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L’émergence de la résistance à une multitude d’agents antimicrobiens chez des bactéries pathogènes est considérée comme une menace majeure pour la santé publique (2). Ces souches sont reconnues comme des organismes multirésistants aux médicaments ou MDR (multidrug-resistant) (4). Les recherches progressent chez les bactéries, à Gram positif, à Gram négatif et acido-alcoolo-résistantes au vu de l’ampleur de la menace pour la santé publique, ces bactéries multirésistantes sont devenues les cibles potentielles à cette fin de recherche. De ce fait, les objectifs de la présente étude ont consisté en la caractérisation structurale et fonctionnelle de différents transporteurs transmembranaires de la famille des RND (Resistance-Nodulation-Division) encore énigmatiques, à savoir: le MmpL3 chez Mycobacterium tuberculosis (Mtb) via l’étude de son orthologue CmpL1 chez Corynebacterium glutamicum (Cgl) et le TriAxBC chez Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). Ainsi, comme première démarche présentée dans le chapitre 2, la structure du transporteur MmpL3 Mtb (un transporteur d'acides mycoliques – sous forme de tréhalose de monomycolates (ou TMM) - essentiel pour la viabilité de Mtb) (5) et celle de son orthologue CmpL1 Cgl ont été prédites via le serveur I-TASSER (6-8). Ces structures ont été validées par la suite en comparant à la carte électronique générée pour CmpL1 (18 Å) par des analyses de microscopie électronique en transmission à coloration négative (TEM). La caractérisation du transporteur CmpL1 purifié par chromatographie à exclusion stérique a confirmé le complexe trimérique de taille avoisinant les 315 KDa (incluant la couronne du détergent) en accord avec des analyses par gel SDS-PAGE. Des études génétiques et biochimiques en collaboration ont d’autre part identifié des résidus engagés dans le transport du TMM chez MmpL3 ainsi que d’autres impliqués dans la résistance à des inhibiteurs ciblant ce transporteur. L’ensemble de ces données a mis en évidence la localisation des résidus essentiels au transport et à la résistance au niveau du canal central du modèle trimérique de MmpL3. La région de MmpL3 activant le transport par force protomotrice a été localisée au niveau d’une cavité centrale qui est une caractéristique intrinsèque de la famille des RND. Les cartes électroniques de faible résolution déjà obtenues pour la protéine CmpL1 font de ce projet une des directions futures du laboratoire. Dans le chapitre 3, nous illustrons le deuxième aspect du présent projet qui repose sur l’extension de l’étude du potentiel thérapeutique du ciblage du transporteur transmembranaire MmpL3 chez les différentes souches de Mycobacterium. Nos collaborateurs ont effectué une analyse biochimique de l’effet thérapeutique des inhibiteurs les plus prometteurs du transporteur MmpL3 Mtb sur certaines souches mycobactériennes non-tuberculeuses (NTB) multi-résistantes. Basés sur nos modélisations structurales comparatives obtenues par I-TASSER (6-8), nous avons pu complémenter les informations biochimiques en soulignant les similitudes et les différences de structure entre les souches TB et NTB ainsi que leurs impacts fonctionnels. Ce chapitre met en évidence l’intérêt du ciblage thérapeutique de MmpL3 chez les espèces NTB. En effet, l’efficacité de certains inhibiteurs de MmpL3 Mtb sélectionnés sur le traitement des infections pulmonaires NTB promet de pouvoir généraliser cette nouvelle voie de traitement pour d’autres souches multi-résistantes NTB voire à contribuer à remédier à la problématique de la résistance aux antibiotiques et décomplexifier le traitement actuel. D’autres études en collaboration entreprenant les mêmes approches d’études structurales ont été réalisées pour les transporteurs tripartites TriAxBC (P. aeruginosa), des pompes à efflux appartenant à la famille des RND. Le but du chapitre 4 était de générer une structure du complexe et de déchiffrer son mode d’assemblage et d’expulsion des antibiotiques vers le milieu externe. Un modèle à structure quaternaire de TriAxBC a été prédit par I-TASSER (6-8) et validé contre sa carte électronique à 4.3 Å générée en Cryo-EM. Le complexe TriAxBC a été également caractérisé par filtration sur gel confirmant une taille approximative de 620 KDa et sa composition en trimère par visualisation sur gel SDS-PAGE. En conclusion, nous avons pu à travers cette étude combiner différentes approches biochimiques, génétiques et structurales soutenant la nécessité d’une approche multidisciplinaire pour l’approfondissement de la compréhension de la structure et du mode de fonctionnement des transporteurs RND. Ces derniers demeurent toujours énigmatiques; toutefois, nos avancées et d’autres à venir permettront la génération de nouveaux médicaments spécifiques traitant les bactéries multirésistantes. / The emergence of resistance to a multitude of antimicrobial agents in pathogenic bacteria is considered a major threat to public health (2). These strains are recognized as multidrug resistant organisms (MDR) (4). Research is progressing in Gram positive, Gram positive high GC and Gram negative bacteria, and given the scale of the public health threat, these MDR have become potential targets for this research. The objectives of the present study consist of the structural and functional characterization of various transmembrane transporters of the still enigmatic RND (Resistance-Nodulation-Division) family, namely: MmpL3 in Mycobacterium tuberculosis (Mtb) via the study of its ortholog CmpL1 in Corynebacterium glutamicum (Cgl) and TriAxBC in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). The first component of this project, presented in Chapter 2, studies the structure of the transporter MmpL3 Mtb (a TMM mycolic acid transporter essential for the viability of Mtb (5) and that of its CmpL1 Cgl orthologue, which have been predicted via the I- Tasser Pack (6-8). These structures were subsequently validated by comparing to the electronic map generated for CmpL1 (18 Å) by negative staining transmission electron microscopy (TEM). Characterization of the purified CmpL1 transporter by size exclusion chromatography confirmed the trimeric complex size around 315 KDa (including the detergent crown) corroborated by SDS-PAGE gel analyses. Collaborative genetic and biochemical studies have also identified residues involved in the transport of TMM in MmpL3 as well as those residues conferring antibiotic resistance. This data highlighted the location of the essential residues of transport and resistance in the central channel of the trimeric Mmpl3 model. The MmpL3 region activating proto-motor transport has been located at a central cavity, which is an intrinsic feature of the RND family. The low-resolution electronic maps obtained for the protein CmpL1 may serve as the foundation of future studies. In Chapter 3 we explore the therapeutic potential of the targeting of the transmembrane transporter MmpL3 in different Mycobacterium strains. Our collaborators studied the therapeutic effect of the most promising inhibitors of the MmpL3 Mtb transporter on certain multi-resistant mycobacterial non-tuberculous (NTB) strains. Based on our comparative structural modeling obtained by I-TASSER (6-8), we supplemented the biochemical data by highlighting the structural similarities and differences between the TB and NTB strains as well as their functional impacts. This chapter highlights the interest of direct or indirect targeting of MmpL3 in NTB species. Indeed, the efficacy of certain selected MmpL3 Mtb inhibitors on the treatment of NTB pulmonary infection have potential as generalizable treatment options for other NTB multi-resistant strains, or even to help address the problem of resistance to antibiotics and simplify current combination approaches. Other collaborative studies undertaking the same structural approaches were carried out for TriAxBC tripartite carriers (P. aeruginosa), efflux pumps belonging to the RND family. The purpose of Chapter 4 was to generate a structure of the complex and decipher its mode of assembly and expulsion of antibiotics from the intracellular environment. A quaternary structure model of TriAxBC was predicted by I-TASSER (6-8) and validated against its 4.3 Å electronic map generated by Cryo-EM. The TriAxBC complex was also characterized by gel filtration confirming an approximate size of 620 KDa and its trimer composition by SDS-PAGE. In conclusion, this study is combining different biochemical, genetic and structural approaches to highlight the need for a multidisciplinary approach to characterizing the structure function of RND transporters. The latter remain enigmatic; however, our contribution and the progress of others will allow the generation of new specific drugs targeting multiresistant strains.

<p>Two species of <i>Neisseria</i>, <i>N. meningitidis</i> and <i>N. gonorrhoeae</i>, are obligate human pathogens that cause meningitis and gonorrhea, respectively. Although generally asymptomatic, <i>N. meningitidis</i> can cause invasive meningococcal disease with high mortality rate. Due to emerging antibiotic resistance strains of <i>N. gonorrhoeae</i>, the Centers for Disease Control and Prevention (CDC) have designated it as an urgent threat to public health. Therefore, immediate interventions are required for fight against these Neisserial pathogens. Iron is an essential nutrient for all bacteria, including <i>Neisseria</i>. However, free iron is scarce in human, therefore, <i>Neisseria</i> have evolved to acquire iron from host proteins. These iron acquisition systems are immunogenic and important for infection and are promising therapeutic targets.</p> <p> In the host, lactoferrin sequesters free iron and limits iron availability to pathogens. However, <i>Neisseria</i> have evolved machinery to hijack iron directly from lactoferrin itself. Lactoferrin binding proteins, LbpA and LbpB, are outer membrane proteins that together orchestrate the acquisition of iron from lactoferrin. Additionally, LbpB serves an additional role in providing protection against host cationic antimicrobial peptides and innate immune response. Despite studies aimed at deciphering the roles of LbpA and LbpB, the molecular mechanisms underpinning iron acquisition and immune protection remain unknown. Here, we investigated the role of the lactoferrin binding proteins in iron acquisition and protection against cationic antimicrobial peptides. We obtained three-dimensional structures of <i>Neisseria</i> LbpA and LbpB in complex with lactoferrin using cryo-electron microscopy and X-ray crystallography. These structures show that both LbpA and LbpB bind to C-lobe of lactoferrin, albeit at distinct sites. Structural analyses show that while lactoferrin maintains its iron-bound closed conformation in the LbpB-lactoferrin complex, it undergoes a large conformational change from an iron-bound closed to an iron-free open conformation upon binding to LbpA. This observation suggest that LbpA alone can trigger the extraction of iron from lactoferrin. Our studies also provide an explanation for LbpB’s preference towards holo-lactoferrin over apo-lactoferrin and LbpA’s inability to distinguish between holo- and apo-lactoferrin. Furthermore, using mutagenesis and binding studies, we show that anionic loops in the C-lobe of LbpB contribute to binding the cationic antimicrobial peptide lactoferricin. Solution scattering studies of the LbpB-lactoferricin complex showed that LbpB undergoes a small conformational change upon peptide binding.</p> Together, our studies provide structural insights into the role of the lactoferrin binding proteins in iron acquisition and evasion of the host immune defenses. Moreover, this work lays the foundation for structure-based design of therapeutics against <i>Neisseria</i> targeting the lactoferrin binding proteins.

Zobrazovanie pomocou kryo-elektrónovej mikroskopie má svoje nezastúpiteľné miesto v analýze viacerých biologických štruktúr. Lokalizácia buniek kultivovaných na mriežke a ich segmentácia voči pozadiu alebo kontaminácii je základom. Spolu s vývojom viacerých metód hlbokého učenia sa podstatne zvýšila úspešnosť úloh sémantickej segmentácie. V tejto práci vyvinieme hlbokú konvolučnú neurónovú sieť pre úlohu sémantickej segmentácie buniek kultivovaných na mriežke. Dátový súbor pre túto prácu bol vytvorený pomocou dual-beam kryo-elektónového mikroskopu vyvinutého spoločnosťou Thermo Fisher Scientific Brno.

Pentameriska ligandstyrda jonkanaler (pLGICs) är avgörande för omvandlingen av kemisk till elektrisk signalöverföring i djurs nervsystem. Dysfunktion i dessa kanaler har visat sig vara kopplad till flera sjukdomar inklusive epilepsi, schizofreni, Alzheimers och autism, vilket gör dem till en måltavla för en mängd olika läkemedel. Att studera eukaryota kanaler är dock mycket utmanande, så upptäckten av prokaryota homologer, som är mycket lättare att studera, har därmed bidragit mycket till förståelsen för struktur och funktion hos proteiner i denna familj. I detta projekt producerades och renades en prokaryotisk pLGIC kallad DeCLIC från Escherichia coli. Strukturell bestämning av kanalen genomfördes med användning av kryo-elektronmikroskopi vid lågt pH och i närvaro av kalcium. En elektrontäthet med 3.4 Å upplösning uppnåddes och jämfördes med tidigare bestämda strukturer vid olika förhållanden i ett försök att bestämma hur proteinets struktur moduleras av kalcium och pH. Resultaten visar flera skillnader i kanalens konformation i närvaro och frånvaro av kalcium såväl som vid olika pH-värden. Dessutom antyder analys av den bestämda elektrontätheten ett möjligt intermediärt tillstånd vid lågt pH i närvaro av kalcium. / Pentameric ligand-gated ion channels (pLGICs) are crucial for the conversion of chemical to electrical signaling in the nervous system of mammals. Dysfunction in these channels has been found to be connected to several diseases including epilepsy, schizophrenia, Alzheimer’s, and autism, making them the target of a wide variety of therapeutic agents. However, studying eukaryotic channels is challenging so the discovery of prokaryotic homologs that are much easier to study has thus greatly helped in the understanding of the structure and function in this family of proteins. In this project, a prokaryotic pLGIC called DeCLIC was produced and purified from Escherichia coli. Structural determination of the channel was pursued using cryo-electron microscopy at a low pH and in the presence of calcium. An electron density at 3.4 Å resolution was achieved and compared to previously determined structures at different conditions in an attempt to determine the structural modulation of calcium and pH. Results show multiple differences in channel conformation in the presence and absence of calcium as well as in different pH conditions. Furthermore, analysis of the determined electron density suggests a possible intermediate state at low pH in the presence of calcium.

Einleitung: Die oberflächliche Beugesehne (OBS) ist die am häufigsten verletzte Struktur des Bewegungsapparates von Pferden. Verletzungen der OBS verursachen ökonomische Einbußen im Pferdesport, sind unter Tierschutzaspekten hochrelevant und sind gekennzeichnet von langen Rekonvaleszenzzeiten von 9--18 Monaten und einer Wiederverletzungsrate von bis zu 80 %. Um Sehnenverletzungen, deren Heilung und den Therapieerfolg zu detektieren, bedarf es grundlegender Kenntnisse der Sehnenbiomechanik. Zur Anwendung kommende Messmethoden sollten idealerweise hochpräzise, minimalinvasiv und über einen längeren Zeitraum einsetzbar sein. Bislang etablierte Methoden genügen diesen Ansprüchen nur teilweise. Daher soll biplanare Hochfrequenz-Fluoreszenz-Kinematografie (FluoKin) als aktueller Goldstandard für Bewegungsstudien auf ihren Einsatz an equinen Sehnengewebe geprüft werden. Ziele der Untersuchungen waren es daher, 1) die Messgenauigkeit von FluoKin zu bestimmen und hinsichtlich Dehnbarkeitsmessungen equiner OBS zu evaluieren, 2) eine Technik zur Nutzung von FluoKin (3D-Röntgenmethode) zu finden, um die Bewegung eines Weichteilgewebes im Röntgenvideo zu visualisieren, 3) diese Methodik in zyklischen Zugprüfversuchen mit gesunden und Kollagenase-geschädigten OBS ex vivo zu prüfen und dafür eine geeignete Haltevorrichtung für die Sehnen zu entwickeln, 4) in einem Pilotversuch die Technik in vivo zu übertragen und in wiederkehrenden Messserien die Dehnung von gesundem, verletztem und heilendem Sehnengewebe zu messen. Tiere, Material und Methoden: Die Präzisionsmessungen wurden mit einem maßgefertigten Testplättchen und einer gefrorenen distalen Vordergliedmaße (VGlm) jeweils statisch (1976 und 5473 Bilder) und in Bewegung (2816 und 5021 Bilder) durchgeführt. Die Sehnenhaltevorrichtung inkl. Kryo-Klemme wurde neben dem Einsatz in der Ex-vivo-Studie zusätzlich Langzeittests (bis 50 min) und Rupturversuchen bis 10 kN (Maschinenlimit) unterzogen. Im Rahmen der Ex-vivo-Zugprüfversuche wurden 13 OBS von VGlm in Schritt (2 %)- und Trab (4 %)-simulierender Dehnung zyklisch getestet. Vier weitere Proben wurden mit Kollagenase inkubiert und inkl. einer Kontrollgruppe (n=4) bei 6 % getestet. Die biomechanischen Kenngrößen wurden von der Zugprüfmaschine erfasst und anhand der Bewegung von implantierten, röntgendichten Markern in zeitgleich aufgenommenen FluoKin-Videos errechnet. In der In-vivo-Langzeitstudie (37 Wochen) wurde in vier FluoKin-Messungen das Dehnverhalten der OBS beider VGlm eines Shetland Ponys in Schritt und Trab ermittelt. Vor der zweiten FluoKin-Messung wurde im mittleren metakarpalen Segment einer OBS eine Sehnenläsion mit Kollagenase induziert, deren Heilungsverlauf verfolgt wurde. Die Ergebnisbeschreibung erfolgte sowohl deskriptiv als auch bei entsprechender Stichprobengröße mit t-Tests (p<0,05). Ergebnisse: In Präzisionsmessungen wurden sowohl die Messgenauigkeit der FluoKin-Anlage (max. Exaktheit von 0,0287 mm ± 0,0377 mm), als auch die zu erwartende Standardabweichung in der studienrelevanten Region (Os metacarpale III, OBS) ermittelt. Im Rahmen der Ex-vivo-Zugprüfversuche wurde eine Haltevorrichtung inkl. Kryo-Klemme für equine OBS entwickelt, welche Probleme herkömmlicher Einspanntechniken zuverlässig löst. Erstmals konnten biomechanische Kenngrößen für die OBS von Shetland Ponys ermittelt werden. Im Mittel konnten abhängig von der Dehnungsrate (simulierter Schritt und Trab) eine Maximalkraft von 325 bzw. 953 N, eine Zugfestigkeit von 1649 bzw. 4820 N/cm² und ein Elastizitätsmodul von 828 bzw. 1212 MPa verzeichnet werden. Nach Inkubation mit Kollagenase stieg die Längenänderung im Mittel um 4,87 %. In vivo konnte die Dehnungszunahme der geschädigten OBS im Schritt bestätigt werden (2,86 % auf 3,38 %); im Trab zeigte sich hingegen ein Abfall (6,78 % auf 5,96 %). Schlussfolgerungen: FluoKin wurde als hochpräzise und minimalinvasive Messtechnik zur Ermittlung der Sehnendehnung equiner OBS ex vivo und erstmals in vivo erfolgreich eingesetzt. Dank der neu entwickelten Haltevorrichtung inkl. Kryo-Klemme konnten langandauernde Ex-vivo-Zugprüfversuche durchgeführt werden. Hierbei zeigten sich Änderungen des Dehnverhaltens der OBS (Konditionierung, Hysterese, Kriechphänomen), was die Notwendigkeit solcher Versuche für die Beschreibung des biomechanischen Verhaltens von Sehnen verdeutlicht. Der In-vivo-Pilotversuch unterstreicht die Bedeutung von FluoKin für innovatives und hochpräzises Monitoring von Sehnenläsionen in Langzeitstudien.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Sehnengewebe 2.1.1 Histologischer und molekularer Aufbau 2.1.2 Biomechanik 2.1.3 Einflüsse auf die Sehnenstruktur und -zusammensetzung 2.2 Tendinopathien der oberflächlichen Beugesehne 2.2.1 Ätiologie 2.2.2 Heilung 2.3 Möglichkeiten zur Bestimmung der Sehnendehnbarkeit 2.3.1 Ex-vivo-Zugprüfversuche mit Sehnen 2.3.2 In-vivo-Ermittlung der Sehnendehnbarkeit 2.4 Zentrale Fragestellungen 3 Publikation 1 Zyklische Zugprüfversuche mit einer neuartigen Kryo-Klemme an oberflächlichen Beugesehnen von Shetland Ponys kombiniert mit biplanarer Hochfrequenz-Fluoreszenz-Kinematografie 4 Publikation 2 Biplanare Hochfrequenz-Fluoreszenz-Kinematografie an der oberflächlichen Beugesehne eines Shetland Ponys – eine In-vivo-Pilotstudie 5 Diskussion 5.1 Diskussion von Material und Methoden 5.1.1 Ermittlung der Messgenauigkeit von FluoKin 5.1.2 Verwendetes Tiermaterial 5.1.3 Implantationstechnik für Sehnenmarker 5.1.4 Aufbau der Ex-vivo-Zugprüfversuche 5.2 Bestimmung der Sehnendehnbarkeit mit FluoKin 5.2.1 Sehnendehnung ex vivo und in vivo in nativem Sehnengewebe 5.2.2 Sehnendehnung ex vivo und in vivo in Kollagenase-geschädigtem Sehnengewebe 5.3 Schlussfolgerungen und Ausblick 5.3.1 Praktische und klinische Relevanz 5.3.2 Fazit und Perspektiven 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9.1 Bauplan des Messplättchens zur Genauigkeitsbestimmung von FluoKin 9.2 Baupläne der Einspanntechnik für Zugprüfversuche mit equinen OBS 9.2.1 Kronbeinhalterung 9.2.2 Kryo-Klemmen 9.3 Genauigkeit von biplanaren Fluoroskopie-Systemen in Abhängigkeit des Versuchsaufbaus 9.4 Lagerungseinflüsse auf biomechanische Eigenschaften von Sehnengewebe 9.5 Vorträge und Präsentationen während der Doktorarbeitszeit / Introduction: The superficial digital flexor tendon (SDFT) is the most frequently injured structure of the musculoskeletal system of horses. Injuries of the SDFT are relevant under animal welfare aspects, cause substantial economic losses in equestrian sport and are associated by long convalescence times of 9 to 18 months and a re-injury rate of up to 80 %. In order to detect tendon injuries, improve their healing and the success of therapy, fundamental knowledge of tendon biomechanics is required. The measurement methods to be used should ideally be highly precise, minimally invasive and applicable over a long period of time. So far, established methods only partially meet these requirements. Therefore, biplanar high-speed fluoroscopic kinematography (FluoKin) as the current gold standard for movement studies will be tested for its use on equine tendon tissue Aims of the study were therefore 1) to determine the measurement accuracy and precision of FluoKin and to evaluate it with regard to measurements on the equine SDFT, 2) to find a technique for using FluoKin (a 3D X-ray method) for visualizing the movement of a soft tissue in X-ray video, 3) to test this methodology in cyclic tensile tests with healthy and collagenase-incubated SDFT ex vivo and to develop a suitable holding device for the tendons in the testing machine, 4) to transfer the technique in an in vivo pilot study on a pony and to measure the elongation of healthy, injured and healing tendon tissue in measurement series. Materials and Methods: Precision measurements were performed with a custom-made test sheet and a frozen distal forelimb static (1976 and 5473 frames) and in motion (2816 and 5021 frames) resp. The tendon holding device with a cryo-clamp was subjected to long-term cyclic tests (up to 50 min) and rupture tests up to 10 kN (machine limit) in addition to its use in the ex vivo study. As part of the ex vivo tensile testing, 13 SDFT of forelimbs were cyclically tested in walk (2 % strain) and trot (4 % strain) simulated elongation. Four additional specimens were incubated with collagenase and tested including a control group (n=4) at 6 % strain. Biomechanical parameters were recorded by the testing machine and calculated from the movement of implanted radiopaque markers in simultaneously recorded FluoKin videos. In the in vivo long-term study (37 weeks) the strain behaviour of the SDFT of both forelimbs of a Shetland pony at walk and trot were determined in four FluoKin measurements. Before the second FluoKin measurement, a tendon lesion was induced with collagenase in the mid-metacarpal segment of one SDFT, and its healing process was monitored. The description of the results was done both descriptively and, with an appropriate sample size, with t-tests (p<0.05). Results: Measurements to assess the precision of both the FluoKin system (max. accuracy of 0.0287 mm ± 0.0377 mm) and the standard deviation to be expected in the region relevant to the study (Os metacarpale III, SDFT). For the ex vivo tensile tests, a holding device with a cryo-clamp for equine SDFT was developed that reliably solved problems of conventional clamping techniques. For the first time, biomechanical parameters for the SDFT of Shetland ponies could be determined. On average, depending on the strain rate (simulated walk and trot), a maximum force of 325 N and 953 N resp., a tensile strength of 1649 N/cm² and 4820 N/cm² resp. and a modulus of elasticity of 828 MPa and 1212 MPa resp. was recorded. After incubation with collagenase, the change in length increased by an average of 4.87 %. In vivo, this increased elongation of the collagenase-injured SDFT could be confirmed at walk (2.86 % to 3.38 %); in contrast, a decrease in strain was observed at trot (6.78 % to 5.96 %). Conclusions: FluoKin was successfully used as a highly precise and minimally invasive measurement technique to determine the tendon strain of equine SDFT ex vivo and for the first time also in vivo. Thanks to the newly developed holding device with a cryo-clamp, long-term ex vivo tensile tests could be carried out and changes in the strain behaviour of the SDFT became apparent (conditioning, hysteresis, creep). This shows the necessity of such tests for the description of the biomechanical behaviour of tendons. The in vivo pilot study underlines the importance of FluoKin for innovative and highly accurate monitoring of tendon lesions in long-term studies.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Sehnengewebe 2.1.1 Histologischer und molekularer Aufbau 2.1.2 Biomechanik 2.1.3 Einflüsse auf die Sehnenstruktur und -zusammensetzung 2.2 Tendinopathien der oberflächlichen Beugesehne 2.2.1 Ätiologie 2.2.2 Heilung 2.3 Möglichkeiten zur Bestimmung der Sehnendehnbarkeit 2.3.1 Ex-vivo-Zugprüfversuche mit Sehnen 2.3.2 In-vivo-Ermittlung der Sehnendehnbarkeit 2.4 Zentrale Fragestellungen 3 Publikation 1 Zyklische Zugprüfversuche mit einer neuartigen Kryo-Klemme an oberflächlichen Beugesehnen von Shetland Ponys kombiniert mit biplanarer Hochfrequenz-Fluoreszenz-Kinematografie 4 Publikation 2 Biplanare Hochfrequenz-Fluoreszenz-Kinematografie an der oberflächlichen Beugesehne eines Shetland Ponys – eine In-vivo-Pilotstudie 5 Diskussion 5.1 Diskussion von Material und Methoden 5.1.1 Ermittlung der Messgenauigkeit von FluoKin 5.1.2 Verwendetes Tiermaterial 5.1.3 Implantationstechnik für Sehnenmarker 5.1.4 Aufbau der Ex-vivo-Zugprüfversuche 5.2 Bestimmung der Sehnendehnbarkeit mit FluoKin 5.2.1 Sehnendehnung ex vivo und in vivo in nativem Sehnengewebe 5.2.2 Sehnendehnung ex vivo und in vivo in Kollagenase-geschädigtem Sehnengewebe 5.3 Schlussfolgerungen und Ausblick 5.3.1 Praktische und klinische Relevanz 5.3.2 Fazit und Perspektiven 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis 9 Anhang 9.1 Bauplan des Messplättchens zur Genauigkeitsbestimmung von FluoKin 9.2 Baupläne der Einspanntechnik für Zugprüfversuche mit equinen OBS 9.2.1 Kronbeinhalterung 9.2.2 Kryo-Klemmen 9.3 Genauigkeit von biplanaren Fluoroskopie-Systemen in Abhängigkeit des Versuchsaufbaus 9.4 Lagerungseinflüsse auf biomechanische Eigenschaften von Sehnengewebe 9.5 Vorträge und Präsentationen während der Doktorarbeitszeit

<p>Proteins are significant components of living cells. They perform a diverse range of biological functions such as cell shape and metabolism. The functions of proteins are determined by their three-dimensional structures. Cryogenic-electron microscopy (cryo-EM) is a technology known for determining the structure of large macromolecular structures including protein complexes. When individual atomic protein structures are available, a critical task in structure modeling is fitting the individual structures into the cryo-EM density map.</p> <p>In my research, I report a new computational method, MarkovFit, which is a machine learning-based method that performs simultaneous rigid fitting of the atomic structures of individual proteins into cryo-EM maps of medium to low resolution to model the three-dimensional structure of protein complexes. MarkovFit uses Markov random field (MRF), which allows probabilistic evaluation of fitted models. MarkovFit starts by searching the conformational space using FFT for potential poses of protein structures, computes scores which quantify the goodness-of-fit between each individual protein and the cryo-EM map, and the interactions between the proteins. Afterwards, proteins and their interactions are represented using a MRF graph. MRF nodes use a belief propagation algorithm to exchange information, and the best conformations are then extracted and refined using two structural refinement methods. </p> <p>The performance of MarkovFit was tested on three datasets; a dataset of simulated cryo-EM maps at resolution 10 Å, a dataset of high-resolution experimentally-determined cryo-EM maps, and a dataset of experimentally-determined cryo-EM maps of medium to low resolution. In addition to that, the performance of MarkovFit was compared to two state-of-the-art methods on their datasets. Lastly, MarkovFit modeled the protein complexes from the individual protein atomic models generated by AlphaFold, an AI-based model developed by DeepMind for predicting the 3D structure of proteins from their amino acid sequences.</p>

<p>Human noroviruses (HuNoVs) are the leading cause of an acute form of non-bacterial gastroenteritis, where strains belonging to genogroup (G) II are dominant. Upon expression with the baculovirus culture system, virus-like particles (VLPs) of HuNoVs are expected to assemble into T = 3 icosahedral capsid particles resembling the structure of the infectious virion particles. However, some strains were found to assemble into either T = 1 or T = 4 capsids, or a combination of two different capsid forms. In this study, we showed that VLPs of the Virginia 1997 387 (VA387) GII.4 outbreak strain assembled into T = 1, T = 3, and T = 4 capsids upon expression in insect cell culture, the first case for a naturally occurring HuNoV strain to assemble into all three capsid states. TEM analysis revealed that T = 1 icosahedral particles were the most abundant in purified samples, which contrasts previous findings where either T = 3 or T = 4 were the most abundant. We resolved the cryo-EM structures of the T = 1 shell (S) domain, T = 3, and T = 4 particles to 2.24, 2.44, and 3.43 Å, respectively, making them the most resolved norovirus (NoV) structures to date. Single particle cryo-EM 3D analysis showed that the protruding (P) domain of T = 1 and T = 4 VLPs are highly dynamic. Additionally, we showed that T = 3 VLPs are resistant while T = 1 and T = 4 VLPs are sensitive to digestion in the presence of trypsin. This suggested that T = 1 and T = 4 capsids are less stable among the VLPs, which is consistent with the highly dynamic P domain inferred from our cryo-EM 3D analysis. During infection, HuNoVs travel through the gastrointestinal (GI) tract where they encounter a broad range of variable conditions that include pH, ionic strength, and host defenses (e.g., proteases). Our analyses suggest that virions are T = 3 particles as they can survive the GI tract upon exiting the host. We determined the first cryo-EM structure of T = 3 VLPs in complex with the known HuNoV host cell receptor, histo-blood group antigen (HBGA), to a resolution of 2.51 Å, demonstrating that NoV VLPs can serve as a platform in the structural characterization of small ligand molecules. Lastly, we identified a histidine residue retained in the S domain of all identified caliciviruses critical in the assembly of capsids. Our structures and their characterization will contribute to the development of therapeutic agents to combat noroviruses. </p>

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<p dir="ltr">Membrane-dependent enzymes play crucial roles in cellular signaling by transducing extracellular signals into intracellular responses. Phospholipase Cepsilon (PLCe) and diacylglycerol kinase alpha (DGKa) are membrane-associated enzymes regulated by G protein-coupled receptors (GPCRs) and receptor tyrosine kinases (RTKs), controlling signaling pathways essential for numerous cellular processes. PLCe catalyzes the hydrolysis of phosphatidylinositol phosphates into inositol phosphates (IPX) and diacylglycerol (DAG), triggering calcium release from intracellular stores and activating protein kinase C (PKC)-dependent pathways. While PLCe is crucial for normal cardiovascular function, hyperactivation or sustained activation can lead to hypertrophy. Due to structural heterogeneity, previous studies focused on isolated regulatory domains or the catalytic core. In this work, I present the first cryo-EM reconstruction of the largest PLCe fragment to date in complex with an antigen-binding fragment (Fab). This structure reveals the domain architecture of the N-terminal regions of the lipase and defines an extended membrane-binding surface critical for maximal basal and G protein-dependent activity. These findings lay the groundwork for high-resolution structures of the full-length enzyme and its complexes with the small GTPase Rap1A. Additionally, I explored the role of mAKAP in the Rap1A–PLCe pathway, alongside the guanine nucleotide exchange factor (GEF) function of PLCe toward Rap1A. In parallel, cryo-EM studies of DGKa bound to a covalent inhibitor were initiated. DGKa reduces DAG, thereby limiting PKC activity, and its inhibition is emerging as a promising cancer immunotherapy target. We have established a protocol for structural studies of full-length DGKa, which will elucidate its structures in basal and inhibited states.</p>