La biogenèse des ribosomes eucaryotes est un processus complexe qui implique la production et l'assemblage de 4 ARNr et 80 protéines. La production des deux sous-unités du ribosome, 40S et 60S, débute dans le nucléole par la synthèse d'un long précurseur commun contenant les séquences des ARNr matures et se termine dans le cytoplasme où ont lieu les dernières étapes d'assemblage des protéines ribosomiques et de clivage des ARNr. La production de ribosomes nécessite la participation de plus de 200 co-facteurs, qui catalysent les clivages et modifications des ARNr, coordonnent leur repliement et leur association aux protéines ribosomiques, et assurent des étapes de contrôle-qualité. Ces protéines sont associées aux particules en cours de maturation et absentes des sous-unités matures. Cette voie de synthèse, globalement conservée chez les eucaryotes, a été principalement étudiée chez la levure. Cependant, des études récentes ont montré des différences importantes de ce processus entre levure et mammifères. Un des verrous importants pour comprendre la fonction des co-facteurs, est l'absence de données sur la structure des précurseurs des sous-unités ribosomiques. J'ai donc entrepris une étude structurale de l'assemblage cytoplasmique de la petite sous-unité ribosomique chez l'homme par cryo-microscopie électronique à transmission. Le but de ma thèse était de déterminer la structure 3D des précurseurs de la petite sous-unité ribosomique purifiés à différentes étape de leur maturation. Ce travail a été conduit en collaboration avec l'équipe du Pr. Ulrike Kutay (ETH Zurich) pour la purification des particules pré-40S à partir de cellules humaines. La première structure 3D de particule pré-40S intermédiaire purifiée en étiquetant le co-facteur LTV1 a été déterminée à 19Å de résolution. Dans un deuxième temps, la structure 3D de la particule pré-40S tardive purifiée à via RIO1(KD) a aussi été déterminée à 15Å de résolution. Ces données nous ont permis de proposer un modèle de localisation des co-facteurs sur les précurseurs de la petite sous-unité ribosomique et de montrer une nouvelle différence dans la formation de la petite sous-unité chez l'Homme comparé à la levure, du fait de la présence de la protéine RACK1 sur les particules pré-40S humaines. La comparaison des structures des précurseurs de la petite sous-unité obtenues a permis de mettre en lumière l'existence de remodelages structuraux de la particule pré-40S au cours de sa maturation. Ce travail met en lumière les premières structures 3D de particules pré-40S humaines et pose les fondements méthodologiques d'explorations futures de la dynamique structurale des particules pré-ribosomiques. / Ribosome biogenesis is a complex process that requires the production and the correct assembly of the 4 rRNAs with 80 ribosomal proteins. In Human, the production of the two subunits, 40S and 60S, is initiated by the transcription of a pre-ribosomal rRNA precursor to the mature 18S, 5.8S, and 28S rRNAs by the RNA polymerase I, which is chemically modified and trimmed by endo- and exoribonuclease, in order to form the mature rRNAs. The nascent pre rRNA associated with ribosomal proteins, small ribonucleoprotein particles (snoRNP) and so called co-factors leading to the assembly of an initial 90S particle. This particle is then split into pre-40S and pre-60S pre-ribosomal particles that fallow independent maturation to form the mature subunit into the cytoplasm. Production of eukaryotic ribosomes implies the transient intervention of more than 200 associated proteins and ribonucleoprotein particles, that are absent from the mature subunits. Synthesis of ribosome, globally conserved in eukaryotes, has been principally studied in yeast. However, recent studies reveal that this process is more complex in human compared in yeast. An important bottleneck in this domain is the lack of structural data concerning the formation of intermediate ribosomal subunits to understand the function of assembly factors. Determination of the structural remodeling of pre-ribosomal particles is crucial to understand the molecular mechanism of this complex process. So I have undertaken a structural study on the assembly of the small ribosomal subunit using cryo-electron microscopy and image analysis. The goal of my thesis is to determine the 3D structures of human pre-40S particles at different maturation stages to see the structural remodeling that occurs during the biogenesis of the small ribosomal subunit. We are collaborating with the group of Pr Ulrike Kutay at ETH Zurich, who purify human pre-40S particles. The 3D structures of human pre-40S particles purified at an intermediate and late maturation stages, has been determined with a resolution of 19 and 15Å respectively. Supplementary densities, compared to the mature subunit, indicate the presence of assembly factors and show the unexpected presence of the RACK1 protein in the precursor of the human small ribosomal subunit in the cytoplasm. The comparison of the 3D structures of human pre-40S particle allows showing the structural remodeling that occur during the maturation of the small ribosomal subunit. This work provides the first 3D structure of human pre-40S particles and laid the methodological foundations for future exploration of the structural dynamics of pre-ribosomal particles.

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Au cours de mon travail de thèse, j’ai étudié la structure des deux complexes de protéines, le complexe FANCD2/FANCI et la Phosphorylase kinase (PhK). Les deux complexes ont été étudiés en utilisant la cryo-microscopie électronique combinée à l’analyse d'image. La voie anémie de Fanconi (FA) a été reconnue comme jouant un rôle important dans la réparation de liaisons inter-brin de l'ADN. Dans cette voie, les protéines FANCD2 et FANCI sont des acteurs clés. Dans mon travail de thèse, j’ai calculé la structurale du complexe FANCD2/FANCI humaine. La structure montre une cavité intérieure, assez grande pour accueillir une hélice d'ADN double brin. Nous avons aussi mis en évidence un domaine en forme de tour. Notre collaborateur (M. Cohn, Oxford) a montré que celui-ci est essentiel pour le recrutement du complexe sur l'ADN. La PhK est l'une des kinases les plus complexes. Elle est composée de quatre sous-unités (αβγδ)4. PhK régule le métabolisme du glycogène, intègre divers signaux pour catalyser la conversion du glycogène phosphorylase b (GP) vers la GP a (actif), et la dégradation ultérieure de glycogène. En utilisant un microscope performant et une caméra de détection d'électrons directe puis après plusieurs étapes de traitement d’image, de correction de mouvement de films induits par les faisceaux d'électrons, j’ai obtenu une structure du complexe en 7Å (FSC gold standard). / During my thesis work, I have investigated the structure of two protein complexes, the FANCD2/FANCI complex and the Phosphorylase Kinase complex (PhK). Both complexes were studied using cryo electron microscopy combined with image analysis. The Fanconi Anemia (FA) pathway has been implied to play a significant role in DNA interstrand crosslink repair and may be the coordinator between different DNA damage repair pathways. Within the FA pathway, the FANCD2 and FANCI proteins are key players. In my thesis work, I have calculated the structure of the human FANCD2/FANCI complex. It possesses an inner cavity, large enough to accommodate a double stranded DNA helix. We also discovered a protruding tower domain, which our collaborator (M. Cohn, Oxford) has shown to be critical for the recruitment of the complex to DNA. PhK is one of the most complex kinases. It is composed of four subunits (αβγδ)4. PhK regulates glycogenolysis, it integrates various signals to catalyze the conversion of glycogen phosphorylase (GP) b to GP a (active), and the subsequent breakdown of glycogen. PhK is a potential target for glycemic control in diseases such as diabetes. Using state of the art electron microscope with a direct electron detection camera, after multiple image processing steps and correction of beams induced motion of films, I obtained a structure of the complexe at 7Å (FSC gold standard).

Tato práce se zabývá strukturní studií dvou proteinů: proteinu Tail morphogenetic protein H (TmpH) bakteriofága 812, který napadá Zlatého stafylokoka (Staphylococcus aureus) a hexamerinu z potemníka (Tribolium castaneum). S. aureus je jedním z nejvíce rezistentních patogenů způsobující onemocnění s vysokou morbiditou a mortalitou. Bakteriofág 812 je schopen infikovat a lyzovat 95 % kmenů S. aureus a má potenciální využití ve fágové terapii. Protein TmpH je součástí virionu tohoto fága. V rámci této práce bylo připraveno několik plazmidů nesoucích gen TmpH, které byly použity pro rekombinantní expresi proteinu v buňkách E. coli BL21(DE3). Protein byl vyčištěn afinitní a gelovou chromatografií. Pro čistý protein byly optimalizovány krystalizační podmínky. Hexamerin je nejhojnějším proteinem larev a kukel hmyzu s dokonalou proměnou. V průběhu metamorfózy hexamerin slouží jako zdroj aminokyselin. V rámci této práce byl hexamerin izolován z kukel potemníka T. castaneum. Pro stanovení struktury hexamerinu byly použity dvě metody: rentgenová krystalografie a kryo-elektronová mikroskopie. Byly optimalizovány podmínky pro růst krystalů a vypěstovány krystaly vhodné pro sběr difrakčních dat. Nicméně struktura hexamerinu byla rychleji vyřešena kryo-elektronovou mikroskopií s rozlišením 3.2 . Znalost struktury hexamerinu umožní pochopení jeho funkce v regulaci vývoje hmyzu s dokonalou proměnou.

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La grande majorité des essais cliniques de transfert de gènes in vivo utilise des vecteurs viraux. Si ces derniers sont efficaces, ils présentent des risques immunogènes, toxiques, voire mutagènes avérés. Les vecteurs synthétiques (non viraux), par leur grande modularité et leur faible toxicité représentent une alternative très prometteuse. Le principal frein à leur utilisation est leur manque d’efficacité. L’objectif majeur de ce travail de thèse a été de comprendre le mécanisme de transfert de gènes associé à différents complexes vecteurs synthétiques/ADN plasmidique, ce qui est indispensable pour une conception rationnelle de nouveaux vecteurs. Nous avons étudié, sur cellules en culture, le mécanisme de transfert de gènes associé à deux lipides cationiques ; le BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) et la DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) qui sont connus pour être des vecteurs efficaces in vitro. Nous avons ainsi pu visualiser par microscopie électronique leurs voies d’entrée, leurs remaniements structuraux ainsi que leur échappement endosomal qui représente une étape clé du processus de transfert de gènes. L’identification non ambigüe des lipoplexes tout au long de leur trafic intracellulaire a été rendue possible grâce au marquage de l’ADN par des nanoparticules de silice dotées d’un cœur de maghémite (Fe2O3) dense aux électrons. Cette stratégie de marquage a également été appliquée à l’étude du mécanisme d’action d’un autre vecteur synthétique de type polymère, le copolymère à blocs non ionique P188 ou Lutrol. Contrairement à la plupart des vecteurs synthétiques, celui-ci présente une efficacité de transfection in vivo chez la souris par injection in situ pour le tissu musculaire ou en intra trachéale dans le poumon. En revanche, il est totalement inefficace in vitro. Nous avons montré que le Lutrol permet une augmentation de l’internalisation d’ADN par les cellules mais n’induit pas son échappement endosomal, ce qui expliquerait son absence d’efficacité in vitro. D’autres voies d’entrée sont alors à envisager in vivo pour comprendre son mécanisme d’action. / The vast majority of clinical trials of gene transfer in vivo use viral vectors. Although they are effective, they induce immunogenic, toxic or mutagenic risks. Due to their high modularity and low toxicity, synthetic vectors (non viral), represent a promising alternative despite their lack of effectiveness. The major objective of this work was to understand the mechanism of gene transfer using two prototypic synthetic vectors, in the context of a rational design of new vectors. We studied on cultured cells, the mechanism of action of two cationic lipids; BGTC (bis(guanidinium)-tren-cholesterol) and DOSP (DiOleylamine A-Succinyl-Paromomycine) formulated with plasmid DNA (lipoplexes) which are in vitro efficient vectors. We have been able to visualize by electron microscopy, their intracellular pathways, their structural alterations and their endosomal escape, the latter being a key step in the process of gene transfer. The unambiguous identification of lipoplexes throughout their intracellular trafficking has been made possible thanks to the labelling of DNA by core-shell silica nanoparticles with an electron dense maghemite core (Fe2O3). The labeling strategy has also been applied to study the mechanism of action of a nonionic block copolymer (P188 or Lutrol). Interestingly, these synthetic vectors have an in vivo transfection efficiency in mice lung and muscle tissue while they are totally inefficient in vitro. We have shown that Lutrol induces an increase of DNA internalization into cells and fails to trigger endosomal escape, which would explain the lack of in vitro efficacy. These findings suggest that the in vivo mechanism of action of Lutrol would involve other internalization pathways.

Gleich einem Etikett dient die N-Glykokosylierung vom Ribosom neu synthetisierter Proteine durch die Oligosaccharyltransferase (OST) bei der kotranslationalen Translokation in das Endoplasmatische Retikulum (ER) als Startpunkt vielschichtiger Prozessierungen. Bisher fehlte der strukturelle Nachweis, dass die OST als mit dem Ribosom assoziierten Membranprotein (RAMP) Bestandteil des auf dem proteinleitenden Kanal, dem Sec61-Komplex, basierenden Translokons ist. In dieser Arbeit berichten wir von der kryoelektronenmikroskopischen 3D-Struktur eines definierten OST-Sec61-Ribosom-Komplexes aus Saccharomyces cerevisiae bei 15,4 Å Auflösung. Dazu wurden die Komponenten (OST, Sec61 und Ribosomen mit naszierender Proteinkette) affinitätschromatographisch gereinigt und das Bindungsverhalten mit 80S-Ribosomen in vitro untersucht. Die OST band mit einer KD von 12,8 nM hochaffin und spezifisch an den bekannten Sec61-Ribosomen-Komplex. Dieser in vitro rekonstituierte trimere Komplex zeigte eine neuartige eng an das Ribosom anschließende Translokonstruktur mit zwei bisher unbekannten ribosomalen Verbindungen, einer einzigen dezentralen porenförmigen Vertiefung und zusätzlichen luminalen Bereichen. Durch das Docken eines Sec61-Homologs in einer alternativen Bindeposition sowie das Docken eines Stt3p-Homologs (der katalytischen Untereinheit der OST) und mit Hilfe der mittels (Kryo-)Negativkontrastierung gewonnenen 3D-Struktur der OST konnten Hybridmodelle erstellt werden. Daraus wurde unter Einbeziehung von bekannten molekularbiologisch gewonnenen Interaktionsdaten das 3D-Modell eines aktiven Ribosomen-gebundenen OST-Sec61-Translokons entwickelt. / Like a label, N-glycosylation by the oligosaccharyltransferase (OST) of newly synthesized proteins emerging from the ribosome while being cotranslationally translocated into the endoplasmic reticulum (ER) provides a starting point for a multitude of processes. Hitherto no structural proof has been presented, that the OST as a ribosome associated membrane protein (RAMP) is a constituent of the translocon, based at its core on the protein conducting channel (Sec61-complex). In this work we report on the 3D-structure of a defined OST-Sec61-ribosome complex from Saccharomyces cerevisiae by cryo-electron microscopy at 15.4 Å resolution. Thereto, the components (OST, Sec61, ribosome nascent chain complexes) have been purified by affinity chromatography and the binding of 80S-ribosomes has been checked in vitro. The OST bound with high affinity by a KD of 12.8 nM specifically to the established Sec61-ribosome complex. This trimeric complex reconstituted in vitro exhibits a new kind of tightly bound ribosomal translocon showing two hitherto unknown connections to the ribosome, a single off-center pore-like indentation and an additional luminal domain. By docking of a Sec61 homologue at an alternative binding position plus the docking of a Stt3p homologue (the catalytic subunit of the OST) and by means of the 3D-structure of the OST using the (cryo-)negative staining technique, hybrid models could be created. Consequently, integrating known interaction data from molecular biology experiments has been used to develop a 3D-model of an active ribosome-bound OST-Sec61-translocon.

Zusammenfassung Thema dieser Arbeit sind zwei zentrale biochemische Aspekte der Proteinbiosynthese , wobei das Ribosom eine zentrale Komponente darstellt: erstens wird ein spezieller Faktor des Elongationszyklus in Pilzen, eEF3, und zweitens der proteinleitende Kanal bei der kotranslationalen Proteintranslokation durch die Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) betrachtet. Für die Elongation der Polypeptidkette benötigen alle Organismen zwei Elongationsfaktoren, die GTPasen eEF1A (EF-Tu in Prokaryoten) und eEF2 (EF-G in Prokaryoten). Bei Fungi wird noch ein dritter Elongationsfaktor, eEF3, benötigt. Dieser Faktor ist eine ATPase mit ABC-Kassetten-Domänen. Durch einen nicht bekannten Mechamismus stimuliert er in Gegenwart von ATP die eEF1A-abhängige Bindung von Aminoacyl-tRNA an die ribosomale A-Stelle. Es wurde vorgeschlagen, dass eEF3 die Freisetzung von deacylierter tRNA aus der ribosomalen E-Stelle ermöglicht, und dadurch über allosterische Kopplung die Affinität der A-Stelle für Aminoacyl-tRNA erhöht. In dieser Arbeit wird die Kryo-EM Struktur von ribosomengebundenem eEF3 bei 13,3 Å vorgestellt. Dabei zeigt sich eine vollig neue ribosomale Bindungsstelle für eEF3 von der aus tatsächlich die Affinität für tRNA in der ribosomalen E-Stelle moduliert werden kann. Mit Hilfe der Kristallstruktur von eEF3 wurde ein molekulares Modell für eEF3 in seiner funktionalen Konformation generiert, welches die strukturelle Basis für die Aktivität dieses ABC-Proteins im Kontext der Translation liefert. Bei der kotranslationalen Translokation stellt der heterotrimere Sec61-Komplex einen signalsequenzgesteuerten proteinleitenden Kanal (PCC) dar, der die Translokation eines sekretorischen Proteins durch, oder die Integration von Membranproteinen in die ER-Membran erlaubt. Es wird angenommen, dass der aktive proteinleitende Kanal im ribosomengebundenen Zustand aus einer oligomeren Struktur mit mehreren Kopien des Sec61-Heterotrimers besteht. Die Kristallstruktur eines inaktiven PCC zeigt jedoch nur ein einziges Heterotrimer (Monomer), das auch im aktiven Zustand funktional sein könnte. In dieser Arbeit wird eine Kryo-EM-Struktur des aktiven proteinleitenden Kanals im Komplex mit einem translatierenden Ribosom aus Hefe präsentiert, die die bislang detailierteste Elektronendichtekarte für den PCC zeigt. Als charakteristisches Merkmal kann eine trichterförmige Pore auf der zytosolischen Seite visualisiert werden. Es wurden verschiedene molekulare Modelle für den aktiven Zustand in die Elektronendichte gedockt. Obwohl eine genaue molekulare Interpretation durch die Auflösung (12,3 Å) nach wie vor limitiert ist, erscheint es sehr wahrscheinlich, dass nur ein einziges, geöffnetes Sec61-Heterotrimer im aktiven Kanal vorliegt. / This work presents cryo-EM structures of two active ribosomal ligands in yeast, namely eEF3 and Sec61. Protein synthesis requires two canonical elongation factors in all kingdoms. These are the GTPases eEF1A (EF-Tu in prokaryotes) and eEF2 (EF-G in prokayotes). In fungi, a third elongation factor eEF3 is required, which belongs to the ATP-binding cassette- (ABC-) protein family. This factor is essential for the binding of the aminoacyl-tRNA-eEF1A-GTP ternary complex to the A site of the ribosome and has been suggested to do so by facilitating the clearance of deacyl-tRNA from the ribosomal E-site. The cryo-EM structure of the ATP-bound form of eEF3 in complex with an 80S ribosome shows that eEF3 binds the ribosome in the post-translocational conformation using a novel binding site. From there the affinity for tRNA in the ribosomal E site could be easily modified. Using the crystal structure of eEF3, a molecular model for eEF3 was generated, which provides the structural basis for the activity of an ABC protein in the context of translation. In co-translational translocation the trimeric Sec61-complex serves as a signal sequence-gated protein-conducting channel (PCC) which allows the translocation of a secetory protein through and the integration of a membrane protein into the lipid bilayer of the ER. Bound to a ribosome, the active PCC seems to have an oligomeric structure consisting of several copies of Sec61-trimers. The crystal structure of an inactive PCC, however, shows only a single heterotrimer (monomer) which could also be functional in the active state. The cryo-EM structure of the active PCC in complex with a translating ribosome shows the hitherto most detailed electron density map for the PCC. The most characteristic feature is a funnel-shaped off-centered pore at the cytosolic side. Several models for the active state were docked into the EM-density. Although a precise molecular interpretation is limited by the resolution (12, 3 Å), a single copy of an opened Sec61-heterotrimer seems to be the most reasonable fit for the density.

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