Neste trabalho foi estudado o potencial imunorregulador da crotoxina (CTX) obtida do veneno de C. d. terrificus, em modelo experimental de colite induzida pelo TNBS em camundongos. A CTX foi capaz de diminuir a perda de peso, o score clínico e histológico, síntese de MPO e citocinas pró-inflamatórias. Menor número de neutrófilos e macrófagos com fenótipos M1 e M2 na lâmina própria foi observado nos grupos TNBS/CTX em relação ao TNBS. A CTX induziu TGF-b e IL-10, PGE2 e LXA4. A neutralização in vivo dessas citocinas ou o bloqueio da síntese desses eicosanoides indica que estas moléculas exercem papel relevante na ação moduladora da CTX no quadro inflamatório. As análises das diferentes populações celulares da lâmina própria, linfonodos e Placas de Peyer mostraram que não houve diferença nos linfócitos CD4+Tbet+ entre os grupos TNBS e TNBS/CTX. No entanto, a CTX promoveu aumento de CD4+FoxP3+ e diminuição de CD4+RORg+. Estes resultados indicam que a CTX é capaz de modular a resposta inflamatória aguda intestinal melhorando o quadro clinico observado nos animais. / In this work it was analyzed the immunomodulatory effect of crotoxin (CTX) isolated from C.d. terrificus snake venom, on the experimental model of colitis induced by TNBS in mice. The CTX was able to inhibit the weight loss, clinical and histological score, MPO synthesis and pro-inflammatory cytokines. Lower number of neutrophils and macrophage (M1 and M2) in lamina propria was observed in TNBS/CTX mice compared with the TNBS group. In contrast, the CTX induced increased TGF-b, IL-10, PGE2 and LXA4. The in vivo neutralization of these cytokines or eicosanoids synthesis indicates that these molecules exert significant role in the modulatory effect of CTX. The analyzes of distinct cell populations from lamina propria, lymph nodes and Peyers pathes showed no difference in CD4+Tbet+ between TNBS or TNBS/CTX mice. However, CTX induced an increase of CD4+FoxP3+ and decreased CD4+RORgt+. Together, these results indicate that CTX is able to modulate intestinal acute inflammatory response induced by TNBS improving the clinical status of the mice.

O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus e seus componentes desencadeiam importantes efeitos biológicos que envolvem direta e/ou indiretamente, componentes do sistema circulatório. Contudo, não há estudos específicos na literatura sobre os efeitos do veneno crotálico ou de suas toxinas, em células endoteliais. As células endoteliais constituem a camada de revestimento interna dos vasos sanguíneos, denominada endotélio. Este tecido é metabolicamente ativo, com função protetora do sistema cardiovascular e desempenha papel central na regulação da função circulatória, através do controle da coagulação, permeabilidade e do tônus vascular. Neste contexto, este estudo teve como objetivo avaliar os efeitos do veneno de Crotalus durissus terrificus (VCdt), do seu componente majoritário, a crotoxina (CTX) e de suas subunidades, fosfolipase A2 (CB) e crotapotina (CA), sobre células endoteliais, em cultura, quanto à: i) viabilidade e proliferação celular; ii) integridade das monocamadas; iii) produção de óxido nítrico, de prostaciclina e mecanismos envolvidos neste efeito. Os resultados obtidos demonstram que o veneno de Crotalus durissus terrificus afetou a viabilidade e a integridade de células endoteliais em cultura, de modo tempo-dependente e apenas na maior concentração, sugerindo sua baixa toxicidade sobre as células endoteliais. A subunidade CB, mas não a CTX nem a crotapotina, reproduziu os efeitos causados pelo VCdt. Em concentrações não citotóxicas, tanto o veneno quanto as toxinas não alteraram a proliferação celular nem a produção basal de óxido nítrico pelas células endoteliais. Por outro lado, o veneno e a subunidade CB, mas não a CTX nem a CA causaram aumento significativo da produção de prostaciclina, via COX-1 e COX-2, sendo que a expressão protéica da isoforma COX-2 foi induzida por estes agentes. Além disso, foi demonstrado que a fosfolipase citosólica é relevante para o aumento da produção de prostaciclina, induzido pela CB. Adicionalmente, foi demonstrado que a atividade catalítica da subunidade CB é essencial para os efeitos descritos. Isto reforça a sugestão de que a subunidade fosfolipásica, isoladamente, possa contribuir para os efeitos do veneno total no endotélio. Nesse sentido, se houver alguma fração desta enzima na sua forma livre, no veneno total, sugere-se que ela contribua, de modo significativo, para os efeitos do veneno de Crotalus durissus terrificus no endotélio. / Crotalus durissus terrificus snake venom (CdtV) and their components induces systemic effects, which interfere with blood vessel system. Endothelial cells (EC) are central elements for haemostasis, regulating blood vessel-wall permeability, blood fluidity and adhesion properties of circulating leukocytes. However, there is no available data on the effects of this venom and its components on endothelial cells. In this study, the effects of CdtV, crotoxin (CTX) which is formed by two distinct subunits named crotapotin (CA) and phospholipase A2 (CB), on endothelial cells in vitro were investigated, analyzing EC viability and proliferation, EC monolayers integrity, release of both nitric oxide and prostacyclin (PGI2). CdtV, at the highest concentration, time-dependently decreased the viability of EC and the integrity of cell monolayers. The CB subunit, but not CTX nor CA, reproduced the effects caused by crude venom. In contrast, neither EC proliferation nor release of oxide nitric were affected by non-cytotoxic concentrations of CdtV or isolated toxins. However, at the same experimental condition, both CdtV and CB increased the prostacyclin release by endothelium through activation of COX-1 and -2 enzyme systems. Moreover, these toxins upregulated protein expression of COX-2 isoform, but did not alter constitutive expression of COX-1. On the other hand, neither CTX nor CA affected basal production of PGI2. Inhibition of cytosolic PLA2 (cPLA2) by AACOCF3 significantly reduced PGI2 increments caused by both CdtV and CB implying that cPLA2 cooperates for the synthesis of PGI2 induced by them. Inhibition of the catalytic activity of CB abrogated its ability to induce the release of PGI2, thus suggesting the importance of the phospholipase A2 enzyme activity for this effect. These findings provide evidence that CdtV and CB can directly activate EC and up-regulate cyclooxygenase pathways for production of prostacyclin, an important mediator of vasodilation and inflammation. Moreover, CB through its catalytic activity may significantly contribute for the stimulatory effect of CdtV in EC. Therefore, these findings indicate novel regulatory mechanisms for both CdtV and venom secretory PLA2 in endothelial cells.

Made available in DSpace on 2016-01-26T18:55:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane de Pauli Pereira.pdf: 1503472 bytes, checksum: 59921819ab10ff8a49c25d968609430f (MD5) Previous issue date: 2012-03-20 / This study evaluated the effects of the venom from Crotalus durissus terrificus and snakebite serum on the clinical signs and liver function in 120 Wistar rats by performing physical examinations, laboratory and histopathology tests. The animals were divided into four experimental groups of thirty animals in each group. The control group (C) - received only solution of sodium chloride 0.9%; Group venom (V) - received 1mg/kg venom; Group snakebite serum (S) - received the indicated dose snakebite serum to neutralize the poison; Poison and serum group (VS) - received venom and the snakebite serum six hours later. The clinical evaluation and specimen obtained for laboratory and histological examinations were performed at time 2 hours, 8 hours and 24 hours in all groups. It was observed for the S Group elevation of serum enzyme alkaline phosphatase (FA), inflammatory reaction, changes in Kupffer cells, necrosis and hyaline degeneration; Group V heart rate decrease over time, increase in rectal temperature (TR), increased FA, increase of serum aspartate aminotransferase (AST), inflammatory infiltrate, changes in Kupffer cells, necrosis and hyaline degeneration; Group VS increased TR and also respiratory rate, elevated serum FA, AST and alanine aminotransferase (ALT), inflammatory reaction, changes in Kupffer cells, necrosis and hyaline degeneration. The results indicate that the venom and snakebite serum alter the clinical parameters and cause liver damage at the doses and times studied. However, further studies with the venom and antivenom to be able to understand the effect of time and changes in the percentage contribution of hepatotoxicity in serum isolated. In addition, to investigate the need for additional treatments to protect the liver. / Este estudo avaliou os efeitos hepatotóxicos do veneno de Crotalus durissus terrificus e soro antiofídico em 120 ratos Wistar, através da realização de exames físico, laboratorial e histopatológico. Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais, com trinta animais em cada grupo, sendo: grupo controle (C) - recebeu solução de cloreto de sódio 0,9%; grupo veneno (V) - recebeu veneno crotálico 1mg/Kg; grupo soro antiofídico (S) - recebeu soro antiofídico na dose indicada para neutralizar o veneno; grupo veneno e soro (VS) - recebeu veneno crotálico e após 6 horas o soro antiofídico. A avaliação clínica e a colheita de material para exames laboratorial e histopatológico do fígado foram realizadas nos momentos 2 horas (n=10), 8 horas (n=10) e 24 horas (n=10) para todos os grupos. Observou-se para o grupo S elevação sérica da enzima fosfatase alcalina (FA), infiltrado inflamatório, alterações nas células de Kupffer, necrose e degeneração de hialina; Grupo V diminuição da frequência cardíaca no decorrer do tempo, aumento na temperatura retal (TR), elevação da FA, elevação sérica da aspartato aminotransferase (AST), infiltrado inflamatório, alterações nas células de Kupffer, necrose e degeneração de hialina; Grupo VS aumento da TR e na frequência respiratória, elevação sérica da FA, elevação sérica da AST, elevação sérica da alanina aminotransferase (ALT), infiltrado inflamatório, alterações nas células de Kupffer, necrose e degeneração de hialina. Os resultados encontrados indicam que o veneno crotálico e o soro antiofídico, associados ou não, alteram os parâmetros clínicos e provocam danos hepáticos nas doses e momentos estudados. No entanto, são necessários novos estudos com o veneno crotálico e a soroterapia para que se possa entender o efeito do tempo nas alterações e a porcentagem de contribuição do soro isolado na hepatotoxicidade. Além disso, investigar a necessidade de tratamentos complementares para a proteção hepática.

Made available in DSpace on 2016-07-18T17:53:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane de Pauli Pereira.pdf: 1503472 bytes, checksum: 59921819ab10ff8a49c25d968609430f (MD5) Previous issue date: 2012-03-20 / This study evaluated the effects of the venom from Crotalus durissus terrificus and snakebite serum on the clinical signs and liver function in 120 Wistar rats by performing physical examinations, laboratory and histopathology tests. The animals were divided into four experimental groups of thirty animals in each group. The control group (C) - received only solution of sodium chloride 0.9%; Group venom (V) - received 1mg/kg venom; Group snakebite serum (S) - received the indicated dose snakebite serum to neutralize the poison; Poison and serum group (VS) - received venom and the snakebite serum six hours later. The clinical evaluation and specimen obtained for laboratory and histological examinations were performed at time 2 hours, 8 hours and 24 hours in all groups. It was observed for the S Group elevation of serum enzyme alkaline phosphatase (FA), inflammatory reaction, changes in Kupffer cells, necrosis and hyaline degeneration; Group V heart rate decrease over time, increase in rectal temperature (TR), increased FA, increase of serum aspartate aminotransferase (AST), inflammatory infiltrate, changes in Kupffer cells, necrosis and hyaline degeneration; Group VS increased TR and also respiratory rate, elevated serum FA, AST and alanine aminotransferase (ALT), inflammatory reaction, changes in Kupffer cells, necrosis and hyaline degeneration. The results indicate that the venom and snakebite serum alter the clinical parameters and cause liver damage at the doses and times studied. However, further studies with the venom and antivenom to be able to understand the effect of time and changes in the percentage contribution of hepatotoxicity in serum isolated. In addition, to investigate the need for additional treatments to protect the liver. / Este estudo avaliou os efeitos hepatotóxicos do veneno de Crotalus durissus terrificus e soro antiofídico em 120 ratos Wistar, através da realização de exames físico, laboratorial e histopatológico. Os animais foram divididos em quatro grupos experimentais, com trinta animais em cada grupo, sendo: grupo controle (C) - recebeu solução de cloreto de sódio 0,9%; grupo veneno (V) - recebeu veneno crotálico 1mg/Kg; grupo soro antiofídico (S) - recebeu soro antiofídico na dose indicada para neutralizar o veneno; grupo veneno e soro (VS) - recebeu veneno crotálico e após 6 horas o soro antiofídico. A avaliação clínica e a colheita de material para exames laboratorial e histopatológico do fígado foram realizadas nos momentos 2 horas (n=10), 8 horas (n=10) e 24 horas (n=10) para todos os grupos. Observou-se para o grupo S elevação sérica da enzima fosfatase alcalina (FA), infiltrado inflamatório, alterações nas células de Kupffer, necrose e degeneração de hialina; Grupo V diminuição da frequência cardíaca no decorrer do tempo, aumento na temperatura retal (TR), elevação da FA, elevação sérica da aspartato aminotransferase (AST), infiltrado inflamatório, alterações nas células de Kupffer, necrose e degeneração de hialina; Grupo VS aumento da TR e na frequência respiratória, elevação sérica da FA, elevação sérica da AST, elevação sérica da alanina aminotransferase (ALT), infiltrado inflamatório, alterações nas células de Kupffer, necrose e degeneração de hialina. Os resultados encontrados indicam que o veneno crotálico e o soro antiofídico, associados ou não, alteram os parâmetros clínicos e provocam danos hepáticos nas doses e momentos estudados. No entanto, são necessários novos estudos com o veneno crotálico e a soroterapia para que se possa entender o efeito do tempo nas alterações e a porcentagem de contribuição do soro isolado na hepatotoxicidade. Além disso, investigar a necessidade de tratamentos complementares para a proteção hepática.

Os venenos de serpentes contém uma mistura complexa de toxinas (proteínas e enzimas) que destroem os processos bioquímicos ou fisiológicos da presa. A crotamina é um dos principais componentes do veneno da cascavel Sul Americana Crotalus durissus terrificus. Essa proteína pertence à família dos polipeptídeos miotóxicos de baixo peso molecular (SBMPs). Uma importante atividade da crotamina é a habilidade de penetrar rapidamente em células proliferamente ativas, podendo ser usada como nanocarreadora, levando DNA plasmidial e drogas para dentro de células tumorais. Outra atividade interessante desta toxina é a indução de morte celular dose dependente em células cancerígenas proliferamente ativas sem prejudicar células normais, demonstrando promissora atividade anticâncer. A crotamina apresenta forte atividade antifúngica e moderada atividade contra procariotos, age bloqueando canais de potássio dependente de voltagem, sendo seletiva para os canais Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3, e induz paralisia dos membros posteriores de camundongo. Dada a importância das atividades da crotamina, a toxina foi usada para produzir na forma recombinante. De forma geral, as toxinas animais são peptídeos secretados para o lúmen da glândula de veneno e são ricos em pontes dissulfeto, comumente expressas em sistemas procarióticos na forma de corpúsculos de inclusão ou em sistemas de expressão periplasmática. Foram construídos três genes sintéticos, um para a expressão em citoplasma e dois para a expressão em periplasma bacteriano utilizando o vetor pRSET-A (Invitrogen ®). Para a expressão de crotamina em citoplasma bacteriano, a região do DNA que codifica a região do peptídeo maduro foi clonada em fusão com uma cauda simples de 6 x His separada por uma seqüência codificante do sítio de clivagem de enterokinase em substituição à proteína de fusão do vetor comercial pRSETA. Para a expressão em periplasma a região codificante da crotamina madura foi clonada sob o controle da seqüência sinal da OmpA de E. coli. Todos os códons raros da crotamina madura foram otimizados de acordo com os códons preferenciais de E. coli. Em uma das construções para a expressão em periplasma, além da crotamina madura, o peptídeo sinal de OmpA também teve seus códons raros otimizados. Os plasmídeos desenhados para a expressão da crotamina madura em citoplasma e periplasma foram transformados em bactéria competente BL21(DE3) e BL21-AI e a indução da proteína foi feita por IPTG e arabinose, respectivamente. A expressão foi analisada por SDS-PAGE e Western Blotting, mostrando que foi possível expressar as três construções em BL21-AI. / Snake venoms contain a complex cocktail of toxins (proteins and enzymes) which disrupt physiological or biochemical processes of the pray. Crotamine is one of the major components present in the venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus. It belongs to the small basic myotoxins peptide SBMPs. An important activity of crotamine is the ability to rapidly penetrate proliferative cells, acting as a nanocarrier, carrying plasmid DNA and drugs into tumor cells. Another interesting activity of this toxin is the ability to promote cell death of actively proliferating cancer cells in a dose dependent manner. Crotamine shows strong antifungical activity and modest activities against prokaryotes, it acts by blocking voltage-dependent potassium channels being selective for channels Kv1.1, Kv1.2 e Kv1.3 and inducing paralysis of the hind limbs of mice. Given the importance of the activities of crotamine, the toxin was chosen for production in the recombinant form. Generally, animal toxins are peptides secreted into the lumen of the venom gland and are rich in disulfide bridges. When expressed in prokaryotic system, animal toxins are commonly found in the form of inclusion bodies. They can also be expressed in periplasmic sytem. Three synthetic genes were constructed, one for expression in the cytoplasm and two for expression in the bacterial periplasm using pRSET-A (Invitrogen ®) system. For cytoplasm expression, the DNA region encoding the mature peptide was cloned in fusion with a 6 x His tag separated by a site. For expression in the periplasm, the mature crotamine coding region was cloned in fusion with E. coli OmpA signal sequence. All crotamine and OmpA signal peptide rare codons were optimized according to E. coli preferred codon usage. The plasmids designed for crotamine expression in periplasm and cytoplasm have been transformed in strains BL21(DE3) and BL21-AI were used as hosts, and the induction of recombinant protein was done by IPTG and arabinose, respectively. The induced culture products were analyzed by SDSPAGE and Western Blot, showing that it was possible to express the three constructs in BL21-AI.

A Crotoxina, o principal componente do veneno de Crotalus durissus terrificus, vem sendo estudada desde 1938. É um complexo polipeptídico natural com grande potencial farmacológico especialmente por seu efeito antitumoral, propriedade que tem despertado o interesse para o diagnóstico e o tratamento do câncer. Entretanto, pouco se sabe sobre seu mecanismo de ação e os sítios com os quais interage em células tumorais. O câncer de mama é o segundo tipo de câncer mais freqüente no mundo e o mais comum entre as mulheres. Cerca de 30 a 60% dos tumores mamários apresentam expressão aumentada de receptores do fator de crescimento epidérmico (EGFR), uma proteína transmembrana que desencadeia a proliferação celular. A partir de dados da literatura mostrando que o efeito antitumoral da Crotoxina é mais potente em células que superexpressam EGFR, estabeleceu-se o objetivo deste trabalho: avaliar os efeitos citotóxicos desse polipeptídeo sobre os tumores de origem mamária MCF-7 (carcinoma humano) e Ehrlich (carcinoma murino ascítico) e realizar um estudo de interação molecular da Crotoxina com células de tumor de Ehrlich. Inicialmente, a Crotoxina foi radiomarcada com iodo-125 (125I-Crotoxina) e iodo-131 (131I-Crotoxina). Ensaios de saturação e competição foram realizados para caracterizar a interação da Crotoxina in vitro, enquanto que a interação in vivo foi avaliada através da biodistribuição e obtenção de imagens em tomografia por emissão de fóton único (SPECT) do composto radiomarcado em camundongos portadores de tumor de Ehrlich. Os resultados evidenciaram que o polipeptídeo apresentou um potente efeito citotóxico sobre as células de tumor de Ehrlich, com valor de DL50 in vitro (concentração do composto que produziu 50% de morte celular) próximo de 1 micromolar, mas não apresentou efeito significativo sobre a linhagem MCF-7. Alterações morfológicas nas células de tumor de Ehrlich tratadas com Crotoxina sugerem indução de morte celular programada. A interação da 125I-Crotoxina com as células de Ehrlich foi saturável com cerca de 70% de especificidade, com Kd= 24,98 nmol/L e Bmax= 16570 sítios/célula para sítios de baixa afinidade e com Kd= 0,06 nmol/L e Bmax=210 sítios/célula para sítios de alta afinidade. O polipeptídeo radiomarcado apresentou menor especificidade (cerca de 37%) para a linhagem MCF-7. O EGF competiu com 20% dos sítios específicos da 125I-Crotoxina indicando que Crotoxina e EGF compartilham parcialmente sítios específicos em células de Ehrlich. Através do estudo de biodistribuição, observou-se que houve captação significativa de 125I-Crotoxina no tumor (razão tumor/músculo esquelético de 18,55) no período de 3 horas após administração deste composto. As imagens SPECT também evidenciaram captação diferenciada pelo tumor, mostrando interação in vivo da 131I-Crotoxina com células de tumor de Ehrlich. O conjunto dos resultados sugere que Crotoxina apresenta potente efeito antitumoral sobre células de Ehrlich e que este efeito é devido pelo menos parcialmente à interação específica com sítios de alta e baixa afinidade. Os sítios de baixa afinidade se correlacionam com o EGFR e os de alta afinidade ainda necessitam de mais investigação para melhor caracterização. Estes resultados corroboram o potencial da Crotoxina como ferramenta para radiodiagnóstico capaz de diferenciar células tumorais. / Crotoxin, the main component of Crotalus durissus terrificus snake venom, has been studied since 1938. It is a natural polypeptidic complex with pharmacological potential because of its antitumoral properties wich has attracted great interest for diagnosis and therapy of oncological deseases. However, Crotoxin mechanism of action and sites of specific interaction on tumor cells are still misunderstood. Breast cancer is the second most frequent type in the world and the most common cancer in women. About 30 to 60% of mammary tumors overexpress epidermal growth factor receptor (EGFR), a transmembrane protein related to cell proliferation. Since literature has reported that Crotoxin antitumoral effect is more potent on cells with EGFR overexpression the objectives of this work were to evaluate Crotoxin cytotoxic effects on mammary tumor cells human breast carcinoma (MCF-7) and Ehrlich tumor cells (murine ascitics carcinoma), and to investigate the specific molecular interaction of Crotoxin on Ehrlich tumor cells. Inititally, Crotoxin was radiolabelled with iodine-125 (125I-Crotoxin) and iodine-131 (131I-Crotoxin). Saturation and competition assay were carried out to characterize Crotoxin in vitro interaction; Crotoxin biodistribution studies and single-photon emission computed tomography (SPECT) of mice bearing Ehrlich tumor have been evaluated to describe in vivo interaction. Our results showed that Crotoxin presented cytotoxic effect against Ehrlich with DL50 in vitro (concentration of compound which is lethal for 50% of cells) of about one micromolar, but did not present significative effect against MCF-7. Morphological alterations characteristic of apoptosis suggests programmed cell death. 125I-Crotoxin interaction with Ehrlich tumor cells was saturable with approximately 70% specificity, and presented Kd=24.98 nmol/L and Bmax=16,570 sites/cell for low affinity binding sites and Kd=0.06 nmol/L e Bmax=210 sites/cell high affinity binding sites; moreover, the radiolabeled polypeptide interaction showed low specificity toward to MCF-7 (37%). EGF reduced 20% of 125I-Crotoxin specific binding, so specific binding sites of Crotoxin on Ehrlich tumor cells partially overlap to EGFR. Crotoxin biodistribution studies showed significant uptake in the tumor paw (tumor/skeletal muscle ratio= 18.55), three hours after administration. SPECT imaging also showed tumor uptake confirming in vivo interaction with Ehrlich tumor cells. Crotoxin had an antitumoral effect on Ehrlich tumor cells and this action is due, at least partially, to the specific interaction with low and high affinity binding sites. Low affinity binding sites correlate EGFR and high affinity binding sites still need identification. These results confirm Crotoxin as a template for radiopharmaceutical design for cancer diagnosis and as a tool for cancer studies, increasing its biotechnological potential.

Orientador: Daniel Carvalho Pimenta / Resumo: O veneno de Crotalus durissus terrificus (Cdt), baseado no critério do perfil da cromatografia de exclusão molecular, pode ser descrito como sendo composto de quatro principais toxinas: Giroxina, Crotamina, Crotoxina e Convulxina. A crotoxina é uma neutoroxina, é um heterodímero não covalente, composta por duas subunidades: fosfolipase A2 (PLA2) e crotapotina (Ctp). A crotapotina constitui o componente da crotoxina que apresenta atividade anti-inflamatória além de ser chaperona de PLA2. Esta molécula é constituída por três cadeias peptídicas ligadas por pontes dissulfeto. Além disso, já foram descritas isoformas para a crotapotina. O objetivo deste estudo foi desenvolver um método cromatográfico para isolar a crotapotina, separar suas cadeias e analisá-las por LC/MS e LC-MS/MS para análise proteômica e/ou seqüenciamento de novo e avaliação da possível existência de um padrão de variação nas substituições de aminoácidos. O método C8-RP-HPLC foi capaz de separar os componentes do veneno de Cdt que puderam ser identificados por espectrometria de massas, de acordo com a sua massa molecular. A crotapotina foi isolada, reduzida e alquilada e submetida à outra separação cromatográfica RP-HPLC (C18) para isolamento das subunidades alquiladas. Conforme descrito na literatura, a cadeia α da crotapotina é composta por 40 resíduos de aminoácidos, enquanto que a cadeia β possui 35 resíduos e a cadeia γ 14, pelo que as subunidades podem ser identificadas pelas suas massas moleculares. As a... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The Crotalus durissus terrificus venom (Cdt), based on molecular size chromatography, can be described as being composed of four main toxins: Giroxin, Crotamine, Crotoxin and Convulxin. Crotoxin is a neutoroxin, a non-covalent heterodimer composed of two subunits: phospholipase A2 (PLA2) and crotapotin (Ctp). Crotapotin is the component of crotaxin that has anti-inflammatory activity besides being a PLA2 chaperone. This molecule consists of three peptide chains linked by disulfide bonds. In addition, isoforms for crotapotin have been described. The objective of this study was to develop a chromatographic methodology to isolate a crotapotin, separate its chains and analyze by LC/MS and LC-MS/MS for proteomic analysis and/or de novo sequencing and evaluation of the possibility of a variation pattern amino acid substitutions. The C8-RPHPLC method was able to separate the Cdt venom components that could be identified by mass spectrometry, according to their molecular mass. The crotapotin was isolated, reduced and alkylated and subjected to another RP-HPLC (C18) chromatographic separation for isolation of the alkylated subunits. As described in the literature, the α chain of crotapotin is composed of 40 amino acid residues, while the β chain has 35 residues and the γ chain, 14, and thus the subunits can be identified by their molecular masses. The analyzes of isolated chains of crotapotin showed the presence of more than one molecule per fraction, indicating the presence of isofor... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rui Ferreira Seabra Junior / Resumo: Os acidentes ofídicos constituem um relevante problema de saúde pública, a qual deve receber cuidados rápidos e eficientes. Em relação ao ofidismo, no Brasil, somente há poucos anos foi definida uma política abrangente que enfocasse as múltiplas questões relacionadas aos acidentes humanos provocados por animais peçonhentos. Os venenos de serpentes apresentam uma mistura de compostos inorgânicos (íons metálicos) e orgânicos, sendo ricos em moléculas biologicamente ativas. Dentre essas moléculas, peptídeos, proteínas e compostos de baixa massa molecular são frequentemente estudados por apresentarem grande potencial terapêutico. Essas moléculas, se bem conhecidas, podem ser utilizadas na investigação de mecanismo moleculares e celulares. Além disso, estabelecem interessantes modelos moleculares para o desenvolvimento de estratégias biotecnológicas aplicáveis na criação de ferramentas experimentais e/ou agentes terapêuticos para a pesquisa básica e aplicada. Diante disso, a elucidação dos peptídeos hipotensores presentes no veneno crotálico da subespécie Crotalus durissus terrificus é o objetivo do presente trabalho. Este estudo poderá promover a identificação de outras moléculas hipotensoras podendo conter princípios ativos mais eficientes para o tratamento de quadros clínicos de hipertensão, doença esta que acomete milhares de pessoas no mundo todo. No presente trabalho, a porção peptídica do veneno da serpente C.d.t., apresentou rendimento médio de 12,8% em relação ao veneno b... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The snakebites are an important public health problem, which must receive quick and efficient care. Regarding the ophidism, in Brazil, only a few years ago a comprehensive policy was defined that emphasized multiple issues related to human accidents caused by venomous animals. The snake venoms present a mixture of inorganic and organic compounds, being rich in biologically active molecules. Among these molecules, peptides, proteins and low molecular weight compounds are often studied by their ability therapeutic. Those molecules, when well known, may be used in the investigation of cellular and molecular mechanism. In addition, it provides interesting molecular models for the development of biotechnological strategies applicable in the creation of experimental tools and / or therapeutic agents for basic and applied research. Therefore, the elucidation of hypotensive peptides present in the venom of Crotalus durissus terrificus subspecies is the aim of this study, once this study may promote the identification of other hypotensive molecules may contain more effective active ingredients for the treatment of clinical conditions hypertension, this disease affecting millions of people in the world. In this study, the peptide portion of the venom of the snake Cdt, performed with an average yield of 12.8% compared to the venom under total protein precipitation conditions in the presence of trifluoro acetic acid to 0.1% (v / v) and, when subjected to purification strategy for reverse... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Patrícia da Rocha Mendes (prmbio@gmail.com) on 2018-08-15T16:34:30Z No. of bitstreams: 1 TESE FINAL 2.pdf: 1912543 bytes, checksum: 5c638621228b797d59f7811694025a8c (MD5) / Approved for entry into archive by Sulamita Selma C Colnago null (sulamita@btu.unesp.br) on 2018-08-15T19:06:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 mendes_pr_dr_bot.pdf: 1912543 bytes, checksum: 5c638621228b797d59f7811694025a8c (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-15T19:06:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mendes_pr_dr_bot.pdf: 1912543 bytes, checksum: 5c638621228b797d59f7811694025a8c (MD5) Previous issue date: 2016-02-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os acidentes ofídicos constituem um relevante problema de saúde pública, a qual deve receber cuidados rápidos e eficientes. Em relação ao ofidismo, no Brasil, somente há poucos anos foi definida uma política abrangente que enfocasse as múltiplas questões relacionadas aos acidentes humanos provocados por animais peçonhentos. Os venenos de serpentes apresentam uma mistura de compostos inorgânicos (íons metálicos) e orgânicos, sendo ricos em moléculas biologicamente ativas. Dentre essas moléculas, peptídeos, proteínas e compostos de baixa massa molecular são frequentemente estudados por apresentarem grande potencial terapêutico. Essas moléculas, se bem conhecidas, podem ser utilizadas na investigação de mecanismo moleculares e celulares. Além disso, estabelecem interessantes modelos moleculares para o desenvolvimento de estratégias biotecnológicas aplicáveis na criação de ferramentas experimentais e/ou agentes terapêuticos para a pesquisa básica e aplicada. Diante disso, a elucidação dos peptídeos hipotensores presentes no veneno crotálico da subespécie Crotalus durissus terrificus é o objetivo do presente trabalho. Este estudo poderá promover a identificação de outras moléculas hipotensoras podendo conter princípios ativos mais eficientes para o tratamento de quadros clínicos de hipertensão, doença esta que acomete milhares de pessoas no mundo todo. No presente trabalho, a porção peptídica do veneno da serpente C.d.t., apresentou rendimento médio de 12,8% em relação ao veneno bruto, sob condições de precipitação das proteínas totais na presença de ácido trifluoracético à 0,1% (v/v) e, quando submetida à estratégia de purificação por cromatografia líquida de fase reversa, 13 frações foram separadas. Por meio de ensaios de contratilidade de tecido isolado in vitro de músculo liso (artéria mesentérica), evidenciou-se que a fração I e a fração V apresentaram efeitos hipotensor e hipertensor, respectivamente. A fração I foi identificada com a sequência QHILIYVGVHD e massa molecular 1274,67 Da. Atualmente, esta molécula hipotensora identificada no presente trabalho foi submetida à síntese peptídica para posteriormente, avaliar-se este peptídeo hipotensor na sua forma sintética, seu efeito hipotensor por meio do ensaio de contratilidade de tecido isolado in vitro de músculo liso em relação ao fármaco Captopril. / The snakebites are an important public health problem, which must receive quick and efficient care. Regarding the ophidism, in Brazil, only a few years ago a comprehensive policy was defined that emphasized multiple issues related to human accidents caused by venomous animals. The snake venoms present a mixture of inorganic and organic compounds, being rich in biologically active molecules. Among these molecules, peptides, proteins and low molecular weight compounds are often studied by their ability therapeutic. Those molecules, when well known, may be used in the investigation of cellular and molecular mechanism. In addition, it provides interesting molecular models for the development of biotechnological strategies applicable in the creation of experimental tools and / or therapeutic agents for basic and applied research. Therefore, the elucidation of hypotensive peptides present in the venom of Crotalus durissus terrificus subspecies is the aim of this study, once this study may promote the identification of other hypotensive molecules may contain more effective active ingredients for the treatment of clinical conditions hypertension, this disease affecting millions of people in the world. In this study, the peptide portion of the venom of the snake Cdt, performed with an average yield of 12.8% compared to the venom under total protein precipitation conditions in the presence of trifluoro acetic acid to 0.1% (v / v) and, when subjected to purification strategy for reversed-phase liquid chromatography, 13 fractions were separated. Using isolated tissue contractility in vitro smooth muscle (mesenteric artery), was evidenced that the fraction I and fraction V showed hypotensive and hypertensive effects, respectively. Fraction I was identified with the QHILIYVGVHD sequence and molecular mass 1274.67 Da. Currently, this hypotensive molecule identified in this study was submitted to the peptide synthesis to subsequently evaluate this hypotensive peptide in its synthetic form, its hypotensive effect through tissue contractility assay isolated in vitro smooth muscle compared to Captopril medicine.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:24:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-12Bitstream added on 2014-06-13T19:10:41Z : No. of bitstreams: 1 anderlini_rp_me_botfm.pdf: 335403 bytes, checksum: 9368ef42c305b23ce4f7419eafcd9557 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A administração de soros heterólogos de origem eqüina constitui o único tratamento para os acidentes ofídicos, porém estes são capazes de induzir reações de hipersensibilidade. Novos processos de hiperimunização em animais alternativos vêm sendo desenvolvidos, juntamente à ferramentas de destoxificação dos venenos e novas alternativas de adjuvantes. No presente trabalho, foi utilizado veneno de Crotalus durissus terrificus nativo (VN) e irradiado com Co60 (VIr), em quatro diferentes protocolos de hiperimunização, para uma avaliação quinzenal do perfil imunológico dos grupos de ovinos pela técnica de ELISA. Os animais foram avaliados clinicamente todos os dias e pesados a cada 14 dias. Ao final, foram inspecionados em frigorífico para aprovação de consumo e os rins, analisados histologicamente. Os soros obtidos foram avaliados quanto à capacidade de neutralização por meio de testes “in vitro”. O momento quatro (M4) apresentou o maior nível de titulação nos quatro grupos, porém o G1, inoculado com VN associado ao adjuvante incompleto de Freund (AIF), apresentou o maior nível quando comparados com os demais grupos, inoculados com VN associado à sílica nanoestruturada SBA-15 (G2), VIrr associado ao AIF (G3) e VIrr associado a SBA-15. Não houve diferença estatística entre os grupos em relação ao ganho de peso. Apenas um animal apresentou lesão no local de aplicação. Todos as carcaças obtiveram um carimbo de aprovação para consumo do Serviço de Inpeção Federa (SIF)l. Não houve alterações histológicas renais características de envenenamento crotálico. Os soros produzidos pelos quatro grupos foram capazes de neutralizar o efeito letal do veneno de Crotalus durissus terrificus, observados pelos testes de neutralização. O protocolo convencional de imunização utilizado no grupo um (G1) mostrou-se mais eficiente na neutralização do efeito letal quando comparados com os demais protocolos. / The administration of heterologous antivenoms raised in horses is considered the only treatment for envenoming by venomous animals. However, it causes hypersensitivity reactions. New hyperimmunization processes in alternatives animals have been developed, associated to detoxication of venoms an new alternatives of adjuvants. In the present study it was used the natural (NV) and Co- 60-irradiated (IrrV) Crotalus durissus terrificus venom, in four differents protocols for a evaluation every fifteen days of the immunological response of the four ovine groups by the ELISA test. The clinical evaluation of the animals was performed and the weigth obteined every fourteen days, submited to a frigorific inspection and histological kidneys analysis. The neutralization capacity of the serum produced was evaluated in “in vitro” test. The fourth moment presented the major titles for all groups. However, the first group (G1), inoculated with NV associated with Freund’s incomplet adjuvant (FIA) and aluminiun hidroxide presented the major titles when compared with the other ones, inoculated with NV associated to SBA-15 (G2), IrrV associated with FIA (G3) and IrrV associated with SBA-15 (G4). There was no estatistic difference between the groups concerning the weigth analysis. Only one animal presented lesion at the inoculation site. All the carcass obtained the consume aprovation stamp of the Federal Inspection Service (FIS). There was no kidney lesions on histological analysis. The four serum produced were able to neutralize the letal effect of Crotalus durissus terrificus venom, showed by the neutralization test. The convencional immunization protocol used for the first group (G1) showed more efficient neutralization capacity when compared with the others groups.