Made available in DSpace on 2014-12-17T15:30:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RodrigoAR_DISSERT.pdf: 1824764 bytes, checksum: fbfdfd8c2f743e113f6663106fda888b (MD5) Previous issue date: 2011-02-04 / In the last years, many scientific researches in implantology have been focused on alternatives that would provide higher speed and quality in the process of osseointegration. Different treatment methods can be used to modify the topographic and chemical properties of titanium surface in order to optimize the tissue-implant reactions by a positive tissue response. This study aimed to evaluate the adhesion and proliferation of mesenchymal cells from human periodontal ligament on two different titanium surfaces, using cell culture techniques. Grade II titanium discs received different surface treatments, forming two distinct groups: polished and cathodic cage plasma nitriding. Human periodontal ligament mesenchymal cells were cultured on titanium discs in 24-well cell culture plates, at a density of 2 x 104 cells per well, including wells with no discs as positive control. Data obtained by counting the cells that adhered to the titanium surfaces (polished group and cathodic cage group) and to the plastic surface (control group), in the 24, 48 and 72-hour periods after plating, were used to analyze cell adhesion and proliferation and to obtain the cell growing curve in the different groups. The data were submitted to nonparametric analysis and the differences between groups were compared by Kruskal-Wallis and Friedman statistical tests. No statistically significant differences were found in the cells counts between the groups (p>0.05). It was concluded that both treatments produced surfaces compatible with the adhesion and proliferation of human periodontal ligament mesenchymal cells / Nos ?ltimos anos, v?rias pesquisas cient?ficas em Implantodontia t?m buscado alternativas que proporcionem maior rapidez e qualidade no processo de osseointegra??o. Diferentes m?todos de tratamento podem ser utilizados para modificar as propriedades topogr?ficas e qu?micas da sua superf?cie do tit?nio, a fim de otimizar as rea??es tecido-implante atrav?s de uma resposta tecidual favor?vel. O presente trabalho teve como objetivo analisar a ades?o e prolifera??o de c?lulas mesenquimais de ligamento periodontal humano a diferentes superf?cies de tit?nio, atrav?s de t?cnicas de cultivo celular. Discos de tit?nio grau II receberam diferentes tratamentos de superf?cie, constituindo dois grupos distintos: polido e nitretado a plasma na configura??o de gaiola cat?dica. C?lulas mesenquimais obtidas do ligamento periodontal de dentes humanos h?gidos foram cultivadas sobre os discos de tit?nio em placas de cultivo de 24 po?os, na densidade de 2 x 104 c?lulas/po?o, incluindo po?os sem discos como controle positivo. Os dados obtidos das contagens das c?lulas aderidas ?s superf?cies de tit?nio (grupo polido e grupo gaiola cat?dica) e ? superf?cie pl?stica (grupo controle), nos intervalos de 24, 48 e 72 horas ap?s o plaqueamento, foram utilizados para analisar a ades?o e prolifera??o celular e obter a curva de crescimento celular nos diferentes grupos. Os dados foram submetidos a an?lises n?o param?tricas e as diferen?as entre os grupos foram comparadas pelos testes estat?sticos Kruskal-Wallis e Friedman. N?o foram encontradas diferen?as estat?sticas significativas nas contagens celulares entre os grupos estudados (p>0,05). Conclui-se que ambos os tratamentos produziram superf?cies compat?veis com ades?o e prolifera??o de c?lulas mesenquimais do ligamento periodontal humano

Os processos de reabsorção radicular externa, geralmente, estão associados aos traumatismos dentários que atingem os tecidos de sustentação e suporte, principalmente a avulsão e a intrusão. A terapia endodôntica nesses casos, deve visar a estabilização ou paralisação deste processo através da utilização de medicação intracanal que possa inibir a atividade osteoclástica, como os bisfosfonatos desde que, esse fármaco seja biocompatível. Neste sentido, o objetivo desse estudo foi analisar a citotoxicidade do alendronato de sódio sobre fibroblastos do ligamento periodontal humano em cultura celular. As células foram cultivadas na densidade de 1 x 10 3 células/placa. Os grupos experimentais foram: G1 (controle) sem alendronato de sódio e G2, G3 e G4 com o alendronato nas concentrações de 10 -5 , 10 -6 e 10 -7 M respectivamente. Nos tempos experimentais de 1, 6, 12 e 24 horas (curto prazo) foi analisada a viabilidade celular e em 2, 4, 6 e 8 dias (longo prazo) a sobrevivência celular. Os resultados em triplicata foram analisados estatisticamente e mostraram que as culturas tratadas com a maior concentração da droga (G2), apresentaram porcentagens de viabilidade celular significantemente menores (p < 0.01), que as dos outros grupos (G1, G3 e G4) nos tempos de 12 e 24 horas. O crescimento celular nos grupos G2 e G3 foram similares. O G2 apresentou crescimento, significantemente menor que dos demais grupos (p < 0.05). Concluiu-se que o alendronato de sódio, em contato direto com fibroblastos de ligamento periodontal humano em cultura, é citotóxico em concentrações mais elevadas (10 -5 e 10 -6 M) / The external root resorption processes are usually associated with dental trauma, mainly avulsion and intrusion. In such cases, the endodontic therapy aims the process stabilization and paralysation, through utilization of medications that can inhibit the osteoclastic activity, like bisphosphonates, since this drug would be biocompatible. The aim of this study was to analyze the sodium alendronate citotoxicity on human periodontal ligament fibroblasts. Cells were plated in a density of 1 X 10 3 cells/dish. The experimental groups were: GI (control) no sodium alendronate, and GII, GIII and GIV with sodium alendronate at the concentrations of 10 -5 , 10 -6 and 10 -7 M, respectively. The experiment times were 1, 6, 12 and 24 hours (short term) for viability and 2, 4, 6 and 8 days (long term) for cell survival. Data in triplicate were statistically analyzed. Cultures treated with the highest alendronate concentration (GII)showed cell viability percentages significantly lower (p < 0.01) than those of the other groups (GI, GIII and GIV), at 12 and 24 hours. Cell growth on GII and GIII groups was similar. GII presented smaller growth than the other groups (p < 0.05). We concluded that sodium alendronate, on direct contact with human periodontal ligament fibroblasts, is citotoxic in concentrations higher than of 10 -6 M

Orientador: Cristina Pontes Vicente / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T06:17:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carneiro_GianeDaniela_M.pdf: 3364731 bytes, checksum: 2f5ed663ad69815d0943761ec70e6408 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: As células progenitoras endoteliais (CPEs) foram descritas por Asahara et al. (1997), isoladas a partir do sangue periférico e são células originadas da medula óssea. Estas células podem ser reconhecidas pela expressão de marcadores como o CD34, CD133, VEGFR2 e o CD31, pela capacidade de internalização de acLDL e de formar estruturas semelhantes a vasos quando cultivas em matrizes tridimensionais. Quando ocorrem lesões endoteliais, elas podem ser mobilizadas da medula migrando para o sangue periférico e atuar no local da lesão arterial, podendo se diferenciar em células endoteliais maduras e promover a re-endotelização do vaso lesionado. Contudo, estas células estão presentes na medula óssea e no sangue periférico em quantidade muito pequena, 0,1 e 0,01% do total de células respectivamente, o que leva diversos grupos de pesquisa buscarem selecionar e cultivar estas CPEs visando aumentar seu número para melhor caracterizá-las in vitro e in vivo. Em nosso trabalho, buscamos estabelecer um meio de cultura capaz de sustentar o crescimento, proliferação e diferenciação das células progenitoras endoteliais isoladas a partir de medula óssea de camundongos C57bl/6, e de caracterizar seus vários estágios de diferenciação destas células em diferentes tempos de cultura. Para tal, células mononucleares foram isoladas da medula de camundongos C57bl/6 por gradiente de Ficoll-Paque PLUS e cultivadas por 3, 7 e 14 dias em meios de cultura diferentes acrescidos de diferentes fatores de crescimento (VEGF, IGF, bFGF e EGF) com concentrações variadas. Dentre todos os meios testados, o DMEM1-M1 (DMEM com vermelho de fenol acrescido de VEGF, IGF e bFGF) foi o que apresentou melhores resultados para os ensaios de proliferação, de viabilidade celular por DAPI, Azul de Tripan e MTT. A partir deste meio foram realizados testes para verificar a expressão de marcadores celulares (CD133, CD34, VEGFR-2 e CD31) por imunocitoquímica, imunofluorescência, Western Blotting e citometria de fluxo. Os resultados de imunocitoquímica e imunofluorescência foram positivos para todos os marcadores, em todos os períodos analisados. A análise por Western Blotting confirmou a expressão destes marcadores, com aumento na expressão de 3 para 7 dias de cultura. Por citometria de fluxo analisamos o perfil destas células em cultura de 7 dias comparando com as células in vivo, e conseguimos visualizar um aumento principalmente na freqüência de células que expressam VEGFR-2, um indicativo de que o meio utilizado está selecionando células progenitoras. A internalização de acLDL que também indica CPEs foi positiva após 7 e 14 dias. As células cultivadas em Matrigel® formaram estruturas semelhantes a vasos após 7 dias de cultura. Nossos resultados indicam que fomos capazes de estabelecer um meio de cultura eficiente na seleção e proliferação de CPEs, inibindo sua diferenciação inicial em células endoteliais, o que nos permitirá utilizar esta técnica de cultura para expandir o número de CPEs obtidas da medula óssea e poder utilizá-las no tratamento de lesões arteriais e em diferentes processos de terapia celular / Abstract: Endothelial progenitor cells (EPCs) were described by Asahara et al. (1997) isolated from peripheral blood, these cells are derived from bone marrow. EPCs can be characterized by the expression of cellular markers like CD34, CD133, VEGFR2 and CD31, internalization of acLDL and formation of structures similar to vessels when culture in tridimensional matrices. In the presence of endothelial lesion, they can be mobilized from bone marrow, migrating to peripheral blood and subsequently the endothelial lesion site. They can differentiate into mature endothelial cells and participate in the re-endothelization of the damaged vessel. However these cells are rare in bone marrow and peripheral blood 0,1 and 0,01%, respectively, several research groups are trying to develop strategies to isolate and cultivate these cells to better determine their characteristics in vitro and in vivo. In our study we tried to establish a culture medium able to sustain growth and proliferation of EPC obtained from C57bl/6 mice bone marrow and characterize the stages of differentiation that they could present in different times of culture. In order to do it, we isolated mononuclear cell from bone marrow using a Ficoll-Paque PLUS gradient and cultivated then for 3, 7 and 14 days using culture mediums with different compositions and concentrations of growth factors (VEGF, IGF, bFGF, EGF). Cellular growth determined by DAPI, trypan blue counting and MTT was more significant with the medium we named DMEM1-M1 (with VEGF, IGF and bFGF). Results obtained with immunocitochemistry and immunofluorescence with this medium was positive in all culture times. Western blotting demonstrated the expression of VEGFR2, CD34 and CD133 in 3 e 7 day, with a litte increase after 7 days. Flow citometry analysis of cells after 7 days in culture demonstrated an increase in cells expressing VEGFR2, indicating the selection of EPC with this medium. Internalization of acLDL and formation of structures similar to vessels were observed after 7 and 14 days in culture and confirms differentiation of mononuclear cells into EPC. So, in conclusion, our results indicate that we developed a culture medium able to sustain proliferation and differentiation of EPCs, inhibiting their terminal differentiation what will allow us to use this culture technique to increase the number of EPC from bone marrow obtained and in the future use these cells in the treatment of arterial lesions in different process of cellular therapy / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

A subespécie Caligo illioneus illioneus, conhecida popularmente por Olho-de-coruja é uma Lepdóptera importante da Mata Atlântica no Brasil, possuindo ampla distribuição Neotropical, sendo predadora voraz de diversas culturas agrícolas de importância econômica quando em seus estádios de lagarta. Desde o descobrimento da primeira estabilização por Grace (1962), mais de 500 linhagens celulares de insetos já foram estabelecidas, sendo ferramentas valiosas para o progresso nos estudos fisiológicos, propagação in vitro de patógenos, pesquisas sobre controle de pragas e na produção de proteínas recombinantes. Porém, poucos trabalhos apresentaram resultados positivos com linhagens de células tronco embrionárias, especialmente em Lepidópteras. Este projeto teve como objetivo obter, isolar e caracterizar células tronco indiferenciadas de ovos embrionados de Caligo illioneus illioneusobtidas a partir de culturas primárias sob protocolo de cultivo celular específico para Lepidópteras, armazenamento em nitrogênio líquido, avaliação da manutenção e expansão in vitro. Através de análises anatômicas e taxonômicas, confirmou-se que a subespécie tratava-se de Caligo illioneus illioneus. As análises ultraestruturais do cório do ovo, através de microscopia eletrônica de varredura, demonstraram variação de 32-35 carenas verticais, havendo diferenças taxonômicas no cório do ovo das espécies do gênero Caligo. Após a obtenção das células do embrião, estas foram isoladas e cultivadas em meio de cultura celular DMEM-High suplementado, em temperatura de 22&deg;C sem a adição de CO2. Foram realizadas as análises de aspectos citológicos, morfologia celular, ciclo celular, análises de imunofenotipagem por citometria de fluxo e potencial elétrico e funcional da membrana mitocondrial. As células apresentaram formato globóide, sem adesão ao substrato, com o núcleo bem delimitado e com baixo volume celular. Os dados obtidos pelas análises do ciclo celular das 4 amostras em diferentes passagens demonstraram que o protocolo estabelecido para a cultura celular foi favorável, com significativo rendimento no número de células, na expansão e criopreservação, confirmado pelo aumento na proporção de células nas fases G2/M e de Síntese, e que as células estavam realizando os processos naturais de interfase e de divisão celular responsável pela embriogênese e crescimento. A análise de imunofenotipagem por citometria de fluxo apresentou marcações positivas com alta expressão para os marcadores de células pluripotentes (Sox2 e Oct 3/4), marcadores de morte celular por apoptose (Caspase 3 e HSP70), marcadores específicos de insetos (Anti Rab-5, Axons BP 102, GM 130 e Dro. FMR1) e marcadores de células de origem mesenquimal (Stro-1, Vimentina), apresentando baixa expressão somente em CD 90. O experimento de potencial elétrico e funcional da membrana mitocondrial apresentou células metabolicamente ativas, não evidenciando diferenças significativas entre as culturas primárias e entre terceira e quinta passagens das 4 amostras. Concluiu-se que foi possível estabelecer um protocolo de cultura celular para Lepidópteras livre de patógenos e que os ovos embrionados de Caligo illioneus illioneus com 3 e 4 dias para a eclosão apresentaram maior duração em cultura celular, possuindo células indiferenciadas, representando, deste modo, uma ferramenta promissora com grande potencial para pesquisas em biotecnologia e biologia molecular, principalmente devido ao fato da espécie ser de importância ecológica, médica e em controle de pragas nas ciências agrárias / Caligo illioneus illioneus subspecies, known popularly by Owl Butterfly, is an important Lepdoptera of the Brazilian Atlantic Forest, with wide distribution Neotropical, being a voracious predator of various agricultural crops of economic importance when in their caterpillar stages. Since discovery of the first stabilization by Grace (1962), over 500 insect cell lines have been established and are valuable tools for progress in physiological studies, in vitro propagation of pathogens, research on pest control and the production of recombinant proteins. However, few studies showed positive results to embryonic stem cell lines, especially in Lepidoptera. This study aimed to obtain, isolate and characterize undifferentiated stem cells of embryonated eggs from Caligo illioneus illioneus, obtained from primary cultures under specific cell culture protocol to Lepidoptera, storage in liquid nitrogen, evaluation of maintenance and expansion in vitro. By means of anatomical and taxonomic analysis, it was confirmed that the subspecies was Caligo illioneus illioneus. Ultrastructural analysis of the egg chorion, by scanning electron microscopy showed variation of 32-35 vertical carina, having taxonomic differences in egg chorion at the Caligo species. After obtaining the embryonic cells, these were isolated and cultured in cell culture medium DMEM-High supplemented, at 22 &deg; C without addition of CO2. They were carried out analysis of cytological aspects, cell morphology, cell cycle, immunophenotyping by flow cytometry and electrical and functional potential of mitochondrial membrane. The cells showed globoid shape without adhesion to the substrate, with well-defined nucleus and low cell volume. Data obtained by cell cycle analysis of the four samples at different passages showed that established protocol for cell culture was favorable, with significant yield relative to the number of cells, the expansion and cryopreservation, confirmed by the increase in the proportion of cells in G2/M and Synthesis phases, and the cells were performing the natural processes of interphase and cell division, responsible for embryogenesis and growth. Immunophenotyping analysis by flow cytometry showed positive markings with high expression for pluripotent cells markers (Sox2 e Oct 3/4), markers of cell death by apoptosis (Caspase 3 e HSP70), specific markers for insects (Anti Rab-5, Axons BP 102, GM 130 e Dro. FMR1) and mesenchymal cell markers (Stro-1, Vimentina), presenting low expression only in CD 90. The electrical and functional potential analysis of mitochondrial membrane has resulted in metabolically active cells, not evidencing significant differences among primary cultures and between the third and fifth passages of 4 samples. It was concluded that it was possible to establish a cell culture protocol to Lepidoptera free from pathogens and that embryonated eggs from Caligo illioneus illioneus with 3 to 4 days for hatching showed longer duration in cell culture, having undifferentiated cells, representing in this way, a promising tool with great potential for research in biotechnology and molecular biology, mainly due to this species have ecological and medical importance and in control pests at the agricultural sciences

Pentoxifilina (PTF), um derivado da metilxantina, tem ação terapêutica como agente antifibrótico. In vitro, a PTF causa inibição na produção de colágeno, glicosaminoglicanos e fibronectina, bem como promove acentuada redução na proliferação dos próprios fibroblastos de quelóides. A PTF na concentração de 1.000 g/mL foi seletiva no controle da inibição da síntese protéica pelos fibroblastos. O objetivo deste estudo foi verificar o comportamento in vitro de fibroblastos oriundos de cicatrizes hipertróficas (HSHF) e de pele não-cicatricial (NHF) na presença e ausência de PTF (1.000 g/mL), quanto à: proliferação celular, produção de colágeno e capacidade dos fibroblastos gerarem contração em modelo experimental de matriz de colágeno. Para tanto, foram utilizados fibroblastos cultivados a partir de amostras de cicatrizes hipertróficas e pele não-cicatricial doadas, com finalidade de pesquisa, pelo banco de Tecidos do Instituto Central do Hospital das Clínicas da FMUSP. Culturas celulares expostas a PTF apresentaram diminuição na proliferação celular em HSHF (46,35%) e em NHF (37,73%) (p<0,0001). Na presença de PTF, foi observada seletividade de inibição na síntese de colágenos, havendo inibição mais expressiva de colágeno tipo III em HSHF e de colágeno tipo I em NHF (p<0,0001). O modelo experimental de matriz de colágeno povoada por fibroblastos de cicatriz hipertrófica apresentou contração menor (12%) na presença de PTF (p<0,0001), em relação à sua ausência / Fibroblasts are thought to be partially responsible for the persisting contractile forces that result in burn contractures. Using a monolayer and fibroblast populated collagen lattice (FPCL) three-dimensional (3D) model we subjected hypertrophic scar and non-cicatricial fibroblasts to the antifibrogenic agent pentoxifylline (PTF) 1000g/mL attempting to reduce proliferation, collagen type I and III synthesis and contraction in this 3D model. Fibroblasts were isolated from post burn hypertrophic scars (HSHF) and non-scarred skin (NHF). Cells were grown in monolayer or incorporated into FPCL\'s and exposed to PTF. In monolayer, cell number proliferation was reduced (46.35% in HSHF group and 37.73% in NHF group) p<0,0001. The PTF also demonstrated to be selective on collagen type I and III synthesis inhibition suggesting higher inhibition of collagen type III on HSHF group and more evident inhibition of type I on NHF group. FPCL\'s containing PTF had surface areas reduced in about 12% p<0,0001. PTF showed inhibition effects on cell proliferation and reduced contraction in both HSHF and NHF

Como neoplasia maligna que mais acomete a cavidade oral, o carcinoma epidermóide gera infinidade de estudos acerca de sua gênese e progressão. O variado perfil genético e protéico observado leva a freqüente insucesso nas terapias adotadas, contribuindo para pobres prognósticos. Este estudo visa compreender melhor o papel da proteína Akt, tida como chave para a proliferação de diversas neoplasias, frente ao estímulo das células derivadas de carcinoma epidermóide humano em cultura (HaCat, HN6, HN19, HN30, HN31) com EGF 10ng/ml e TGF &#946; 5ng/ml. Para tanto, analisou-se a expressão de pAkt, ciclina D1, Bad, caspase-3 e PTEN, através de imunofluorescência, western-blot e imunoprecipitação. Os resultados mostraram aumento da expressão de pAkt e ciclina D1 frente ao tratamento com EGF, bem como diminuição de Bad e PTEN, com exceção de HN31. A imunoprecipitação revelou neste caso que pAkt previne a apoptose através de inativação direta de Bad. Já nas células tratadas com TGF &#946; , obtivemos resultados diferentes do esperado para este supressor de tumor. A expressão de pAkt mostrou-se aumentada nas linhagens celulares, mas estável em HN19 e HN31. Ciclina D1 mostrou aumento em HN6 e HN30, manutenção em HaCat e HN19 e diminuição em HN31. HaCat mostrou queda dos níveis de caspase-3 e Bad, manutenção em HN6, aumento em HN30, aumento somente de Bad em HN31 e HN19 com níveis inalterados após o tratamento para ambas as proteínas. Estes achados sugerem o importante papel desempenhado pelo EGF nas linhagens de carcinoma epidermóide estudadas, e como esta via é importante candidata a ser visada em tratamentos quimioterápicos. A ação do TGF &#946; mostrou discrepâncias, revelando seu comportamento dúbio frente os diversos tipos celulares, e sugerindo possível relação entre este receptor e a via do pAkt, o que requer estudos mais apropriados. A baixa ocorrência de apoptose também reforça esta possibilidade, mostrando como a via do Akt é essencial para a progressão neoplásica e pode estar relacionada a mais eventos celulares do que já sabido. / Squamous cell carcinoma raises a great interest regarding carcinogenesis and its proliferative pathways, due to the high incidence and poor prognosis. The broad genetic and proteic profiles contribute to this poor prognosis. The present study aims to better comprehend the role played by pAkt, key protein for the development of many neoplasms. Cell lines derived from oral squamous cell carcinoma (HaCat, HN6, HN19, HN30 and HN31) were induced with 10ng/ml EGF and 5ng/ml TGF &#946; . The expressions of pAkt, cyclin D1, Bad, caspase-3 and PTEN were analyzed through immunofluorescence, western-blot and immunoprecipitation. Results showed higher pAkt and cyclin D1 expression after EGF treatment, as well as a decrease in Bad and PTEN levels, except for HN31. Immunoprecipitation revealed that pAkt prevents apoptosis through Bad direct inactivation. However, TGF &#946; treatment revealed different results, from what expected for this tumor supressor. pAkt expression revealed to be increased in all cells lines, but stable for HN19 and HN31. HaCat exhibited decreased levels of caspase-3 and Bad, which were unaltered in HN6, augmented in HN30. HN31 revealed only Bad increased levels, and no alterations in HN19. These findings suggest the crucial role played by EGF stimulation in the studied cell lines, and a good candidate to be targeted by chemotherapeutical approaches. TGF &#946; treatment showed discrepancies, revealing diverse behaviors in the different cell lines. An exhisting relation between TGF &#946; receptors and pAkt pathway may not be discharged, requiring further studies. The low occurrence of apoptosis reinforces this possibility, showing how important is Akt and related pathways for neoplastic progression, and its possible relation to cellular events not described to date.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Até a década de 1990 acreditava-se que o DNA era a única molécula alvo das radiações ionizantes. Mas algumas observações questionaram esta teoria. Em 1992 o efeito bystander, em português, efeito espectador, foi descrito por Nagasawa e Little. Este efeito é responsável por uma série de respostas como morte, instabilidade cromossômica ou outras anormalidades que ocorrem em células não irradiadas, que entraram em contato com células irradiadas ou meio irradiado a partir de células irradiadas. Entender o efeito bystander pode ter consequências importantes para a terapia e estudos do risco às exposições de baixas doses de radiação ionizante. Organismos vivos são compostos de milhões de células que, juntas, executam tarefas de grande complexidade. Apesar de cada célula ter uma estrutura interna que obedece às leis da bioquímica, é a interação entre as células que gera uma gama de diferentes fenômenos. Os modelos computacionais buscam soluções elegantes para simular a natureza. Neste trabalho, desenvolvemos um modelo computacional para simular o efeito bystander das radiações ionizantes em culturas celulares. Este modelo computacional é um autômato celular bidimensional, consistindo de duas redes sobrepostas, onde a primeira representa a cultura de células, e a segunda, o meio no qual as células são incorporadas. O modelo computacional descreve o comportamento do efeito bystander para diferentes configurações e densidade de células onde diferentes níveis de sinais são liberados pelas células irradiadas no meio. O efeito de re-emissão de sinais também foi introduzido no modelo. A partir dos dados das simulações foram obtidas equações capazes de antever os resultados experimentais. Os resultados obtidos a partir do modelo computacional e do ajuste matemático mostraram-se em excelente concordância com dados experimentais disponíveis na literatura. Observou-se que há dois pontos de inflexão nas curvas de dose-resposta no regime de baixa dose que podem representar uma adaptabilidade da cultura celular à radiação ionizante, transformando-a mais ou menos rádio resistente. / Until the 1990s it was believed that the DNA was the only target molecule of ionizing radiation. But some observations have questioned this theory. In 1992, the bystander effect was described by Nagasawa and Little. This effect is responsible for a series of answers as death, chromosomal instability or other abnormalities that occur in non-irradiated cells, which get in contact with irradiated or irradiated medium from irradiated cells. Understanding the bystander effect may have important consequences for therapy and exposure risk studies to low doses of ionizing radiation. Living organisms are composed of millions of cells that together perform tasks of great complexity. Although each cell has an internal structure that obeys the biochemistry laws, it is the interaction between the cells that generate a range of different phenomena. Mathematical models seek elegant solutions to simulate nature. In this work, we developed a computer model to simulate the bystander effect of ionizing radiation in cell cultures. This computational model is a two-dimensional cellular automata, consisting of two overlapping networks, where the first represents the cells culture and the second, the medium in which cells are embedded. The computational model describes the behavior of the bystander effect for different configurations and cells density where different signal levels are released by cells irradiated in the medium. The signals re-emission effect was also introduced in this model. From the simulations data, equations capable of predicting the experimental results were obtained. The results obtained from the computational model and the mathematical model are in excellent agreement with experimental data available in the literature. It was observed that there are two inflection points in the dose-response curves in the low dose regime and they may represent a cell culture adaptability to ionizing radiation by transforming it into more or less radio-resistant.

Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular facultativo responsável por listeriose, uma doença de origem alimentar. Dentre os 13 sorotipos de L. monocytogenes existentes, o sorotipo 4b é o mais freqüentemente isolado de humanos, enquanto os sorotipos 1/2a, 1/2b e 1/2c são mais freqüentes em alimentos e amostras ambientais. O estudo da variabilidade de virulência de quatro cepas de L. monocytogenes recentemente isoladas (1/2B - alimento; 1/2C e 4BENV - ambiente de processamento de alimento; 4BCLIN - sangue), além de duas outras cepas de casos de listeriose (P14 e P14A), foi o objetivo deste trabalho. Avaliou-se a capacidade de invasão, proliferação intracelular, citotoxicidade, disseminação intercelular, polimerização de filamentos de actina e transcrição gênica dos genes de virulência actA, plcA e plcB das cepas em modelos celulares eucarióticos MDBK, HeLa e L929. A cepa de origem alimentar 1/2B apresentou características de invasão, taxa de multiplicação (IGC), assim como a disseminação intercelular, semelhantes às cepas clínicas P14 e 4BCLIN em células HeLa. As cepas de origem ambiental (1/2C e 4BENV), apesar da baixa capacidade de invasão em todas linhagens celulares empregadas, apresentaram IGC superior às demais cepas estudadas e disseminação intercelular superior ou similar às cepas clínicas, dependendo da célula eucariótica. As cepas de origem clínica 4BCLIN, P14, P14A tiveram maiores porcentagens de invasão nas linhagens MDBK e L929, porém, em relação à população intracelular (UFC/mL), as cepas 4BCLIN e P14A foram superiores às demais. Estas últimas também foram citotóxicas às células HeLa, induzindo à liberação de LDH e à morte por necrose. Já as cepas de origem alimentar, ambiental e a cepa clínica P14 não foram citotóxicas às células HeLa e MDBK. Em relação à polimerização dos filamentos de actina não houve diferença estatística entre as cepas. Todos os genes de virulência estudados apresentaram maior número de transcritos para as cepas de origem não clínica (1/2B, 1/2C e 4BENV). Sendo assim, todas as cepas de L. monocytogenes estudadas possuem potencial patogênico, por apresentar pelo menos duas características relacionadas à virulência da espécie. Alimentos possivelmente contaminados com estas cepas representam risco à saúde pública. / Listeria monocytogenes is a facultative intracellular pathogen responsible for listeriose, a foodborne disease. Amongst the 13 serotypes of L. monocytogenes, the serotype 4b is more frequently isolated from clinical samples while the serotypes 1/2a, 1/2b and 1/2c are associated with food and food processing environment. The study of the virulence variability of four L. monocytogenes strains recently isolated (1/2B - food; 1/2C and 4BENV - food processing environment; 4BCLIN blood), as well as two strains of listeriosis (P14 and P14A) was the aim of this work. Eukaryotic cellular models HeLa, MDBK and L929 were used to evaluate the invasion capacity, intracellular proliferation, cytotoxicity, intercellular dissemination and polymerization of actin tails of L. monocytogenes strains. Gene transcription of the virulence genes actA, plcA and plcB was also conducted. The food isolate 1/2B presented invasion characteristics, multiplication index (IGC), as well as the intercellular dissemination, similar to the clinical strains P14 and 4BCLIN in HeLa cells. Environmental strains (1/2C and 4BENV), although showing a low capacity of invasion in all cellular models, had the highest IGC comparing to the other isolates. They also showed similar to or higher intercellular dissemination than the clinical ones, depending on the cell line used. The clinical strains 4BCLIN, P14, P14A presented greater invasion capacity in MDBK and L929 cells than all other isolates. However, in relation to the intracellular population (CFU/mL) the isolates 4BCLIN and P14A showed superior results. These strains were also cytotoxic to HeLa cells, inducing LDH release and death due to necrosis. The food, environmental and P14 isolates were not cytotoxic to HeLa and MDBK cells. There was no statistical difference in actin tail polymerization between the strains. The non-clinical isolates (1/2B, 1/2C and 4BENV) presented higher number of transcripts for than the clinical ones. In conclusion, all L. monocytogenes strains studied showed pathogenic potential, based on expression of at least two characteristics related to the virulence of the species. The presence of these strains in food represents public health risk.

A produção de proteínas recombinantes, principalmente para uso farmacêutico, tem sido intensamente estudada, juntamente com suas propriedades físico-químicas, o que possibilita uma melhor escolha da técnica de purificação, e assim, evitar perdas no rendimento e custos elevados. A glicocerebrosidase (GCR) é uma enzima lisossomal, e sua deficiência ocasiona um distúrbio autossômico recessivo denominado doença de Gaucher. Atualmente o tratamento para essa patologia é por meio da Terapia de Reposição Enzimática (TRE), a qual tem sido realizada com grande êxito. Tendo em vista fornecer dados que possam auxiliar na redução do número de etapas cromatográficas no processo de downstream, este trabalho teve como objetivo, a purificação da GCR expressa por células de Ovário de Hamster Chinês (CHO), em meio livre de soro fetal bovino (SFB). Para se alcançar tais resultados, realizou-se o cultivo das células CHO-GCR em meio quimicamente definido livre de SFB (CHO-S-SFM II). Foram realizadas três técnicas cromatográficas (troca iônica, interação hidrofóbica e afinidade), com base em suas propriedades físico-químicas. E para o ensaio da atividade enzimática, foi utilizado o substrato fluorogênico 4-Methylumbeliferyl &#946;-D-glucopyranoside (4MU-G). As células CHO-GCR cultivadas em meio CHO-S-SFM II, apresentando viabilidade maior que 95%, e produção da GCR ativa, durante todo o período de cultivo. Os protocolos aplicados para a purificação da GCR, não apresentaram resultados significativos. Com o volume não retido após cromatografia por interação hidrofóbica, se estimou os valores de KM 2,13 e VMAX 0,0295 UFR/h para as constantes cinéticas da GCR. A diálise no processo de purificação mostrou ser uma etapa necessária para a atividade enzimática da GCR. No cultivo das células CHO-GCR para a formação do banco de trabalho, nos meios RPMI 1640 e &#945;-MEM, ambos com a adição de 10% SFB, não houve diferença significativa no crescimento entre eles, e apresentaram 100% de viabilidade durante todo o período de cultivo. Porém, ao analisar de forma isolada a fase exponencial de cada curva, notou-se que às células cultivadas no meio RPMI 1640, apresentaram taxa de crescimento superior, às cultivadas em meio &#945;-MEM. Concluiu-se que a expressão da GCR em meio livre de SFB, proporciona amostras menos complexas, em relação aos meios de cultura que necessitam de suplementação com SFB, o que pode reduzir o número de etapas cromatográficas, melhorando o rendimento e a redução da perda da atividade da GCR. O meio basal RPMI 1640 com a adição de SFB foi uma alternativa satisfatória para o cultivo das células CHO-GCR. Este estudo forneceu dados que podem contribuir para a melhoria do processo de purificação da GCR. Novas pesquisas podem ser desenvolvidas a fim de melhorar o processo de purificação da GCR. / The production of recombinant proteins, mainly for pharmaceutical use, has been intensively studied along with its physico-chemical properties, which allows a better choice of the purification technique, and thus avoid losses in yield and high costs. Glucocerebrosidase (GCR) is a lysosomal enzyme, and its deficiency causes an autosomal recessive disorder called Gaucher\'s disease. Currently the treatment for this pathology is through Enzymatic Replacement Therapy (ERT), which has been successfully performed. In order to provide data that may help reducing the number of chromatographic steps in the downstream process, this work aimed to purify GCR expressed by Chinese Hamster Ovary (CHO) cells in fetal bovine serum free (FBS). To achieve such results, the CHO-GCR cells were cultured in chemically defined Serum-free medium (CHO-S-SFM II). Three chromatographic techniques (ion exchange, hydrophobic interaction and affinity) were performed, based on their physicochemical properties. And for the enzymatic activity assay, the fluorogenic substrate 4-Methylumbeliferyl &#946;-D-glucopyranoside (4MU-G) was used. CHO-GCR cells cultured in CHO-S-SFM II medium, presenting viability greater than 95% and GCR production active, throughout the culture period. The protocols applied for GCR purification did not present significant results. With the volume not retained after chromatography by hydrophobic interaction, KM values of 2.13 and VMAX 0.0295 UFR/h were estimated for GCR kinetic constants. Dialysis in the purification process was shown to be a step necessary for the enzymatic activity of GCR. In the culture of the CHO-GCR cells for the formation of the working bank, in the media RPMI 1640 and &#945;-MEM, both with the addition of 10% FBS, there was no significant growth difference between them, and they showed 100% viability during all the growing period. However, when analyzing in isolation, the exponential phase of each curve, it was observed that the cells grown in RPMI 1640 medium showed higher growth rates, tham grown in &#945;-MEM medium. It was concluded that the expression of GCR in serum-free medium provides less complex samples, relative to the culture media requiring FBS supplementation, which may reduce the number of chromatographic steps, improving yield and loss reduction of GCR activity. The basal medium RPMI 1640 with the addition of FBS was a satisfactory alternative for culturing the CHO-GCR cells. This study provided data that may contribute to the improvement of the GCR purification process. New research can be developed to improve the GCR purification process.

Anexos fetais como cordão umbilical, membrana amniótica e líquido amniótico foram recentemente sugeridos como fontes ideais de diferentes linhagens de células-tronco, devido à natureza não invasiva do procedimento de isolamento, a grande massa de tecido para colheita de células com alta eficiência e os potenciais de diferenciação. Portanto, o presente estudo teve como objetivo analisar morfologicamente as membranas extraembrionárias através de microscopia de luz e imunohistoquímica e analisar as células oriundas do saco vitelino suíno visando caracterizar qual seu potencial como possível fonte de células-tronco pluripotentes, para futuro uso na terapia regenerativa. Para a imunohistoquímica das membranas, as membranas foram processadas pelas técnicas rotineiras de histologia e em seguida os blocos foram cortados sequencialmente e colocados em laminas previamente silanizadas, o protocolo de imunohistoquímica foi o convencional utilizando os seguintes anti-corpos: Citoqueratina e VEGF. Foram feitos ensaios de concentração e viabilidade celular, avaliação do crescimento celular, caracterização por citometria de fluxo utilizando anticorpos específicos (CD105, NANOG, CD45 e Oct-3/4) e caracterização por imunohistoquímica utilizando os seguintes anti-corpo: CD90, CD105, CD117, Vimentina, Stro-1, Oct-4, VEGF, Beta Tubulina, Citoqueratina e PCNA. O saco vitelino situava-se na porção ventral do embrião, próximo ao cordão umbilical, se mostrando como uma estrutura pequena, contendo poucos vasos e com coloração amarelada, este também apresentou como uma estrutura trilaminar (endoderma, mesênquima e mesotélio), onde a endoderme possuía um epitélio simples cubico, o mesênquima possuindo uma grande quantidade de tecido conjuntivo e o mesotélio contendo células achatadas. O amnio mostrou-se ligado intimamente ao embrião, sendo a primeira membrana fetal considerando a ordem embrião/útero, possuía forma oval e coloração transparente, histologicamente esta membrana é composta por 2 camadas distintas, um epitélio simples pavimentoso e um mesênquima contendo uma substancia amorfa com pouca quantidade de células. A membrana coriônica mostrou-se pouco rugosa e a membrana alantóidea como uma estrutura em forma de meia lua, possuindo uma intensa vascularização, conforme a evolução da gestação fica quase impossível à percepção das duas, formando a membrana córioalantoidea. O córion é constituído por uma camada de células arredondadas, dispostas em formato linear, já o alantoide é caracterizado por seu mesênquima amorfo com uma quantidade pequena de células. Em relação a imunohistoquima todas as membranas expressaram os marcadores VEGF e Citoqueratina. As celulas do saco vitelino mostraram aderência ao plástico e possuindo uma morfologia fusiforme, semelhante a fibroblastos, estas atingiram a confluência de 70% em aproximadamente 20 dias, estas celulas foram mantidas ate a passagem 4, onde posteriormente ocorreu morte celular. Estas celulas possuíam imunofenoipagem semelhante as celulas-tronco mesênquimais e hematopoiéticas, expressando marcadores como CD105, CD90, CD117, Vimentina, Stro-1, Oct-4, VEGF, Beta Tubulina, Citoqueratina, Nanog e PCNA. Do estudo realizado pode-se concluir que: existem células especificas em cada membrana extraembrionária, e que as celulas oriundas do saco vitelino possuem características semelhantes as celulas-tronco mesênquimais e embrionárias, sendo considerada uma ferramenta importante para futuros estudos experimentais de terapia celular na medicina veterinária regenerativa. / Fetal attachments as umbilical cord, amnion and amniotic fluid have recently been suggested as ideal sources of different strains of stem cells, due to the noninvasive nature of the isolation procedure, the large mass of tissue to harvest cells with high efficiency and potential differentiation. Therefore, this study aimed to analyze morphologically membranes extraembryonic by light microscopy and immunohistochemistry and analyze the cells from the yolk sac to characterize this cells as to potential as a possible source of pluripotent stem cells for future use in regenerative therapy. For immunohistochemistry, the membranes were processed by routine histological techniques, and then the blocks were cut sequentially and placed on silanized slides previously, the protocol was the immunohistochemistry conventional using the following antibodies: Cytokeratin and VEGF. Trials were made for concentration and cell viability, cell growth evaluation, and the characterization by flow cytometry using specific antibodies (CD105, NANOG, CD45 and Oct-3/4) and characterization by immunohistochemistry using the following antibody: CD90, CD105, CD117, vimentin, Stro-1, Oct-4, VEGF, beta tubulin, Cytokeratin and PCNA. The yolk sac stood in the ventral portion of the embryo near the umbilical cord, proving how a structure small, few vessels and with yellowed, this also presented as a trilaminar structure (endoderm, mesenchyme and mesothelium), where the endoderm had a simple cubic epithelium, the mesenchyme with a large amount of connective tissue and the mesothelium with flattened cells. The amnio shown to be deeply linked to the embryo, being the first membrane fetal considering the order embryo/uterus, and had oval-shaped transparent coloring, histologically this membrane is composed of two distinct layers, a simple squamous epithelium and mesenchyme containing an amorphous substance with a small amount of cells. The chorionic membrane showed little wrinkles and alantoic membrane structure as a crescent-shaped, having an intense vascularization, and the evolution of the pregnancy is almost impossible the perception of the two, forming the membrane chorioallantoid. The corium is constituted by a layer of round cells, arranged in linear format, as the allantois is characterized by its mesenchyme amorphous with a small amount of cells. Relative to immunohistochemical all membranes expressing VEGF and cytokeratin markers. The yolk sac cells showed adherence to plastic and a spindle-like morphology, similar to fibroblasts, they reached confluence of 70% in about 20 days, these cells were maintained until passage 4, where later cell death occurred. These cells had similar imunofenoipagem the mesenchymal stem cells and hematopoietic cells expressing markers such as CD105, CD90, CD117, vimentin, Stro-1, Oct-4, VEGF, Beta Tubulin, Cytokeratin, Nanog and PCNA. From the study it can be concluded that: there are specific cells in each extraembrionária membrane, and that the cells derived from the yolk sac have characteristics similar to mesenchymal stem cells and embryonic, and being considered an important tool for future experimental studies of cell therapy in medicine veterinary regenerative.