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Revisa morfológicamente y molecularmente, mediante el código de barras de ADN, las especies de Cryptonemia presentes en la costa central de Perú. Una colecta exhaustiva de ejemplares de Cryptonemia, entre los 9°S - 78°O y los 15°S - 75°O, proporciona material para el análisis morfológico, donde se aplican técnicas de tinción con anilina y de medición con el software ImageJ. Para el análisis molecular se generan secuencias del gen cloroplastidial rbcL, con las cuales se realiza construcciones filogenéticas con tres métodos: el método de máxima parsimonia (MP), máxima verosimilitud (ML) e inferencia bayesiana (IB). Los análisis morfológicos y moleculares reconocen solo tres especies de las seis reportadas para la costa central, C. anconensis, C. limensis, C. obovata, más dos especies no reconocidas, Cryptonemia sp.1 y Cryptonemia sp. 2. Futuras revisiones requieren incluir una mayor cantidad de ejemplares para las morfoespecies caracterizadas, en especial Cryptonemia sp. 1 y Cryptonemia sp. 2, así como la aplicación de otros marcadores moleculares, mitocondriales y nucleares, los cuales han sido de ayuda para distinguir especies y resolver las relaciones filogenéticas en otros géneros de la familia Halymeniaceae. / Tesis

Modern agriculture has been focused on very intensive agricultural systems that depend on external inputs such as fertilizers or pesticides. These practices have lead to a simplification of the landscape and a decline of abundance of natural enemies. Nevertheless in the last years there has been an increasing interest in the application of more environmentally friendly techniques in agriculture, such as biological control (BC). Specifically, conservation biological control (CBC) involves the manipulation of the environment to enhance natural enemy’s effectiveness, which can be achieved by means of reducing harmful conditions or improving favourable ones. Habitat management, a part of the CBC approach, consists of selecting plants that provide natural enemies with resources such as non-host foods including pollen or nectar, alternative preys or hosts or shelter from adverse conditions. There are several forms of habitat manipulation approaches that may enhance natural enemy’s numbers in crops; of all those different strategies, the use of insectary plants to conserve beneficial insects has been greatly used. The main objective of this work is to investigate the extent to which the use of vegetal resources may improve the CBC by means of habitat manipulation. This main objective has been developed in six specific objectives that have been carried out in sex chapters. In chapter 1, the potential of the Mediterranean plant Lobularia maritima to be used as an insectary plant for the conservation of the omnivorous predator Orius majusculus has been evaluated. This predator effectively preys on thrips in crops such as lettuce as its conservation in the Mediterranean area is very important. The results have shown that L. maritima provides the predator enough resources to survive in the absence of prey, which would allow the survival of the predator during periods of prey scarcity. In chapter 2, both O. majusculus and O. laevigatus have demonstrated that they prey on thrips in L. maritima plants and they are able to control these pest populations on this insectary plant. At the same time, O. majusculus effectively reproduces on L. maritime with thrips as prey. Therefore, L. maritima can be considered a good insectary plant for the conservation of O. majusculus that does not enhance thrips populations. Results in chapter 3 have demonstrated that different plant species affect very differently the survival, reproduction and nutrient status of the predatory bug O. insidiosus. These observed differences are in part due to the levels of access to the floral and extrafloral resources. Moreover, the predator reproduction is enhanced by an increase in biodiversity. These results show that it is very important to choose the most appropriate plant species for each specific situation and each specific CBC program. In chapter 4 the interactions of two important predators have been evaluated. It has been observed that O. insidiosus and N. americoferus are able to detect one another when they share the same habitat and in fact, they change their reproductive decisions depending on if they are exposed to the other species or they are only exposed to conspecifics. In chapter 5 tomato specific DNA markers have been designed. They allow the tomato DNA identification within the guts of three different species with different feeding habits in the laboratory. Moreover, these markers allow the tomato DNA identification within field collected insects. In chapter 6 is has been demonstrated that the use of mulches in vineyards not only enhance the arthropods abundance on the vineyard soil but also they improve several ecosystem services such as soil temperature and moisture and earthworm populations. On the other hand they improved some harvest parameters and they reduce pest and diseases on the vineyard canopy. Overall it can be concluded that the results of this work have demonstrated that the use of several vegetal resources can noticeably improve CBC programs despite the fact the vegetal species must be selected carefully and depending on every specific CBC program. / La agricultura moderna se ha centrado en sistemas de producción muy intensivos, lo cual ha mermado considerablemente el estado de salud tanto del medio natural como de los enemigos naturales que en el habitan. Sin embargo en los últimos años ha habido una cada vez más marcada tendencia hacia sistemas agrarios más respetuosos con el medio ambiente. En éste contexto el control biológico (CB) ha tomado una mayor relevancia y el número de trabajos de investigación centrados en esta disciplina ha ido creciendo en las últimas décadas. Dentro del CB, el control biológico por conservación (CBC) se basa en la conservación de enemigos naturales en campo bien mediante la mejora de aquellas condiciones que les favorecen bien mediante el detrimento de las condiciones que les perjudican. Dentro del CBC, la gestión del hábitat mediante el uso de plantas insectario favorece la conservación de dichos enemigos naturales en el campo, facilitando de esta manera el control de plagas en los cultivos. El objetivo general de esta tesis ha sido el de investigar hasta qué punto el uso de recursos vegetales puede contribuir al CBC mediante la gestión del hábitat. En el capítulo 1 se ha evaluado el potencial de una planta insectario mediterránea, Lobularia maritima, para conservar un importante depredador de trips, Orius majusculus, en cultivos como la lechuga. Esta planta ha demostrado que cuenta con los recursos suficientes para conservar a dicho depredador en el campo en periodos de escasez de presa. En el capítulo 2 se ha obtenido que tanto O. majusculus como O. laevigatus son capaces de controlar a su presa principal, trips, en plantas de L. maritima, en condiciones de laboratorio; así mismo, O. majusculus se reproduce eficazmente cuando se alimenta en trips en dicha planta insectario. Por tanto, L. marítima permite tanto el establecimiento del depredador como el control de trips por parte del anterior, lo cual la presenta como una buena candidata para la conservación de O. majusculus. En el capítulo 3 se ha observado que distintas especies vegetales afectan de manera muy diversa al desarrollo de otro depredador. O. insidiosus, y que dichas variaciones se deben en parte al acceso a los recursos florales y extra florales de las plantas. Este depredador además es capaz de optimizar su reproducción ante un aumento de la diversidad vegetal. Estos resultados revelan la importancia de elegir la especie vegetal más apropiada, evaluando cada contexto concreto. En el capítulo 4 se ha obtenido que dos importantes depredadores, O. insidiosus y N. americoferus, son capaces de detectar la presencia el uno del otro cuando comparten el mismo hábitat y que, de hecho, alteran sus decisiones reproductivas dependiendo de si se ven expuestos a individuos conspecíficos o de otra especie. En el capítulo 5 se han diseñado marcadores moleculares específicos de tomate que permiten la detección del mismo inmediatamente después de ser ingerido en 3 especies de insectos. Además estos marcadores permiten la detección de material vegetal de insectos de campo. En el capítulo 6 se ha obtenido que el uso de mantillos vegetales en viña permiten una mayor población de artrópodos beneficiosos y de lombrices de suelo, comparado con el suelo desnudo. Por otra parte, mejora las condiciones del suelo, así como puede mejorar la calidad de la uva y la cosecha. En general puede concluirse que los resultados de esta tesis han demostrado que el uso de varios recursos vegetales puede mejorar de manera notable la aplicación de programas de CBC, aunque las especies vegetales deben seleccionarse de manera cuidadosa y según se adapten mejor a cada situación concreta.

La limitació en l’ús de fungicides per al control de malalties en postcollita de fruita és una problemàtica d’elevada magnitud en el sector fructícola actual. Degut a això l’ús d’estratègies alternatives com el control biològic microbià són fonamentals per a la producció de fruita de qualitat. Malgrat tot, el desenvolupament de programes de biocontrol eficaços requereix d’un coneixement profund de la capacitat de control i els mecanismes d’acció utilitzats per l’agent microbià que es pretén emprar, així com de la possibilitat per a què aquest pugui ésser produït i formulat a nivell comercial. En aquest context, la bactèria Bacillus subtilis soca CPA–8 aïllada de la superfície de nectarines al Laboratori de Patologia de Postcollita del Centre IRTA (Lleida) ha demostrat tenir una bona capacitat de biocontrol de malalties de postcollita de fruita de pinyol. El seu futur ús a nivell comercial depèn de l’estudi del seu potencial de biocontrol de malalties de postcollita de fruita; així com del desenvolupament de processos per a l’optimització de la producció i formulació. La present tesi tenia com a objectiu principal avaluar aspectes clau per al desenvolupament de B. subtilis CPA–8 com agent efectiu per al control biològic de malalties de postcollita de fruita. Per a complir amb aquest objectiu, en primer lloc, es va dur a terme una anàlisi detallada de les característiques biològiques de la soca CPA–8 com ara el seu creixement en medi de cultiu, producció d’endòspores i substàncies antifúngiques; així com el seu potencial per al control de malalties importants en postcollita de taronja, poma i fruita de pinyol (Capítol 1). Amb aquests resultats, el següent pas fou estudiar el mode d’acció utilitzat per B. subtilis CPA–8 per a la supressió de patògens de postcollita, concretament contra Monilinia spp. causant de la podridura marró en fruita de pinyol (Capítol 2). Mitjançant la combinació d’eines d‘anàlisi químic, moleculars i biològiques es van determinar els principals factors implicats en la capacitat antagònica de la soca CPA–8 contra Monilinia spp. El pas següent fou optimitzar la producció de B. subtilis CPA–8, en aquest sentit es va desenvolupar un medi de cultiu de baix cost que proporcionés un creixement alt i mantingués l’eficàcia de biocontrol (Capítol 3). Primer es van buscar fonts de nitrogen i de carboni econòmiques entre productes comercials i subproductes agroalimentaris. Posteriorment es va dur a terme l’escalat de la producció de la bactèria en un bioreactor de 5 L i es va comprovar l’efectivitat per al control de Monilinia spp. en préssecs. El pas final fou la formulació de B. subtilis CPA–8 mitjançant l’assecat per atomització (Capítols 4 i 5). Aquest mètode fou seleccionat per dos motius, d’una banda perquè aquesta és una tècnica d’assecat viable per a formulació de bactèries a baix cost i per l’altra banda en base als resultats obtinguts en el capítol 1 sobre la capacitat de la bactèria per produir endòspores resistents al calor i efectives contra patògens de postcollita de fruita. Primer es va dur a terme un estudi comparatiu de l’efecte de l’atomització sobre la supervivència de B. subtilis CPA–8 i de l’agent de biocontrol Pantoea agglomerans CPA–2 (Capítol 4). Posteriorment es va realitzar una avaluació de les substàncies protectores/material de suport més adequades per a l’atomització de la soca CPA–8, i amb els millors productes atomitzats es van avaluar diferents medis de rehidratació i l’activitat antifúngica; així com la vida útil y l’efectivitat durant l’emmagatzemament (Capítol 5) Els resultats obtinguts en el capítol 1 demostraren que B. subtilis CPA–8 produeix cèl lules, endòspores resistents al calor i compostos que tenen una alta activitat antagònica in vitro contra els principals patògens de postcollita de fruita Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum i Penicillium expansum. Els tractaments de cèl lules, endòspores y sobrenedants lliures de cèl lules de la soca CPA–8 mostraren diferents nivells d’efectivitat per al control de podridures en taronja, poma i fruita de pinyol, presentant els millors resultats contra Monilinia spp. en préssecs i nectarines amb reduccions de la incidència de la malaltia fins al 100 %. L’assaig de dosis de diferents tractaments de la soca CPA–8 a 108, 107 i 106 UFC mL–1 foren efectius contra Monilinia spp. de forma semblant o millor al Serenade Max®. L’estudi del mode d’acció de B. subtilis CPA–8 (Capítol 2) va demostrar que els sobrenedants lliures de cèl lules provinents de cultius líquids tenen una alta activitat antifúngica in vitro contra Monilinia spp. similar a l’observada amb suspensions cel lulars. Les anàlisis mitjançant PCR i bioautografia en TLC d’extractes butanòlics d’aquests sobrenedants en comparació amb els de les soques de referència de B. subtilis UMAF6614 i UMAF6639, van revelar la producció de les principals famílies de lipopèptids antifúngics coneguts en Bacillus (fengicines, iturines i surfactines), fet que apuntava l’antibiosi com a principal mecanisme d’acció implicat en la capacitat de biocontrol de B. subtilis CPA–8. Les fraccions corresponents a les fengicines foren les responsables de l’activitat inhibitòria de la soca CPA–8 enfront de Monilinia spp. Aquests resultats van ser corroborats definitivament mitjançant la construcció de mutants de B. subtilis CPA–8 defectius per a la producció de fengicina interrompent l’expressió del gen fenB. Les anàlisis per PCR i bioautografia en TLC revelaren que els mutants defectius de la soca CPA–8 perdien la capacitat d’inhibir a Monilinia spp. per la seva incapacitat per a produir fengicines. Els assaigs d’efectivitat en fruita utilitzant tractaments provinents dels mutants de la soca CPA–8 van demostrar que aquests havien perdut la capacitat de controlar la podridura causada per Monilinia spp. amb percentatges d’incidència similars als observats en el control sense tractar, mentre que els tractaments amb la soca parental o Serenade Max® presentaven reduccions de la malaltia de fins el 100 %. Tots aquests resultats demostraren que la producció de fengicines juga un paper molt important en l’efectivitat de B. subtilis CPA–8 per a controlar la podridura marró del préssec; i que aquest resulta ser el principal mode d’acció implicat en la seva capacitat de biocontrol. En l’optimització de la producció de B. subtilis CPA–8 (Capítol 3) els resultats obtinguts van demostrar que és possible aconseguir alts nivells de biomassa (superiors a 3×109 UFC mL–1) emprant dos medis de baix cost composats per farina de soja desengreixada 44 % a 40 g L–1 com a font de nitrogen en combinació amb sacarosa a 20 g L–1 o melassa a 5 g L–1 com a fonts de carboni. A més a més, la producció de la soca CPA–8 en aquest medi de baix cost va poder ser escalada a nivell de laboratori en un bioreactor de 5 L de capacitat a 30 °C, amb agitació de 200 rpm i flux d’aire de 100 L h–1, mantenint les concentracions de la bactèria a 3×109 UFC mL–1. Els assaigs en fruita amb tractaments de la soca CPA–8 crescuda en el medi optimitzat de baix cost van demostrar que aquesta mantenia la seva eficàcia de biocontrol contra M. fructicola en préssecs amb reduccions de la malaltia de fins al 95 %, similar als tractaments de la bactèria crescuts en medis de laboratori. Les poblacions de CPA–8 van sobreviure en ferides de préssecs inoculats, independentment dels medis de cultiu utilitzats. Aquests resultats proporcionen una base fiable per a la producció de la soca CPA–8 a nivell industrial. En la formulació de B. subtilis CPA–8 mitjançant assecat per atomització (Capítols 4 i 5) els resultats demostraren que aquesta bactèria és capaç de sobreviure a les altes temperatures del procés (32.3 % de viabilitat i 3.3×109 UFC g–1 de concentració final de producte), comparada amb P. agglomerans CPA–2 utilitzada com a model de bactèria sensible a la calor i no formadora d’endòspores que no fou resistent (menys del 2 % de viabilitat). La supervivència de la soca CPA–8 a l’atomització va estar directament relacionada amb la seva capacitat per a produir endòspores resistents a les altes temperatures. La resistència a la calor de la soca CPA–8 a més a més va dependre de la fase de creixement, essent el cultiu de 72 h, més resistent que el de 24 h, probablement pel seu major contingut d’endòspores. Els resultats obtinguts en l’estudi de la substància protectora/material de suport més adequada per a l’atomització de B. subtilis CPA–8 van demostrar que quatre diferents combinacions de llet desnatada en pols i MgSO4 proveïen una bona recuperació de pols (28–38 %) i continguts d’humitat del 7–13 %. La supervivència de la soca CPA–8 fou diferent en els atomitzats dels cultius de 24 i 72 h. Les formulacions de 72 h mostraven una major supervivència (28–32 %) y amb concentracions finals al voltant d’1.6–3.3×109 UFC g–1, mentre que la viabilitat dels atomitzats de 24 h fou inferior a l’1 %, fet pel qual les primeres van seleccionar–se per a la seva posterior avaluació. Diferents rehidratants como l’aigua o el tampó fosfat van proporcionar una bona recuperació de cèl lules viables en les formulacions de CPA–8 similars a les obtingudes amb llet desnatada en pols o sacarosa al 10 % amb el que es dedueix que l’aigua pot utilizar–se com a rehidratant amb l’avantatge a nivell pràctic que això suposa. L’estudi de la vida útil de les formulacions de la soca CPA–8 emmagatzemades a 4 °C (fred) i a 20 °C (temperatura ambient) va demostrar que la viabilitat es mantenia o disminuïa lleugerament (0.2–0.3 log) durant 6 mesos d’emmagatzematge. A més a més, després de 4 i 6 mesos de conservació aquestes formulacions controlaven la podridura marró causada per Monilinia spp. en nectarines i préssecs mostrant reduccions de la incidència de la malaltia entre el 90 i 100 %. Els resultats obtinguts van demostrar que l’atomització podria ser un mètode d’assecat adequat per a obtenir formulacions estables i efectives de B. subtilis CPA–8.En conclusió els estudis realitzats en aquesta tesi demostren el potencial de l’antagonista B. subtilis CPA–8 per al control de malalties de postcollita de fruita i estableixen les bases per a la seva posterior implementació de la producció i formulació a nivell comercial. / La limitación en el uso de fungicidas para el control de enfermedades en postcosecha de fruta es un grave problema en el sector frutícola actual. Debido a esto, el uso de estrategias alternativas como el control biológico microbiano son fundamentales para la producción de fruta de calidad. Sin embargo, el desarrollo de programas de biocontrol eficaces requiere de un fuerte conocimiento de la capacidad de control y los mecanismos de acción usados por el agente microbiano que se pretende emplear, así como de la posibilidad para que éste pueda ser producido y formulado a nivel comercial. En este contexto, la bacteria Bacillus subtilis cepa CPA–8 aislada de la superficie de nectarinas en el Laboratorio de Patología de Postcosecha del Centro IRTA (Lleida) ha demostrado tener una importante capacidad de biocontrol de enfermedades de postcosecha de fruta de hueso. Su futuro uso a nivel comercial depende del estudio de su potencial de biocontrol de enfermedades de postcosecha de fruta; así como del desarrollo de procesos para su óptima producción y formulación. La presente tesis tiene como objetivo fundamental evaluar aspectos clave para el desarrollo de B. subtilis CPA–8 como agente eficaz de control biológico de enfermedades de postcosecha de fruta. Para cumplir con este objetivo, en primer lugar, se realizó un análisis detallado de las características biológicas de la cepa CPA–8 como su crecimiento en medio de cultivo, producción de endosporas y sustancias antifúngicas; así como su potencial para el control de importantes podredumbres de postcosecha de naranja, manzana y fruta de hueso (Capítulo 1). Con estos resultados el siguiente paso fue estudiar el modo de acción usado por B. subtilis CPA–8 para la supresión de patógenos de postcosecha, concretamente contra Monilinia spp. causante de la podredumbre marrón en fruta de hueso (Capítulo 2). Mediante la combinación de herramientas de análisis químico, molecular y biológico se determinaron los principales factores implicados en la capacidad antagónica de la cepa CPA–8 contra Monilinia spp. El siguiente paso fue optimizar la producción de B. subtilis CPA–8, para lo cual se desarrolló un medio de cultivo de bajo coste que proporcionase un crecimiento alto y mantuviese la eficacia de biocontrol (Capítulo 3). Primero se buscaron fuentes de nitrógeno y carbono económicas entre productos comerciales y subproductos agroalimentarios. Posteriormente se realizó el escalado de producción de la bacteria en un bioreactor de 5 L y se comprobó la efectividad para el control de Monilinia spp. en melocotones. El paso final fue la formulación de B. subtilis CPA–8 mediante secado por atomización (Capítulos 4 y 5). Este método fue seleccionado por dos motivos, por un lado porque ésta es una técnica de secado viable para formulación de bacterias a bajo coste y en base a los resultados obtenidos en el capítulo 1 sobre la capacidad de la bacteria para producir endosporas resistentes al calor y eficaces contra patógenos de postcosecha de fruta. Primero se realizó un estudio comparativo del efecto de la atomización sobre la supervivencia de B. subtilis CPA–8 y del agente de biocontrol Pantoea agglomerans CPA–2 (Capítulo 4). Posteriormente se realizó una evaluación de las sustancias protectoras/material de soporte más adecuadas para la atomización de la cepa CPA–8, y de los mejores productos atomizados se evaluaron los distintos medios de rehidratación y la actividad antifúngica; así como su vida útil y efectividad durante conservación (Capítulo 5).Los resultados obtenidos en el capítulo 1 indicaron que B. subtilis CPA–8 produce células, endosporas resistentes al calor y compuestos que tienen una alta actividad antagónica in vitro contra los principales patógenos de postcosecha de fruta Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum y Penicillium expansum. Los tratamientos de células, endosporas y sobrenadantes libres de células de la cepa CPA–8 mostraron diferentes niveles de efectividad para el control de podredumbres en naranja, manzana y fruta de hueso, presentando los mejores resultados contra Monilinia spp. en fruta de hueso con reducciones de la incidencia de la enfermedad hasta del 100 %. El ensayo de dosis de diferentes tratamientos de la cepa CPA–8 a 108, 107 y 106 UFC mL–1 fueron efectivos contra Monilinia spp., de forma similar o mejor que Serenade Max®. El estudio del modo de acción de B. subtilis CPA–8 (Capítulo 2) demostró que los sobrenadantes libres de células provenientes de cultivos líquidos tenían una alta actividad antifúngica in vitro contra Monilinia spp. similar a la observada con suspensiones celulares. Los análisis mediante PCR y bioautografía en TLC de extractos butanólicos de estos sobrenadantes en comparación con los de las cepas de referencia de B. subtilis UMAF6614 y UMAF6639, revelaron la producción de las principales familias de lipopéptidos antifúngicos conocidos en Bacillus (fengicinas, iturinas y surfactinas), lo que apuntó a la antibiosis como el principal mecanismo de acción implicado en la capacidad de biocontrol de B. subtilis CPA–8. Las fracciones correspondientes a las fengicinas fueron las responsables de la actividad inhibitoria de la cepa CPA–8 frente a Monilinia spp. Estos resultados fueron definitivamente corroborados mediante la construcción de mutantes de B. subtilis CPA–8 defectivos para la producción de fengicina interrumpiendo la expresión del gen fenB. Los análisis por PCR y bioautografía en TLC revelaron que los mutantes defectivos de la cepa CPA–8 perdieron la capacidad de inhibir a Monilinia spp. por su incapacidad para producir fengicinas. Los ensayos de efectividad en fruta utilizando tratamientos provenientes de los mutantes de la cepa CPA–8 demostraron que éstos habían perdido su capacidad para controlar la podredumbre causada por Monilinia spp. con porcentajes de incidencia similares a los observados en el control sin tratar, mientras que los tratamientos con la cepa parental o Serenade Max® presentaron reducciones de enfermedad de hasta el 100 %. Todos estos resultados demostraron que la producción de fengicinas juega un papel muy importante en la efectividad de B. subtilis CPA–8 para controlar la podredumbre marrón del melocotón; y que éste resulta ser el principal mecanismo de acción implicado en su capacidad de biocontrol. En la optimización de la producción de B. subtilis CPA–8 (Capítulo 3) los resultados obtenidos demostraron que se pueden conseguir altos niveles de biomasa (superiores a 3×109 UFC mL–1) usando dos medios de bajo coste compuestos por harina de soja desengrasada 44 % a 40 g L–1 como fuente de nitrógeno en combinación con sacarosa a 20 g L–1 o melaza a 5 g L–1 como fuentes de carbono. Además la producción de la cepa CPA–8 en este medio de bajo coste pudo ser escalada a nivel de laboratorio en un bioreactor de 5 L de capacidad a 30 °C, con agitación de 200 rpm y flujo de aire de 100 L h–1, manteniendo las concentraciones de la bacteria a 3×109 UFC mL–1. Los ensayos en fruta con tratamientos de la cepa CPA–8 crecida en el medio optimizado de bajo coste demostraron que ésta mantenía su eficacia de biocontrol contra M. fructicola en melocotones con reducciones de enfermedad de hasta el 95 %, similar a los tratamientos de la bacteria crecidos en medios de laboratorio. Las poblaciones de CPA–8 sobrevivieron en heridas de melocotones inoculados, independientemente de los medios de cultivo utilizados. Estos resultados proporcionan una base fiable para la producción de la cepa CPA–8 a nivel industrial. En la formulación de B. subtilis CPA–8 mediante secado por atomización (Capítulos 4 y 5) los resultados demostraron que esta bacteria es capaz de sobrevivir a las altas temperaturas del proceso (32.3 % de viabilidad y 3.3×109 UFC g–1 de concentración final de producto), comparado con P. agglomerans CPA–2 utilizada como modelo de bacteria sensible al calor y no formadora de endosporas que no fue resistente (menos del 2 % de viabilidad). La supervivencia de la cepa CPA–8 a la atomización estuvo directamente relacionada con su capacidad para producir endosporas resistentes a las altas temperaturas. La resistencia al calor de la cepa CPA–8 además dependió de la fase de crecimiento, siendo el cultivo de 72 h, más resistente que el de 24 h, probablemente por su mayor contenido de endosporas. Los resultados obtenidos en el estudio de la sustancia protectora/material de soporte más adecuada para la atomización de B. subtilis CPA–8 demostraron que cuatro diferentes combinaciones de leche desnatada en polvo y MgSO4 proveían una buena recuperación de polvo (28–38 %) y contenidos de humedad del 7–13 %. La supervivencia de la cepa CPA–8 varió considerablemente en los atomizados con los cultivos de 24 h y los de 72 h. Las formulaciones de 72 h mostraron una mayor supervivencia (28–32 %) y con concentraciones finales entorno a 1.6–3.3×109 UFC g–1, mientras que la viabilidad de los atomizados de 24 h fue inferior al 1 %, por lo cual se seleccionaron para su posterior evaluación. Diferentes rehidratantes como el agua o tampón fosfato proporcionaron una buena recuperación de células viables en las formulaciones de CPA–8 similares a las obtenidas en leche desnatada en polvo o sacarosa al 10 % por lo que el agua puede utilizarse como rehidratante con la ventaja a nivel práctico que supone. El estudio de la vida útil de las formulaciones de la cepa CPA–8 almacenadas a 4 °C (frío) y a 20 °C (temperatura ambiente) demostró que la viabilidad se mantuvo o disminuyó ligeramente entorno a 0.2–0.3 log durante 6 meses de almacenamiento. Además después de 4 y 6 meses de almacenamiento estas formulaciones controlaron la podredumbre marrón causada por Monilinia spp. en nectarinas y melocotones mostrando reducciones de la incidencia de la enfermedad entre el 90 y 100 %. Los resultados obtenidos demostraron que la atomización podría ser un método de secado adecuado para obtener formulaciones estables y eficaces de B. subtilis CPA–8. En conclusión los estudios realizados en esta tesis demuestran el potencial del agente de biocontrol B. subtilis CPA–8 para el control de enfermedades de postcosecha de fruta y sientan las bases para su posterior implementación de la producción y formulación a nivel comercial / Synthetic fungicides are the primary means to reduce losses caused by postharvest diseases. However, public concern for their negative impact on human health and environment associated with undesirable chemical residues on fruit and proliferation of fungicide–resistant isolates have impelled the search for alternative methods. Biological control using microorganisms has emerged as an effective alternative to control postharvest diseases and to produce quality fruit free of fungicide residues. However, the development of a successful biocontrol product requires a strong knowledge about the antagonistic ability and mechanisms of action used by the microbial agent to disease suppression and the possibility for its production and formulation to commercial application. In this context, Bacillus subtilis strain CPA–8 isolated from nectarines surface in the Postharvest Pathology Laboratory from IRTA centre (Lleida) has shown a significant capacity for biocontrol of postharvest diseases of stone fruit. Its future use on a commercial level depends on its antagonistic potential to control fruit postharvest diseases as well as an optimum production and formulation systems. This thesis has the main objective to evaluate key aspects involved in development of B. subtilis CPA–8 as an effective biocontrol agent of postharvest diseases on fruit. To achieve this objective, first, the CPA–8 growth and production of endospores and antifungal substances were characterized. Then, biocontrol potential of B. subtilis CPA–8 was tested against the main postharvest decay on oranges, apples and stone fruit (Chapter 1). Based on these results, the mechanism of action used by CPA–8 to suppress postharvest pathogens, particularly against Monilinia spp. causing brown rot in stone fruit was studied (Chapter 2). Based on chemical, molecular and biological analysis the key factors involved in the biocontrol activity of CPA–8 against Monilinia spp. were identified. Next step was optimizing B. subtilis CPA–8 production by developing a low cost medium that provide maximum bacterium growth and maintain its biocontrol efficacy (Chapter 3). First, different media combining economical nitrogen and carbon sources from commercial products and by–products were evaluated. Second, CPA–8 production was scaled up in a 5–liter bioreactor and the efficacy to control of Monilinia spp. in peaches was evaluated. The final step was B. subtilis CPA–8 formulation by spray drying (Chapters 4 and 5). This method was selected because it is a cost effective technique for bacteria preservation and results of Chapter 1 indicated that CPA–8 was heat resistant by endospores production capacity. These endospores had also demonstrated good antifungal activity against fruit postharvest pathogens. First, the role of endospore production by B. subtilis CPA–8 on its survival to spray–drying process was investigated by comparing CPA–8 with the biocontrol agent Pantoea agglomerans CPA–2 as model of heat–sensitive and non–spore forming bacterium (Chapter 4). Finally, carriers/protectants were evaluated to prepare CPA–8 formulations by spray drying; and with the best CPA–8 formulations rehydration media, shelf life stability and biocontrol efficacy during storage were evaluated (Chapter 5). The results obtained in Chapter 1 indicated that CPA–8 produces cells, heat–resistant endospores and compounds with high antifungal activity in vitro against the major fruit postharvest pathogens Botrytis cinerea, Monilinia laxa, Monilinia fructicola, Penicillium digitatum, Penicillium italicum and Penicillium expansum. Treatment of cells, endospores and cell–free supernatants of CPA–8 showed different efficacy levels to control fugal decay on oranges, apples and stone fruit, obtaining the best results against Monilinia spp. on stone fruit with disease reductions up to 100%. Dose tests demonstrated that different CPA–8 treatments at 108, 107 and 106 CFU mL–1 were effective against Monilinia spp., similar or better than Serenade Max®, a commercial biocontrol product based in a B. subtilis strain. Experimental evidence suggested that B. subtilis CPA–8 has biocontrol potential to control postharvest diseases on several fruit types, particularly against peach brown rot. The mode of action study (Chapter 2) showed that cell free supernatants and butanolic extracts from liquid cultures of B. subtilis CPA–8 had a strong antifungal activity in vitro against Monilinia spp. similar to that observed with cell suspensions. Fengycin, iturin and surfactin lipopeptides were identified by TLC in butanolic extracts from cell free supernatants of CPA–a by comparison with the B. subtilis reference strains UMAF6614 and UMAF6639, indicating that antibiosis could be the major factor involved in the CPA–8 biological control ability. TLC–bioautography analysis showed that CPA–8 antifungal activity was associated only with fengycin lipopeptide. These results were definitively supported by mutagenesis analysis targeted to suppress fengycin biosynthesis by disruption of the fenB gene. PCR and TLC–bioautography analysis allowed to identify CPA–8 transformants with reduced or suppressed antifungal activity and to select the defective phenotype associated with the lack of fengycin bands. Fruit trials confirmed that fengycin–defective mutants lost their ability to control peach brown rot disease in comparison with CPA–8 wild type strain or Serenade Max®. Taken together our data indicate that fengycin–like lipopeptides play a major role in the biological control potential of B. subtilis CPA–8 against peach brown rot. The results obtained in Chapter 3 indicate that high production levels of B. subtilis CPA–8 (>3×109 CFU mL–1) could be achieved in a low cost medium based on defatted soy flour 44 % (40 g L–1) with sucrose (20 g L–1) or molasses (5 g L–1). CPA–8 production in the optimized low cost medium was scaled–up in a 5–L bioreactor at 30 °C under shaking at 200 rpm and with air flow of 100 L h–1 and production was maintained around 3×109 CFU mL–1. Fruit trials with cells and cell free supernatants obtained from CPA–8 grown in optimized medium maintained biocontrol efficacy against M. fructicola in peaches showing disease reduction up to 95 %, similar to the treatment from bacterium grown in expensive laboratory media. CPA–8 populations survived in wounds on inoculated peaches, regardless of the culture media used. The results could be used to provide a reliable basis for the fermentation scaling–up process to an industrial level. The results obtained in Chapters 4 and 5 indicate that B. subtilis CPA–8 is heat resistant to high temperatures involved in spray–drying process by endospore production comparing with the heat sensitive and non–spore forming P. agglomerans CPA–2. The 72–h–old CPA–8 cultures spray–dried showed the best survival with 32.3 % viable cells recovery and a final concentration product of 3.3×109 CFU g–1, while CPA–2 viability was lower than 2 %. Heat resistance of CPA–8 was also depending on growth time, being 72–h–old culture more resistant than 24–h–old culture, probably due to the higher content of endospores. These results suggest that endospore production improves CPA–8 resistance to spray–drying formulation system. The study of carriers/protectants addition in spray–drying CPA–8 formulations showed that four different combinations of skim milk and MgSO4 provided reasonable recovery powder (28–38 %) and moisture content (7–13 %). CPA–8 survival varied considerably among spray–dried 24– and 72–h–old formulations. The 72 h–old CPA–8 culture spray dried showed the highest survival (28–32 %) and a final concentration product of 1.6–3.3×109 CFU g–1, while viability of 24 h–old culture formulations were lower than 1 %. Rehydration media as water or phosphate buffer provided good recovery of dried cells from CPA–8 formulations as well as skim milk or sucrose both at 10%. This result is a practical advantage. CPA–8 formulations after 4 and 6 month of storage at 4 ºC (cold) or at 20 ºC (room temperature) maintained survival and efficacy to control brown rot caused by Monilinia spp. on nectarines and peaches achieving disease incidence reductions among 90 and 100 %. Spray drying could be considered a suitable method to obtain stable and effective formulations of B. subtilis CPA–8. In conclusion, the studies in this thesis demonstrated the biocontrol potential of B. subtilis CPA–8 to control postharvest diseases of fruit and established the bases for subsequent implementation of production and formulation at commercial level.

En el cultivo de la vid, se reporta a Botrytis cinerea Pers como el hongo patógeno causante de lesiones cancrosas, necrosamiento de brotes y racimos de flores, y pudrición de frutos y semillas, que ocasionan grandes pérdidas económicas a los agricultores. El control de este patógeno se realiza hasta nuestros días con sustancias de origen químico: plaguicidas; los cuales son aplicados al follaje, a las semillas y al suelo, ocasionando problemas en el ambiente. En el presente trabajo, se colectaron 56 muestras de hojas de vid, infectadas con Botrytis cinerea Pers, en un viñedo del caserío La Huaca, en el distrito de San Benito, provincia de Contumaza, departamento de Cajamarca, durante el verano del 2006; de las cuales se aislaron e identificaron 12 cepas de Trichoderma viride. En la evaluación de la actividad antagonista de las 12 cepas de T. viride sobre B. cinerea mediante el método Precolonizado de Placas a 24° C y 28° C, se seleccionó a las cinco cepas: CH-13, CH-25, CH-30, CH-38 y CH-52 que presentaron los mayores porcentajes de área ocupada sobre el patógeno. Estas cepas presentaron actividad antagonista del tipo micoparasitismo, observándose enrollamiento y penetración de las hifas de las cepas de T. viride sobre las hifas de B. cinerea. De las cinco cepas seleccionadas de T. viride, la cepa CH-30 presentó el mayor porcentaje de área ocupada sobre B. cinerea a 24° C y 28° C con un 54.67% y 98% respectivamente. Por los resultados obtenidos, las cinco cepas nativas de Trichoderma viride pueden ser consideradas como una alternativa ecológica para su evaluación como agentes potenciales de control biológico del patógeno B. cinerea. / In the culturing of grapevine, there is reported Botrytis cinerea Pers as the fungus pathogenic causative of canker injuries, necrotizing of outbreaks and clusters of flowers, and rotting of fruits and seeds, which cause big economic losses to the farmers. The control of this pathogenic is realized actually by substances of chemical origin: pesticides; which are applied to the foliage, to the seeds and to the soil, causing environment problems. In this present work, there were collected 56 samples of leaves of grapevine, infected with Botrytis cinerea Pers, in a vineyard of The Huaca hamlet, in San Benito district, Contumaza province, Cajamarca department, during the summer of 2006; from these ones, there were isolated and identified 12 strains of Trichoderma viride. In the evaluation of the antagonist activity of these 12 strains of T. viride on B. cinerea by the method of Plates pre-colonized in 24° C and 28 °C, was selected five strains: CH-13, CH-25, CH-30, CH-38 and CH-52 that presented the major percentages of occupied area over the fungus pathogenic. These strains showed antagonist activity of mycoparasitism kind, being observed rolling and penetration of mycelium of T. viride strains on the mycelium of B. cinerea. From 5 T. viride strains selected, the CH-30 one showed the major percentage of occupied area on B. cinerea in 24° C and 28 °C with 54.67% and 98% respectively. For the results obtained, five native strains of Trichoderma viride can be considered as an ecological alternative for its evaluation as potential agents of biological control of the pathogenic B. cinerea.

Argentina es el país olivícola más importante del continente Americano, tanto en cantidad de plantas como producción anual obtenida, siendo una actividad asociada a la región oeste y noroeste del país. El olivo constituye el principal cultivo de importancia económica de la región y tiene como plagas re-emergentes a especies de Diaspididos y Coccidos. Actualmente las cochinillas, afectan la calidad de los productos y subproductos del olivo. Comercialmente el daño más significativo es en frutos, siendo éstos descartados para aceitunas en conserva y derivándolos para aceite, los cuales pueden resultar rancios. El objetivo del trabajo fue generar y actualizar el conocimiento sobre las especies de cochinillas que afectan al cultivo del olivo en las principales provincias olivícolas (Catamarca y La Rioja), su variación en el tiempo, especie de mayor importancia y la presencia/ausencia de enemigos naturales en los dos sistemas de producción (STP y SI) existente. Los monitoreos se realizaron en fincas con Sistemas Tradicional de Producción (STP) en la provincia de La Rioja y con Sistemas Intensivos (SI) en la provincia de Catamarca. Los mismos se ejecutaron desde Diciembre de 2007 hasta Diciembre de 2009. En este estudio se registraron siete especies de cochinillas: Parlatoria oleae, Aonidiella aurantii, Aspidiotus nerii, Acutaspis paulista, Pseudischnaspis bowreyi, Hemiberlesia rapax (Diaspididae), y Saissetia oleae (Coccidae). De las especies encontradas Duplaspidiotus koehleri resulto ser una nueva cita para olivo. Parlatoria oleae fue la más importante por su gran abundancia poblacional, su presencia en campo se observo durante todo el año, con dos picos poblacionales máximos en primavera y verano. Además se conoció que sobre esta cochinilla actúa un complejo de enemigos naturales formado por tres especies de parasitoides: Aphytis maculicornis y Coccobius sp. (Aphelinidae) y Signiphora flavopalliata (Signiphoridae); dos especies aún no descriptas de predadores coccinélidos (pertenecientes a los géneros Coccidophilus y Microweisea), un crisópido (Chrysoperla argentina) y un ácaro predador (Acaridae).

Se evaluó las diferencias bioquíinicas en el ámbito de la actividades proteolíticas y de la inhibición de la actividad proteolítica ensayas con proteínas de hojas de papa, entre los clones "resistentes" (282LM87B, 220LM87B, 136LM86B y 662LM86B) y "susceptible" (Revolución) a la inosca ininadora Lirionzyza hmidobrensis, Blanchard (Díptera, Agromyzidae), una plaga perjudicial del cultivo de la papa (Solarium tuberosunz spp) especialmente en lugares donde el uso de insecticidas es intenso. Las i plantas de papa resistentes, y Revolución, fueron sometidas previamente al daño por el ataque de adultos de la mosca minadora (daño por mosca) o por herida con estilete (daño artificial), y para ser evaluados mediante el grado de inducción de las proteínas en las hojas. Entre los clones resistentes, se encontró importantes márgenes de variación de las actividades proteolíticas en las hojas y la inhibición proteolítica de los extractos de larvas por efecto de las proteínas de hojas de los clones 282LM87B y 662LM86B con respecto a Revolución. Las unidades de actividad proteolítica por gramo de proteína de las de hojas (ug-') y las unidades de actividad proteolítica de larvas (U) heron 20,5 ugeyl 0.05 U con 282LM87B; 20.83 ug-'y 0,12 U con 662LM86B y 17,5 ug-'y 0,25 U con Revolución, respectivamente. Mediante ensayos de zimografía para determinar isoinhibidores de proteasas se encontró dos bandas, de 63 y 105 kDa de peso molecular aproximado, expresados mayosinente entre los clones resistentes. Este ensayo determinó una diferenciación visual iinpoitante entre los clones resistentes con el susceptible. Se siguió el nivel de expresión de la banda de 105 kDa entre plantas de diferentes edades (20-80 días) dañadas artificialinente y en el cual se observó disminución en el nivel de su expresión en plantas de más de 60 días. Se discute la correlación de los niveles mayores de actividad proteolítica y de la inhibición de la actividad proteolítica hallados en los clones resistentes, especialmente en 282LM87B, con el atributo de la resistencia a la mosca minadora. Palabras claves: Solanum tuberosum, mosca minadora, zimografía, plantas resistentes.

La presencia en Argentina de Anastrepha fraterculus (Diptera: Tephritidae) (especie nativa) y Ceratitis capitata (especie exótica) limitan la exportación de frutas y hortalizas al estado fresco, ya que estas plagas son de importancia cuarentenaria. A nivel mundial existe una tendencia a disminuir el empleo de plaguicidas de sintesis contra “moscas de la fruta”, debido fundamentalmente a los efectos nocivos de estos sobre el ambiente y la salud humana, sumado a la necesidad de la conservación de la biodiversidad en los agro-ecosistemas. Por tal motivo, los programas para su control se basan en la utilización de un sistema integrado de técnicas bio-racionales o no contaminantes. Como medio bio-rracional de control de estas especies, en Argentina se emplean la técnica del insecto estéril y un himenóptero parasitoide exótico. El uso de microorganismos patógenos como agentes de control biológico es de gran importancia, debido a las enfermedades epizoóticas sobre poblaciones de insectos plaga. Entre ellos, los hongos constituyen un importante grupo de patógenos de insectos y otros artrópodos plaga y son considerados excelentes candidatos como agentes de control biológico, ya que pueden infectar a los insectos directamente a través de la penetración de la cutícula, presentan dispersión activa y pasiva, persistencia en el medio, tolerancia a factores adversos debido al desarrollo de esporas de resistencia, y su manipulación in vitro es relativamente fácil. En Argentina existen varias referencias sobre la presencia y el uso de hongos patógenos sobre insectos plaga, sin embargo, aún no han sido utilizados contra “moscas de la fruta”. Por tal motivo la finalidad de la investigación fue seleccionar especies de hongos patógenos que puedan ser utilizados como agentes de control de A. fraterculus y C. capitata. Se realizó la prospección semanal de larvas y pupas de A. fraterculus y C. capitata que se encontraban en fruta de nogal, durazno y guayaba y en suelo, en la selva de Las Yungas durante los veranos de 2007-2008, 2008-2009 y 2009-2010. Como resultado se obtuvieron 59 aislamiento fúngicos, de los cuales 4 correspondieron al hongo entomopatógeno Beauveria bassiana (Hypocreales: Cordycipitaceae) aislados de larvas de A. fraterculus, 31 al género Fusarium Link, 12 al género Aspergillus Link, 6 a los géneros Penicillium Link y Mucor Micheli. Se evaluó la patogenicidad de los 4 aislamientos nativos de B. bassiana sobre larvas de A. fraterculus, mediante el método de inmersión y de larvas de A. fraterculus y C. capitata, mediante el método de espolvoreo. Y se siguió la mortalidad diferida en pupas y adultos. La mortalidad de larvas y pupas de las dos especies de tefritidos fue mayor al 55% cuando fueron tratadas por el método de espolvoreo. Valores menores al 27% fueron registrados para larvas y pupas de A. fraterculus inoculadas por el método de inmersión. En el caso de los adultos de ambas especies los porcentajes de mortalidad fueron menores al 1% y 22%, mediante la aplicación del inoculo por inmersión y espolvoreo, respectivamente. Se observó que el método de espolvoreo fue más efectivo para el control de los estados inmaduros y que causo un control de la plaga del 80%. También se evaluó la mortalidad de 3 aislamientos de B. bassiana y 1 de Isaria fumosorosea Wizw (Eurotiales: Trichocomaceae) aislados de hospederos no tefritidos, contra larvas y adultos de A. fraterculus, inoculados mediante los métodos de aspersión en tierra e inmersión y aspersión, respectivamente. Se registró una mortalidad entre 12 y 16% para larvas y pupas. Los adultos inoculados por inmersión registraron mortalidades de 44% y 86%, mientras que los inoculados por aspersión menor al 12%. Se realizó un ensayo para evaluar la acción conjunta de B. bassiana aislado a partir de Myzus sp (Hemiptera: Aphididae) y del parasitoide de pupas Coptera haywardi Loiácono (Hymenoptera: Diapriidae) para el control de C. capitata, tanto cuando actuaron juntos como separados, en condiciones de semicampo. Las larvas de la plaga fueron inoculadas mediante la aspersión del inóculo en suelo y se hizo un seguimiento en los estados de pupa y adulto. La acción conjunta de ambos enemigos naturales produjo un control del 95% (eficacia), siendo los adultos el estado más susceptible, mientras que B. bassiana y C. haywardi produjeron un control de 65% y 45%, respectivamente, cuando actuaron independientemente. La mortalidad del hongo sobre el parasitoide fue del 15,6 ± 1,8%. De estos estudios podemos concluir que para lograr un efectivo control de las “moscas de la fruta” es preferible el empleo de cepas aisladas a partir de ellas mismas. Por otra parte se observó que el método de aplicación más efectivo sería la inoculación del hongo en suelo, de este modo las larvas se infectarían al momento de enterrarse y al permanecer en el suelo junto con las pupas muertas y esporuladas, serían una fuente de inoculo para la infección de los adultos emergentes. En cuanto a las cepas nativas de B. bassiana aisladas de larvas de A. fraterculus, se deberían realizar evaluaciones a campo y pruebas de patogenicidad sobre adulto, debido a que no fue evaluado en el presente trabajo.

En el Cinturón Hortícola de La Plata (provincia de Buenos Aires), el cultivo de tomate constituye una de las actividades productivas más importantes, tanto en invernáculo como al aire libre. La “polilla del tomate” Tuta absoluta (Meyrick) (Lepidoptera, Gelechiidae), de origen Neotropical, es la plaga clave del cultivo de tomate en esta región. El control de este insecto se lleva a cabo casi exclusivamente utilizando plaguicidas, lo que trae aparejado toxicidad sobre la salud humana y el ambiente, y efectos negativos sobre los enemigos naturales, con la consecuente disminución del control natural de la plaga. Por estas razones, se necesita explorar enfoques para el manejo basados en principios ecológicos. Entre los endoparasitoides larvales que atacan a T. absoluta en la provincia de Buenos Aires, Pseudapanteles dignus (Muesebeck) (Hymenoptera, Braconidae) es el dominante. Es un endoparasitoide de distribución Neártica y Neotropical, solitario y koinobionte. El conocimiento existente sobre la interacción entre este parasitoide con T. absoluta no es aún suficiente para concluir si el mismo constituye un buen agente de control biológico. La hipótesis central de este trabajo es que el parasitoide P. dignus posee atributos de su historia de vida y parámetros demográficos que le confieren potencialidad para controlar a la plaga T. absoluta, en tomate. El objetivo general fue estudiar aspectos fundamentales de las estrategias de su historia de vida y de su demografía, a campo y en laboratorio, con el fin de aportar bases más sólidas para evaluar su viabilidad en el Control Biológico. Se plantearon los siguientes objetivos parciales: 1) Determinar el potencial de crecimiento poblacional de P. dignus sobre el hospedador T. absoluta, a través de la estimación de parámetros poblacionales en laboratorio, 2) Evaluar el efecto del parasitismo en hospedadores de diferente edad (L1-L2 y L3-L4) de T. absoluta sobre la fecundidad y supervivencia de la hembra de P. dignus, 3) Determinar la estrategia de oviposición (Pro-ovigénica – Sinovigénica) de P. dignus sobre T. absoluta 4) Evaluar la existencia de superparasitismo, 5) Estimar el impacto de P. dignus sobre poblaciones de T. absoluta, en condiciones de campo.

La Tripanosomiasis americana es el problema sanitario más relevante de la Argentina, afectando cerca de 1,6 millones de personas. La Organización Mundial de la Salud considera a la enfermedad de Chagas como uno de los mayores flagelos de América Latina: unas 18 millones de personas sufren sus consecuencias y 120 millones están en riesgo de infección. Si bien esta enfermedad se distribuye principalmente en América Latina, en las últimas décadas se ha observado con mayor frecuencia en los Estados Unidos, Canadá, muchos países europeos y algunos del Pacífico Occidental. Hasta hoy, el control de esta enfermedad, se basa exclusivamente en insecticidas que acarrean múltiples problemas en cuanto a su incorrecta aplicación y baja selectividad, debido a que eliminan tanto enemigos naturales de los triatominos como otras especies benéficas para el hombre, produciendo un gran deterioro en el medio ambiente, provocando todo esto que los insectos sean cada vez más resistentes a los insecticidas aplicados. La introducción o el incremento de enemigos naturales en poblaciones naturales de las principales especies transmisoras de Chagas, puede lograr con el tiempo la reducción del número de vectores a niveles que aseguren la interrupción de la transmisión del parásito en la población susceptible. Cabe destacar que los aspectos negativos en las campañas de rociado y la perspectiva que esas dificultades se agraven, ha motivado a que la búsqueda de nuevos métodos de control de triatominos de domicilio y peridomicilio haya sido identificada como un área prioritaria de investigación por la Organización Mundial de la Salud. El Triatoma virus (TrV) es el único virus entomopatógeno identificado en triatominos hasta el momento. Existen observaciones que sustentarían el uso de TrV como control biológico. Muscio en 1997, registró porcentajes superiores a 90% de mortalidad en el laboratorio en estados ninfales de T. infestans infectados con TrV. Además, Rozas-Dennis y Cazzaniga en el 2000, observaron que la infección con TrV reduce la longevidad y la fecundidad de las hembras adultas, y que las ninfas infectadas muestran parálisis en las patas y dificultad para desprenderse de la exuvia. De acuerdo al Comité Internacional de Taxonomía Viral (ICTV), TrV pertenece a la familia Dicistroviridae cuya especie tipo es el virus de la parálisis del grillo, con un único género: Cripavirus. Es un virus ARN de hebra simple y sentido positivo, con una longitud de 9.010 bases y una masa molecular teórica de 2.886,4 KDa. La composición de los viriones de TrV es 35% de ARN y 65% de proteínas. El genoma posee dos marcos abiertos de lectura denominados ORF1 y ORF2 que codifican las proteínas no estructurales y de la cápside respectivamente; separados por una región intergénica (IGR). De acuerdo a los estudios realizados hasta el momento, TrV puede transmitirse principalmente por vía horizontal, mediante la ruta fecal-oral, como así también por una vía vertical (transovárica). Su distribución en la naturaleza se restringe solamente a T. infestans y T. sordida. Hasta el momento no se conocen estudios inherentes a la búsqueda de TrV en Latinoamérica: al presente solo se ha encontrado en Argentina. El objetivo central de este trabajo fue, por un lado estudiar la diversidad de TrV en triatominos de nuestro país; y obtener un sistema para la replicación de TrV in vitro. Así, se analizaron triatominos de 10 provincias argentinas desde el 2008 hasta el 2011, resultando un total de 1632 ejemplares pertenecientes a 10 especies de domicilio, peridomicilio y ambiente silvestre: T. infestans, T. guasayana, T. delpontei, T. breyeri, T. eraturysiforme, T. sordida, T. platensis, T. garciabesi, Panstrongylus guentheri y Psammolestes coreodes. Las especies anteriormente mencionadas fueron capturadas en viajes de campaña, obtenidas del material conservado en la colección de nuestro laboratorio o enviadas de otros centros de referencia. A todos los insectos se les extrajo la materia fecal para luego extraerle ARN y finalmente analizarlas mediante RT-PCR. Los resultados positivos resultantes de la RT-PCR fueron 29. Estos productos resultantes se purificaron, cuantificaron y se enviaron a secuenciar. El análisis de las muestras secuenciadas no mostraron variabilidad genómica significativa. Esto se vio reflejado tanto a nivel específico, como de hábitat y distribución geográfica de los triatominos. Contar con líneas o cultivos celulares sensibles a la infección con TrV podría traer grandes ventajas. Permitir aislar, caracterizar y estudiar en profundidad la biología del virus nos permitiría obtener masa viral, siendo una herramienta fundamental para su posible uso como agente de control biológico. Si bien, no se conocen líneas celulares susceptibles a TrV, se intentó su replicación en líneas de dípteros y lepidópteros. Se desconoce además, si el virus producirá efecto citopático visible en las células. Con respecto a este otro gran objetivo general, se intentó la replicación de TrV en cultivos celulares. Por un lado, en líneas celulares de insecto, por medio de distintos métodos: transfección, electroporación, inoculación con tripsina y con virus purificado. Por otro lado se intentó obtener cultivo primario de vinchucas sanas. Para esto se utilizaron triatominos de la colonia de nuestro laboratorio. Los sustratos para la realización del cultivo primario fueron embriones y adultos (con y sin tripsina y explantos); además se inocularon huevos embrionados. Para todos los métodos y ensayos descriptos anteriormente, se utilizaron técnicas de SDS-PAGE, Western Blot (WB), Inmunofluorescencia indirecta (IFI) o bien RT-PCR para confirmar la presencia del TrV en las células. Para evaluar el líquido alantoideo se utilizó la técnica de Hemaglutinación (HA). No fue posible la replicación in vitro de TrV en líneas celulares de dípteros (C6/36) y lepidópteros (SF9, SF21, HighFive). Tampoco fue posible obtener un clon celular partiendo de tejidos adultos o embrionarios de vinchucas sanas. En cuanto a la presencia de virus en líquido alantoideo por HA, en ningún caso se obtuvo resultado positivo, ni tampoco utilizando sobrenadantes supuestamente infectados. Sin embargo el virus TrV purificado utilizado como control, aglutinó los glóbulos rojos de pollo. En las pruebas complementarias de Microscopia electrónica, SDS-PAGE, WB, IFI, RT-PCR tampoco obtuvimos resultados satisfactorios. Este trabajo de tesis, representa uno de los estudios más amplios realizado hasta el presente en TrV de triatominos en Argentina. El registro de este virus es de alta importancia, debido a que de las tres vías posibles de contagio de la enfermedad de Chagas, la vectorial es la predominante en el área endémica, siendo imprescindible profundizar aún más en el conocimiento de los insectos huéspedes para optimizar su control. Los resultados de esta labor, amplían considerablemente la información existente sobre este virus en Argentina, siendo de suma importancia además para el resto de los países afectados por la enfermedad. Si bien no fue posible la replicación del virus in vitro, nada se conocía al respecto sobre TrV. Es por ello que se intentará su replicación en líneas celulares de hemípteros, donde se han citado resultados exitosos en virus muy cercanos filogenéticamente. Se esbozan datos novedosos sobre la distribución geográfica y de ambiente; hospedero y variabilidad genómica de las especies analizadas. Si bien no ha sido uno de los objetivos de este trabajo de tesis, el desarrollo de la misma, permitió ampliar el estudio del virus para poder llegar a utilizarlo en un futuro inmediato, como ya se ha mencionado, como agente de control biológico.