifiques de ces études expérimentales. / Confocal Raman microspectroscopy seems to be a tool with strong potential for in vivo skin analyses, and for innovative applications in dermatology and cosmetology fields. This biophotonic technique allows access to very specific molecular information non-destructively and without any particular skin labeling or sample preparation. The referenced work focused on the characterization of the cutaneous constituents, the evaluation of the rate of skin hydration, the monitoring of active ingredient permeation or diagnosis of tumoral skin lesions. These studies were performed with a variety of instrumental configurations. In view of the design of a new confocal Raman micro-probe, this thesis has established a registry of precise specifications; the instrumental parameters were defined, and their effects on the quality of the Raman records (parasite fluorescence, signal to noise ratio, signal attenuation in depth) were evaluated. In particular, the impact of the excitation wavelength, a key parameter in Raman spectroscopy, was analyzed. In our experiments, the reproducibility and the variability of the Raman signal were also considered. In order to evaluate the Raman approach for the analysis of cutaneous permeation of active ingredients, the cutaneous diffusion of two molecules (caffeine and resveratrol) applied in low concentrations were monitored by confocal Raman microspectroscopy using the acquisition parameters defined for the micro-probe. We have demonstrated the possibility of recording diffusion kinetics and at the same time unraveled specific limitations of these experimental studies.

La peau assure la protection de l’organisme contre les agressions extérieures. Pourtant, la peau n’est pas à l’abri des effets inéluctables du vieillissement chronologique. En effet, ce processus a pour conséquence d’altérer la structure des différentes couches cutanées au point d’en affecter leurs caractéristiques fonctionnelles. Ce travail de thèse a pour but de caractériser les modifications moléculaires et structurales de la peau au cours du vieillissement chronologique à l’aide de méthodes non-invasives que sont les spectroscopies optiques vibrationnelles. Ainsi avons-nous pu mettre en évidence des altérations structurales du réseau de collagène dans des échantillons de peaux d’âges différents à l’aide d’une approche basée sur l’imagerie IR-TF (Infrarouge à Transformée de Fourier) en mode polarisé. Par la suite, nous avons démontré l’influence des molécules d’eau sur les changements d’orientation des fibres de collagène avec l’âge en adoptant une méthodologie basée sur la substitution, thermodynamiquement favorable, des molécules d’eau liée au collagène (H2O) par des molécules d’eau deutérée (D2O). Lors d’études réalisées in vivo, nous avons établi des corrélations entre les propriétés physiques (mécanique et statut d’hydratation) et les informations moléculaires du stratum corneum (SC) en traitant les données Raman et biométriques par la méthode des moindres carrés partiels (PLS). En s’appuyant sur la complémentarité des techniques biophysiques employées, ces différentes études ont permis d’illustrer le potentiel des spectroscopies vibrationnelles pour évaluer le vieillissement cutané et en déterminer certaines bases moléculaires. / The skin protects the body against external aggressions. However, the skin is not immune to the inevitable effects of the chronological aging. Indeed, this process leads to several structural alterations of the different cutaneous layers to the point of affecting their functional characteristics. This thesis work aims to assess the molecular and structural changes of the skin during chronological aging by using non-invasive methods such as optical vibrational spectroscopies. To do this, we highlighted the structural modifications of the collagen network in different-aged skin samples by using an approach based on FT-IR imaging (Fourier Transform Infrared) in polarized mode. Subsequently, we demonstrated the influence of water molecules on the changes of collagen fibers with age by adopting a methodology based on the substitution, thermodynamically favorable, of the collagen-bound water molecules (H2O) by deuterated water molecules (D2O). In in vivo studies, we have established correlations between physical and molecular properties of the stratum corneum (SC) by analyzing the Raman and biometric measurements with the Partial Least Squares (PLS) processing. Based on the complementarity of the biophysical techniques employed, these studies permitted to evaluate the impact of the chronological aging on the skin and could open some interesting prospects in both cosmetology and dermatology.

L’objectif de cette étude a été de formuler et caractériser des émulsions simples huile/eau d’intérêt pharmaceutique stabilisées par de la β-lactoglobuline (β-lg), de la gomme arabique (GA), de la gomme xanthane (GX) et des mélanges β-lg:GA et β-lg:GX. Les concentrations massiques totales des dispersions de biopolymères étaient de 1 % et ont été augmentées à 2,5 % si les émulsions formulées n’étaient pas stables. Le mélange β-lg:GA a été réalisé à pH 4,2 afin de permettre la formation de complexes par interactions électrostatiques attractives entre la β-lg et la GA. Deux ratios β-lg:GA ont été étudiés : 2:1 et 1:2. Enfin, le mélange β-lg:GX a été effectué à pH 7, où les deux biopolymères étant chargés négativement ne se complexent pas et à un ratio de 1:1. Une étude de stabilité des émulsions a été menée sur 6 mois. Les stabilités obtenues ont pu être classées par ordre croissant : GA 2,5 % < β-lg:GA 2,5 % < β-lg 2,5 % < GX 1 % = β-lg:GX 1 %. Plusieurs mécanismes de stabilisation ont été mis en évidence grâce à l’étude des propriétés interfaciales des biopolymères, à l’étude des propriétés rhéologiques des émulsions et à des observations au microscope confocal à balayage laser des émulsions après marquage des biopolymères à la fluorescence. La β-lg et la GA sont toutes deux capables de s’adsorber à l’interface des globules huileux alors que la GX augmente la viscosité de la phase continue. L’association β-lg:GA conduit à la formation d’une double couche interfaciale stabilisante. Enfin, l’association β-lg:GX combine les mécanismes de stabilisation de la protéine, par adsorption interfaciale et de la gomme, par augmentation de la viscosité de la phase continue. / The main objective of this study was to formulate and characterize oil-in-water simple emulsions of pharmaceutical interest stabilized by β-lactoglobulin (β-lg), gum arabic (GA), xanthan gum (XG), and mixtures of β-lg:GA and β-lg:XG. The total biopolymer final concentration in the dispersions was 1 (w/w) % and could be raised to 2.5 (w/w) % if the formulated emulsions were not stable. β-lg:GA mixing was performed at pH 4.2 to allow attractive electrostatic interactions between the two biopolymers and thus the formation of complexes. Two protein:polysaccharide ratios were investigated: 2:1 and 1:2. Conversely, β8lg:XG mixing was performed at pH 7, where both biopolymers are negatively charged, in order to avoid the complex formation, and with a 1:1 ratio. A stability study was conducted for emulsions over a 6-month period. The obtained stabilities could be classified increasingly: GA 2.5 % < β-lg:GA 2.5 % < β-lg 2.5 % < XG 1 % = β-lg:XG 1 %. Several stabilization mechanisms were evidenced by the study of the biopolymer interfacial properties, the study of emulsion rheology and by confocal laser scanning microscopy observations with labeled fluorescent biopolymers. β-lg and GA were both able to adsorb at the interface of oil globule. XG enhanced the continuous phase viscosity. β-lg:GA mixing led to the formation of a stabilizing interfacial double layer. Finally, β-lg:XG association combined the stabilization mechanisms of both biopolymers, respectively: interfacial adsorption and enhancement of the continuous phase viscosity.

La fonction barrière de la peau, qui protège l’organisme contre les molécules exogènes, limite la pénétration des actifs cosmétiques, ce qui réduit l’efficacité des molécules actives dans les couches profondes de l’épiderme. Il est alors apparu essentiel d'optimiser l'administration des actifs cosmétiques déjà existants afin d’en tirer tout le bénéfice escompté. Certaines innovations sont développées pour répondre à ce défi, notamment l’encapsulation des actifs cosmétiques dans des nanosystemes. En parallèle, il est nécessaire de s’intéresser aux méthodes analytiques capables de fournir une information qualitative et quantitative sur ces systèmes dispersés dans un produit fini complexe et de permettre une évaluation biologique à différents stades de développement des formulations. / The barrier function of the skin, which protects the body against exogenous molecules, limits the penetration of active cosmetic ingredients (ACI), thus reduce the effectiveness of molecules with a deep cellular target. Therefore, it appeared crucial to optimize the administration of existing active cosmetic in order to get the full benefits expected. Some innovations are explored to bypass this issue, including the encapsulation of existing active cosmetic in nanocarriers. In parallel, it is important to also focus on the development of analytical methodologies that could provide qualitative and quantitative information, in particular the determination of ACI contents and potentially excipients incorporated in a final form, and biological evaluation at different stages of formulation.

Le développement récent de l’endoscopie interventionnelle digestive nous a conduit à prendre en charge deux types de pathologies préoccupantes. Il s’agit d’une part des fistules digestives souvent responsables d’une morbi-mortalité élevée et d’autre part des sténoses œsophagiennes après résection tumorale endoscopique étendue. Dans ces deux situations, des phénomènes inflammatoires chroniques conduisent soit à l’absence de fermeture de la fistule soit à une fibrose importante responsable de sténose de l’œsophage. La thérapie cellulaire a déjà été utilisée pour diminuer ces phénomènes inflammatoires et entrainer une cicatrisation. La thérapie tissulaire par cellules souches organisées en construction 3D représente un avantage important en permettant de cibler le site d’action par dépôt direct du feuillet cellularisé. Notre objectif était d’évaluer l’effet thérapeutique de ces nouveaux outils pour fermer les fistules digestives et pour prévenir la survenue des sténoses œsophagiennes. La première étape a consisté a évaluer l’efficacité du traitement par des cellules souches mésenchymateuses provenant de moelle osseuse humaine, marquées puis organisées en doubles feuillets, dans un modèle de fistule entéro-cutanée post-chirurgicale chez la souris nude. L’évaluation clinique et en imagerie (IRM et microscopie confocale) a montré une meilleure cicatrisation avec une augmentation de la microvascularisation et une accélération de la fermeture de la fistule chez les souris greffées. Les effets observés semblent liés à une augmentation précoce de la synthèse des facteurs de réparation (EGF et le VEGF) et des cytokines anti-inflammatoires (TGF-ß2 et IL-10). Après avoir développé un modèle inédit de fistule oeso-cutanée chez le porc grâce à la mise en place par voie endoscopique et chirurgicale de prothèses plastiques entre la lumière œsophagienne et la peau, nous avons évalué l’efficacité thérapeutique d’un gel contenant des vésicules extracellulaires issues de cellules souches isolées du tissu adipeux de porc. Ce gel injecté dans la fistule par voie endoscopique a permis la fermeture des fistules. Enfin, la troisième partie de notre travail a consisté à évaluer l’efficacité de la greffe allogénique de doubles feuillets de cellules souches mésenchymateuses pour prévenir la survenue des sténoses œsophagiennes dans un modèle porcin après dissection sous muqueuse étendue. Il existait une réduction significative du taux de sténose œsophagienne cicatricielle dans le groupe greffé avec une fibrose moins importante. En conclusion, l’effet paracrine antifibrosant des cellules souches mésenchymateuses organisées en feuillets est efficace à la fois pour fermer les fistules entéro-cutanées chez la souris et pour prévenir les sténoses œsophagiennes chez le porc. Un gel avec des vésicules extracellulaires issues des cellules souches a de la même façon un effet cicatrisant anti-inflammatoire permettant la fermeture des fistules œsophagiennes chez le porc. Ces résultats sont très encourageants et posent la question d’une évaluation future chez l’homme. / Recent developments in digestive interventional endoscopy lead us to manage two types of digestive disease. First, it is digestive fistulas associated in many cases with high morbi-mortality; and second is oesophageal stenosis after extended superficial endoscopic resection. In both situations, chronic inflammatory process resulted in delayed or no fistula healing for the first case or oesophageal stenosis due to fibrosis. Cellular therapy has proved to be successful in reducing the inflammatory process and to promote tissue healing. Tissue therapy with 3D construct stem cells represents a major advantage by allowing a direct adaptation on the right place. Our objective was to evaluate the therapeutic effect of new strategy to close the digestive fistula and to prevent oesophageal stenosis. First step was to evaluate the effect of labelled human bone marrow derived mesenchymal stem cells engraftment in the form of double cellsheet in a post-surgical fistula model in nude mice. Clinical and radiological (MRI and probe based confocal microscopy) evaluation showed a better fistula healing with higher microvascularization and a faster fistula closing in grafted mice. These effects appear to be related to an increase production of factors involved in tissue repair (EGF et le VEGF) and anti-inflammatory cytokines (TGF-ß2 et IL-10). We developed an unpublished eso-cutaneous fistula in a porcine model after plastic catheters placement by surgical and endoscopic way between the oesophageal lumen and the skin. We evaluated the therapeutic effect of a hydrogel with extracellular vesicles extracted from porcine adipose derived stem cells. The hydrogel with vesicles was injected into the fistula by endoscopy. Radiological and histological evaluation 15 days after injection showed a fistula tract closure in treated group.The third part of this work was to evaluate the effect of allograft of adipose derived stem cells 3D construct to prevent the stenosis after extended endoscopic submucosal dissection in a porcine model. There was a significant reduction of number and degree of stenosis with decrease fibrosis infiltration in the grafted group.In summary, thanks to their paracrine and antifibrotic effect, the mesenchymal stem cells organised as 3D construct allowed fistula closure in an entero-cutaneous model in mice and prevention of stenosis after extended oesophageal submucosal dissection in a porcine model. Moreover, endoscopic hydrogel and extracellular vesicles injection allowed oesophageal fistula healing in a porcine model. These promising results pose the challenge of future clinical studies.

Ce travail présente une étude, par microscopie optique et de fluorescence, de matériaux hybrides, basés sur des monolithes de silice contenant des dérivés du cyano-anthracène : 9,10-dicyano-anthracène (DCA) ou 9,14-dicyano-benzo(b)triphénylène (DBTP), qui sont des photo-sensibilisateurs de l'oxygène singulet. Alors que ces matériaux sont bien caractérisés du point de vue de la photo-oxydation des sulfures sous des conditions hétérogènes par des études macroscopiques, certaines propriétés concernant l'association du photosensibilisateur avec l'absorbant peuvent être masquées, dominées ou encore mal interprétées par uniquement des mesures d'ensemble. Ici, nous combinons la spectroscopie d'ensemble et la microscopie optique et de fluorescence, et développons des protocôles expérimentaux concernant des échantillons solides épais, dans le but d'étudier la distribution spatiale et la mobilité des photosensiblisateurs dans la matrice hôte ainsi que d'analyser les interactions entre ces deux entités. La microscopie optique montre dans tous les cas des inhomogénéités localisées à l'interface du monolithe et attribuées à la formation de bulles pendant la synthèse et une accumulation locale du DBTP. A partir de simulations Monte-Carlo de lancer de rayons, nous développons un protocôle pour corriger les artéfacts de réfraction dans les profils d'intensité de fluorescence en fonction de la profondeur, obtenus par des mesures confocales, pour déterminer la distribution axiale du photosensibilisateur ce qui permet de mettre en évidence une nette augmentation de la concentration en photosensibilisateurs dans les premiers 50—100 m dessous la surface. L'analyse FRAP montre la très lente mobilité de tous les photosensibilisateurs et un retour partiel de l'intensité ce qui signifie que les photosensibilisateurs se trouvent dans des régions compartimentées, probablement dues à des contraintes aléatoires du réseau de pores. De plus, l'analyse FLIM montrent des propriétés photo physiques semblables pour le DBTP inclus et greffé ce qui permet d'envisager l'inefficacité de la fonctionnalisation. Ces observations soulignent que les monolithes à base de silice sont des systèmes hors d'équilibre et correspondent à un instantané des inhomogénéités gelées pendant les derniers instants du processus de condensation-hydrolyse des monomères de silice. Enfin, corréler la spectroscopie classique avec nos observations confocales sur différentes formes de DBTP, nous permet d'établir que la bande d'émission de fluorescence non-structurée et fortement déplacée vers le rouge est probablement due à la formation d'excimères. / This work presents an optical and fluorescence microscopy study of hybrid materials based on porous silica monoliths containing derivatives of cyano-anthracene: 9,10-dicyano-anthracene (DCA) or 9,14-dicyano-benzo(b)triphenylene (DBTP), photo-sensitizers of singlet oxygen. While these materials are well known from bulk studies for the efficient photo-oxidation of sulphides under heterogeneous conditions, some characteristics of the association of the photo-sensitizer and the absorbent may be masked, overlooked or otherwise misinterpreted by bulk investigations alone. Here, we combine classical bulk spectroscopy with optical and fluorescence microscopy, and develop experimental protocols for thick solid state samples, to study the spatial distribution and the mobility of the guest in the host matrix, and analyse guest-host interactions. Optical microscopy shows in all cases localised inhomogeneities at monolith interface, ascribed to bubble formation during synthesis; wide-field fluorescence microscopy shows that these features are associated with local accumulation of the larger, more hydrophobic of the two photo-sensitizers, DBTP. Photo-sensitizer lateral distribution at the monolith interface is otherwise homogeneous. Based on Monte Carlo ray-tracing simulations, we develop a protocol for correcting refraction artefacts in measured confocal fluorescence depth profiles, to obtain the photo-sensitizer axial distribution. While it in general exhibits a sharp increase in concentration in the first 50—100 m below the surface compared to the bulk, this layer contributes negligibly to the total content of the monoliths. FRAP analysis shows mobility of the photo-sensitizers in all cases, but with diffusion constants implying months or years to equilibrate the centimetre-sized monoliths. Classical bulk and confocal spectroscopy with FLIM analysis show similar photo-physical properties of DBTP included and grafted. The main effects of funcionalization in this photo-sensitizer are to slow down diffusion and to counter its aggregation. Incomplete FRAP recovery implies photo-sensitizer mobility is compartmented, probably due to random constrictions in the pore network. These observations underline that silica-based monoliths are non-equilibrium systems encapsulating a snapshot of any homogeneities frozen in during the later stages of hydrolysis-condensation of silicate units. Correlating classical bulk spectroscopy with our confocal observations on the different DBTP forms, conclude that its unusual structureless, red-shifted emission is probably due to excimer emission.

Le maintien de l’homéostasie énergétique est placé sous le contrôle de cytokines qui agissent dans le système nerveux central, notamment au niveau de l’hypothalamus. En particulier, la leptine, cytokine produite par le tissu adipeux, diminue la prise alimentaire et stimule la perte de poids. L’obésité est une épidémie mondiale qui progresse de façon alarmante, notamment chez les enfants et souvent associée à des pathologies sévères et des désordres endocriniens comme la résistance à la leptine ou à l’insuline. Le CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor) est une neurocytokine de la même famille que la leptine dont l’un des principaux avantages est qu’il stimule la perte de poids dans les cas de leptino-résistance en activant les mêmes voies de signalisation que la leptine (Benomar et al., 2009). Face à l’épidémie mondiale d’obésité,chez la population adulte comme enfantine, il apparaît nécessaire de décrypter les mécanismes impliqués dans la genèse de la maladie ainsi que les potentiels agents thérapeutiques.L’objectif premier de ce travail de thèse a été de caractériser l’impact d’une alimentation maternelle hyperlipidique (HF) sur les capacités de contrôle de l’homéostasie énergétique chez la descendance. En effet, le concept de « programmation métabolique » propose que des pertubations de l’environnement périnatal puissent influencer durablement la descendance, la rendant plus susceptible de développer une obésité dans un contexte nutrionnellement riche.Des études menées au sein du laboratoire ont montré qu’un régime maternel HF pouvait programmer l’acquisition de la leptino-résistance chez la descendance à l’âge adulte (Ferezou-Viala et al., 2007b). Nous avons donc testé la prédispostion de ces animaux à prendre du poids lorsqu’ils étaient nourris avec un régime hypercalorique (P). Nos données ont montréqu’étonnamment, le régime maternel HF protégeait la descendance contre le gain de poids induite par le régime P, induisait des modifications d’expression des marqueurs de l’homéostasie énergétique dans le foie et l’hypothalamus, ainsi que de profondes réorganisations cytoarchitectoniques dans le noyau arqué. Plus précisément, le régime maternel HF était associé à une réorganisation de la couverture astrocytaire périvasculaire dans le noyau arqué de la descendance qui persistait à l’âge adulte.Dans une seconde partie de la thèse, nous avons étudié les mécanismes d’action du CNTF. En effet, notre équipe a récemment mis en évidence que le CNTF endogène pourrait jouer un rôle dans la régulation de l’homéostasie énergétique. Les niveaux hypothalamiques de cette cytokine, présente dans les astrocytes et les neurones du noyau arqué, augmentent chez les animaux résistant à une alimentation hypercalorique. Cela pourrait suggérer un rôle protecteur du CNTF contre la prise de poids chez certains individus (Vacher et al., 2008). A ce jour, les mécanismes d’action du CNTF restent cependant mal compris car ce dernier ne possède pas de peptide signal et n’est donc pas sécrété selon des mécanismes d’exocytose classiques. Partant du constat que le CNTF et ses sous-unités réceptrices étaient distribuées de façon similaire dans les cellules du noyau arqué, nous avons émis l’hypothèse que le CNTF pourrait exercer une action intracellulaire sur les cellules de cette structure. Dans cette étude nous démontrons que le CNTF peut interagir directement avec ses récepteurs dans le noyau des neurones anorexigènes du noyau arqué, pour réguler leur activité transcriptionnelle. Ces données proposent ainsi un nouveau mécanisme à l’action anorexigène du CNTF / Obesity is a major health disease which involves numerous metabolic disorders. Increasing evidence suggests that the risk of developing the pathology in adulthood may be influenced through inappropriate perinatal nutrition. In our study, we first investigated the impact of a maternal high-fat (HF) diet, which is known to induce hypothalamic leptin resistance in adult offspring (Férézou-Viala et al., 2007), to develop obesity in a rich diet environment (P diet). Our results showed that surprisingly, HF maternal diet protected offspring against body weight gain induced by P diet. In a second part of the thesis, we studied mechanisms of action of CNTF, a neurocytokine which could protect some people against body weight gain induced by a P diet (Vacher et al., 2008). Results of this study showed that CNTF ant its subunits receptors could translocate to the hypothalamic cell nucleus to induced POMC transcription.

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L'exocytose régulée, est un processus qui permet la communication entre les cellules à travers la sécrétion des hormones et des neurotransmetteurs. Dans les neurones et les cellules neuroendocrines, l'exocytose est strictement contrôlée par des signaux extracellulaires tels que le potentiel trans-membranaire et la fixation des ligands sur des récepteurs. Des progrès substantiels ont été effectués afin de comprendre le mécanisme moléculaire de l'exocytose. Les composants majeurs de la machinerie de sécrétion ont été dévoilés. Maintenant, la question qui émerge concerne le rôle de la plateforme de protéines qui semble avoir une action coordonnée entre chaque protéine. Dans le cas de la famille des annexines, qui est bien connue pour son action dans l'exocytose, leurs modes d'interactions séquentielles ou concertées avec d'autres protéines ainsi que leurs effets régulateurs sur l'exocytose ne sont pas encore bien établis. Des résultats précédents indiquent que l'Annexine A6 (AnxA6) affecte l'homéostasie du calcium et la sécrétion de la dopamine à partir des cellules PC12, utilisées comme un modèle cellulaire de neurosécrétion (Podszywalow Bartnicka et al., 2010). Afin de déterminer l'effet inhibiteur de l'AnxA6 sur l'exocytose de la dopamine, nous cherchons des partenaires moléculaires de l'AnxA6 dans les cellules PC12. Nous faisons l'hypothèse que l'AnxA6 interagit avec la PLD1, une enzyme active dans l'étape de la fusion des vésicules avec la membrane plasmique. En utilisant la microscopie confocale et la microscopie à onde évanescente, nous avons trouvé que l'isoforme 1 de l'AnxA6 et la PLD1 sont tous les deux recrutés sur la surface des vésicules au cours de la stimulation des cellules PC12. AnxA6 inhibait l'activité de la PLD comme indiqué par notre méthode d'analyse enzymatique au moyen de la spectroscopie infrarouge. En conclusion, nous proposons que l'AnxA6 n'est pas seulement impliquée dans la réorganisation des membranes par ses capacités à se lier avec des phospholipides négativement chargés et avec le cholestérol, mais elle influence également l'activité de la PLD1, changeant la composition lipidique des membranes / The regulated exocytosis is a key process allowing cell-cell communication through the release of hormone and neurotransmitters. In neurons and neuroendocrine cells, it is strictly controlled by extracellular signal such as transmembrane potential and ligand bindings to receptors. Substantial progress has been made to understand the molecular mechanism of exocytosis. Major components of secretory machinery have been brought to light. Now the emergent question concerns the role of scaffolding proteins that are thought to coordinate the action of each other. In the case of annexin family well known to be involved in exocytosis, their modes of –sequential or concerted- interactions with other proteins, and their regulatory effects on exocytosis are not very well established. Previous findings indicated that Annexin A6 (AnxA6) affected calcium homeostasis and dopamine secretion from PC12 cells, used as cellular model of neurosecretion (Podszywalow-Bartnicka et al., 2010). To determine the inhibitory effect of AnxA6 on exocytosis of dopamine, we were looking for molecular partners of AnxA6 in PC12 cells. We hypothesized that AnxA6 interacts with phospholipase D1 (PLD1), an enzyme involved in the fusion step. By using confocal microscopy and total internal reflection fluorescence microscopy, we found that isoform 1 of AnxA6 and Phospholipase D1 are both recruited on the surface of vesicles upon stimulation of PC12 cells. AnxA6 inhibited phospholipase D activity as revealed by our enzymatic assay based on infrared spectroscopy. To conclude, we propose that AnxA6 is not only implicated in membrane organization by its capacity to bind to negative charged phospholipids and to cholesterol, but AnxA6 is also affecting PLD1 activity, changing membrane lipids composition