Resumo não disponível

Objetivo: Comparar a eficácia do transplante de membrana amniótica (MA) criopreservada e liofilizada quanto à velocidade de reepitelização em defeitos epiteliais corneanos em coelhos. Desenho do estudo: Estudo experimental intervencional. Métodos: Foram utilizados vinte e seis olhos de vinte e seis coelhos divididos em dois grupos cujas córneas foram submetidas a uma desepitelização de 7 mm de diâmetro e, posteriormente, recobertas com MAs fixadas com cola de fibrina. O Grupo 1 recebeu MAs criopreservada, enquanto o Grupo 2 recebeu MAs liofilizadas. Foram avaliados os seguintes critérios: velocidade de reepitelização corneana por fotografias seriadas das córneas no primeiro, quarto e sétimos dia pós-operatório, estudo anatomopatológico e imunohistoquímico das córneas e análise por microscopia eletrônica de varredura de uma amostra de cada MA. Resultados: Em cada grupo, o percentual de reepitelização corneana foi significativamente maior entre o primeiro e sétimo dia pós-operatório (p<0,001). Entre os grupos, não houve diferença estatisticamente significativa (p=0,867). Em relação à análise anatomopatológica, não houve diferença significativa entre autólise e vacuolização epitelial entre os grupos (p=0,064 e p=0,204, respectivamente). Em relação à integridade da membrana basal, quando vista ao PAS, todas as amostras receberam classificação 2 (membrana basal íntegra). A imunohistoquímica mostrou marcação positiva para citoqueratina e vimentina em todos os olhos de ambos os grupos. A microscopia eletrônica revelou que a MA criopreservada possui uma espessura maior do que a liofilizada. Conclusão: A MA liofilizada mostrou-se tão eficaz quanto a criopreservada no tratamento de defeitos epiteliais corneanos em coelhos. Não houve diferença nas características anatomopatológicas e imunohistoquímicas entre os dois tipos de MA. A MA liofilizada deve ser considerada no arsenal terapêutico dos oftalmologistas, com a vantagem de ser mais facilmente armazenada, ter um prazo de validade maior, além da segurança biológica de se ter um material esterilizado.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-01-03T17:06:47Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 520179 bytes, checksum: 82f7ab11782c0fc92b88e2d7d0df243b (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-03T17:06:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 520179 bytes, checksum: 82f7ab11782c0fc92b88e2d7d0df243b (MD5) Previous issue date: 2016-07-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente estudo teve como objetivo a avaliação comparativa dos crioprotetores glicerol, etilenoglicol e dimetilformamida, além da adição de antocianina ao meio base de congelamento, como tentativa de minimizar os danos celulares oriundos do processo de criopreservação. Foram utilizados seis garanhões da raça Mangalarga Marchador, maturos sexualmente, hígidos e aprovados para reprodução por meio de exame andrológico. As coletas de sêmen foram realizadas com intervalos de dois dias pelo método da vagina artificial com auxílio de uma fêmea em estro natural ou induzido ou manequim, totalizando cinco ejaculados por garanhão. A primeira etapa do estudo teve por finalidade determinar a melhor concentração destes crioprotetores e aditivo para que fosse usada na etapa seguinte. Para este fim foram realizadas análises de motilidade espermática progressiva total e vigor espermático. Verificou-se que as concentrações de 4, 5 e 6 % de etilenoglicol e dimetilformamida utilizadas isoladamente nos diluentes de criopreservação não tiveram diferença (P>0,05) sobre os parâmetros de motilidade espermática progressiva total e vigor espermático. Os mesmos crioprotetores utilizados em associação podem ser feitos nas proporções 1:4 e 2:3 % (etilenoglicol : dimetilformamida) sem proporcionar diferenças nos parâmetros físicos do sêmen espermatozoides. Na segunda etapa, as amostras de sêmen criopreservadasforam submetidas às análises físicas convencionais (motilidade espermática progressiva total e vigor espermático), teste de termo- resistência e a análise do grau de integridade das células espermáticas utilizando sondas fluorescentes e analisados por meio da citometria de fluxo. Os tratamentos experimentais foram assim constituídos: Controle Botucrio (B); Etilenoglicol 4% (E); Dimetilformamida 5% (D); Etilenoglicol + Dimetilformamida (ED) ou associados com antocianina (BA, EA, DA e EDA) na verificou-se os piores valores médios em todos os testes, enquanto nos tratamentos D e DA se mostraram menos agressivos às membranas plasmática e acrossomal. Os valores médios de motilidade espermática progressiva total e vigor espermático foram semelhantes em todos os tratamentos, exceto nos tratamentos E e EA, que foram inferiores. No entanto, os tratamentos empregando o diluente a base de dimetilformamida caíram aproximadamente 50 % nos valores de motilidade espermática nos primeiros 30 minutos do teste de termorresistência quando comparados ao tratamento controle (B) ou acrescido de antioxidante (BA). Resultado condizente com os valores percentuais de células com o potencial de membrana mitocondrial íntegro quantificados por meio de citometria de fluxo. A antocianina parece ter efeito neutralizador de radicais livres produzidos por células inviáveis, podendo ser utilizada como antioxidante não penetrante na criopreservação do sêmen de equinos da raça Mangalarga Marchador. / The present study aimed at comparative assessment of glycerol, ethyleneglycol and dimethylformamide as cryoprotectants, and the addition of an anthocyanin in the extander base of freezing, as an attempt to minimize cell damage arising from the cryopreservation process. Six stallions MangalargaMarchador breed, sexually mature, healthy and approved for breeding by breeding soundness evaluationwere used. Semen was collected in intervals of two days by artificial vagina method with the aid of a female in natural or induced estrus or manikin, totalizing five ejaculates per stallion.Thefirst stage of the study aimed to determine the best concentration of these cryoprotectants and additive to be used onthe following stage. For this purpose were conducted analysis of spermaticprogressive motilityand spermatic vigor. As results the concentrations of 4, 5 and 6% ethyleneglycol and dimethylformamide used alone had no differences ( P>0.05 ) on the spermatic progressive motilityand spermatic vigor. The same cryoprotectants can be used in association in the proportions 1:4and 2:3% (ethyleneglycol: dimethylformamide) without differences in the physical parameters of criopreservaited semen. The anthocyanin may be used in concentrations of 0.5 and 3 μL / 100 million of espermatozoa, but not on the concentration of 9 μL / 100 million of espermatozoa. At the second stage, the semen criopreservated samples were subjected to conventional physical analysis (total spermatic motility and spermatic vigor), thermal resistance test, and analysis of the level of integrity of sperm cells using fluorescent probes by flow cytometery. The treatments were constituted as follows: Control Botucrio (B); 4 % Ethyleneglycol (E); Dimethylformamide 5 % (D); Ethyleneglycol + Dimethylformamide (ED) orassociated with anthocyanin (BA, EA, DA, and EDA) at 0.5 μL / 100 million spermatozoaconcentration. For E and EA treatments, there were verified the worst average valuesfor all tests, meanwhile D and DA treatments showed to be less aggressive to the plasma and acrosome membranes. The mean values of spermatic progressive motility and spermatic vigorwere similar for all treatments, except for the treatments E and EA, witch presented inferior results. Even though, diluents Dimethylformamide-based treatments droppedalmost 50 % in the spermatic motility values at the first 30 minutes of the thermal resistance test compared to control treatment (B) or with anthocyaninadded (BA). This result was consistent with the percentual values of cells with intact mitochondrial membrane potential quantified by flow cytometery. Anthocyanin seems to have a scavenger effect over free radicals produced by unviable cells and can be used as non-penetrating antioxidant for cryopreservation in equine semen of MangalargaMarchadorbreed stallions.

Orientador: Gilson Hélio Toniollo / Coorientador: Maricy Apparício Ferreira / Banca: Fabricio Singaretti de Oliveira / Banca: Erika da Silva Carvalho Morani / Banca: Geórgia Modé Magalhães / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Resumo: Esta pesquisa teve por justificativa ampliar os estudos acerca da criopreservação de tecido gonadal e células espermáticas de gatos domésticos, podendo servir de modelo experimental para felinos selvagens. Objetivou-se comparar os efeitos da criopreservação sobre diferentes tamanhos de fragmentos testiculares, empregando dois crioprotetores. Utilizaram-se os testículos de 31 gatos domésticos, submetidos à orquiectomia eletiva. Os testículos foram pesados e apenas os que apresentarem pesos entre 1 e 2 g foram empregados. O tecido testicular foi dissecado e cortado em fragmentos de tamanhos pré-determinados (0,3cm3 e 0,5cm3). Uma amostra foi direcionada para as avaliações a fresco: integridade de membrana e do DNA; histopatologia; incidência de apoptoses por imuno-histoquímica; e índice de peroxidação lipídica - TBARS. A criopreservação foi feita em meio Tris-gema Equex STM suplementado com 3% de crioprotetores (glicerol e propanediol) através da técnica congelação rápida. Após a descongelação, foram realizados os mesmos testes iniciais. Os primeiros resultados obtidos com os 12 gatos iniciais apontaram na avaliação histomorfológica e pelo teste de lipoperoxidação lipídica que o glicerol foi mais eficiente que o propanediol na criopreservação de fragmentos testiculares de gatos domésticos de 0,5cm3 (Capítulo 2). No experimento seguinte, avaliaram-se os fragmentos testiculares de outros 31 gatos domésticos, seccionados nos mesmos tamanhos e criopreservados nas mesmas condições d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This research had the justification to broaden the studies about the cryopreservation of gonadal tissue and sperm cells of domestic cats, and could serve as an experimental model for wild cats. The objective of this study was to compare the effects of cryopreservation on different sizes of testicular fragments using two cryoprotectants. The testicles of 31 domestic cats submitted to elective orchiectomy were used. The testes were weighed and only those weighing between 1 and 2 g were used. The testicular tissue was dissected and cut into fragments of predetermined sizes (0.3cm3 and 0.5cm3). A sample was directed to fresh evaluations: membrane integrity and DNA; histopathology; incidence of apoptosis by immunohistochemistry; and lipid peroxidation index - TBARS. Cryopreservation was done on Tris-egg yolk Equex STM medium supplemented with 3% cryoprotectants (glycerol and propanediol) by the rapid freezing technique. After thawing, the same initial tests were performed. The first results obtained with the 12 initial cats showed that glycerol was more efficient than propanediol in the cryopreservation of testicular fragments of domestic cats of 0.5 cm3 (Chapter 2). In the following experiment, the testicular fragments from 31 other domestic cats, sectioned in the same sizes and cryopreserved under the same conditions as in the previous experiment, were evaluated using 3% glycerol or 3% propanediol in the Tris- egg yolk Equex STM medium, using rapid freezing technique, followed b... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by MARCOS LEANDRO TEIXEIRA DE OLIVEIRA (marcosteixeira@ufv.br) on 2018-11-12T11:31:36Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1597909 bytes, checksum: 6fb796bc17a56a608f0d6023bb14284b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-12T11:31:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1597909 bytes, checksum: 6fb796bc17a56a608f0d6023bb14284b (MD5) Previous issue date: 2018-03-21 / Foram realizados dois diferentes experimentos com o sêmen de suínos da raça Piau: o primeiro referiu-se à criopreservação seminal e o segundo, ao efeito da sazonalidade no perfil proteômico do plasma seminal e nas características físicas e morfológicas do sêmen. No primeiro experimento, foram utilizadas vinte coletas de cinco machos. O extensor de congelamento foi baseado em extensor de gema de lactose e ovo, adicionado a 2 % de glicerol, 3 % de dimetilacetamida. A adição de conjugados de colesterol carregados com ciclodextrina foi realizada após centrifugação, quando o sêmen foi diluído com o extensor de resfriamento. Quatro grupos foram submetidos ao seguinte tratamento: sem adição (grupo 1); 1,5 mg de colesterol carregado com ciclodextrina / 120x10 6 espermatozoides (grupo 2); 1,5 mg de colestanol carregado com ciclodextrina / 120x10 6 espermatozoides (grupo 3); 1,5 mg de esperma desmosterol carregado com ciclodextrina / 120x10 6 espermatozoides (grupo 4). Para analisar a qualidade pós-descongelamento, foram verificadas a motilidade e a morfologia espermática. Além disso, para verificar a viabilidade dos espermatozoides, foram utilizados o teste hiposmótico, a coloração supravital e o teste fluorescente. Os valores médios registrados para a motilidade espermática total imediatamente após a descongelação foram de 54,5 ± 5,8, 55,5 ± 5,3, 53,7 ± 6,7 e 52,5 ± 6,6 %, respectivamente, para os grupos de um a quatro, sem diferença entre eles (p> 0,05). Em relação ao teste fluorescente, os resultados foram 28,3 ± 13,2, 26,9 ± 12,2, 22,2 ± 11,4 e 32,0 ± 15,3 %, respectivamente, para os grupos de um a quatro, também sem diferença entre os grupos (p> 0,05). Da mesma forma, testes complementares para avaliação da integridade e funcionalidade da membrana plasmática não mostraram diferença entre os tratamentos (p> 0,05). Em conclusão, o uso de conjugados de colesterol carregados com ciclodextrina adicionados à membrana plasmática do esperma não demonstrou qualquer efeito aditivo no aumento e / ou manutenção da motilidade do espermatozoide. No experimento 2, foram utilizados dez varrões da raça Piau, aprovados previamente como férteis por exame andrológico e as coletas de sêmen foram realizadas mensalmente para análise, durante o período de um ano, avaliando motilidade, vigor, morfologia, concentração/ mL e concentração total. O perfil protéico do plasma seminal foi obtido por eletroforese bidimensional, as análises de imagem dos géis foram realizadas pelo programa ImageMaster 2D Platinum 6,0 (GE Healtcare®) e a identificação das proteínas foi por espectrometria de massas usando MALDI-TOF/TOF, com o software Mascot Daemon para a busca em banco de dados. A validação das proteínas identificadas entre os tratamentos foi realizada pelo programa SCAFOLD (95 %). No presente estudo, observou-se que as estações climáticas do ano influenciaram a qualidade do sêmen, e que no inverno houve maior alteração na morfologia espermática em relação ao verão, com mais defeitos espermáticos maiores e totais (p<0,05), porém esses valores ainda se mostram dentro dos padrões de qualidade seminal preconizados para a espécie. Em relação à motilidade espermática progressiva, vigor e concentração espermática, não sofreram influência das estações climáticas do ano (p>0,05). Importantes proteínas do plasma seminal de varrões da raça Piau foram identificadas e validadas, destacando-se as espermadesinas. Foram reportadas correlações significativas entre as características seminais e alguns spots. Ao longo das estações do ano, dez spots foram observados como diferencialmente abundantes. / Two different experiments were carried out on the semen of Piau pigs: the first one referred to seminal cryopreservation and the second one, to the effect of seasonality on the proteomic profile of seminal plasma and on the physical and morphological characteristics of semen. In the first experiment, twenty samples of five males were used. The freezer extender was based on lactose and egg yolk extender, added to 2 % glycerol, 3 % dimethylacetamide. The addition of cyclodextrin loaded cholesterol conjugates was performed after centrifugation, when the semen was diluted with the cooling extender. Four groups were submitted to the following treatment: no addition (group 1); 1.5 mg of cyclodextrin-loaded cholesterol / 120x10 6 spermatozoa (group 2); 1.5 mg of cyclodextrin-loaded cholestanol / 120x10 6 spermatozoa (group 3); 1.5 mg of cyclodextrin-loaded desmosterol sperm / 120x10 6 spermatozoa (group 4). In order to analyze the post-thawing quality, the sperm motility and morphology were verified. In addition, to verify the viability of the spermatozoa, hyposmotic test, supravital staining and fluorescent test were used. The mean values recorded for the sperm motility immediately after thawing were 54.5 ± 5.8, 55.5 ± 5.3, 53.7 ± 6.7 and 52.5 ± 6.6 % , respectively, for groups one to four, with no difference between them (p> 0.05). Regarding the fluorescent test, the results were 28.3 ± 13.2, 26.9 ± 12.2, 22.2 ± 11.4 and 32.0 ± 15.3 %, respectively, for the groups one to four, also with no difference among groups (p>0.05). Likewise, complementary tests to assess the integrity and functionality of the plasma membrane showed no difference among treatments (p> 0.05). In conclusion, the use of cyclodextrin-loaded cholesterol conjugates added to the plasma sperm membrane did not demonstrate any additive effect on the increase and / or maintenance of sperm motility. In the experiment 2, ten boars of the Piau breed, previously approved as fertile by andrological examination, were used and the semen collections were carried out monthly for analysis during one year, evaluating motility, vigor, morphology, concentration / mL and total concentration. The protein profile of the seminal plasma was obtained by bidimensional electrophoresis, the image analyzes of the gels were performed by ImageMaster 2D Platinum 6.0 program (GE Healtcare®) and the identification of the proteins was obtained by mass spectrometry using MALDI-TOF/TOF, with Mascot Daemon software for database search. The validation of the proteins identified among the treatments was performed by the SCAFOLD program (95 %). In the present study, it was observed that the seasons of the year influenced semen quality, and that in winter there was a greater change in sperm morphology than in summer, with more major and total sperm defects (p <0.05), however these values are still within the seminal quality standards recommended for the species. Regarding progressive sperm motility, vigor and sperm concentration, they were not influenced by climatic seasons of the year (p>0.05). Important proteins of the seminal plasma of Piau boars were identified and validated, especially the spermadines. Significant correlations were reported between seminal characteristics and some spots. Throughout the seasons, ten spots were observed as differentially abundant.

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Marina Ragagnin de lima / Banca: Luisa Cunha Carneiro / Resumo: A necessidade de uma metodologia mais prática para transferência de embriões em tempo fixo em rebanhos de gado de corte, para que se torne mais proveitoso, tem aumentado ao longo dos anos. O presente estudo avaliou a taxa de concepção e gestação de embriões produzidos in vitro transferidos a fresco, vitrificados ou congelados em um rebanho nelore de corte. Doadoras Nelore (n= 20) de um mesmo rebanho foram previamente selecionadas para serem submetidas a ovum pick up em dia aleatório do ciclo estral. Oócitos foram recuperados e selecionados para maturação in vitro por 24 horas a 38,5°C com 5% CO2 e 95% de humidade do ar. Para fertilização in vitro, sêmen da mesma partida, de um touro pré-selecionado da raça Nelore foi utilizado. Após 6 dias de cultivo in vitro, os embriões na fase de blastocisto foram aleatoriamente selecionados para serem transferidos a fresco, vitrificados ou congelados. As transferências foram realizadas em novilhas e vacas do mesmo rebanho das doadoras. As taxas de concepção, aos 30 dias, para os embriões transferidos a fresco, vitrificados ou congelados e transferidos depois do reaquecimento foram, respectivamente, de 37,64 ± 11,20%, 24,09 ± 2,34% e 16,21 ± 10,23%. As taxas de concepção, aos 30 dias, considerando a categoria da receptora, novilha ou vaca foi de 23,02 ± 3,42% e 31,06 ± 4,62%, respectivamente. O estudo mostrou que o método de congelação lenta, para transferência direta utilizado, não consegue resultados similares aos transferidos à... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The necessity of a more practical fixed time embryo transfer method in beef cattle herds, in order to make it more usable, has grown over the years. The present study compared the conception and pregnancy rates of in vitro produced embryos transferred fresh, vitrified or slow frozen in an nelore beef herd. Nelore donors (n=20) were previously selected to be submitted to ovum pickup on a random day of estrous cycle. Oocytes were recovered and selected for in vitro maturation for 24 hours at 38,5°C with 5% CO2 and 95% air humidity. For in vitro fertilization, semen, from the same batch, of one pre-selected Nelore bull was used. After 6 days of in vitro cultivation, embryos on blastocysts stage were randomly selected to be transferred either fresh, vitrified or frozen. The transfer procedures were conducted on heifers and cows of the same herd of the donors. Conception rates, at 30 days, for fresh transferred, vitrified and frozen transferred embryos were, respectively, 37,64 ± 11,20%, 24,09 ± 2,34% and 16,21 ± 10,23%. Conception rates, at 30 days, considering animal category of the recipients, heifer or cow were 23,02 ± 3,42% e 31,06 ± 4,62%, respectively. This study showed that the slow freezing, for direct transfer method used, can't achieve similar results (p= 0,0078) as the fresh transferred on Nelore herds, and vitrification still has to be the cryopreservation method for embryos on Nelore herds. It was used a significance of p<0,05. / Mestre

Orientador: Roberto Sartori Filho / Banca: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: Margot Alves Nunes Dode / Resumo: Objetivou-se com o presente estudo avaliar a criotorerância de mórulas e blastocistos produzidos in vivo de doadoras da raça Sindi e Nelore (Bos indicus) e Holandês Preto e Branco (HPB - Bos taurus). No Experimento 1, 24 fêmeas lactantes e não lactantes da raça Sindi foram superovuladas com 100 mg de FSH suíno com protocolos em que as duas últimas aplicações de FSH foram substituídas ou não por 300 UI de eCG. Sete dias após a indução da ovulação, os embriões foram colhidos e avaliados quanto ao estágio de desenvolvimento embrionário e grau de qualidade. Dois terços dos embriões foram destinados à criopreservação, dos quais metade foi congelada pelo método convencional, com curva de resfriamento de -0,5ºC/min e a outra metade foi vitrificada pela técnica de Cryotop. Em seguida, foram descongelados e transferidos para receptoras sincronizadas, de maneira contemporânea aos embriões frescos. No Experimento 2, 31 fêmeas da raça Nelore foram superovuladas com 133 mg de FSH suíno e os dois terços dos embriões colhidos foram criopreservados e transferidos semelhantemente ao Experimento 1. No Experimento 3, 67 vacas lactantes e novilhas da raça HPB foram superovuladas com 500 e 300 UI de FSH suíno, respectivamente, e após a colheita dos embriões foram adotados os mesmos procedimentos realizados nos Experimentos 1 e 2. Os resultados foram analisados por modelos lineares generalizados e estão apresentados na forma de média dos quadrados mínimos ± erro padrão. Nos Experimentos 1 e 2, os embriões transferidos a fresco apresentaram maior taxa de concepção aos 30 dias do que os vitrificados e congelados (54,8±7,4a, 17,7±7,3b e 19,5±6,6%b; respectivamente; P 0,0013) na raça Sindi (n=231 embriões) e (46,0±6,1a; 31,2±5,4b e 28,1±5,3%b; respectivamente, P 0,04) na raça Nelore (n=297 embriões). O estágio de desenvolvimento embrionário parece não... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the cryotolerance of morulae and blastocysts produced in vivo in Sindhi and Nelore (Bos indicus) and Holstein (Bos taurus) donnors. In Experiment 1, 24 lactating and non-lactating Sindhi donnors were superovulated with 100 mg porcine FSH with protocols in which the last two FSH treatments were replaced or not by 300 IU eCG. Embryos were collected 7 days after ovulation induction and embryo development and quality degree were accessed. Two thirds of the embryos were cryopreserved, by the conventional freezing or Cryotop method. After that, embryos were thawed and transferred to synchronized recipients, simultaneously to fresh embryos. In Experiment 2, 31 Nelore cows were superovulated with 133 mg porcine FSH and two thirds of the embryos were cryopreserved and transferred similarly to Experiment 1. In Experiment 3, 67 Holstein lactating dairy cows and heifers were superovulated with 500 and 300 IU pFSH, respectively, and the same procedures were performed as in Experiments 1 and 2. Results were analyzed using generalized linear models and are presented as least squares means ± standard error. In Experiments 1 and 2, fresh embryos had a higher conception rate at Day 30 than those vitrified and frozen (54.8±7.4a, 17.7±7.3b and 19.5±6.6%b; respectively; P 0.0013) in Sindhi donnors (n=231 embryos) and (46.0±6.1a; 31.2±5.4b and 28.1±5.3%b; respectively; P 0.04) in Nelore donors (n = 297 embryos). Embryo developmental stage seems to have not influenced conception rates of Zebu embryos, especially cryopreserved ones. Finnaly, in Experiment 3, conception rates of fresh and cryopreserved embryos were similar (37.4±12.3, 24.5±11.3 and 21.0±9.5%; respectively, P>0.15) and also no difference was detected for the cryotolerance of morulae versus blastocysts (P>0.10) / Mestre

A criopreservação do sêmen é de muita importância para a produção de equinos pois permite o amplo comércio internacional de sêmen e a redução dos custos com transporte de animais. Entretanto, o sêmen criopreservado apresenta reduzida longevidade e integridade funcional, um obstáculo para a expansão dessa técnica. Recentes descobertas sugerem que os maiores danos durante a criopreservação de sêmen de garanhões ocorrem devido ao desequilíbrio osmótico e às espécies reativas de oxigênio. Um método para combater os efeitos deletérios da congelação é utilizar substâncias que possam amenizar os danos subletais. O objetivo desse experimento foi avaliar o efeito da adição de duas substâncias com efeito protetor celular (mio-inositol e ácido ferúlico) ao meio de congelação, na qualidade do sêmen criopreservado de garanhões. Para isso foram realizadas 5 colheitas de sêmen de 5 garanhões. O sêmen foi processado para criopreservação e antes do envase foi dividido em 3 tratamentos: controle, mio-inositol (30mM) e ácido ferúlico (160 &#181;M). As palhetas foram descongeladas e analisadas quanto a motilidade computadorizada (CASA), integridade de membrana, estado metabólico e produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) em microscopia de epifluorescência nos tempos 0, 2 e 4h de incubação a 37°C. Previamente foram realizadas validações da técnica de mensuração simultânea da membrana plasmática e estado metabólico (sondas PI, H33342 e resazurina) e correlação entre duas técnicas de mensuração de EROs (DCFH-DA e DCFH-DA com H33342). Os dados obtidos foram avaliados no programa SAS, versão 9,3 (SAS, 2011) utilizando ANOVA e medidas repetidas no tempo, para as validações foram realizadas regressões lineares simples. A adição de mio-inositol no diluidor de congelação resultou em maior motilidade total no tempo 2h e 4h e maior motilidade progressiva nos tempos 0 e 2h de incubação pós-descongelação em relação aos outros grupos. O tratamento com mio-inositol resultou em maior quantidade de células com membrana plasmática íntegra nos tempo 0h (53,3±1,4%); 2h (50,0±1,0%) e 4h (37,9±1,5%) de incubação que o grupo controle: 0h (48,0±1,0%); 2h (44,9±1,1%); e 4h (31,5±1,7%). O ácido ferúlico prejudicou as características de motilidade (CASA) e a integridade da membrana plasmática, entretanto melhorou o estado metabólico em todos os tempos. Conclui-se que o mio-inositol melhora as características de motilidade e a integridade de membranas espermáticas do sêmen criopreservado de equinos e que o ácido ferúlico apesar de prejudicar essas características promove melhor metabolismo espermático, mensurado pela técnica de redução da resazurina. / Sperm cryopreservation is of great importance for equine production, it assists in the international semen trade and reduce costs with animal transportation. However, frozen/thawed semen has reduced longevity and functional integrity and these is an obstacle to the expansion of this technique. The improvement in quality of cryopreserved semen is very important, especially to help become available more widely new technologies, such as sperm sexing. Recent findings suggest that the greatest damage during cryopreservation of stallion semen occur due to osmotic imbalance and the reactive oxygen species (ROS). One method to mitigate the deleterious effects of freezing is using substances that might lessen the sublethal damage. The objective of this experiment was to evaluate the quality of frozen/thawed stallion sperm after using two substances that have protective effects in the freezing medium: myo-inositol and ferulic acid. Were performed five sperm collection of 5 stallions. The semen was processed and before cryopreservation it was divided into three treatments: control, myo-inositol (30 mM) and ferulic acid (160 mM). The straws were thawed and analyzed at 0, 2 and 4 h of incubation time at 37°C. It was performed computerized motility (CASA), membrane integrity, metabolic status and ROS production using an epifluorescence microscope. Before beginning of the experiment were carried out validations of the technique of simultaneous assessment of plasma membrane and metabolic state (PI probes, H33342 and resazurin) and correlation between two measurement techniques ROS (DCFH-DA and DCFH-DA with H33342). The data were analyzed using the SAS version 9.3 (SAS, 2011) with ANOVA and repeated measures. For the probes validation were used linear regressions. The addition of myo-inositol in the freezing extender resulted in higher total motility in time 2h and 4h and increased progressive cells at 0 and 2 h of incubation post-thaw compared to the other groups. Treatment with myo-inositol resulted in a higher number of cells with intact plasma membrane in time 0h (53.3 ± 1.4%); 2h (50.0 ± 1.0%) and 4h (37.9 ± 1.5%) of incubation than the control group: 0h (48.0 ± 1.0%), 2h (44.9 ± 1.1%), and 4h (31.5 ± 1.7%). The use of ferulic acid resulted in the worst characteristics of motility (CASA) and plasma membrane integrity, however improved metabolic status at all incubation times. It is concluded that myo-inositol improves sperm motility characteristics and preserves membrane integrity of equine cryopreserved semen. Ferulic acid although impairing these characteristics, promotes better sperm metabolism, measured by resazurin test.

A preocupação com a qualidade do sêmen ovino congelado tem sido motivo de muitas pesquisas, principalmente pela dificuldade da transposição cervical durante a inseminação artificial. Contudo, a inseminação intra-cervical é frequentemente usada em ovinos e resulta em redução da fertilidade com o uso do sêmen congelado. Neste sentido, esse estudo foi dividido em dois experimentos. No 1o experimento foi verificado o potencial da ciclodextrina pré-carregada com colesterol como aditivo ao diluidor na proteção da cinética espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial, capacitação espermática e produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS) em espermatozoides criopreservados ovinos. Cinco ejaculados de seis carneiros (n = 30) foram divididos em três tratamentos: apenas diluidor (CON); diluidor + colesterol incorporado a ciclodextrina (CLC + CHO); e diluidor + ciclodextrina pura (CLCP). Após a diluição (50x106 espermatozóides/mL), o sêmen foi envasado em palhetas, identificado e criopreservado utilizando um sistema automatizado. Duas palhetas da mesma partida de cada tratamento foram descongeladas (a 37°C durante 30 segundos) e analisadas quanto motilidade (CASA), morfologia dos espermatozoides (DIC), integridade do plasma (PI-H342) e acrossomal (FITC-PSA) membranas, potencial mitocondrial (JC-1), produção de radicais livres (CellRox), peroxidação lipídica (BODIPY) e fluidez da membrana celular (merocianina 540). As comparações entre os grupos foram analisadas pelo PROC MIXED do SAS e o efeito de grupo foi detectado pelo teste de Tukey (p&lt;0,05) ou pela estatística não paramétrica de ordem (Kruskal-Wallis), quando era necessário. No 2º experimento os mesmos ejaculados foram divididos por congelabilidade baseados na motilidade total pós-descongelação (MTPD) e na porcentagem de redução na motilidade total (%RMT) quando comparados o sêmen in natura e o sêmen pós-descongelação (somente diluidor), sendo divididos nos grupos alta (MTPD&gt;60% e %RMT&lt;40%), intermediária (60%&gt;MTPD&gt;40% e 60%&gt;RMT&gt;40%) e baixa (MTPD&lt;40% e %RMT&gt;60%) congelabilidade. Foram analisados os tratamentos CON e CLC+CHO dentro de cada animal e de cada grupo quanto a motilidade (CASA), a integridade das membranas plasmática (PI-H342) e acrossomal (FITC-PSA), potencial mitocondrial (JC-1), peroxidação lipídica (BODIPY) e fluidez da membrana celular (merocianina 540). As comparações foram realizadas por análise de variância (ANOVA) em arranjo fatorial 3X3 (Tratamento CLC+CHO, CON e in natura X grupos alta, intermediária e baixa congelabilidade), as comparações entre os grupos foram analisadas pelo PROC MIXED do SAS e o efeito de grupo foi detectado pelo teste de Tukey (p &lt;0,05) ou pela estatística não paramétrica de ordem (Kruskal-Wallis), quando era necessário. No 1o experimento o tratamento CLC+CHO se mostrou mais eficaz em preservar os parâmetros de motilidade, integridade de membranas e potencial mitocondrial quando comparado aos demais tratamentos. O grupo CLCP mostrou queda nos parâmetros de motilidade, integridade de membrana, potencial mitocondrial, mostrando, com isso, uma queda na preservação espermática. No 2o experimento observou-se que o tratamento CLC+CHO mostrou maior grau de preservação para motilidade total e progressiva, células rápidas, preservação de membranas plasmática e acrossomal e potencial mitocondrial quando comparado ao CON. Esse efeito teve maior significância nos grupos de baixa e intermediária congelabilidade, não sendo tão expressivo no grupo de alta. Pode-se concluir com esse estudo que o tratamento com ciclodextrina acrescida de colesterol contribui para uma melhor preservação dos parâmetros espermáticos do sêmen ovino, principalmente em animais apresentando baixa congelabilidade, contudo não apresenta diferença em ejaculados de alta congelabilidade. / Frozen ram semen has been the subject of many researches, mainly due to the difficulty of cervical transposition during artificial insemination. However, intra-cervical insemination in sheep is often used, resulting in reduced fertility with the use of frozen semen. To this end, this study was divided into two experiments. In the first experiment was verified the potential of cyclodextrin loaded with cholesterol as an additive to the extender in the protection of sperm kinetics, integrity of plasmatic and acrosomal membranes, mitochondrial function, sperm capacitation and production of reactive oxygen species (ROS) in cryopreserved sheep sperm. Five ejaculates from six rams (n = 30) were divided into three treatments: only extender (CON); extender + cyclodextrin loaded with cholesterol (CLC + CHO); and extender + pure cyclodextrin (CLCP). After dilution (50x106 spermatozoa/mL), semen was stored in straws, identified and cryopreserved using an automated system. Two straws from each ejaculate and treatment were thawed (at 37° C for 30 seconds) and analyzed for motility (CASA), morphology of spermatozoa (DIC), plasmatic (PI-H342) and acrosomal (FITC-PSA) membrane integrity, mitochondrial potential (JC-1), production of free radicals (CellRox), lipid peroxidation (BODIPY) and cell membrane permeability (Merocyanine 540). Comparisons between groups were analyzed using PROC MIXED of SAS and the effect of group was detected by Tukey (p &lt;0.05) or by the order of nonparametric statistics (Kruskal-Wallis) test, when necessary. In the 2nd experiment the same ejaculates were divided by freezability based on the total post-thaw motility (TPTM) and the percentage of reduction in total motility (%RTM) when compared fresh and post-thaw semen (only extender), and divided into the groups: high (TPTM &ge; 60% and %RTM &le; 40%), intermediate (60%&gt; TPTM &gt; 40% and 60%&gt; %RTM &gt; 40%) and low (TPTM &le; 40% and %RTM &ge; 60%) freezability. CON and CLC + CHO treatments were analyzed within each animal and each group for motility (CASA), plasmatic (PI-H342) and acrosomal (FITC-PSA) membrane integrity, mitochondrial potential (JC-1), lipid peroxidation (BODIPY) and cell membrane permeability (Merocyanine 540). Comparisons were performed by analysis of variance (ANOVA) with a factorial arrangement 3x3 (groups CLC+CHO, CON and fresh X groups high, medium and low freezability), comparisons between groups were analyzed using PROC MIXED of SAS and the group effect was detected by the Tukey test (p &lt; 0.05) or no statistical order parametric (Kruskal-Wallis), when necessary. In the first experimente, CLC + CHO treatment was more effective in preserving the parameters of motility, membrane integrity, and mitochondrial potential compared to other treatments. The CLCP group showed a fall in the parameters of motility, membrane integrity, mitochondrial potential, showing thereby a decrease in sperm preservation. In the 2nd experiment, it was observed that the treatment CLC + CHO showed greater preservation for total and progressive motility, rapid cell preservation, plasmatic and acrosomal membranes and mitochondrial potential when compared to CON. This effect was most significant in the groups of low and intermediate freezability, not being as significant in the group of high freezability. We can conclud from this study that treatment with cyclodextrin loaded with cholesterol contributes to better preservation of sperm parameters in ram semen, especially in animals displaying low freezability, however there where no diference in the high freezability group.

Foi conduzida uma série de experimentos onde se buscou definir: 1) o limite de tolerância do espermatozóide caprino a soluções hiperosmóticas de sacarose; 2) um diluente para criopreservação de sêmen que minimizasse as flutuações de volume celular. O limite de tolerância da membrana, avaliado pelo corante eosina-nigrosina, foi de 930 mOsm em soluções de sacarose em Ringer-lactato a 38oC. Os danos à integridade de membrana (IM), em osmolalidades acima deste valor, se estabeleceram no primeiro minuto de exposição e não se agravaram até 10 minutos depois. A motilidade (MOT) foi mais afetada que a IM. A rediluição abrupta em meio isosmótico causou dano extenso e proporcional ao grau de desidratação prévia. Nos experimentos seguintes, adição de 375 mM de sacarose ao diluidor TRIS-gema com 6,8% de glicerol (TGG), 5 minutos antes da congelação, resultou em MOT e IM similares ao controle TGG sem sacarose. Descongelação e rediluição a 4oC favoreceram a MOT e, a 38oC, favoreceram a IM. O diluente TRIS-gema com 375 mM de sacarose e concentração de glicerol reduzida para 1,7% apresentou melhor MOT e IM que o controle (65% e 187% vs 52% e 100%, respectivamente). A MOT após 2 h e o vigor após 6 h foram maiores quando a rediluição pós-descongelação foi em 5 passos se comparado a 3 passos (28% e 9% vs 19% e 2%, respectivamente). Na fase seguinte do trabalho, diluentes elaborados com 300 mM após 6 h a 38oC, melhor MOT e vigor que o controle (33% e 26% vs 15% e 10%, respectivamente). A descongelação a 20oC favoreceu a MOT e o vigor nos tempos zero, 2 h e 6 h pós-descongelação em todos os grupos contendo sacarose. O etilenoglicol não diferiu do glicerol na concentração de 3,4% quando adicionado a diluente contendo 300 mM de sacarose. Nestes diluentes, a rediluição em 5 passos a 20oC não diferiu em MOT e IM da feita em 1 passo a 38oC. No último experimento, sêmen congelado em diluente contendo 300 mM de trealose e zero% de glicerol mostrou melhor IM após descongelação em um passo a 38oC (320% vs 100% no controle) e maior MOT às 6 h após descongelação e rediluição em 5 passos a 20oC (56% vs 26% no controle). Conclui-se que o sêmen caprino tolera soluções de sacarose até o limite de 930 mOsm, mas a rediluição deve ser progressiva. A desidratação parcial, causada por soluções concentradas de sacarose ou trealose, permite a congelação de sêmen sem adição de crioprotetores permeantes. Os melhores resultados foram obtidos em diluente TRIS-gema sem glicerol e adicionado de 300 mM de trealose. / The objective of this study was to: 1) define the tolerance limits of goat sperm to hyperosmotic sucrose solutions; 2) establish an extender that minimizes cell volume variations during the processes of freezing and thawing. Boer goat semen was diluted with Ringer-lactate-Sucrose solutions at 38oC. The hyperosmotic tolerance limit was 930 mOsm evaluated with eosin-nigrosin stain. At osmolalities above this value, damage was evident after 1 min and was not affected by further exposure. Redilution in a single step resulted in massive membrane damage that was nearly proportional to the dehydration intensity previously undergone. Motility (MOT) was more distinctly impaired than membrane integrity (MI). In the next experiments, addition of 375 mM sucrose (Suc) 5 min previous to freezing to TRIS-egg yolk extender containing 6.8% glycerin (TYG) resulted in sperm motility (MOT) and MI similar to control extender TYG without sucrose. Thawing and redilution at 4oC affected favorably the MOT, and at 38oC, was favorable to MI. When freezing in TRIS-egg yolk-Suc extenders with low glycerin concentration (1.7%) MOT and MI were significantly higher than in the control TYG (65% and 187% vs 52% and 100%, respectively). MOT 2 h after thawing and intensity of motility (INTMOT) after 6 h after thawing were better preserved after a redilution of 5 increasing volume-steps than after redilution of 3 steps (28% and 9% vs 19% and 2%, respectively). In sequence, extenders containing 300 mM sucrose and thawed-rediluted 5 steps at 20oC improved MOT and INTMOT after 6 h (33% and 26% vs 15% and 10% in the control Group). The thawing-redilution at 20oC improved the results in all groups containing sucrose. At a concentration of 3.4% added to TRIS-yolk extender with 300 mM sucrose, the cryoprotectant ethylene glycol gave similar results as glycerin. MOT and INTMOT in the different time intervals were not influenced by redilution in 5 steps at 20oC or in one step at 38<SUPoC. In the last experiment made, semen frozen in a TRIS-yolk extender with 300 mM trehalose and devoid of glycerin showed the best MI after thawing-redilution in 1 step at 38oC (320% vs 100% in the control Group). The highest MOT after 6 h incubation was observed when this group was thawed-rediluted at 20oC in 5 steps (56% vs 26% in the control). From the results obtained it may be concluded that the upper tolerance limit of goat spermatozoa to hyperosmotic sucrose solutions is 930 mOsm. The redilution and return to isosmolality should be stepwise made. Goat semen can be frozen in extenders devoid of permeant cryoprotectants like glycerin when, previous to freezing, the cells are partially dehydrated by concentrated sucrose or trehalose solutions. The best survival rate was obtained when freezing goat spermatozoa in a glycerin-free TRIS-yolk-extender containing 300 mM of trehalose.