Frente à importância da preservação dos recursos genéticos algais depositados em coleções de referência para o apoio de programas de melhoramento, faz-se necessário o desenvolvimento de metodologias para a conservação de microalgas em estado metabolicamente inativo por longos períodos. Neste contexto, objetivou-se com o presente trabalho estabelecer protocolos otimizados de criopreservação para espécies de microalgas com arquiteturas celulares distintas (colonial cenobial, cocóide unicelular e colonial palmeloide), determinando-se os parâmetros ótimos para o congelamento, incluindo a fase de crescimento algal, além do tipo e da concentração de agentes crioprotetores. Foram testados três agentes químicos crioprotetores: dois agentes com alta permeabilidade celular, Glicerol e Dimetilsulfóxido (DMSO), e um agente não-permeável, Polietilenoglicol 400 (PEG 400). A otimização das variáveis foi realizada empregando-se delineamento composto central rotacional (DCCR) 22. Para a maioria das cepas unicelulares cocóides analisadas o congelamento durante a fase de desaceleração do crescimento algal (6º dia de cultivo) na presença do crioprotetor DMSO 7% (v/v) resultou nas taxas mais elevadas de viabilidade celular após a criopreservação (até 94%). Por outro lado, as taxas mais altas de recuperação da viabilidade celular de algas cenobiais (62,6%) foram obtidas mediante congelamento durante a fase de crescimento algal exponencial (3º dia de cultivo) na presença dos agentes glicerol e PEG 400 combinados na concentração de 5% (v/v) cada. Comportamento distinto também foi observado para as cepas palmelóides analisadas, com as taxas de recuperação mais elevadas (78,8%) tendo sido obtidas mediante congelamento durante a fase de desaceleração do crescimento algal (6º dia de cultivo) na presença da combinação de agentes crioprotetores, glicerol (5% v/v) + PEG 400 (5% v/v). Os resultados obtidos sugerem que a morfologia apresentada pelo talo algal pode ser um bom indicador para a escolha do agente crioprotetor a ser utilizado para a criopreservação. / In view of the importance of preserving algal genetic resources deposited in reference collections for the support of enhancement programs, it is necessary to develop methodologies for the conservation of microalgae in a metabolically inactive state for long periods. In this context, the objective of this work was to establish optimized cryopreservation protocols for microalgae species with distinct cellular architectures (cenobial colonial, unicellular coccoid and palmeloid colonial), determining the optimal parameters for freezing, including the algal growth phase, and also the type and concentration of cryoprotective agents. Three cryoprotectants were tested: two agents with high cell permeability, Glycerol and Dimethylsulfoxide (DMSO), and a non-permeable agent, Polyethylene Glycol 400 (PEG 400). The optimization of the variables was carried out using a central composite rotational design (CCRD) 22. For most of the single-celled coccoid strains analyzed, the freezing during the deceleration phase of algal growth (6th day of culture) in the presence of 7% DMSO cryoprotectant v/v) resulted in the highest rates of cell viability after cryopreservation (up to 94%). On the other hand, the highest rates of cellular viability of the cenobial algae (62.6%) were obtained by freezing during the exponential algal growth phase (3rd day of cultivation) in the presence of combined glycerol and PEG 400 agents in the concentration of 5% (v / v) for each one. Different behavior was also observed for the analyzed palmeloid strains, with the highest recovery rates (78.8%) being obtained by freezing during the deceleration phase of algal growth (6th day of culture) in the presence of the combination of cryoprotectants, glycerol (5% v/v) + PEG 400 (5% v/v). The results obtained suggest that the morphology presented by the algal stem can be a good indicator for the choice of cryoprotectant to be used for cryopreservation.

É sabido das vantagens da utilização do sêmen criopreservado na reprodução eqüina, mas também é de conhecimento que o entendimento desta biotecnologia ainda é carente. Não se tem concordância quanto à dose e concentração espermáticas ideais para se obter bons resultados de fertilidade. Assim, este experimento teve o intuito de avaliar o movimento espermático pelo sistema computadorizado (CASA), a morfologia espermática, além da integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, com sondas fluorescentes, em espermatozóides eqüinos criopreservados nas concentrações de 100, 200, e 400x106sptz/mL e nos volumes 0,50 e 0,25mL. Foram utilizados quatro garanhões sendo oito colheitas de cada animal, através de vagina artificial. Após a colheita, o sêmen foi diluído em extensor à base de leite desnatado (1:1), centrifugado 500xg por 10 minutos, o sobrenadante retirado, e o pellet ressuspendido em diluidor Botu-Crio® nas concentrações de 100 (C100), 200 (C200) e 400x106sptz./mL (C400). Em seguida, envasado em palhetas de 0,50 e 0,25mL. Para criopreservação do sêmen utilizou–se aparelho automatizado (TK3000®), com curvas de resfriamento -0,25ºC/min e de congelação -15ºC/min até -80ºC e -10ºC/min, até atingir -120ºC, quando as palhetas foram mergulhadas em N2 líquido (-196 ºC) e armazenadas em botijões criogênicos. Foram descongeladas duas palhetas de cada tratamento em banho-maria (37ºC por 30s). Uma amostra do sêmen foi diluída em formol salino para avaliação da morfologia espermática e outra em TALP sperm à concentração de 25x106sptz/mL. Logo após, uma amostra desta solução foi submetida à análise computadorizada do movimento espermático. As características analisadas foram: motilidade total (MTCA, %), motilidade progressiva (MPRO, %), velocidade progressiva (VSL, &#956;m/s), velocidade curvilinear (VCL, &#956;m/s), deslocamento lateral de cabeça (ALH, &#956;m) e freqüência de batimento flagelar (BCF, Hz). Em seguida, uma outra amostra foi avaliada quanto à integridade das membranas plasmática e acrossomal e o potencial de membrana mitocondrial, utilizando PI, JC-1 e FITC-PSA, por microscopia de epifluorescência. Foram determinados os percentuais de espermatozóides com membranas plasmáticas intactas (MPI), acrossomais intactas (MAI) e mitocondriais de alto potencial (APM) e membranas plasmática e acrossomal intactas e com alto potencial de membrana mitocondrial (PIAIA). Foi utilizada análise de variância (ANOVA) (p<0,05) e teste de médias SNK (p<0,05), pelo método SAS®. Não houve efeito da interação entre volume da palheta e concentração espermática para as características estudadas. As características do movimento espermático foram influenciadas pela concentração, de forma que C100>C200>C400, exceto em LIN e STR. O volume somente alterou os valores de STR e VCL. Quanto à integridade e funcionalidade das membranas, não houve efeito do volume, enquanto que as concentrações alteraram somente MPI (C100>C200>C400) e APM (C100=C200>C400). Na morfologia espermática, a concentração somente afetou a percentagem de cauda dobra ou enrolada (C100>C200=C400) e o volume de armazenamento somente as quantidades de cabeça isolada normal e patológica (0,50>0,25mL). Assim, o melhor método de congelação, neste experimento, foi em C100, seguido por C200 e por último C400, em ambos os volumes. Portanto, a qualidade seminal pós-descongelação está diretamente relacionada com a quantidade de agentes crioprotetores por unidade celular, independente do volume da palheta. / It has been known the advantages of cryopreserved semen utilization in equine reproduction, but the understanding of this biotechnology is uncertain yet. There was not agreement of the ideal spermatic dose and concentration to optimize fertility results. Thus this experiment had the objective to evaluate spermatic motion by computed analysis (CASA), spermatic morphology and the plasmatic and acrosomal membrane integrity and mitochondrial membrane potential with fluorescence probes of equine cryopreserved spermatozoa on 100, 200 and 400x106sptz/mL concentrations and 0.50 and 0.25mL volumes. Eight ejaculates from four stallions were collected in artificial vagina. The semen was diluted in skim-milk extender (1:1), centrifuged at 500xg for ten minutes, the supernatant was removed and the freezing extender Botu-Crio® was added in the pellet to a final concentrations of 100 (C100), 200 (C200) and 400x106sptz/mL (C400); after that, it was packed in 0.50 and 0.25mL straws. The cryopreservation of semen utilized an automatic system (TK3000®), with cooling slope -0.25°C/minute and freezing slope of -15°C/minute, until -80°C, and -10°C/minute, until -120°C, when the straws were plunged into liquid nitrogen (-196°C), and stored in cryogenics tank. They were thawed for 30s in a 37°C waterbath. A sample of semen was diluted in saline formol to morphology spermatic evaluation and another diluted in TALP sperm at 25x106sptz/mL. After, a sample was submitted to CASA evaluation. The analyzed characteristics were: total motility (TMCA, %), progressive motility (PROM, %), progressive velocity (VSL, µm/s), track speed (VCL, µm/s), beat cross frequency (BCF, Hz) and lateral amplitude of head (ALH, µm). Afterward, another sample was evaluated about plasmatic and acrosomal membranes integrity and mitochondrial potential membrane, using PI, JC-1 and FITC-PSA by epifluorescence microscope. It was determined the spermatozoa percentage with intact plasmatic membranes (IPM), intact acrosomal membranes (IAM), and high potential mitochondrial membrane (HPM) and intact plasmatic and acrosomal membranes and with high potential mitochondrial membrane (IPIAH). For statistical analysis were utilized variance analysis (ANOVA - p<0.05) and SNK test (p<0.05) with standard deviation, by SAS® system. There was not effect of straw volume and spermatic concentration interaction in the studied characteristics. The spermatic motion characteristics were influenced by concentration (C100>C200>C400), except LIN and STR. The volume changed the values of percentage of STR e VCL. In membrane integrity and functionality there was no volume effect, however the concentrations changed only IPM C100>C200>C400) e HPM (C100=C200>C400). In spermatic morphology, the concentration affected the percent of folded or coiled tail (C100>C200=C400) and the volume only affected the loose normal and abnormal head (0.50>0.25mL). Thus, the better freezing method, in this experiment, was C100, followed by C200, and C400, in both straws volumes. The seminal quality post-thawed is related with the cryoprotector quantity by cell, free of the straw volume.

Orientador: Gilson Hélio Toniollo / Coorientador: Maricy Apparicio Ferreira / Banca: Elzylene Léga / Banca: Geórgia Modé Magalhães / Resumo: A criopreservação de ovário ou tecido ovariano permite a preservação do material genético de qualquer espécie animal que seja submetido à gonadectomia por indicação preventiva, terapêutica ou, até mesmo, por morte inesperada. O objetivo do presente trabalho foi avaliar se o tamanho do fragmento ovariano influencia ou não a resistência aos crioprotetores. Para tanto, os ovários foram colhidos de 34 gatas domésticas (várias raças, 1-5 anos de idade) por ovariectomia de rotina, transportados ao laboratório e depois seccionados em fragmentos de diferentes tamanhos (3 x 3 x 3mm, 5 x 3 x 3mm e 7 x 3 x 3mm) e destinados aleatoriamente aos grupos de controle (GC3, GC5 e GC7, respectivamente) ou vitrificados (GV3, GV5 e GV7, respectivamente). Os fragmentos vitrificados-aquecidos foram avaliados por histomorfologia e imunohistoquímica (para taxas de apoptose utilizando a caspase-3 clivada). A avaliação histológica demonstrou que 72,97% dos folículos presentes em GV3 e 72,58% nos fragmentos do grupo GV5 eram normais, enquanto que nos fragmentos do GV7 essa taxa foi de apenas 42,86%. A principal alteração morfológica foi o desprendimento das células epiteliais da membrana basal presentes em todos os grupos. Da mesma forma, a avaliação imunohistoquímica, utilizando a caspase 3, revelou uma pequena proporção de células apoptóticas nos fragmentos do grupo GV3 (53%), enquanto que no grupo GV7, 43,58% das células expressaram a caspase 3 clivada. Esses achados indicam que fragmentos seccionado... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Cryopreservation of ovary or ovarian tissue allows preservation of genetic material of any animal species that is submitted to gonadectomy for preventive, therapeutic or even by unexpected death. The aim of the present study was to investigate whether or not the size of the ovarian fragment influence its resistance to cryostorage. For that purpose, ovaries were collected from 34 queens (various breeds, age 1-5 y) by routine ovariectomy, transported to the laboratory and then sectioned in different sizes (3 x 3 x 3 mm, 5 x 3 x 3 mm and 7 x 3 x 3 mm) and randomly assigned to a control (GC3, GC5 and GC7, respectively) or vitrified (GV3, GV5 and GV7, respectively) groups. Vitrified-warmed fragments were evaluated by histomorphology and immunohistochemistry (for apoptotic rates by using cleaved caspase-3). Histological examination reveal that 72.97% of the follicles in GV3 and 72.58% in GV5 were normal while only 42.86% of the follicles in GV7. The main morphological alteration presented in all groups was a detachment of the epithelial cells by basement membrane. Similarly, immunohistochemistry evaluation using caspase 3 revealed a small proportion of apoptotic cells in GV3 (53%) while in GV7 43.58% of the cells expressed cleaved caspase-3. These findings indicate that fragments sectioned in 3 x 3 x 3 mm (27mm3) seems more adequate for perfusion of the cryoprotectant, causing less damage to the cell after vitrification-warming. / Mestre

Resumo não disponível

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Naiara Zoccal Saraiva / Banca: Maria Emilia Franco Oliveira / Banca: Paulo Henrique Franceschini / Banca: Clara Slade Oliveira / Banca: Fabio Morato Monteiro / Resumo: Embriões produzidos in vitro (PIV) apresentam baixa sobrevivência aos métodos convencionais de criopreservação. Na tentativa de melhorar a produção e taxa de sobrevivência embrionária após a vitrificação foram utilizados reguladores metabólicos L-carnitina (CA), Forskolina (FO) e Ácido linoleico conjugado trans-10; cis-12 (CLA), separadamente ou em associação em diferentes doses, à partir do quarto (D4) ou sexto (D6) dia do cultivo de desenvolvimento embrionário. No experimento 1 o uso de 2,5 mM de CA influenciou positivamente na produção (62,0±12,5%, P=0,02), expansão (60,7%, P=0,009) e eclosão (41,1%, P=0,04). No experimento 2, a produção de embriões não foi influenciada pela suplementação com FO (P=0,2), entretanto, a dose de 15,0μM afetou positivamente a expansão (53,2%, P=0,001) e eclosão (46,8%, P0,001). No experimento 3, a produção de embriões não foi influenciada pela suplementação do meio de cultivo com CLA (P=0,4), no entanto a dose de 150,0 μM afetou positivamente a expansão (85,5%, P=0,001) e eclosão (70,9%, P=0,001) dos embriões reaquecidos e cultivados por 48 horas. No experimento 4, a associação dos reguladores de metabolismo lipídico utilizados não influenciou a produção de embriões (P=0,16), entretanto o melhor resultado de produção observado foi no tratamento com 15,0 μM de FO individualmente. As taxas de expansão e eclosão foram influenciadas pela suplementação com reguladores de metabolismo adicionados individualmente ou em associação (P=0,001). A melhor taxa de expansão foi observada na suplementação associando CA+FO+CLA, com 90,05%, que não diferiu (P>0,05) da suplementação com CLA (86,4) e da associação CA+CLA (87,9%). Entretanto, a melhor taxa de eclosão foi obtida com CLA (71,8%, P=0,01), superior aos demais tratamentos. Foi concluído que o uso dos... / Abstract: Embryos produced in vitro (IVP) have low survival to conventional cryopreservation methods. In attempt to improve the production and the rate of embryo survival to the cryopreservation process, was used the metabolic regulators, L-carnitine (CA), forskolina (FO) and the conjugated linoleic acid isomers trans-10, cis-12 (CLA), separately or in combination in different doses, starting the fourth (D4) or sixth (D6) days of the embryo culture development in vitro. In experiment 1, the best results of production (62,0 ± 12,5%, P = 0,02), expansion (60,7%, P = 0,009), and hatching (41,1 % P = 0,04) was obtained using 2,5 mM of CA. In experiment 2, the production of embryos was not influenced by supplementation with FO (P=0,2), however, the dose of 15,0μM was the best result of expansion (53,2%) and hatching (46,8%) (P=0,001). In experiment 3, the production of embryos was not influenced by supplementation with CLA (P=0,4), however, the dose of 150,0 μM resulted in higher rates of expansion (85,5%, P=0,001) and hatching (70,9%, P=0,001). In the experiment 4, the embryo production was not influenced by the supplementations (P=0,16), however the best result of the production was using 15,0μM of FO individually. The expansion and hatching rates was influenced by supplementation with the metabolism regulators added individually or in a combination (P=0,001). The best expansion rate was observed with the association CA+FO+CLA (90,05%), that was not different (P>0,05) of the CLA (86,4%) or CA+CLA (87,9%) groups. However, the best hatching rate was obtained with CLA (71,8%), which was higher to the other treatments (P=0.01). In conclusion, the use of the metabolic regulators CA, FO and CLA from the fourth day of the embryo culture in vitro increase ... / Doutor

Orientador: Eunice Oba / Coorientador: Alicio Martins Júnior / Banca: Fernanda da Cruz Landin / Banca: Yeda Fumie Watanabe / Resumo: O objetivo deste estudo foi verificar o efeito de diferentes meios e tempos de refrigeração sobre o desenvolvimento e expressão gênica de embriões bovinos produzidos in vitro. Para tanto, blastocistos D7 foram divididos em três grupos: controle, embriões mantidos em meio SOFaa, em incubadora de CO2, por 6 e 48h; refrigerados, embriões mantidos a 5 °C, em Meio 199, por 24 (M199-24h) e 48h (M199-48h) ou em meio BotuEmbryo®, por 24 (BE-24h) e 48h (BE-48h). Após a refrigeração, os embriões foram cultivados sob as mesmas condições do grupo controle para avaliação da viabilidade embrionária às 6 e 48h, e das taxas de reexpansão e eclosão, às 24 e 48h, respectivamente. Às 6h de cultivo parte dos embriões foi retirada e armazenada para posterior análise de qPCR e TUNEL. Menor porcentagem (P<0,05) de blastocistos viáveis, às 6 e 48h, foi observada no grupo M199-48 em relação ao grupo controle. A taxa de reexpansão não diferiu entre os embriões refrigerados e o grupo controle, porém, menor (P<0,05) taxa de eclosão foi observada nos grupos M199-48h e BE-48h do que no grupo controle. Maior (P<0,05) porcentagem de células apoptóticas foi observada no grupo BE-48h do que nos grupos controle e BE-24h. Os meios e tempos utilizados não alteraram a expressão dos genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 e SLC2A1. Portanto, de modo geral, o meio e o tempo de refrigeração não promoveram efeito potencial adverso sobre a viabilidade embrionária, taxa de reexpansão e eclosão, número de células apoptóticas e expressão gênica, sugerindo o emprego do meio BotuEmbryo®, o qual é disponível comercialmente / Abstract: This study was carried out to investigate the effects of different media and cooling times on the development and gene expression of in vitro-derived bovine embryos. Therefore, blastocysts D7 were divided into three groups: control, embryos kept in SOFaa medium, under CO2 incubation, for 6, 24 and 48 hours; cooled embryos, kept in Medium 199, for 24 (M199-24h) and 48 hours (M199-48h) or in BotuEmbryo® medium, for 24 (BE-24h) and 48 hours (M199-48h). After cooling, the embryos were cultured under the same conditions used for the control group for evaluation of embryo viability at 6 and 48 hours, and of re-expansion and hatching rates, at 24 and 48 hours, respectively. At 6h of culture part of the embryos was removed and stored for later analysis of qPCR and TUNEL. Low percentage (P<0.05) of viable blastocysts, at 6 and 48 hours, was observed in group M199-48h than for control group. Re-expansion rate did not differ between cooled embryos and control group, however, lower (P<0.05) hatching rate was observed in M199-48h and BE-48h groups than for control group. Higher (P<0.05) percentage of apoptotic cells was found in BE-48h compared with control and BE-24h groups. Media and cooling times used did not alter the expression of genes HSPA1A, PRDX1, SOD1 and SLC2A1. Thus, overall, medium and cooling time did not promoted potential adverse effect on the embryonic viability, re-expansion and hatching rate, number of apoptotic cells and gene expression, suggesting the use of BotuEmbryo® medium, which is commercially available / Mestre

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Fabio Morato Monteiro / Banca: César Roberto Esper / Banca: Marcelo Roncoletta / Resumo: O plasma seminal já foi descrito como benéfico e ao mesmo tempo prejudicial aos espermatozoides e isto está relacionado com o tempo de contato entre eles. A criopreservação do sêmen em touros pode ser prejudicada por exposição contínua dos espermatozoides ao plasma seminal (PS) e a aplicação de métodos para sua remoção pode aumentar a qualidade dos espermatozoides recuperados pós-descongelação, melhorando os resultados de biotécnicas que utilizam sêmen criopreservado. Pelo fato da centrifugação causar muitos danos aos espermatozoides, a filtragem com Sperm Filter® apresenta-se como um novo método de remoção do PS que almeja melhores resultados, porém não foi encontrado relato da sua aplicação em bovinos até o momento. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito dos métodos de centrifugação e filtragem com Sperm Filter® sobre a criopreservação do sêmen bovino. Para isso, o sêmen de 38 touros Nelore foi colhido por eletroejaculação. Após a colheita, o sêmen foi fracionado em três alíquotas iguais para divisão em três grupos: controle (N), em que o sêmen foi diluído com PS; centrifugação (C), em que o PS foi removido por centrifugação a 600 X g por 10 minutos; e filtragem (F), em que o PS foi removido por filtragem com Sperm Filter®. As amostras foram criopreservadas, e pós-descongelação foram avaliados a cinética espermática, a integridade das membranas plasmática e acrossomal, o potencial mitocondrial, o estresse oxidativo e a capacidade fecundante através da produção in vitr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Seminal plasma has been described as beneficial and harmful to the spermatozoa and this is related to the contact time between them. Cryopreservation of semen from bulls can be undermined by continuous exposure of sperm to the seminal plasma (SP) and the application of methods for removal can increase the quality of post-thaw sperm recovered, improving fertilization. Centrifugation cause a lot of damage to sperm and filtering with Sperm Filter® is a new SP removal method that aims to better results, but has not yet been applied in bull. The aim of this study was to evaluate the effect of the methods of centrifugation and filtering with Sperm Filter® on cryopreservation of bovine semen. For this, semen of 38 Nelore bulls was collected by electroejaculation. Semen was fractioned into three equal aliquots for division into three groups: control (N), wherein the semen was diluted with SP; centrifugation (C), in which the SP was removed by centrifugation at 600 X g for 10 minutes; and filtration (F), in which the SP was removed by filtration with Sperm Filter®. Samples were cryopreserved and was evaluated after thawing sperm kinetics, the integrity of plasma and acrosomal membranes, mitochondrial potential, oxidative stress and the fertilizing capacity by in vitro embryo production (IVP). The kinetics, higher values of the path velocity (P = 0.0005) and progressive speed (P = <0.0001) were observed in the groups C and F and the beat frequency parameters, straightness and linearity... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Samira Ramos (samira.ramos@unifenas.br) on 2019-02-26T16:35:22Z No. of bitstreams: 1 Amarildo_Marciano_Rosa.pdf: 697737 bytes, checksum: f45cb56a60aced2c55ace1d99ecec4f0 (MD5) / Made available in DSpace on 2019-02-26T16:35:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Amarildo_Marciano_Rosa.pdf: 697737 bytes, checksum: f45cb56a60aced2c55ace1d99ecec4f0 (MD5) Previous issue date: 2018-06-20 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The objective of this study was to evaluate the influence of the use of single-layer colloidal silica of glycidoxypropyltrimethoxysilane-equine formulation-Androcoll-E® (Minitube, Germany) on the freezing of canine semen. For this, 5 dogs, of different breeds, with satisfactory semen characteristics (CBRA, 2013) were used. Seven ejaculates / animal were collected and subdivided, forming: Group A - samples centrifuged at 300g for 10 minutes using Androcoll-E® and group E samples centrifuged at 700g for 10 minutes using CaniPlus Enhance® medium (Minitube; Germany). In both groups, the steps of discarding the supernatant, resuspension of the pellet in CaniPlus Enhance® (1mL of medium / 100 x 106 spermatozoa), packaging (25 x 106 spermatozoa / pallet), refrigeration (2 to 6ºC for 2 hours) , freezing (20 minutes at 5cm over N2 vapor and storage at -196C in N2 canister) and thawing (at 37 ° C for 60 seconds). After 7 days, the samples were resubmitted to centrifugation, forming 4 subgroups (16 straws / animal / subgroup): AA (Androcoll-E® centrifugation in the pre- and post-thawing stage), AE (Androcoll-E® centrifugation at pre-freezing stage and CaniPlus Enhance® in post-thawing), EA (CaniPlus Enhance® centrifugation in pre-freezing and with Androcoll-E® after thawing) and EE (CaniPlus Enhance® centrifugation in pre and post-thaw stages). Microscopic analysis of semen (concentration, vigor, membrane integrity, sperm morphology, subjective and computerized motility) was performed. Test of variance, Tukey and Kruskall Wallis were used, considering p <0.05. There was a statistical difference in relation to computerized motility and sperm morphology. The mean trajectory velocity and curvilinear velocity were higher in the EE group, the cross flagellar beating and the rectilinearity in the EA group and the linearity in the AA group. In relation to sperm morphology, the EA group presented the highest percentage of morphologically intact cells (95%), whereas in the AE group, minor defects (23%) and higher were greater than acceptable (12%). The use of equine colloidal silica after thawing (EA group) selects morphologically intact spermatozoa, which present parameters that indicate a better migration capacity and penetration into the cervical mucus. / O objetivo deste estudo foi avaliar a influência do uso da centrifugação em camada única de sílica coloidal de glicidoxipropiltrimetoxissilano- formulação equina-Androcoll-E® (Minitube, Germany), na congelação do sêmen canino. Para isso, 5 cães, de raças distintas, com características seminais satisfatórias (CBRA, 2013) foram utilizados. Sete ejaculados/animal foram coletados e subdivididos, formando: Grupo A- amostras centrifugadas a 300g, por 10 minutos, utilizando Androcoll-E® e grupo E- amostras centrifugadas a 700g, por 10 minutos, utilizando o meio CaniPlus Enhance® (Minitube; Germany). Em ambos os grupos foram realizadas as etapas de descarte do sobrenadante, ressuspensão do pellet em CaniPlus Enhance® (1mL de meio/100 x 106espermatozoides), envase (25 x 106 espermatozoides móveis/palheta), refrigeração (2 a 6ºC por 2 horas), congelação (20 minutos a 5cm sobre vapor de N2 e armazenamento a -196ºC em botijão de N2) e descongelação (a 37ºC por 60 segundos). Após 7 dias, as amostras foram ressubmetidas à centrifugação, formando 4 subgrupos (16 palhetas/animal/subgrupo): AA (centrifugação com Androcoll-E® na etapa de pré e pós descongelação), AE (centrifugação com Androcoll-E® na etapa pré congelação e com CaniPlus Enhance® na pós descongelação), EA (centrifugação com CaniPlus Enhance® na pré congelação e com Androcoll-E® na pós descongelação) e EE (centrifugação com CaniPlus Enhance® nas etapas pré e pós descongelação). A análise microscópica do sêmen (concentração, vigor, integridade de membrana, morfologia espermática, motilidade subjetiva e computadorizada) foi realizada. Teste de variância, Tukey e Kruskall Wallis foram usados, considerando p<0,05. Houve diferença estatística em relação à motilidade computadorizada e morfologia espermática. A velocidade média da trajetória e curvilínea foram superiores no grupo EE, o batimento flagelar cruzado e a retilinearidade no grupo EA e a linearidade no grupo AA. Em relação à morfologia espermática, o grupo EA foi o que apresentou maior porcentagem de células morfologicamente íntegras (95%) enquanto no grupo AE, os defeitos menores (23%) e maiores foram superiores aos aceitáveis (12%). O uso da centrifugação com sílica coloidal equina pós descongelação (grupo EA) seleciona espermatozoides morfologicamente íntegros, que apresentam parâmetros que indicam melhor capacidade de migração e penetração no muco cervical.

A preocupação com a qualidade do sêmen ovino congelado tem sido motivo de muitas pesquisas, principalmente pela dificuldade da transposição cervical durante a inseminação artificial. Contudo, a inseminação intra-cervical é frequentemente usada em ovinos e resulta em redução da fertilidade com o uso do sêmen congelado. Neste sentido, esse estudo foi dividido em dois experimentos. No 1o experimento foi verificado o potencial da ciclodextrina pré-carregada com colesterol como aditivo ao diluidor na proteção da cinética espermática, integridade das membranas plasmática e acrossomal, função mitocondrial, capacitação espermática e produção de espécies reativas ao oxigênio (ROS) em espermatozoides criopreservados ovinos. Cinco ejaculados de seis carneiros (n = 30) foram divididos em três tratamentos: apenas diluidor (CON); diluidor + colesterol incorporado a ciclodextrina (CLC + CHO); e diluidor + ciclodextrina pura (CLCP). Após a diluição (50x106 espermatozóides/mL), o sêmen foi envasado em palhetas, identificado e criopreservado utilizando um sistema automatizado. Duas palhetas da mesma partida de cada tratamento foram descongeladas (a 37°C durante 30 segundos) e analisadas quanto motilidade (CASA), morfologia dos espermatozoides (DIC), integridade do plasma (PI-H342) e acrossomal (FITC-PSA) membranas, potencial mitocondrial (JC-1), produção de radicais livres (CellRox), peroxidação lipídica (BODIPY) e fluidez da membrana celular (merocianina 540). As comparações entre os grupos foram analisadas pelo PROC MIXED do SAS e o efeito de grupo foi detectado pelo teste de Tukey (p&lt;0,05) ou pela estatística não paramétrica de ordem (Kruskal-Wallis), quando era necessário. No 2º experimento os mesmos ejaculados foram divididos por congelabilidade baseados na motilidade total pós-descongelação (MTPD) e na porcentagem de redução na motilidade total (%RMT) quando comparados o sêmen in natura e o sêmen pós-descongelação (somente diluidor), sendo divididos nos grupos alta (MTPD&gt;60% e %RMT&lt;40%), intermediária (60%&gt;MTPD&gt;40% e 60%&gt;RMT&gt;40%) e baixa (MTPD&lt;40% e %RMT&gt;60%) congelabilidade. Foram analisados os tratamentos CON e CLC+CHO dentro de cada animal e de cada grupo quanto a motilidade (CASA), a integridade das membranas plasmática (PI-H342) e acrossomal (FITC-PSA), potencial mitocondrial (JC-1), peroxidação lipídica (BODIPY) e fluidez da membrana celular (merocianina 540). As comparações foram realizadas por análise de variância (ANOVA) em arranjo fatorial 3X3 (Tratamento CLC+CHO, CON e in natura X grupos alta, intermediária e baixa congelabilidade), as comparações entre os grupos foram analisadas pelo PROC MIXED do SAS e o efeito de grupo foi detectado pelo teste de Tukey (p &lt;0,05) ou pela estatística não paramétrica de ordem (Kruskal-Wallis), quando era necessário. No 1o experimento o tratamento CLC+CHO se mostrou mais eficaz em preservar os parâmetros de motilidade, integridade de membranas e potencial mitocondrial quando comparado aos demais tratamentos. O grupo CLCP mostrou queda nos parâmetros de motilidade, integridade de membrana, potencial mitocondrial, mostrando, com isso, uma queda na preservação espermática. No 2o experimento observou-se que o tratamento CLC+CHO mostrou maior grau de preservação para motilidade total e progressiva, células rápidas, preservação de membranas plasmática e acrossomal e potencial mitocondrial quando comparado ao CON. Esse efeito teve maior significância nos grupos de baixa e intermediária congelabilidade, não sendo tão expressivo no grupo de alta. Pode-se concluir com esse estudo que o tratamento com ciclodextrina acrescida de colesterol contribui para uma melhor preservação dos parâmetros espermáticos do sêmen ovino, principalmente em animais apresentando baixa congelabilidade, contudo não apresenta diferença em ejaculados de alta congelabilidade. / Frozen ram semen has been the subject of many researches, mainly due to the difficulty of cervical transposition during artificial insemination. However, intra-cervical insemination in sheep is often used, resulting in reduced fertility with the use of frozen semen. To this end, this study was divided into two experiments. In the first experiment was verified the potential of cyclodextrin loaded with cholesterol as an additive to the extender in the protection of sperm kinetics, integrity of plasmatic and acrosomal membranes, mitochondrial function, sperm capacitation and production of reactive oxygen species (ROS) in cryopreserved sheep sperm. Five ejaculates from six rams (n = 30) were divided into three treatments: only extender (CON); extender + cyclodextrin loaded with cholesterol (CLC + CHO); and extender + pure cyclodextrin (CLCP). After dilution (50x106 spermatozoa/mL), semen was stored in straws, identified and cryopreserved using an automated system. Two straws from each ejaculate and treatment were thawed (at 37° C for 30 seconds) and analyzed for motility (CASA), morphology of spermatozoa (DIC), plasmatic (PI-H342) and acrosomal (FITC-PSA) membrane integrity, mitochondrial potential (JC-1), production of free radicals (CellRox), lipid peroxidation (BODIPY) and cell membrane permeability (Merocyanine 540). Comparisons between groups were analyzed using PROC MIXED of SAS and the effect of group was detected by Tukey (p &lt;0.05) or by the order of nonparametric statistics (Kruskal-Wallis) test, when necessary. In the 2nd experiment the same ejaculates were divided by freezability based on the total post-thaw motility (TPTM) and the percentage of reduction in total motility (%RTM) when compared fresh and post-thaw semen (only extender), and divided into the groups: high (TPTM &ge; 60% and %RTM &le; 40%), intermediate (60%&gt; TPTM &gt; 40% and 60%&gt; %RTM &gt; 40%) and low (TPTM &le; 40% and %RTM &ge; 60%) freezability. CON and CLC + CHO treatments were analyzed within each animal and each group for motility (CASA), plasmatic (PI-H342) and acrosomal (FITC-PSA) membrane integrity, mitochondrial potential (JC-1), lipid peroxidation (BODIPY) and cell membrane permeability (Merocyanine 540). Comparisons were performed by analysis of variance (ANOVA) with a factorial arrangement 3x3 (groups CLC+CHO, CON and fresh X groups high, medium and low freezability), comparisons between groups were analyzed using PROC MIXED of SAS and the group effect was detected by the Tukey test (p &lt; 0.05) or no statistical order parametric (Kruskal-Wallis), when necessary. In the first experimente, CLC + CHO treatment was more effective in preserving the parameters of motility, membrane integrity, and mitochondrial potential compared to other treatments. The CLCP group showed a fall in the parameters of motility, membrane integrity, mitochondrial potential, showing thereby a decrease in sperm preservation. In the 2nd experiment, it was observed that the treatment CLC + CHO showed greater preservation for total and progressive motility, rapid cell preservation, plasmatic and acrosomal membranes and mitochondrial potential when compared to CON. This effect was most significant in the groups of low and intermediate freezability, not being as significant in the group of high freezability. We can conclud from this study that treatment with cyclodextrin loaded with cholesterol contributes to better preservation of sperm parameters in ram semen, especially in animals displaying low freezability, however there where no diference in the high freezability group.

Foi conduzida uma série de experimentos onde se buscou definir: 1) o limite de tolerância do espermatozóide caprino a soluções hiperosmóticas de sacarose; 2) um diluente para criopreservação de sêmen que minimizasse as flutuações de volume celular. O limite de tolerância da membrana, avaliado pelo corante eosina-nigrosina, foi de 930 mOsm em soluções de sacarose em Ringer-lactato a 38oC. Os danos à integridade de membrana (IM), em osmolalidades acima deste valor, se estabeleceram no primeiro minuto de exposição e não se agravaram até 10 minutos depois. A motilidade (MOT) foi mais afetada que a IM. A rediluição abrupta em meio isosmótico causou dano extenso e proporcional ao grau de desidratação prévia. Nos experimentos seguintes, adição de 375 mM de sacarose ao diluidor TRIS-gema com 6,8% de glicerol (TGG), 5 minutos antes da congelação, resultou em MOT e IM similares ao controle TGG sem sacarose. Descongelação e rediluição a 4oC favoreceram a MOT e, a 38oC, favoreceram a IM. O diluente TRIS-gema com 375 mM de sacarose e concentração de glicerol reduzida para 1,7% apresentou melhor MOT e IM que o controle (65% e 187% vs 52% e 100%, respectivamente). A MOT após 2 h e o vigor após 6 h foram maiores quando a rediluição pós-descongelação foi em 5 passos se comparado a 3 passos (28% e 9% vs 19% e 2%, respectivamente). Na fase seguinte do trabalho, diluentes elaborados com 300 mM após 6 h a 38oC, melhor MOT e vigor que o controle (33% e 26% vs 15% e 10%, respectivamente). A descongelação a 20oC favoreceu a MOT e o vigor nos tempos zero, 2 h e 6 h pós-descongelação em todos os grupos contendo sacarose. O etilenoglicol não diferiu do glicerol na concentração de 3,4% quando adicionado a diluente contendo 300 mM de sacarose. Nestes diluentes, a rediluição em 5 passos a 20oC não diferiu em MOT e IM da feita em 1 passo a 38oC. No último experimento, sêmen congelado em diluente contendo 300 mM de trealose e zero% de glicerol mostrou melhor IM após descongelação em um passo a 38oC (320% vs 100% no controle) e maior MOT às 6 h após descongelação e rediluição em 5 passos a 20oC (56% vs 26% no controle). Conclui-se que o sêmen caprino tolera soluções de sacarose até o limite de 930 mOsm, mas a rediluição deve ser progressiva. A desidratação parcial, causada por soluções concentradas de sacarose ou trealose, permite a congelação de sêmen sem adição de crioprotetores permeantes. Os melhores resultados foram obtidos em diluente TRIS-gema sem glicerol e adicionado de 300 mM de trealose. / The objective of this study was to: 1) define the tolerance limits of goat sperm to hyperosmotic sucrose solutions; 2) establish an extender that minimizes cell volume variations during the processes of freezing and thawing. Boer goat semen was diluted with Ringer-lactate-Sucrose solutions at 38oC. The hyperosmotic tolerance limit was 930 mOsm evaluated with eosin-nigrosin stain. At osmolalities above this value, damage was evident after 1 min and was not affected by further exposure. Redilution in a single step resulted in massive membrane damage that was nearly proportional to the dehydration intensity previously undergone. Motility (MOT) was more distinctly impaired than membrane integrity (MI). In the next experiments, addition of 375 mM sucrose (Suc) 5 min previous to freezing to TRIS-egg yolk extender containing 6.8% glycerin (TYG) resulted in sperm motility (MOT) and MI similar to control extender TYG without sucrose. Thawing and redilution at 4oC affected favorably the MOT, and at 38oC, was favorable to MI. When freezing in TRIS-egg yolk-Suc extenders with low glycerin concentration (1.7%) MOT and MI were significantly higher than in the control TYG (65% and 187% vs 52% and 100%, respectively). MOT 2 h after thawing and intensity of motility (INTMOT) after 6 h after thawing were better preserved after a redilution of 5 increasing volume-steps than after redilution of 3 steps (28% and 9% vs 19% and 2%, respectively). In sequence, extenders containing 300 mM sucrose and thawed-rediluted 5 steps at 20oC improved MOT and INTMOT after 6 h (33% and 26% vs 15% and 10% in the control Group). The thawing-redilution at 20oC improved the results in all groups containing sucrose. At a concentration of 3.4% added to TRIS-yolk extender with 300 mM sucrose, the cryoprotectant ethylene glycol gave similar results as glycerin. MOT and INTMOT in the different time intervals were not influenced by redilution in 5 steps at 20oC or in one step at 38<SUPoC. In the last experiment made, semen frozen in a TRIS-yolk extender with 300 mM trehalose and devoid of glycerin showed the best MI after thawing-redilution in 1 step at 38oC (320% vs 100% in the control Group). The highest MOT after 6 h incubation was observed when this group was thawed-rediluted at 20oC in 5 steps (56% vs 26% in the control). From the results obtained it may be concluded that the upper tolerance limit of goat spermatozoa to hyperosmotic sucrose solutions is 930 mOsm. The redilution and return to isosmolality should be stepwise made. Goat semen can be frozen in extenders devoid of permeant cryoprotectants like glycerin when, previous to freezing, the cells are partially dehydrated by concentrated sucrose or trehalose solutions. The best survival rate was obtained when freezing goat spermatozoa in a glycerin-free TRIS-yolk-extender containing 300 mM of trehalose.