Aliskiren is the first representative of a new class of drugs, the low molecular weight renin inhibitors, orally active and clinically used in a new effective treatment for hypertension. In the present study, the methods were developed and validaded for assessment of aliskiren in pharmaceutical products. Aliskiren samples were also submitted to the physicochemical tests, meeting the specifications. The analysis by reversed-phase liquid chromatography were performed using Waters XBridge (150 mm x 4.6 mm i. d.), maintained at 25 °C. The mobile phase was consisted of acetonitrile/ water (95:5, v/v)/ 25 mM phosphoric acid pH 3.0 (40:60, v/v), run at flow rate of 1 mL/min and using UV detection at 229 nm. The chromatographic separation was obtained within 3.68 minutes. The spectrophotometric method was also developed and validaded, and the aliskiren can be quantified at 279 nm, using water as diluent. The procedures were validated evaluating parameters such as the specificity, linearity, precision, accuracy, limits of detection and quantitation, and robustness, giving results within the acceptable range. The proposed methods were applied for the analysis of pharmaceutical products, showing significant correlation (P > 0.05) of the results. The dissolution test was developed using 900 mL of 0.1 M of chloridric acid 37 ± 0.5 °C as dissolution medium, apparatus paddle at a stirring rate of 50 rpm and quantitation by spectrophotometric method. Therefore, the procedures can be applied to improve the quality control of pharmaceutical products and to assure the safety and therapeutic efficacy of the drug. / O alisquireno é o primeiro representante de uma nova classe de inibidores da renina, de baixo peso molecular e ativo por via oral, sendo utilizado clinicamente em um novo e eficaz tratamento para a hipertensão arterial (HA). No presente trabalho, foram desenvolvidos e validados métodos para avaliação de alisquireno em produtos farmacêuticos. Submeteram-se os produtos aos testes físico-químicos, mostrando que cumprem as especificações. As análises por cromatografia líquida em fase reversa foram realizadas utilizando coluna Waters XBridge (150 mm x 4,6 mm d. i.), mantida à 25 ºC. A fase móvel foi composta de acetonitrila/ água (95:5, v/v)/ ácido fosfórico 25 mM pH 3,0 (40:60, v/v), eluída na vazão de 1 mL/min e detecção no ultravioleta a 229 nm. A separação cromatográfica foi obtida no tempo de 3,68 minutos. Paralelamente, desenvolveu-se e validou-se método por espectrofotometria no ultravioleta (UV) em 279 nm, utilizando água como diluente. Os procedimentos foram validados, avaliando-se os parâmetros de especificidade, linearidade, precisão, exatidão, robustez e limite de detecção e quantificação, cujos resultados cumpriram os requisitos preconizados. Os métodos propostos foram aplicados na análise de produtos farmacêuticos, demonstrando correlação significativa dos resultados (P > 0,05). Desenvolveu-se método de dissolução do fármaco, utilizando como meio 900 mL de ácido clorídrico 0,1 M mantido a 37 ± 0,5 °C, aparato pá, rotação de 50 rpm e quantificação por espectrofotometria no UV. Desse modo, estabeleceram-se procedimentos que podem ser aplicados para aprimorar o controle da qualidade de medicamentos, bem como contribuir para garantir a segurança e eficácia no uso terapêutico.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2096.pdf: 2883888 bytes, checksum: 14ee3b8f3f2831e4e82bdcea414da0f8 (MD5) Previous issue date: 2007-08-10 / Universidade Federal de Sao Carlos / This present thesis describes the development of analytical methodologies involving the HPLC-PDA-MS/MS coupling to verify the production of both polar and non-polar metabolites in orange trees produced by grafting Citrus sinensis onto Citrus limonea. By the use of such kind of method, it was possible to verify the production of both polymethoxy and glycosyl flavonoids. This method was then applied to plants with symptoms of two different diseases, Citrus Sudden Death (MSC) and Greening. Regarding this last disease, the methodologies were focused on detection of some analogous of benzoic acid like gentisic acid, orbicularin, salicylic acid and glycosyl salicylic acid. Another part of this work was focused on isolation and characterization of Alternariol (AOL) and Alternariol Monomethyl Ether (AME), mycotoxins produced in vitro by a phytopathogenic strain of Alternaria alternata and the molecule tenuazoic acid. These mycotoxins were also monitored using HPLC-DAD for 30 days in an attempt to find out a possible profile of their production. In addition, an analytical method involving HPLC-MS/MS was developed, validated and applied to quantify the amounts of AOL and AME in different parts of tangerines (i.e., on flavedo and on albedo tissues) with and without symptoms of Alternaria Brown Spot disease. The levels of such substances were about 17.4 ± 1.0 μg/kg of AOH and 3.5 ± 0.2 μg/kg of AME on flavedo. Some inhibition tests against Guinardia citricarpa, related to Black Spot disease, were also done with some isolated compounds. Five of these compounds showed to have 100% of inhibition in this test at concentration of 500 μg/mL: benzoic acid, 3,4,5-trimethoxibenzoic acid, 3,4-dimethoxibenzoic acid, and the glycosyl flavonoids naringin and rutin. / Este trabalho descreve o desenvolvimento de metodologias de análise para metabólitos polares e de polaridade intermediária presentes em laranjeiras provenientes da enxertia de Citrus sinensis sobre Citrus limonea usando HPLC-DAD-MS/MS. Através deste método, foram detectados flavonóides glicosilados e polimetoxilados. O método também foi aplicado na análise de plantas com sintomas da doença Morte Súbita dos Citros (MSC). Neste mesmo contexto foram analisadas plantas sadias e com sintomas da doença Greening com o objetivo de monitorar moléculas derivadas do ácido benzóico como o ácido gentísico, orbicularina, ácido salicílico e ácido salicílico glicosilado (ácido β-O-D glucosilsalicilico). Um outro estudo realizado neste trabalho tratou do isolamento e identificação das micotoxinas alternariol (AOH) e alternariol monometil éter (AME), além do ácido tenuazônio, produzidas in vitro pelo microrganismo fitopatogênico de citros Alternaria alternata. A produção destas micotoxinas foi monitorada através de HPLC-DAD ao longo de trinta dias de cultivo do microrganismo com a finalidade de construir uma curva de produção destas moléculas. Validou-se também um método usando HPLC-MS/MS para quantificar as micotoxinas AOH e AME nas cascas de tangerina (albedo e flavedo) com sintomas de mancha marrom de alternaria (MMA), onde encontrou-se 17.4 ± 1.0 μg/kg de AOH e 3.5 ± 0.2 μg/kg de AME no flavedo de tangerina. Por fim, foram realizados ensaios de inibição do fungo fitopatogênico de citros Guignardia citricarpa, causador da doença pinta preta, através do método de germinação de esporos em placa de poliestireno. As substâncias que apresentaram praticamente 100% de inibição foram dois derivados do ácido benzóico, o ácido 3,4,5-trimetoxibenzóico e o ácido 3,4-dimetoxibenzóico, e os flavonóides glicosilados naringina e rutina. Essas quatro substâncias, na concentração de 500 μg/mL, foram capazes de inibir por completo a germinação dos esporos de G. citricarpa.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2186.pdf: 7582063 bytes, checksum: 715da59653caf8b9238d64f51054ac22 (MD5) Previous issue date: 2008-12-05 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work present the development and application of methods by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) to the quality control of vegetable samples known as stone breaker , that correspond to Phyllanthus species, two of them entered in Brazilian Pharmacopoeia: P.niruri L. and P. tenellus Roxb. A chromatographic profile analytical method was developed and validated, using HPLC with diode array detection (DAD), for the analysis of aqueous extracts of Phyllanthus authentic samples, which consisted of six species grown under controlled conditions in two different sites (Campinas and São Carlos, Brazil) and also not cultivated samples, collected in 27 cities of São Paulo state. Chemometric methods of exploratory analysis were used to interpret the chromatographic informations, such as Principal Component Analysis (PCA) and Hierarquical Cluster Analysis (HCA). Classification models (SIMCA, KNN e PLS-DA) were developed and validated and demonstrated that the Phyllanthus species can be differentiated from each other through their chromatographic profiles and multivariate analysis. The chromatographic method was applied in the analysis of 25 stone breaker commercial samples and their authenticity was determined by the classification models: the results showed that most products are produced with the P. tenellus species, although they are marketed as P. niruri; two samples was determined as adulteration since they were not classified as any Phyllanthus species. A chemical marker was purified by semi-preparative HPLC-UV from the crude aqueous extract of P. niruri specie; spectroscopy characterization determined its structure as corilagin, an hydrolisable tannin. An analytical method by HPLC-UV was developed and validated for quantification of this marker in extracts of Phyllanthus species and stone breaker commercial samples. For the cultivated samples, there was significant variability in the concentration of corilagin according to the place of cultivation and the time of year; among the non-cultivated P. tenellus samples, there was large differences in the marker concentration, result of the influence of different habitats in secondary metabolism of the plant. The corilagin quantification therefore was not feasible to determine the authenticity/quality of commercial samples, but can be used in the monitoring of Phyllanthus cultivated species. In two commercial samples the marker was not detected, which characterized as adulterated samples of stone breaker . / O presente trabalho apresenta o desenvolvimento e aplicação de métodos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) para o controle de qualidade de amostras vegetais conhecidas como quebra-pedra , que correspondem a espécies do gênero Phyllanthus, duas delas inscritas na Farmacopéia Brasileira: P.niruri L. e P. tenellus Roxb. Um método analítico de perfil cromatográfico foi desenvolvido e validado, utilizando CLAE com detecção por arranjo de diodos (DAD), para a análise de extratos aquosos de amostras autênticas de Phyllanthus, que consistiram de seis espécies cultivadas sob condições controladas, em dois diferentes locais (Campinas e São Carlos/SP, Brasil) e também de amostras não cultivadas, coletadas em 27 municípios do estado de São Paulo. Para a interpretação das informações cromatográficas, métodos quimiométricos de análise exploratória foram utilizados: Análise de Componentes Principais (PCA) e Análise de Agrupamentos Hierárquicos (HCA). Modelos quimiométricos de classificação (SIMCA, KNN e PLS-DA) foram elaborados e validados e demonstraram que as espécies de Phyllanthus podem ser diferenciadas entre si através de seus perfis cromatográficos e análise multivariada. O método cromatográfico foi aplicado na análise de 25 amostras comerciais de quebra-pedra e sua autenticidade foi determinada através dos modelos de classificação: os resultados demonstraram que a maior parte dos produtos é produzida com a espécie P. tenellus, embora sejam comercializados como P. niruri; para duas amostras foi determinada adulteração, uma vez que não foram classificadas como nenhuma espécie de Phyllanthus. Utilizando CLAE-UV semi-preparativa, um marcador químico foi purificado a partir do extrato aquoso bruto da espécie P. niruri; a caracterização espectroscópica determinou sua estrutura como sendo a corilagina, um tanino hidrolisável. Um método analítico por CLAE-UV foi desenvolvido e validado para a quantificação desse marcador em extratos de espécies de Phyllanthus e em amostras comerciais de quebra-pedra . Para as amostras cultivadas, verificou-se significativa variabilidade na concentração de corilagina em função do local de cultivo e da época do ano; entre as amostras não-cultivadas de P. tenellus, houve grandes diferenças na concentração do marcador, resultado da influência de diferentes habitat s no metabolismo secundário do vegetal. A quantificação de corilagina, portanto, não se mostrou viável na determinação da autenticidade/qualidade de amostras comerciais, porém pode ser utilizada no monitoramento de espécies cultivadas de Phyllanthus. Em duas amostras comerciais o marcador não foi detectado, o que as caracterizou como amostras adulteradas de quebra-pedra .

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3753.pdf: 9161600 bytes, checksum: 26887a20430e04deb54cb6b8e7360500 (MD5) Previous issue date: 2011-06-22 / Universidade Federal de Sao Carlos / The present work describes the study of variation in the chemical profile of citrus after inoculation of Xylella fastidiosa, in charge of the Citrus Variegated Chlorosis is one of the most serious diseases that cause damage in Brazilian citrus. The bacterium X. fastidiosa was inoculated in Citrus sinensis grafted on C. limonia and was evaluated using chemometric tools and development of analytical methods such as HPLC-DAD, LC-MS/MS, LC-UV-SPE-NMR and HRMAS quantitative variation of some secondary metabolites such as coumarins and flavonoids identified both in grafts and in the matrix C. sinensis and C. limonia. The chemometric methods PCA and HCA applied to the data obtained in studies by HPLC-DAD and HR-MAS allowed to discriminate plants contaminated with the bacteria of the species healthy, as well as the respective individuals. By analyzing the change in the chemical profile of citrus studied by HPLC-UV-SPE-NMR it was possible to detect the presence of a new class of secondary metabolites derived from p-hidroxy-cinnamic acid containing oxidized dihydropyran and dihydrofuran rings. Similarly, when analyzing the compounds of medium polarity by LC-MS/MS technique was identified, until now, in the roots and leaves several coumarins not cited in the literature for any of the species that constitute the graft, as dihydrosuberenol, 2 ', 3'-dihydrosuberosin, citrubutin the limonoid diosfenol limonin and flavonoid 3-hydroxy-3', 4 ',5,7,8- pentamethoxyflavone. Finally, was observed that coumarin bergapten is present in reasonable quantities only in the leaves of Rangpur lime, which is tolerant to X. fastidiosa, and when the graft presents with symptoms of citrus variegated chlorosis is a small production of this in their leaves, indicating that this is a phytoanticipin. / O presente trabalho descreve o estudo da variação do perfil químico de citros após a inoculação da bactéria Xylella fastidiosa, responsável pela Clorose Variegada do Citros (CVC) que é uma das mais sérias doenças causadoras de prejuízos na citricultura brasileira. Para isso, inoculou-se a X. fastidiosa em enxertos de C. sinensis sobre C. limonia e avaliou-se através de ferramentas quimiométricas e de desenvolvimento de métodos analíticos como HPLC-DAD, LC-MS/MS, LC-UV-SPE-NMR e HRMAS a variação quantitativa de alguns metabólitos secundários, como cumarinas e flavonóides identificados tanto nos enxertos quanto nas matrizes C. sinensis e C. limonia. As ferramentas quimiométricas PCA e HCA aplicadas aos dados obtidos nos estudos de HPLC-DAD e HR-MAS permitiram discriminar as plantas contaminadas com a bactéria das espécies sadias, assim como os respectivos indivíduos. Ao analisar a variação do perfil químico dos citros estudados através da HPLC-SPE-UVNMR foi possível detectar a presença de uma nova classe de metabólitos secundários derivados do ácido p-metoxicinâmico contendo anéis diidropirano e diidrofurano oxidados. Do mesmo modo, ao analisar os compostos de média polaridade, através da técnica de LC-MS/MS foi possível identificar, até o presente momento, nas raízes e folhas algumas cumarinas não citadas na literatura para nenhuma das duas espécies que constituem o enxerto, como diidrosuberenol, 2 ,3 -diidrosuberosina, citrubutina, o limonóide limonina diosfenol e o flavonóide 3-hidroxi- 3 ,4 ,5,7,8-pentametoxiflavona. Finalmente, observou-se que a cumarina bergapteno está presente em quantidade razoável apenas nas folhas do limão cravo, o qual é tolerante à X. fastidiosa, e quando o enxerto apresenta os sintomas da CVC há uma pequena produção desta em suas folhas, indicando ser esta uma fitoantecipina

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4201.pdf: 1105695 bytes, checksum: 41c82e2e434b34f67fdaecb9396797d9 (MD5) Previous issue date: 2011-09-30 / Universidade Federal de Sao Carlos / This thesis aimed the fractionation of metalloproteins in beef samples. To this purpose initially it was proposed a method for extraction of proteins using the sample extractor in buffered alkaline medium and surfactant solutions. After optimization were observed approximately 85% extraction efficiency and r.s.d. < 5%, showing the efficiency, reproducibility, simplicity and velocity of the method. After that, the experimental conditions for the fractionation of metalloproteins were evaluated. High performance liquid chromatography (HPLC) and polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) were used for physical-chemical separation and mass spectrometry and optical emission inductively coupled argon plasma (ICP OES and ICP-MS, respectively) as detection methods. The analytes Ca, Cu, Fe, Mg and Zn were evaluated; however, Mg was not detected in any condition of the study. To obtain a condition of appointment of detection for the other four elements, it was chosen to use less energy plasma conditions in ICP-MS (cool plasma), in order to avoid isobaric interference emanating from the plasma when the determination of the elements Ca and Fe. Finally, samples of meat with different maturation stages were analyzed by PAGE and HPLC-ICP-MS. Approximately 17 protein bands could be observed by PAGE and the band of 43 kDa was the more intense. Some peaks were detected for each element by HPLC size exclusion. All items showed at least a fraction above the dead volume of the column, Fe and Zn, and this fraction, also showed a fraction of 17 and 27 kDa respectively. / Esta tese teve como principal objetivo o fracionamento de metaloproteínas em amostras de carne bovina. Para isso, inicialmente foi proposto um método para extração de proteínas nas amostras de interesse utilizando extrator em meio alcalino tamponado e o emprego de surfactantes. Após otimização foram observados aproximadamente 85 % de eficiência de extração e d.p.r. < 5%, demonstrando ser eficiente e reprodutível, além de ser um método simples e rápido. A seguir foram avaliadas as condições experimentais de análise para o fracionamento das metaloproteínas. Foram empregadas cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) e a eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) como técnicas físico-químicas de separação e espectrometria de massa e de emissão óptica com plasma de argônio indutivamente acoplado (ICP-MS e ICP OES, respectivamente) como métodos de detecção. Os analitos monitorados foram Ca, Cu, Fe, Mg e Zn, contudo, o Mg não foi detectado em nenhuma das condição estudadas. Para a obtenção de uma condição de compromisso de detecção para os outros 4 elementos, optou-se por utilizar condições de plasma menos energéticas em ICP-MS ( cool plasma), como forma de se evitar interferências isobáricas provindas do plasma quando da determinação dos elementos Ca e Fe. Por fim, amostras de carne com diferentes períodos de maturação foram avaliadas por PAGE e HPLC-ICP-MS. Aproximadamente 17 bandas protéicas puderam ser observadas por PAGE, sendo a banda de 43 kDa a mais intensa. Alguns picos foram detectados para cada elemento por cromatografia líquida por exclusão de tamanho. Todos os elementos apresentaram pelo menos uma fração acima do volume morto da coluna. O Fe e o Zn, além dessa fração, apresentaram também uma fração de 17 e 27 kDa, respectivamente.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4713.pdf: 7322193 bytes, checksum: d831b04a382a378ad337ae269de61986 (MD5) Previous issue date: 2012-05-25 / Universidade Federal de Minas Gerais / Different types of preparative chromatography techniques were applied to the enantiomeric purification of a series of chiral drugs. The efficiency of multicolumn chromatography with variable zones (VARICOL®) process and also the application for the resolution of drugs modafinil, atenolol and albendazole sulfoxide were investigated and is fully discussed in this work. The initial conditions for the separations were determined by theoretical simulation, using the software HELP 10.3 by Novasep®. For the modafinil separation, different feed concentrations were evaluated for the same zone distribution and period. The most efficient process provided 96.0% of enantiomeric purities for both enantiomers with a production rate of 2.24 g/dia. The enantiomers of albendazole sulfoxide were separated by the VARICOL® process, and the enantiomeric purities obtained were of 99.5% and 99.0% for rafinate and extract, respectively, with a production rate of, approximately, 2.0 g/dia. For both developed method, the mobile phase used was exclusively methanol, which was recovered around 95 %. Atenolol was efficiently enantiorresolved by CHIRALCEL OD®, however, the enantiomers were not obtained with high purities by the VARICOL® process due to their low solubility in the mobile phase and the high cycle time. This work describes also, for the first time, the absolute configuration of albendazole sulfoxide as (&#8722;)-(S) and (+)-(R)- enantiomers.To this end, vibrational circular dichroim and theoretical calculations were applied. The albendazol sulfoxide enantiomers were used for In Vitro tests against Taenia Solium cysts, the macroscopic, the microscopic and the biochemical behavior for the cysts were evaluated; (+)-(R)-albendazole sulfoxide was the enantiomer with the highest anthelmintic effect. Elution chromatography was used for the resolution of 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA) and omeprazole. MDMA was separated by the use of recycling in mass overload conditions, enantiomeric purities of 99.0% and 96.0% were obtained for (R)-(-)- and (S)-(+)- MDMA, respectively, with production rate of 40.0 mg/mL. Racemic MDMA and both enantiomers were used to evaluate oxidative stress status parameters. The enantiomers showed distinct effects in the liver redox state with the (R)-(&#8722;)- enantiomer being the responsible for the highest oxidative damage. For omeprazole separation, stack injections with mass overload was used, a production rate of 1.10 g/dia and high enantiomeric purities (99.0%) were attained and for this process, furthemore the mobile phase was totally recycled. / Diferentes técnicas cromatográficas em escala preparativa foram aplicadas para a purificação de misturas enantioméricas. O estudo da eficiência do processo de cromatografia multicoluna com comprimento de zona variável (VARICOL®), assim como sua aplicação para a separação dos fármacos modafinil, atenolol e albendazol sulfóxido são descritos neste trabalho e os resultados obtidos são detalhadamente discutidos. As condições iniciais de operação foram ajustadas através da simulação teórica no programa HELP 10.3 (Novasep®). Para a separação do modafinil, diferentes concentrações de alimentação foram avaliadas, para uma mesma configuração de zonas e período. O método mais eficiente desenvolvido para este fármaco proporcionou purezas enantioméricas de 96,0% para ambos enantiômeros, com taxas de produção acima de 2,24 g/dia. O albendazol sulfóxido foi eficientemente separado pelo processo VARICOL®, obteve-se purezas enantioméricas de 99,5% e 99,0% para o refinado e extrato, respectivamente, com taxa de produção de, aproximadamente, 2,0 g/dia. Em ambos os procedimentos a fase móvel composta por 100% de metanol foi recuperada em 95,0%. O atenolol foi enantiorresolvido, de maneira eficiente, pela coluna CHIRALCEL OD®, a baixa solubilidade deste composto na fase móvel e o longo tempo de ciclo, impossibilitou a obtenção de seus enantiômeros com altas purezas pelo processo VARICOL®. Os enantiômeros puros do albendazol sulfóxido foram submetidos a teste sobre cistos de Taenia Solium, o comportamento macroscópico, microscópico e bioquímico dos céstodos foi avaliado e, de maneira geral, o (+)-albendazol sulfóxido teve maior efeito anti-helmíntico. A configuração absoluta do centro estereogênico dos enantiômeros do albendazol sulfóxido foi determinada pela primeira vez, para isso utilizou-se dicroísmo circular vibracional e cálculos teóricos. A cromatografia de eluição foi utilizada para a resolução dos enantiômeros do MDMA e do omeprazol. O ecstasy foi enantiorresolvido com reciclo em condições de sobrecarga de massa, obteve-se boas purezas enantioméricas - 99,0% para o (R)-(-)-MDMA e 96,0% para o (S)-(+)-MDMA e taxa de produção de 40,0 mg/mL. Os enantiômeros do MDMA foram utilizados em testes de estresse oxidativo, apresentando diferente comportamento. Para o isolamento dos enantiômeros puros do omeprazol, utilizouse injeções do tipo stack com sobrecarga de massa, taxa de produção de 1,10 g/dia, alta purezas enantioméricas para ambos enantiomêros (acima de 99,0 %) e o uso de fase móvel totalmente reciclada são atrativos deste procedimento.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5327.pdf: 3614226 bytes, checksum: 2b258357050da3177584310ef5f5ac3a (MD5) Previous issue date: 2013-05-03 / Universidade Federal de Sao Carlos / The development of ligand screening assays plays a very important role in the discovery of biologically active compounds. In this context, the use of immobilized capillary reactors has been adopted as a new technique for high throughput screening assays, which furnishes high selectivity, reproducibility. This work describes the covalent immobilization of electric fish (Electrophorus electricus) and human acetylcholinesterases (AChE) on fused silica capillaries and magnetic beads. The selected enzyme acts on the central nervous system and is a validated target for the treatment of Alzheimer s disease as for new insecticides. Zonal chromatography with the acetylcholinesterase capillary bioreactors was employed to determine kinetics constants, to a ligand screening assay of 79 compounds, and to inhibition mechanisms determination of the 05 identified ligands. A new approach to the screening of natural product extracts was developed based on ligand fishing experiments and zonal chromatography. For that, the magnetic beads were used for the ligand fishing experiments and capillary bioreactors for the activity assays. The later was employed also under nonlinear condition to determine the affinity constant of the fished ligand. This work reports also the identification by a solution assay of a new acetylcholinesterase substrate and, the studies by zonal bioaffinity chromatography to identify the bi-substrate mechanism. / O desenvolvimento de ensaios para a triagem de ligantes é de grande importância para a descoberta de compostos biologicamente ativos. Neste contexto, o emprego de biorreatores enzimáticos tem sido adotado em ensaios em massa para triagem de ligantes, uma vez que possuem elevada seletividade com alta reprodutibilidade e produtividade. Este trabalho descreve a imobilização covalente da acetilcolinesterase de peixe-elétrico (Electrophorus electricus) e humana em capilares de sílica fundida e partículas magnéticas. A enzima selecionada justifica-se uma vez que atua no sistema nervoso central e é um alvo validado para o tratamento da doença de Alzheimer e desenvolvimento de inseticidas. Os biorreatores capilares de acetilcolinesterase foram empregados por cromatografia zonal para determinação das constantes cinéticas, e também para a triagem de 79 compostos com determinação do mecanismo de ação dos 05 ligantes identificados. Um novo modelo de triagem de extratos de produtos naturais foi desenvolvido usando os biorreatores de partículas magnéticas para pescar ligantes e os biorreatores capilares para determinar o percentual de atividade. O uso dos biorreatores capilares em cromatografia zonal não-linear permitiu caracterizar a afinidade do ligante selecionado. Este trabalho reporta também, um novo substrato identificado através de ensaios em solução para a acetilcolinesterase e, os estudos por cromatografia zonal de bioafinidade, para o mecanismo bi-substrato.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:34:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6024.pdf: 16349859 bytes, checksum: 7382f8d4bf5a05fb4df9d51d782682b1 (MD5) Previous issue date: 2013-12-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work describes the results obtained from studies carried out to quantify phenyl-&#946;-D-glucuronide (FG) and nitrophenyl-&#946;-D-glucuronide (NFG) in human urine by direct injection sample using LC-MS/MS system. The columns RAM-BSA SAX and RAM-BSA C8 were prepared and evaluated in relation to their exclusion capability of urine macromolecules and retention capability of FG by direct injection samples. Both columns presented good retention capability for glucuronide, however, the RAM-BSA SAX column was more efficient in exclusion since this column did not have any interferences eluting after the exclusion time. However, the RAM-BSA SAX column can not be used for FG quantification by LC-MS/MS because the chromatographic condition of this column presented high buffer concentration (40 mM ammonium formate), which resulted in total suppression of the FG signal. Therefore, the column RAM-BSA C8 was selected for the development of the methods. In this study we evaluated triple quadrupole (QqQ) and ion trap (IT) mass spectrometry for both selected glucuronides. It was not possible to obtain selectivity in the analytical conditions developed using UHPLC-QqQ. When we used the IT analyzer, we obtained selectivity in a multidimensional mode for the FG using the column RAM-BSA C8 in the first dimension and the column Ascentis Express F5 in the second dimension. For the NFG we achieved selectivity in a unidimensional mode. The figures of merit obtained with external standarization calibration curve with spiked pooled urines were accurate and precise. For FG, the LQ and LD were 1.0 &#956;g/mL and 0.5 &#956;g/mL, respectively, and to NFG, the LQ and LD were 4.0 &#956;g/mL and 3.0 &#956;g/mL. For the method application we adopted calibration by standard addition to minimize the individual differences between urine donors. To all six toxicological samples analyzed, just one exceeded the regulatory limits for urinary phenol. For NFG, there were no toxicological samples available, thus the method was applied in spiked samples in the laboratory. / Este trabalho descreve os resultados obtidos nos estudos feitos para quantificar fenil-&#946;-D-glucuronídeo (FG) e nitrofenil-&#946;-D-glucuronídeo (NFG), em urina humana por injeção direta de amostra, utilizando-se sistemas LC-MS/MS. Para injeção direta de amostras, as colunas RAM-BSA SAX e RAM-BSA C8 foram preparadas e avaliadas em relação à capacidade de exclusão das macromoléculas da urina e à capacidade de retenção do FG. Ambas as colunas apresentaram boa capacidade de retenção para o glucuronídeo, no entanto, quanto à exclusão, a coluna RAM-BSA SAX mostrou-se mais eficiente, visto que nesta coluna não houve eluição de interferentes, após o tempo de exclusão. Porém, a coluna RAM-BSA SAX não pode ser utilizada para a quantificação de FG por LCMS/ MS, pois as condições cromatográficas estabelecidas para esta coluna envolveram alta concentração de tampão (formiato de amônio 40 mM), o que acarretou na supressão total do sinal referente ao FG. Portanto, a coluna RAMBSA C8 foi selecionada para o desenvolvimento dos métodos. Neste trabalho avaliaram-se os analisadores do tipo triplo quadrupolo (QqQ) e ion trap (IT) para ambos os glucuronídeos estudados. Nas condições analíticas desenvolvidas utilizando-se UHPLC-QqQ, não foi possível se obter seletividade. Quando o IT foi utilizado como analisador, a seletividade foi obtida no modo multidimensional para o FG, utilizando-se a coluna RAM-BSA C8 na primeira dimensão e a coluna Ascentis Express F5 na segunda dimensão, e no modo simples para o NFG. As figuras de méritos obtidas por padronização externa, a partir de uma curva construída fortificando-se um pool de urinas, foram exatas e precisas, com LQ de 1,0 &#956;g/mL e LD de 0,5 &#956;g/mL, para FG, e LQ de 4,0 &#956;g/mL e LD de 3,0 &#956;g/mL, para o NFG. Para aplicação dos métodos, a calibração por adição de padrão foi adotada para contornar as diferenças individuais entre as urinas dos doadores. Das seis amostras toxicológicas analisadas, uma amostra ultrapassou o valor de referência da normalidade para fenol urinário. Para o NFG, na ausência de amostras toxicológicas, o método foi aplicado em amostras-padrão preparadas no laboratório.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1927.pdf: 15439861 bytes, checksum: a37ec11edf9b18931913f9fd214dc363 (MD5) Previous issue date: 2007-03-15 / Financiadora de Estudos e Projetos / The relative retention and enantioselectivity of a homologue series constituted by five benzimidazoles, K+/H+ - ATPase pump inhibitors, was determined for three amylose tris-phenylcarbamate chiral stationary phases (CSP), under reverse and normal phase modes of elution, using ethanol as a organic modifier. It was verified similar retention profiles for the benzimidazoles homologue series on the three evaluated chiral phases, under reversed mode of elution. The switch between reversed to polar organic mode of elution, under same conditions of reversed mode, and even with a percentage of water, in the mobile phase, around 15% it is clearly observed and discussed. Also, the benzimidazoles series retention profiles on three chiral columns were similar when in the normal elution mode. However, a switch from normal to polar organic mode is slow, indicating that retention/separation mechanisms, that operate in both elution modes, are very comparable. The discrimination chiral capacity of these stationary phases was differentiated when ethanol was used as organic modifier on three elution modes. The amylose tris (3,5 dimethylphenylcarbamate) phase (CSP-2) showed high resolution (Rs) power (0.90 ¡Ü Rs ¡Ü 3.46 and 1.25 ¡Ü á ¡Ü 2.24) for omeprazole enantiomers on the three elution modes. The amylose tris [(S)-phenyethyllcarbamate) phase (CSP-3), in turn, display resolution capacity for all series of homologous enantiomers in normal mode of elution. Herein, it was established for first time a relation between normal and reversed elution mode through the isoelution point determination. Under the same percentage of ethanol, in normal mode, and water in reversed mode, the retentions are similar, when polysaccharides phases are used as chiral selectors. The enantiomeric separations of enantiomers series were carried out in multimilligram scale, and the determination of its elution order was evaluated in the three elution modes. The omeprazole enantiomers separation was performed in multimilligram scale, as a model, using the solid-phase injection technique. The results were compared with those obtained from the separation by means of classical volume injection of sample. These results are presented and discussed. / A retenção relativa e a enantiosseletividade de uma séria homóloga de cinco benzimidazóis, inibidores da bomba K+/H+-ATPase, foram determinados em três fases quirais de tris-fenilcarbamatos de amilose, no modo reverso e normal de eluição, utilizando etanol como modificador orgânico. Foram verificados perfis de retenção similares para a série homóloga de benzimidazóis, nas três fases quirais avaliadas no modo reverso de eluição. A passagem do modo reverso para o modo polar-orgânico de eluição, mesmo sob condições de modo reverso, e ainda com porcentagem de água, na fase móvel, em torno de 15% é claramente observada e discutida. Os perfis de retenção da série de benzimidazóis nas três colunas quirais também foram similares quando a eluição foi no modo normal. Entretanto, a mudança do modo normal para o modo polar-orgânico é lenta, indicando que os mecanismos de retenção/separação, que operam nos dois modos de eluição, são mais próximos. A capacidade de discriminação quiral destas fases estacionárias foi diferenciada quando se utilizou etanol como modificador orgânico nos três modos de eluição. A fase tris (3,5 dimetilfenilcarbamato) de amilose (CSP-2) mostrou alto poder de resolução (0,90 . Rs . 3,46 e 1,25 . &#945; . 2,24) para os enantiômeros do omeprazol nos três modos de eluição. A fase tris [(S)-feniletilcarbamato] de amilose (CSP-3.1), por sua vez, apresentou capacidade de resolução para todos os enantiômeros da série homóloga no modo normal de eluição. Neste trabalho, foi estabelecida, pela primeira vez, uma relação entre o modo normal e reverso de eluição através da determinação do ponto de isoeluição. Numa mesma porcentagem de etanol, no modo normal, e de água, no modo reverso, as retenções são similares, quando se utilizam as fases de polissacarídeos como seletores quirais. Foram realizadas as separações enantioméricas dos enantiômeros da série em escala multi-miligramas, e a determinação da ordem de eluição dos mesmos foi avaliada nos três modos de eluição. A separação dos enantiômeros do omeprazol foi feita em escala multi-miligrama, como modelo, usando a técnica de injeção em fase sólida. Os resultados foram comprados com os obtidos da separação utilizando o modo clássico de injeção de amostras. Estes resultados são apresentados e discutidos.

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1979.pdf: 2208972 bytes, checksum: e233199cf0f55587baf4e545b627b83a (MD5) Previous issue date: 2008-08-27 / Universidade Federal de Minas Gerais / This work reports the quantification of NADH formed by an immobilized enzyme reactor (IMER) of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) of T. cruzi using multidimensional high-performance liquid chromatography. For this, The IMER was used in the first dimension while an analytical C8 column was used in the second dimension. The conditions of the pre-treatment of the fused silica capillary tubes and the covalent immobilization of the enzyme into the capillary were successfully optimized, resulting in increased enzymatic activity and stability. Kinetic studies for the T. cruzi GAPDH-IMER were carried out to verify the influence of the immobilization over the enzyme affinity for the substrate and cofactor. The kinetic results for the IMERs of human and parasite GAPDH enzymes were compared to those obtained with the enzymes in solution, and showed that the covalent immobilization method used affected mainly the affinity of the human enzyme for the substrate. The human and parasite GAPDH-IMERs were employed for the ligand screening. The ligands recognized by the IMERs were the same identified by the enzymes in solution, showing that the immobilized enzymes kept the ability of recognizing the activity compounds modulators. The IMERs demonstrated to be a useful tool also for inhibitors binding reversibility characterization. In view of the high costs and difficulties involved on enzyme purification, the methods described in this work represents a valuable way of preserving enzyme activity and carrying out a variety of biochemical experiments. / Este trabalho descreve a quantificação do NADH formado pela reação do biorreator da enzima gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH) de T. cruzi usando cromatografia liquida de alta eficiência multidimensional. Para isto, o biorreator foi usado na primeira dimensão e uma coluna analítica C8 na segunda dimensão. As etapas de pré-tratamento dos capilares de s&#21248;ica fundida e da imobilização covalente da enzima, neste suporte, foram otimizadas com sucesso, resultando no aumento da atividade e da estabilidade da enzima. Os estudos cin&#39425;icos para a enzima GAPDH-Tc imobilizada foram realizados para verificar se o método de imobilização empregado afetou a afinidade da enzima pelo substrato ou cofator. Os resultados obtidos com os biorreatores das enzimas GAPDH-Tc e humana foram comparados &#28722;ueles obtidos com as enzimas em solução, e evidenciaram que o método de imobilização covalente afetou principalmente a afinidade da enzima humana pelo substrato. Os biorreatores das enzimas do parasita e humana foram empregados para a triagem de ligantes. Os ligantes reconhecidos pelos biorreatores foram os mesmos identificados pelas enzimas em solução, evidenciando que a enzima imobilizada reteve a capacidade de reconhecer os compostos capazes de modular a atividade enzim&#30136;ica. Os biorreatores mostraram-se uma ferramenta &#20544;il na caracterização dos inibidores quanto &#12539;reversibilidade da ligação. Considerando os altos custos e as dificuldades envolvidas na purificação de enzimas, os procedimentos descritos neste trabalho representam um valioso método para preservar a atividade enzim&#30136;ica e para a realização de uma variedade de ensaios bioquímicos.