Submitted by LAUDICÉIA ALVES DE OLIVEIRA null (laudiceias2me@hotmail.com) on 2017-08-24T14:12:10Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Laudicéia Alves de Oliveira CEVAP_UNESP.pdf: 2169254 bytes, checksum: 473bc1036ce9b9cddf2749344ac2b4c6 (MD5) / Approved for entry into archive by Luiz Galeffi (luizgaleffi@gmail.com) on 2017-08-25T14:32:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oliveira_la_me_bot.pdf: 2169254 bytes, checksum: 473bc1036ce9b9cddf2749344ac2b4c6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-25T14:32:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oliveira_la_me_bot.pdf: 2169254 bytes, checksum: 473bc1036ce9b9cddf2749344ac2b4c6 (MD5) Previous issue date: 2017-07-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O veneno de Crotalus durissus terrificus (Cdt), baseado no critério do perfil da cromatografia de exclusão molecular, pode ser descrito como sendo composto de quatro principais toxinas: Giroxina, Crotamina, Crotoxina e Convulxina. A crotoxina é uma neutoroxina, é um heterodímero não covalente, composta por duas subunidades: fosfolipase A2 (PLA2) e crotapotina (Ctp). A crotapotina constitui o componente da crotoxina que apresenta atividade anti-inflamatória além de ser chaperona de PLA2. Esta molécula é constituída por três cadeias peptídicas ligadas por pontes dissulfeto. Além disso, já foram descritas isoformas para a crotapotina. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método cromatográfico para isolar a crotapotina, separar suas cadeias e analisá-las por LC/MS e LC-MS/MS para análise proteômica e/ou seqüenciamento de novo e avaliação da possível existência de um padrão de variação nas substituições de aminoácidos. O método C8-RP-HPLC foi capaz de separar os componentes do veneno de Cdt que puderam ser identificados por espectrometria de massas, de acordo com a sua massa molecular. A crotapotina foi isolada, reduzida e alquilada e submetida à outra separação cromatográfica RP-HPLC (C18) para isolamento das subunidades alquiladas. Conforme descrito na literatura, a cadeia α da crotapotina é composta por 40 resíduos de aminoácidos, enquanto que a cadeia β possui 35 resíduos e a cadeia γ 14, pelo que as subunidades podem ser identificadas pelas suas massas moleculares. As análises das cadeias isoladas de crotapotina mostraram a presença de mais de uma molécula por fração, indicando a presença de isoformas no veneno. Análises proteômicas e sequenciamento de novo por LC-MS/MS elucidaram a existência de variações de resíduos de aminoácidos em tais cadeias. Estudos de atividade biológica poderão elucidar as diferenças que tais isoformas apresentam em suas características intrínsecas. / The Crotalus durissus terrificus venom (Cdt), based on molecular size chromatography, can be described as being composed of four main toxins: Giroxin, Crotamine, Crotoxin and Convulxin. Crotoxin is a neutoroxin, a non-covalent heterodimer composed of two subunits: phospholipase A2 (PLA2) and crotapotin (Ctp). Crotapotin is the component of crotaxin that has anti-inflammatory activity besides being a PLA2 chaperone. This molecule consists of three peptide chains linked by disulfide bonds. In addition, isoforms for crotapotin have been described. The objective of this study was to develop a chromatographic methodology to isolate a crotapotin, separate its chains and analyze by LC/MS and LC-MS/MS for proteomic analysis and/or de novo sequencing and evaluation of the possibility of a variation pattern amino acid substitutions. The C8-RPHPLC method was able to separate the Cdt venom components that could be identified by mass spectrometry, according to their molecular mass. The crotapotin was isolated, reduced and alkylated and subjected to another RP-HPLC (C18) chromatographic separation for isolation of the alkylated subunits. As described in the literature, the α chain of crotapotin is composed of 40 amino acid residues, while the β chain has 35 residues and the γ chain, 14, and thus the subunits can be identified by their molecular masses. The analyzes of isolated chains of crotapotin showed the presence of more than one molecule per fraction, indicating the presence of isoforms in the venom. Protein analyzes and de novo sequencing by LC-MS / MS elucidated a existence of variations of amino acid residues in such chains. Studies of biological activity are to elucidate how the differences that such isoforms present in their intrinsic characteristics.

Resumo: A administração de soros heterólogos de origem eqüina constitui o único tratamento para os acidentes ofídicos, porém estes são capazes de induzir reações de hipersensibilidade. Novos processos de hiperimunização em animais alternativos vêm sendo desenvolvidos, juntamente à ferramentas de destoxificação dos venenos e novas alternativas de adjuvantes. No presente trabalho, foi utilizado veneno de Crotalus durissus terrificus nativo (VN) e irradiado com Co60 (VIr), em quatro diferentes protocolos de hiperimunização, para uma avaliação quinzenal do perfil imunológico dos grupos de ovinos pela técnica de ELISA. Os animais foram avaliados clinicamente todos os dias e pesados a cada 14 dias. Ao final, foram inspecionados em frigorífico para aprovação de consumo e os rins, analisados histologicamente. Os soros obtidos foram avaliados quanto à capacidade de neutralização por meio de testes "in vitro". O momento quatro (M4) apresentou o maior nível de titulação nos quatro grupos, porém o G1, inoculado com VN associado ao adjuvante incompleto de Freund (AIF), apresentou o maior nível quando comparados com os demais grupos, inoculados com VN associado à sílica nanoestruturada SBA-15 (G2), VIrr associado ao AIF (G3) e VIrr associado a SBA-15. Não houve diferença estatística entre os grupos em relação ao ganho de peso. Apenas um animal apresentou lesão no local de aplicação. Todos as carcaças obtiveram um carimbo de aprovação para consumo do Serviço de Inpeção Federa (SIF)l. Não houve alterações histológicas renais características de envenenamento crotálico. Os soros produzidos pelos quatro grupos foram capazes de neutralizar o efeito letal do veneno de Crotalus durissus terrificus, observados pelos testes de neutralização. O protocolo convencional de imunização utilizado no grupo um (G1) mostrou-se mais eficiente na neutralização do efeito letal quando comparados com os demais protocolos. / Abstract: The administration of heterologous antivenoms raised in horses is considered the only treatment for envenoming by venomous animals. However, it causes hypersensitivity reactions. New hyperimmunization processes in alternatives animals have been developed, associated to detoxication of venoms an new alternatives of adjuvants. In the present study it was used the natural (NV) and Co- 60-irradiated (IrrV) Crotalus durissus terrificus venom, in four differents protocols for a evaluation every fifteen days of the immunological response of the four ovine groups by the ELISA test. The clinical evaluation of the animals was performed and the weigth obteined every fourteen days, submited to a frigorific inspection and histological kidneys analysis. The neutralization capacity of the serum produced was evaluated in "in vitro" test. The fourth moment presented the major titles for all groups. However, the first group (G1), inoculated with NV associated with Freund's incomplet adjuvant (FIA) and aluminiun hidroxide presented the major titles when compared with the other ones, inoculated with NV associated to SBA-15 (G2), IrrV associated with FIA (G3) and IrrV associated with SBA-15 (G4). There was no estatistic difference between the groups concerning the weigth analysis. Only one animal presented lesion at the inoculation site. All the carcass obtained the consume aprovation stamp of the Federal Inspection Service (FIS). There was no kidney lesions on histological analysis. The four serum produced were able to neutralize the letal effect of Crotalus durissus terrificus venom, showed by the neutralization test. The convencional immunization protocol used for the first group (G1) showed more efficient neutralization capacity when compared with the others groups. / Orientador: Benedito Barravieira / Coorientador: Rui Seabra Ferreira Junior / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca: Nancy do Nascimento / Mestre

Os venenos de serpentes contém uma mistura complexa de toxinas (proteínas e enzimas) que destroem os processos bioquímicos ou fisiológicos da presa. A crotamina é um dos principais componentes do veneno da cascavel Sul Americana Crotalus durissus terrificus. Essa proteína pertence à família dos polipeptídeos miotóxicos de baixo peso molecular (SBMPs). Uma importante atividade da crotamina é a habilidade de penetrar rapidamente em células proliferamente ativas, podendo ser usada como nanocarreadora, levando DNA plasmidial e drogas para dentro de células tumorais. Outra atividade interessante desta toxina é a indução de morte celular dose dependente em células cancerígenas proliferamente ativas sem prejudicar células normais, demonstrando promissora atividade anticâncer. A crotamina apresenta forte atividade antifúngica e moderada atividade contra procariotos, age bloqueando canais de potássio dependente de voltagem, sendo seletiva para os canais Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3, e induz paralisia dos membros posteriores de camundongo. Dada a importância das atividades da crotamina, a toxina foi usada para produzir na forma recombinante. De forma geral, as toxinas animais são peptídeos secretados para o lúmen da glândula de veneno e são ricos em pontes dissulfeto, comumente expressas em sistemas procarióticos na forma de corpúsculos de inclusão ou em sistemas de expressão periplasmática. Foram construídos três genes sintéticos, um para a expressão em citoplasma e dois para a expressão em periplasma bacteriano utilizando o vetor pRSET-A (Invitrogen ®). Para a expressão de crotamina em citoplasma bacteriano, a região do DNA que codifica a região do peptídeo maduro foi clonada em fusão com uma cauda simples de 6 x His separada por uma seqüência codificante do sítio de clivagem de enterokinase em substituição à proteína de fusão do vetor comercial pRSETA. Para a expressão em periplasma a região codificante da crotamina madura foi clonada sob o controle da seqüência sinal da OmpA de E. coli. Todos os códons raros da crotamina madura foram otimizados de acordo com os códons preferenciais de E. coli. Em uma das construções para a expressão em periplasma, além da crotamina madura, o peptídeo sinal de OmpA também teve seus códons raros otimizados. Os plasmídeos desenhados para a expressão da crotamina madura em citoplasma e periplasma foram transformados em bactéria competente BL21(DE3) e BL21-AI e a indução da proteína foi feita por IPTG e arabinose, respectivamente. A expressão foi analisada por SDS-PAGE e Western Blotting, mostrando que foi possível expressar as três construções em BL21-AI. / Snake venoms contain a complex cocktail of toxins (proteins and enzymes) which disrupt physiological or biochemical processes of the pray. Crotamine is one of the major components present in the venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus. It belongs to the small basic myotoxins peptide SBMPs. An important activity of crotamine is the ability to rapidly penetrate proliferative cells, acting as a nanocarrier, carrying plasmid DNA and drugs into tumor cells. Another interesting activity of this toxin is the ability to promote cell death of actively proliferating cancer cells in a dose dependent manner. Crotamine shows strong antifungical activity and modest activities against prokaryotes, it acts by blocking voltage-dependent potassium channels being selective for channels Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3 and inducing paralysis of the hind limbs of mice. Given the importance of the activities of crotamine, the toxin was chosen for production in the recombinant form. Generally, animal toxins are peptides secreted into the lumen of the venom gland and are rich in disulfide bridges. When expressed in prokaryotic system, animal toxins are commonly found in the form of inclusion bodies. They can also be expressed in periplasmic sytem. Three synthetic genes were constructed, one for expression in the cytoplasm and two for expression in the bacterial periplasm using pRSET-A (Invitrogen ®) system. For cytoplasm expression, the DNA region encoding the mature peptide was cloned in fusion with a 6 x His tag separated by a site. For expression in the periplasm, the mature crotamine coding region was cloned in fusion with E. coli OmpA signal sequence. All crotamine and OmpA signal peptide rare codons were optimized according to E. coli preferred codon usage. The plasmids designed for crotamine expression in periplasm and cytoplasm have been transformed in strains BL21(DE3) and BL21-AI were used as hosts, and the induction of recombinant protein was done by IPTG and arabinose, respectively. The induced culture products were analyzed by SDSPAGE and Western Blot, showing that it was possible to express the three constructs in BL21-AI.

O veneno de animais contém um arsenal de toxinas que desencadeia respostas fisiológicas e bioquímicas específicas. A crotamina, um peptídio catiônico (4,4 kDa, pI 9,5), é um dos componentes mais abundantes do veneno de cascavel Sul Arrericana (Crotalus durissus terrificus). No Brasil, há populações de C. d. terrificus que expressam ou não a crotamina no veneno. Em um único espécime de C. d. terrificus crotamina-positivo, foram isolados cDNAs precursores de duas isoformas de crotamina, dentre as quais a crotamina lle-19, presente somente no veneno de C.d. ruruima. Análise por Northern blot de RNA total e mensageiro de glândulas de C.d. terrificus crotamina-positivo e -negativo, indica que a expressão é defectiva em espécimes de cascavel crotamina-negativo. O gene da crotamina (Crt-pl) foi isolado e possui três exons interrompidos por dois introns de diferentes fases e tamanhos. O exon I codifica a totalidade do peptídio sinal; o exon II codifica os três resíduos carboxi-terminais do peptídio sinal, bem como a maior parte da toxina madura; o terceiro exon codifica os resíduos terminais da toxina. Tentativa de identificar o pseudogene da crotamina, que indicaria a ausência de transcritos na glânlula de veneno, permitiu isolar um gene parálogo ao da crotamina, isto é o gene crotasin (Cts-p2). Esse gene apresenta a mesma organização estrutural do gene da crotamina, contudo, o intron I é cerca de 800 pares de base mais longo e o exon II é hipermutado. Esse gene é expresso em diferentes tecidos de cascavel, majoritariamente no pâncreas, mas insignificantemente nas glândulas de veneno. Surpreendentemente, esse gene é também detectado no genoma de C. d. terrificus crotamina-positivo, sugerindo que o gene de crotamina é o produto de uma duplicação gênica, bem como da evolução acelerada que operou restritivamente ao exon II. Buscando as funções do produto desse gene nos tecidos de cascavel, por alinhamento de domínios protéicos e outras famílias de peptídios de vertebrados, duas categorias foram encontradas: peptídios catiônicos antibióticos (β-defensinas) e domínios ricos em cisteína de receptores de fator de crescimento. Testes antibióticos indicam que o crotasin, a crotamina e oligopeptídios derivados sintéticos possuem certa atividade microbicida seletiva. Por outro lado, ensaios com células-tronco embrionárias de camundongo e crotamina de veneno mostram que a crotamina é citotóxica em concentrações milimolares, mas induz a diferenciação dos corpos embrionários, em concentrações micromolares. Esses achados demonstram a multi-funcionalidade de peptídios catiônicos, com três pontes de cisteína precisamente arranjadas, é decorrente da versatilidade dos domínios protéicos anfipáticos, que permitem interação com a membrana plasmática, modulando canais iônicos e receptores celulares. / Abstract not available.

A giroxina é uma enzima serinoprotease do veneno da cascavel sul-americana Crotalus durissus terrificus. É uma toxina apenas parcialmente caracterizada e com múltiplas atividades. Atua na coagulação, na diminuição da pressão arterial e induz um comportamento neurotóxico descrito como rolamento em barril. Os mecanismos envolvidos nestas atividades não são conhecidos. Considerando que a giroxina é uma enzima com alto potencial para ser um novo fármaco com aplicações em clínica médica como a trombina, tripsina, ancrod®, batroxobin® e calicreína, é importante determinar como a giroxina atua. As análises em eletroforese em gel de poliacrilamida e dicroísmo circular confirmaram a pureza e integridade da molécula. A administração intravenosa em camundongos comprovou a neurotoxicidade (rolamento em barril). O estudo in vivo com microscopia intravital comprovou que a giroxina induz vasodilatação com participação dos receptores ativados por proteases (PARs), do óxido nítrico e da Na+K+ATPase. A adesão e rolamento de leucócitos indicaram que não possui atividade pró-inflamatória. A giroxina induziu a agregação plaquetária, que foi bloqueada pelos inibidores dos receptores PAR-1 e PAR-4 (SCH 79797 e tcY-NH2, respectivamente). Finalmente, foi demonstrado que a giroxina alterou temporariamente a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE). Neste estudo foi comprovado que os receptores ativados por proteases e o óxido nítrico são mediadores envolvidos nas atividades biológicas da giroxina. / Gyroxin is a serine protease enzyme from the South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus) venom; it is only partially caractherized and has multiple activites. Gyroxin induces blood coagulation, blood pressure decrease and a neurotoxic behavior named barrel rotation. The mechanisms involved in this neurotoxic activity are not known. Whereas gyroxin is a member of enzymes with high potential to become a new drug with clinical applications such as thrombin, batroxobin®, ancrod®, tripsyn and kalicrein, it is important to find out how gyroxin works. The analysis on agarose gel electrophoresis and circular dichroism confirmed the molecules\' integrity and purity. The gyroxin intravenous administration in mice proved its neurotoxicity (barrel rotation). In vivo studies employing intravital microscopy proved that gyroxin induces vasodilation with the participation of protease activated receptors (PARs), nitric oxide and Na+K+ATPase. The leukocytes\' adherence and rolling counting indicated that gyroxin has no proinflammatory activity. Gyroxin induced platelet aggregation, which was blocked by inhibitors of PAR1 and PAR4 receptors (SCH 79797 and tcY-NH2, respectively). Finally, it was proved that the gyroxin temporarily alter the permeability of the blood brain barrier (BBB). Our study has shown that both the protease-activated receptors and nitric oxide are mediators involved in the biological activities of gyroxin.

A giroxina é uma enzima serinoprotease do veneno da cascavel sul-americana Crotalus durissus terrificus. É uma toxina apenas parcialmente caracterizada e com múltiplas atividades. Atua na coagulação, na diminuição da pressão arterial e induz um comportamento neurotóxico descrito como rolamento em barril. Os mecanismos envolvidos nestas atividades não são conhecidos. Considerando que a giroxina é uma enzima com alto potencial para ser um novo fármaco com aplicações em clínica médica como a trombina, tripsina, ancrod®, batroxobin® e calicreína, é importante determinar como a giroxina atua. As análises em eletroforese em gel de poliacrilamida e dicroísmo circular confirmaram a pureza e integridade da molécula. A administração intravenosa em camundongos comprovou a neurotoxicidade (rolamento em barril). O estudo in vivo com microscopia intravital comprovou que a giroxina induz vasodilatação com participação dos receptores ativados por proteases (PARs), do óxido nítrico e da Na+K+ATPase. A adesão e rolamento de leucócitos indicaram que não possui atividade pró-inflamatória. A giroxina induziu a agregação plaquetária, que foi bloqueada pelos inibidores dos receptores PAR-1 e PAR-4 (SCH 79797 e tcY-NH2, respectivamente). Finalmente, foi demonstrado que a giroxina alterou temporariamente a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BHE). Neste estudo foi comprovado que os receptores ativados por proteases e o óxido nítrico são mediadores envolvidos nas atividades biológicas da giroxina. / Gyroxin is a serine protease enzyme from the South American rattlesnake (Crotalus durissus terrificus) venom; it is only partially caractherized and has multiple activites. Gyroxin induces blood coagulation, blood pressure decrease and a neurotoxic behavior named barrel rotation. The mechanisms involved in this neurotoxic activity are not known. Whereas gyroxin is a member of enzymes with high potential to become a new drug with clinical applications such as thrombin, batroxobin®, ancrod®, tripsyn and kalicrein, it is important to find out how gyroxin works. The analysis on agarose gel electrophoresis and circular dichroism confirmed the molecules\' integrity and purity. The gyroxin intravenous administration in mice proved its neurotoxicity (barrel rotation). In vivo studies employing intravital microscopy proved that gyroxin induces vasodilation with the participation of protease activated receptors (PARs), nitric oxide and Na+K+ATPase. The leukocytes\' adherence and rolling counting indicated that gyroxin has no proinflammatory activity. Gyroxin induced platelet aggregation, which was blocked by inhibitors of PAR1 and PAR4 receptors (SCH 79797 and tcY-NH2, respectively). Finally, it was proved that the gyroxin temporarily alter the permeability of the blood brain barrier (BBB). Our study has shown that both the protease-activated receptors and nitric oxide are mediators involved in the biological activities of gyroxin.

O veneno de animais contém um arsenal de toxinas que desencadeia respostas fisiológicas e bioquímicas específicas. A crotamina, um peptídio catiônico (4,4 kDa, pI 9,5), é um dos componentes mais abundantes do veneno de cascavel Sul Arrericana (Crotalus durissus terrificus). No Brasil, há populações de C. d. terrificus que expressam ou não a crotamina no veneno. Em um único espécime de C. d. terrificus crotamina-positivo, foram isolados cDNAs precursores de duas isoformas de crotamina, dentre as quais a crotamina lle-19, presente somente no veneno de C.d. ruruima. Análise por Northern blot de RNA total e mensageiro de glândulas de C.d. terrificus crotamina-positivo e -negativo, indica que a expressão é defectiva em espécimes de cascavel crotamina-negativo. O gene da crotamina (Crt-pl) foi isolado e possui três exons interrompidos por dois introns de diferentes fases e tamanhos. O exon I codifica a totalidade do peptídio sinal; o exon II codifica os três resíduos carboxi-terminais do peptídio sinal, bem como a maior parte da toxina madura; o terceiro exon codifica os resíduos terminais da toxina. Tentativa de identificar o pseudogene da crotamina, que indicaria a ausência de transcritos na glânlula de veneno, permitiu isolar um gene parálogo ao da crotamina, isto é o gene crotasin (Cts-p2). Esse gene apresenta a mesma organização estrutural do gene da crotamina, contudo, o intron I é cerca de 800 pares de base mais longo e o exon II é hipermutado. Esse gene é expresso em diferentes tecidos de cascavel, majoritariamente no pâncreas, mas insignificantemente nas glândulas de veneno. Surpreendentemente, esse gene é também detectado no genoma de C. d. terrificus crotamina-positivo, sugerindo que o gene de crotamina é o produto de uma duplicação gênica, bem como da evolução acelerada que operou restritivamente ao exon II. Buscando as funções do produto desse gene nos tecidos de cascavel, por alinhamento de domínios protéicos e outras famílias de peptídios de vertebrados, duas categorias foram encontradas: peptídios catiônicos antibióticos (β-defensinas) e domínios ricos em cisteína de receptores de fator de crescimento. Testes antibióticos indicam que o crotasin, a crotamina e oligopeptídios derivados sintéticos possuem certa atividade microbicida seletiva. Por outro lado, ensaios com células-tronco embrionárias de camundongo e crotamina de veneno mostram que a crotamina é citotóxica em concentrações milimolares, mas induz a diferenciação dos corpos embrionários, em concentrações micromolares. Esses achados demonstram a multi-funcionalidade de peptídios catiônicos, com três pontes de cisteína precisamente arranjadas, é decorrente da versatilidade dos domínios protéicos anfipáticos, que permitem interação com a membrana plasmática, modulando canais iônicos e receptores celulares. / Abstract not available.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 5111.pdf: 6171719 bytes, checksum: 0356f236abaa5b549156bc72fde00f70 (MD5) Previous issue date: 2012-09-14 / Universidade Federal de Minas Gerais / Some snakes have the ability to survive long periods without food and are capable to ingest large meal size. The ingestion of proportionally large preys triggers an expressive increase on the oxidative metabolic demand (SDA Specific Dinamic Action) which can become several times higher than the resting metabolic rate. The two described extreme situations might lead to cardiac changes to adapt structure and function in order to afford these two opposite physiological demands. During long food deprivation (Phase III), the depletion of the body structure may affect the heart muscle. That should be reverted to the SDA and prevent an overload on cardiovascular system. The standard cardiac function of South-american Rattlesnake, Crotalus durissus terrificus, was described as well as the changes caused by long term food deprivation and SDA. The importance of sodium-calcium exchanger (NCX), functionality of sarcoplasmic reticulum, extracellular calcium dependence and the effect of adrenergic stimulation were tested in adult animals at 30°C, under three different metabolic states: postabsorptive, SDA peak and food deprivation. The ventricular mass does not change after food deprivation and SDA. The force of contraction was higher in the base of the heart if compared to the apex, but there is no difference among the experimental groups and it is probably reflex of the fiber orientation in each region of the ventricle. The sarcoplasmatic reticulum is functional in all groups, but the dependence of reticular calcium is lower during starvation compared to the other groups. Muscle contraction is mostly supported by the extracellular Ca2+. The NCX have minor contribution to force generation (20%) but has a major role pumping calcium out of the cell (faster than SERCA). The increase in extracellular Ca2+ concentration during digestion can augment twitch force and would represent a contractile advantage to support the increased cardiac work without the development of hypertrophy. The adrenergic stimulation produced sustained increase in Fc for a wide range of stimulation frequencies in all the tested groups. / O coração possui a importante capacidade de se remodelar diante de alterações nas demandas funcionais. Serpentes apresentam a capacidade de ingestão de grandes presas e a capacidade de sobreviver a grandes períodos de privação alimentar. A ingestão de grandes massas de alimento demanda uma elevação metabólica e leva a uma compensação na massa ventricular e um aumento na força de contração do miocárdio, evitando uma sobrecarga no sistema cardiovascular. Durante o jejum ocorre depleção da estrutura corpórea podendo também atingir o músculo cardíaco. Para descrever a função cardíaca da Cascavél Sul-americana, Crotalus durissus terrificus, e as possíveis alterações diante dos extremos metabólicos, foi testada a importância do trocador Na+/Ca2+ (NCX), a funcionalidade do retículo sarcoplasmático (RS), a dependência do Ca2+ extracelular e o efeito da estimulação adrenérgica em animais adultos à temperatura constante de 30°C em período pós-absortivo, pico de SDA e após jejum prolongado. Observou-se que a massa ventricular se mantém estável mesmo durante os extremos metabólicos. Há uma diferença na geração de tensão entre as tiras da base e ápice ventriculares, presente nos 3 grupos alimentares e que pode se dar em função da orientação das fibras nas duas regiões do ventrículo. O teste com rianodina mostrou que o RS é funcional nos 3 grupos porém a dependência do cálcio proveniente do RS é menor após o jejum prolongado quando comparado aos demais grupos. O cálcio extracelular é o principal responsável pela contração do miócito cardíaco e o NCX, que fornece uma pequena parte de cálcio para a contração, é o principal bombeador de cálcio para fora da célula e é mais rápido do que a Ca2+- ATPase do RS. O meio extracelular é a principal fonte de cálcio ativador da contração sendo que o aumento de cálcio circulante disponível para a contração nos animais durante a digestão ofereceria uma vantagem contrátil para este grupo sem necessidade de hipertrofia. A adrenalina produziu um aumento substancial na Fc capaz e ser mantido por diferentes frequências de estimulação nos 3 grupos testados.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-08-04T16:19:31Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EstudoAcaoCrotoxina.pdf: 1097986 bytes, checksum: 66081e843a1d162632a99dfcc3d73c8e (MD5) / Approved for entry into archive by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br) on 2017-08-08T12:02:19Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EstudoAcaoCrotoxina.pdf: 1097986 bytes, checksum: 66081e843a1d162632a99dfcc3d73c8e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-08T12:02:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EstudoAcaoCrotoxina.pdf: 1097986 bytes, checksum: 66081e843a1d162632a99dfcc3d73c8e (MD5) Previous issue date: 2016-04-12 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença parasitária amplamente disseminada na maioria dos países da América Latina, e pode ser causada por diferentes espécies do gênero Leishmania. Este protozoário é um parasito intracelular obrigatório que desenvolveu mecanismos para subverter a atividade microbicida dos macrófagos, como a inibição da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) e óxido nítrico (NO). A quimioterapia ainda é um dos tratamentos mais efetivos para esta doença, entretanto, as drogas leishmanicidas disponíveis são, em geral, tóxicas, apresentam custo elevado e necessitam da utilização por longos períodos. Assim, o desenvolvimento de novos produtos naturais para o tratamento da leishmaniose se tornou prioridade. As toxinas ofídicas são fontes naturais de produtos bioativos com propriedades terapêuticas amplamente descritas na literatura. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi analisar a ação da crotoxina (CTX), uma proteína dimérica e o principal componente do veneno de serpente da espécie Crotalus durissus terrificus, sobre a interação Leishmania (Leishmania) amazonensis e macrófagos. A toxina diminuiu significativamente em 32,5% o crescimento de promastigotas na concentração de 1,2 μg/mL e 24,9% na concentração de 2,4 μg/mL após 96 horas de tratamento (IC50 = 22,86 μg/mL). O teste colorimétrico (MTT) demonstrou que essa toxina não induziu efeito tóxico sobre macrófagos. Também foi observado que macrófagos tratados com CTX apresentaram um significativo aumento na capacidade de metabolizar o substrato MTT (média = 59,78% ± 3,31, mais elevado) quando comparados ao controle sem tratamento. Além disso, foi observado que os macrófagos tratados apresentaram intensa produção de ROS (média= 35,95% ±2,76, mais elevado) comparado ao controle. Outro dado importante observado foi o fato de células hospedeiras infectadas e tratadas com CTX apresentarem um aumento significativo na capacidade fagocítica e na eliminação dos parasitas intracelulares, com aumento na produção de NO, aumento da área celular e a intensa produção de citocinas pró-inflamatórias, caracterizando o perfil M1 de ativação celular. Esta ativação teve como consequência a morte dos parasitas através da resposta do hospedeiro, diminuindo o número de parasitos após 48h de tratamento com 2,4 e 4,8 μg/mL de CTX, revertendo, assim, a ação anérgica promovida pela L. amazonensis. Portanto, a CTX promove um bom prognóstico para esta infecção, evidenciando a possibilidade desta substância atuar como possível alternativa de tratamento contra leishmaniose, especialmente em casos de infecções por espécies que induzem respostas anérgicas. / American Tegumentary Leishmaniasis (ATL) is a parasitic disease widely spread in most countries of Latin America, and caused by different species of the genus Leishmania. This protozoan is an obligate intracellular parasite that developed mechanisms to subvert the microbicidal activity of macrophages, such as inhibition of reactive oxygen species (ROS) and nitric oxide (NO) production. The chemotherapy is one of the most effective treatments for this disease, although the antileishmanial drugs available are in general toxic, expensive and require long-term treatment. Thus, the development of new natural products to treat leishmaniasis has become a priority. Ophidian toxins are natural sources of bioactive products with therapeutic properties already described. Therefore, we considered analyze the activity of crotoxin (CTX), a dimeric protein and the main neurotoxic component of Crotalus durissus terrificus snake venom, against promastigotes of Leishmania (L.) amazonensis and macrophages. The toxin significantly decreasing of 32,5% on the growth of promastigotes at 1,2μg/mL and 24,9% at 4,8μg/mL after 96 hours of treatment (IC50= 22,86μg/mL). The colorimetric assay (MTT) showed that this compound presented no cytotoxic effects against macrophages. Interestingly, CTX treated macrophages presented a significant higher capacity to metabolize the MTT substrate (mean= 59,78% ±3,31, higher) when compared with untreated control. It was observed that treated macrophages presented intense production of ROS (mean= 35,95% ±2,76, higher) when compared with untreated cells. Treated macrophages presented increased phagocytic activity and were capable to eliminate intracellular parasites. Besides that, these cells had it NO and pro-inflammatory cytokines production increased and morphological alteration that characterizes the M1 cellular activation profile. That activation culminates with the parasite elimination throughout host response, reverting the anergic action promoted by L. amazonensis, thereby leading to a good disease prognostic, evidencing that this compound could be a promising antileishmanial agent.

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O segundo animal que recebeu a dose de 0,066mg/kg também adoeceu, mas recuperou-se após 12 dias da inoculação. A dose de 0,03 mg/kg determinou quadros não fatais do envenenamento, com período de evolução que variou entre 6 e 10 dias. O quadro clínico caracterizou-se por considerável aumento de volume no local de inoculação (omoplata) que se estendeu por todo o membro, apatia, cabeça baixa, alterações locomotoras evidenciadas pelo arrastar das pinças no solo, decúbito e dificuldade para levantar, redução dos reflexos auricular, palatal, do lábio superior e de ameaça, aumento das frequências cardíaca e respiratória. Os exames laboratoriais revelaram leucocitose por neutrofilia e linfocitose em apenas dois animais. Houve aumento das enzimas creatina-quinase (CK), dehidrogenase láctica (DHL) e da uréia; redução nos níveis séricos de cálcio, fósforo e magnésio. O tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) aumentou nos equinos que morreram. Os achados de necropsia foram edema do tecido subcutâneo em todo o membro em que foi aplicado o veneno, sufusões no epicárdio dos ventrículos cardíacos esquerdo e direito, bexiga repleta de urina com áreas hemorrágicas em grande parte da mucosa. Ao exame observaram-se fígado com vacuolização moderada difusa, afetando mais a zona intermediária do lóbulo hepático, dilatação dos sinusóides hepáticos leve e rim com dilatação leve dos túbulos uriníferos, principalmente no córtex. / The clinic-pathological picture and laboratory findings in horses experimentally inoculated with the venom of Caudisona durissa terrificus (Crotalus durissus terrificus, according to the former nomenclature) are described. The purpose of this study was to contribute to the understanding of this type of snake accident in horses. The lyophilized venom was diluted into 1ml of a 0.9% saline solution and was inoculated subcutaneously into five horses, at the doses of 0.12mg/kg (one horse), 0.066mg/kg (two horses) and 0.03mg/kg (two horses). The venom caused death of the horse that had received 0.12mg/kg, and of one horse of the two that had received the dose of 0.066mg/kg. The clinical course varied from 27h27min to 52h29min. The second horse inoculated with 0.066mg/kg recovered within 12 days after inoculation. The dose of 0.03mg/kg had a course of 6 to 10 days but did not cause fatal envenomation. The clinical picture in the horses was characterized by swelling of the inoculation site and adjacent areas, by apathy and lowered head, locomotory alterations shown by dragging of the hoves on the ground, decubitus and difficulty to get up, reduction of auricular, palatal, upperlip and threat reflexes, and increase of heart and breathing frequency. The laboratory examination revealed leukocytosis and lymphocytosis in two horses. There was increase of the creatine-kinase (CK), lactic dehydrogenase (DHL) and ureia; reduction in the seric levels of calcium, phosphorus and magnesium. The time of activated partial tromboplastina (TTPA) increased in the horses that died. Post mortem findings were edema of the subcutaneous tissue at the inoculated shoulder, suffusions in the epicard of left and right heart ventricles, bladder replete with urine containing a white-yellowish sediment, and hemorrhagic areas in its mucosa. Histopatologic examination revealed the liver parenchyma with diffuse moderate vacuolation affecting predominantly the intermediate area of the hepatic lobe, and slight dilation of the sinusoides in some areas; in the kidney slight dilation of the uriniferous tubules mainly in the cortex.