Orientador: Marcos Hikary Toyama / Resumo: A giroxina é a principal serino protease encontrada no veneno total de Crotalus durissus terrificus. As serino proteases de veneno de serpentes são proteínas que apresentam uma grande similaridade estrutural com a trombina humana incluindo a alta conservação do sitio catalítico. Os resμltados já obtidos pelo nosso grupo revelaram a capacidade dos flavonoides glicosilados de Laguncularia racemosa em reduzir de forma significativa a atividade enzimática das trombinas humanas. A identificação destas molécμlas revelou que dois flavonoides glicosilados (quercetina-3-O-arabinosidio (QAra) e quercetina-3-O-ramnosidio (QRham)) respondem pela inibição da trombina (Rodrigues et al., 2015). Sabe-se que a soroterapia antiveneno não consegue neutralizar de forma eficiente a ação farmacológica das serino proteases e consequentemente não é capaz de neutralizar os danos homeostáticos e teciduais. Neste trabalho, uma nova serino protease foi isolada do veneno total de Crotalus durissus terrificus (cdtsp-2) através de quatro estapas de separação, usando a superdex 75 com uma fase móvel de bicarbonato de amônia pH 8, a cdtsp-2 Estas duas frações foram então fracionadas em coluna de troca iônica em DEAE para separação das principais frações e posteriormente fracionadas em CLAE de fase reversa para confirmar o grau de homologia molecular e em todas as etapas cromatográfica foram acompanhadas pelos ensaios enzimáticos em BApNA. A nova serino protease denominada como Cdtsp-2 (Crotalus durissus terr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Gyroxin is the major serine protease present in Crotalusdurissusterrificus venom. Serine proteases from snake venom are proteins, which exhibit a great structural similarity to hμMan thrombin including the catalytic site conservation. The resμlts already obtained by our group revealed the glycosylated flavonoidsability of Laguncμlariaracemosato significantly reduce the enzymatic activity of hμMan thrombins. The molecμles identification reveals two glycosylated flavonoids (quercetin-3-O-arabinosidiμM (QAra) and quercetin-3-O-rhamnosidiμM(QRham)), which inhibit thrombin (Rodrigues et al., 2015). Antivenomserotherapycan not efficiently neutralize the serine proteases pharmacological action and is not able to neutralize homeostatic and tissue damage. In this work, a new serine protease was isolated from Crotalusdurissusterrificusvenom (cdtsp-2) by throμgh four separation stages , using superdex 75 with a mobile phase of ammoniμM bicarbonate pH 8. These two fractions were fractionated on ion exchange colμMn in DEAE for separation of the major fractions and subsequently fractionated in reverse phase CLAE to confirm the degree of molecμlar homology.All chromatographic steps were monitored by the enzymatic assays in BApNA. The new serine protease called cdtsp-2 (Crotalusdurissusterrificus serine protease 2) is an unpublished protein, with a molecμlar mass of 27 kDa and its N-terminal sequence showed structural differences when compared to the gyroxin of Crotalusdurissusterrificus. Re... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:55Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-08Bitstream added on 2014-06-13T20:10:06Z : No. of bitstreams: 1 oliveira_dgl_me_sjrp.pdf: 2024541 bytes, checksum: 9e617f882421a4dd2f2cc715da6fb79f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Toxins isolated from vemos have been used as molecular tools to understand many physiological processes. The enzymes isolated from the venoms of Crotalus and Bothrops species interfere with the control and balance of the hemostatic system (PEREZ et al., 1996) and thus, the determination of their structures is potentially very important. These enzymes are serine proteinases that are similar to tyrpsin in their specificity but are generally referred to as thrombin-like enzymes due to their ability to cleave fibrinogen. The principal aim of this project was to isolate and characterize snake venom poteins that inetefere with the control and regulation of the hemostatic system in quantities and purity required for structural studies. Gel filtration, ion-exchange and HPLC chromatographic techniques were used to isolate convulxin, crotoxin, giroxin and crotamine, the principle components from the venoms of Crotalus durissus collineatus and Crotalus durissus terrificus and the serine and metalo proteinases from the venom of Bothrops jararaca. The purity of the samples was evaluated by SDS-PAGE and the specific activity of the samples was determined. Crystallization experiments were then carried out.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6572.pdf: 3046018 bytes, checksum: a72ab59cf0526c45a9dee765c02c9f7c (MD5) Previous issue date: 2014-12-18 / Financiadora de Estudos e Projetos / The Sarcoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA), phospholamban (PLB) and the Na+-Ca2+ exchanger (NCX) proteins are essential for the cardiac calcium management and myocardial contractility in vertebrates. The increase in metabolic rate generated from mechanical and physiological process of digestion is known as specific dynamic action (SDA) and represents the energy cost of processing, digestion and absorption of food. In several groups of reptiles, feeding generates a rapid increase in rates of gas exchange, whose peak usually occurs one or two days after feeding, before suffering a slower decline and returning to preprandial values. Ingestion of large quantity of food demands a metabolic elevation and leads to indemnities related in ventricular mass and an increase in myocardial force contraction, avoiding an overload on the cardiovascular system. During the fasting, depletion of body mass occurs and it can also reach the heart muscle. To describe the importance and the changes in SERCA2, PLB and NCX proteins on the effects of feeding/digestion in reptiles broad-snouted caiman (Caiman latirostris), burmese phyton (Python molurus) and also by prolonged fasting in South-American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus) Western blotting technique was used. We observed the homology existence between the proteins of reptiles in relation to mammals. The SDA increased expression of SERCA2 protein in three species of reptiles. The SDA can also have unduced the expression of an isoform and/or reduced phosphorylation at some active sites of SERCA2 in ventricular tissue of P. molurus. A direct relationship between the expression of SERCA2 with the PLB expression in C. durissus was observed. However in P. molurus and C. latirostris this relation does not exist. The three reptiles expressed the PLB with molecular mass of 50 kDa, whereas the mouse expressed 25 kDa. The vast evolutionary distance that separates mammals of reptiles may have caused the rise of isoforms between these groups, explaining this difference. The increased expression of NCX along with lower expression of SERCA2 and PLB in C. durissus in food group Fasting compared to the other two groups suggests a higher calcium mobilization in this feeding regime, which would be advantageous from the energy point of view. The expression of NCX with different molecular mass between the three species, a smaller number of consensus regions with the animals phylogenetically more distant and the great plasticity of NCX gene to form distinct proteins, suggest the expression of proteins isoforms with the reptiles studied in this research. / As proteínas Ca2+-ATPase do Retículo Sarcoplasmático (SERCA2), Fosfolambam (PLB) e o Trocador Na+/Ca2+ (NCX) são fundamentais para o manejo do cálcio e a contratilidade miocárdica nos vertebrados. A elevação da taxa metabólica gerada a partir dos processos mecânicos e fisiológicos da digestão é conhecida como "ação dinâmica específica" (SDA) e representa o custo energético do processamento, digestão e absorção dos alimentos. Em vários grupos de répteis, a alimentação gera um rápido aumento nas taxas de troca gasosa, cujo pico ocorre geralmente um dia ou dois após a alimentação, antes de sofrer um declínio mais lento e retornar aos valores pré-prandiais. A ingestão de grandes massas de alimento demanda uma elevação metabólica e leva a uma compensação na massa ventricular e um aumento na força de contração do miocárdio, evitando uma sobrecarga no sistema cardiovascular. Durante o jejum ocorre depleção da estrutura corpórea podendo também atingir o músculo cardíaco. Para descrever a importância e as mudanças nas proteínas SERCA2, PLB e NCX diante os efeitos da alimentação/digestão nos répteis cascavel sul-americana (Crotalus durissus terrificus), na píton (Python molurus) e também do jejum prolongado no jacaré-de-papo-amarelo (Caiman latirostris), utilizada a técnica molecular Western blotting. Observou-se a existência de homologia entre as proteínas dos répteis com relação aos mamíferos. A SDA levou a uma maior expressão da proteína SERCA2 nas três espécies de répteis. A SDA também pode ter induzido a expressão de uma isoforma e/ou uma menor fosforilação em alguns sítios ativos da SERCA2 no tecido ventricular de P. molurus. Uma relação direta entre a expressão da SERCA2 com a expressão do PLB foi verificada somente em C. durissus, não havendo tal relação em P. molurus e C. latirostris. As três espécies de répteis expressaram o PLB com mesma massa molecular, de 50 kDa, e diferente da do rato, que é de 25 kDa. A grande distância evolutiva que separa os répteis dos mamíferos pode ter ocasionado o surgimento de isoformas entre esses grupos, explicando tal diferença. O aumento da expressão do NCX em C. latirostris do grupo alimentar Digestão sugere uma maior mobilização do cálcio e um maior inotropismo de forma frequência-específica através dessa proteína. A maior expressão do NCX juntamente com a menor expressão da SERCA2 e do PLB em C. durissus no grupo alimentar Jejum em relação aos outros dois grupos alimentares sugere uma maior mobilização do cálcio pelo NCX nesse regime de alimentação, o que seria vantajoso do ponto de vista energético. A expressão do NCX com diferentes massas moleculares entre as três espécies estudadas, um menor número de regiões conservadas em animais filogeneticamente mais distantes, e a grande plasticidade do gene da proteína NCX em formar proteínas distintas, sugere a expressão de proteínas isoformas nos répteis estudados.