O objetivo deste trabalho foi estudar o processo pelo qual hormônios e fatores de crescimento controlam a proliferação celular em mamíferos. O modelo experimental utilizado foi linhagens de células estabelecidas em cultura. Os estudos centraram-se em dois tipos básicos de células: fibroblastos e células adrenais e o ataque experimental foi feito sob dois pontos de vista: bioquímico e genético. O ataque bioquímico envolveu desenvolver estudos cinéticos da síntese de DNA não só durante o carenciamento de células para soro, como também durante a reestimulação de células carenciadas por:soro, hormônios e fatores de crescimento. Medidas do conteúdo intracelular de cAMP foram efetuadas com o intuito de adquirir informações à respeito do mecanismo de ação destes fatores. Um modelo de ciclo celular foi proposto no qual o controle do crescimento seria exercido através de reguladores positivos e negativos que agiriam estimulando ou inibindo a passagem de células do estado de repouso (Go) para a fase proliferativa. Entre os reguladores positivos (estimuladores) do sistema fibroblasto, encontra-se hormônios clássicos, como esteróides e insulina, e fatores de crescimento de natureza hormonal como EGF, PF (fator proteico extraído de glândulas pituitárias) e prostaglandina F2α. O esteróide hidrocortisona pode agir como regulador negativo, inibindo o crescimento de fibroblastos. Medidas do período de tempo transcorrido desde a estimulação de células carenciadas (Go), até o aparecimento da onda de síntese de DNA (período definido operacionalmente como Gl) foram feitas. Em fibroblastos 3T3 este período foi de 12 a 13 horas tanto para células estimuladas com soro como com hormônios clássicos (hidrocortisona, insulina) ou fatores de crescimento (EGF, PF) ou ainda com combinações deles (EGF + PF + insulina; PF + hidrocortisona; PF + hidrocortisona + insulina). No sistema células adrenais, adrenocorticotropina (ACTH) foi o único hormônio clássico que apresentou atividade sobre o crescimento destas células e também o único efetuador negativo encontrado. Neste sistema PF mostrou-se como o único fator com atividade estimulatória sobre o crescimento. Gl aqui foi de 11 horas tanto para células estimuladas com soro como com PF. Além disso os hormônios clássicos hidrocortisona e insulina não apresentaram atividade estimulatória por si só ou em combinação com PF. A análise da ação de hidrocortisona no sistema fibroblasto e de ACTH no sistema células adrenais estimuladas, forneceu evidências de que após deixar Go, em direção a S, numa certa altura de Gl as células tornam-se irreversivelmente comprometidas com o processo replicativo. Este comprometimento parece ocorrer 5 horas antes de S, sendo referido como Glc. Em face destes resultados foi proposto que os reguladores agem estimulando ou inibindo a transição Go → Glc. Na tentativa de obter maior definição do sistema de controle do crescimento, aproveitamo-nos das vantagens oferecidas pelo modelo experimental usado, para a busca de mutantes do tipo regulatório. Esta busca resultou no isolamento das linhagens ST1 e AR-1, derivadas, respectivamente, de fibroblastos 3T3 e células adrenais Y-l. Entre os vários aspectos interessantes da linhagem ST1 destaca-se: a) o dramático efeito de hidrocortisona causando mudança nas características das células as quais passam de um fenótipo tipicamente transformado para normal. Este fenômeno foi observado tanto \"in vitro\" (através de medidas de parâmetros de crescimento) como \"in vivo\" (através de ensaios de tumorogenicidade); b) as alterações morfológicas de caráter antagônico provocadas, por um lado, pela adição de hidrocortisona (causando achatamento) e, por outro, pela retirada do soro ou adição de cAMP ao meio de cultura (arredondamento). Através do estudo da ação de inibidores, obteve-se evidências do envolvimento de microtúbulos nestas alterações morfológicas. A análise do conteúdo intracelular de cAMP indicou que este nucleotídeo não atua como mediador da ação de hidrocortisona. Sua ação parece ser devida à indução de alterações no sistema superfície celular - membrana -citoesqueleto. Ao contrário de outros variantes de células Y-l resistentes à ACTH, células AR-1 mostraram-se também resistentes a cAMP. A utilidade destas células nos estudos da postulada mediação deste nucleotídeo na ação de ACTH, é óbvia. / The aim of this work was to study the process by which hormones and growth factors control proliferation of mammalian cells. Cell lines established in culture were used as the experimental model. The studies were centered on two basic types of cells: fibroblasts and adrenal cells and the experimental approach was made from two viewpoints: biochemical and genetic. The biochemical approach involved kinetic studies of the DNA synthesis process not only during serum starvation but also during restimulation of serum starved cells by serum, hormones and growth factors. Intracellular cyclic AMP determinations were made in order to gain informations on the mechanism of action of these factors. A cell cycle model was proposed in which cell growth control would be exerted by positive and negative regulators that would act by stimulating or inhibiting the flow of cells from a resting state (Go) to the proliferative phase. Among the positive regulators (stimulators) found for the fibroblast system are: classical hormones, like steroids and insulin, and growth factors of homonal nature, like EGF, PF (protein factor extracted from pituitary glands) and prostaglandin F2α. The steroid hydrocortisone can also act as a negative regulator, inhibiting fibroblast growth. Measurements of the time interval between stimulation of serum starved (Go) cells and the onset of DNA synthesis (period that is operationally defined as Gl) were made. In 3T3 fibroblasts this period was 12 to 13 hours for cells stimulated not only by serum but also by classical hormones (hydrocortisone, insulin) or growth factors (EGF, PF) or even by combinations of these factors (EGF + PF + insulin; PF + hydrocortisone; PF + hydrocortisone + insulin). In the adrenal system, adrenocorticotropin (ACTH) was the only classical hormone to present activity on the growth of these cells and also the only negative regulator found. In this system PF was shown to be the only factor with growth stimulatory activity. GL was estimated as 11 hours for cells stimulated with serum or PF. Moreover hydrocortisone and insulin had no stimulatory activity \"per si\" or in combination with PF. The analysis of hydrocortisone action on the fibroblast system on one hand and of that of ACTH on the adrenal system, on the other, indicated that upon leaving Go, towards S, at a certain point in Gl, cells become irreversibly committed to the replicative process. This commitment seems to occur 5 hours before S and is referred to as Glc. In view of these data we proposed that regulators act by stimulating or inhibiting the transition Go → Glc. In an attempt to obtain a better definition of the growth control system and taking advantage of the experimental model utilized, we searched for mutants of the regulatory type. This search resulted in the isolation of the lines ST1 and AR-l from 3T3 fibroblasts and Y-l adrenal cells, respectively. Among several interesting aspects of the STl cell line, we point out: a) the dramatic effect of hydrocortisone changing the characteristics of these cells from a typically transformed phenotype to a normal pattern. This phenomenon was observed both \"in vitro\" (by measuring a number of growth parameters) and \"in vivo\" (by tumorogenicity assays). b) morphological alterations of antagonistic nature caused by hydrocortisone (flattening) on one hand, and by the removal of serum or cAMP addition to the culture medium (rounding) on the other. Evidence for the involvement of microtubules in these alterations were obtained through studies on the action of several inhibitors. Quantitative analysis of intracellular cAMP indicated that this nucleotide does not act as a mediator of hydrocortisone action. Rather, this action seems to be due to the induction of alterations on the cell surface-membrane-cytoskeleton system. Contrary to other variants of the Y-1 line which are resistant to ACTH, AR-1 cells are also resistant to cAMP. The usefulness of these cells in studies of the postulated mediation by cAMP of the ACTH action, is obvious.

Objetivos: O objetivo desse estudo foi avaliar comparativamente o potencial osteogênico in vitro de células obtidas do ramo mandibular (RM, área doadora) e do seio maxilar enxertado com uma mistura de RM e osso bovino inorgânico (OBI), previamente à instalação de implantes de titânio (SM, sítio do seio maxilar enxertado). Material e Métodos: As células foram obtidas de três pacientes submetidos a procedimentos de aumento do soalho do seio maxilar com a proporção de 1:1 de RM e OBI (GenOx Inorg®). No momento da realização dos enxertos no seio maxilar e após 08 meses, antes da inserção dos implantes de titânio, fragmentos ósseos foram colhidos do RM e do SM, respectivamente, e submetidos à digestão enzimática com tripsina e colagenase para obtenção de células primárias. As células foram subcultivadas e crescidas sob condições osteogênicas por até 21 dias, tendo sido avaliados os seguintes parâmetros: proliferação/viabilidade celular, expressão gênica de marcadores osteoblásticos, atividade de fosfatase alcalina (ALP) e conteúdo de cálcio, por extração do vermelho de Alizarina. Culturas primárias derivadas do RM foram expostas ao GenOx Inorg® por 7 dias, quando se avaliou a atividade de ALP. Os resultados foram comparados por ANOVA two-way, seguido do teste de Tukey, ou pelo teste de Mann-Whitney. Resultados: Culturas do SM exibiram uma redução significante do potencial osteogênico se comparado ao de culturas do RM, com um aumento progressivo na proliferação celular associado a uma redução da expressão dos marcadores osteoblásticos, da atividade de ALP e do conteúdo de cálcio. A exposição do GenOx Inorg® às células primárias derivadas do RM inibiram a atividade de ALP. Conclusão: Esses resultados sugerem que o uso do GenOx Inorg® em associação a fragmentos do RM para aumento do soalho do seio maxilar inibe a diferenciação de células osteoblásticas no sítio de inserção de implantes de titânio após 8 meses de enxertia. / Objectives: This study aimed to comparatively evaluate the in vitro osteogenic potential of cells obtained from the mandibular ramus (MR, autogenous bone donor site) and from the maxillary sinus bone grafted with a mixture of anorganic bovine bone (ABB) and MR prior to titanium implant placement (MS, grafted implant site). Material and methods: Cells were obtained from three patients subjected to maxillary sinus floor augmentation with a 1:1 mixture of ABB (GenOx Inorg®) and MR. At the time of the sinus lift procedure and after 8 months, prior to implant placement, bone fragments were taken from MR and MS, respectively, and subjected to trypsin-collagenase digestion for primary cell culturing. Subcultured cells were grown under osteogenic condition for up 21 days and assayed for proliferation/viability, osteoblast marker mRNA levels, alkaline phosphatase (ALP) activity and calcium content/Alizarin red staining. ALP activity was also determined in primary explant cultures exposed to GenOx Inorg® (1:1 with MR) for 7 days. Data were compared using the two-way ANOVA followed by the Tukey test; otherwise, the Mann-Whitney test was used. Results: MS cultures exhibited a significantly lower osteogenic potential compared with MR cultures, with a progressive increase in cell proliferation together with a downregulation of osteoblast markers, reduced ALP activity and calcium content. Exposure of MR-derived primary cultures to GenOx Inorg® inhibited ALP activity. Conclusion: These results suggest that the use of GenOx Inorg® in combination with MR fragments for maxillary sinus floor augmentation inhibits the osteoblast cell differentiation at the implant site in the longterm.

O carcinoma de células escamosas de vulva (CECV) corresponde a cerca de 95% dos tumores vulvares. Apresenta bom prognóstico quando diagnosticado precocemente. O tratamento cirúrgico, embora eficaz, pode ser mutilante e acarreta em sérios danos psicossociais para as pacientes. Embora algumas pesquisas sobre os mecanismos que determinam os comportamentos clínico e biológico dos CECV tenham sido realizadas, ainda há muito a ser investigado. As tetraspaninas (TSPANs) são proteínas de membrana que interagem com diversas moléculas e estão envolvidas em diferentes processos fisiológicos como proliferação e migração celular. Vários estudos associam sua expressão desregulada ao desenvolvimento de cânceres. Resultados anteriores de nosso grupo mostraram maior expressão de CD63 em amostras de pacientes com CECV, e menor expressão de KAI1/CD82, em relação ao tecido normal adjacente. Porém, seu papel nesses tumores permanece incerto. Assim, o objetivo deste trabalho foi caracterizar os perfis de expressão gênica e proteica de CD63 e KAI1/CD82, bem como avaliar os efeitos de sua manipulação genética no comportamento de células de CECV metastático e não metastático. As linhagens utilizadas neste trabalho foram SW954 (ATCC® HTB-117(TM), não metastática) e SW962 (ATCC® HTB-118(TM), metastática). Os ensaios de qRT PCR mostraram maior expressão de CD63, e menor de KAI1/CD82, nas células metastáticas, em relação as não metastáticas. Assim, optou-se pela manipulação transiente somente de CD63 por RNA interferente (RNAi). Os resultados mostraram efeitos significativos de inibição de expressão gênica e proteica de CD63 em ambas linhagens, por qRT PCR e imunocitoquímica (ICQ), respectivamente, porém, a inibição da TSPAN foi mais proeminente nas células metastáticas. A deleção da tetraspanina acarretou em redução significativa da proliferação das células não metastáticas (*p < 0.05) e metastáticas (**p=0.0022), bem como na migração das células metastáticas (*p < 0.05). Assim sendo, os resultados apontam CD63 com relevante papel nos CECV, uma vez que sua inibição compromete a proliferação e capacidade de migração das células tumorais. Além disso, a perda de expressão do supressor de metástases KAI1/CD82 corrobora os dados para outros tipos de canceres. Em conjunto, essas TSPAN, podem ser considerados não só importantes fatores prognósticos no CECV, mas potenciais alvos terapêuticos / Vulvar squamous cell carcinoma (VSCC) accounts about 95% of vulvar tumors. When diagnosed at an early stage, prognosis is usually good. Although effective, surgical treatment can be mutilating and entails serious psychosocial damage to patients. Whilst molecular aspects in VSCCs have been investigated, mechanisms underlying the VSCC clinical and biological behavior are poorly understood. Tetraspanins (TSPANs) are membrane proteins, which can interact with several molecules. In addition, they are involved in physiological processes such as proliferation and migration. Besides that, several studies show the deregulated expression of TSPANs associated with cancer development. Previous results of our group showed higher expression of CD63, and lower expression of KAI1/CD82, in VSCC patient samples, compared to adjacent normal tissue. However, the role of these proteins in vulvar tumors remains uncertain. Thus, the aim of this work was to characterize CD63 and KAI1/CD82 gene and protein expression profile in VSCC metastatic and non-metastatic cells lines, and to investigate the effects of genetic manipulation on these cells behavior. The cell lines used in this work were SW954 (Non-metastatic) and SW962 (metastatic). The qRT PCR assays showed CD63 overexpression and KAI1/CD82 downexpression in the metastatic cells. Thus, we chose to perform transient manipulation of CD63 by interfering RNA (RNAi). The RNAi assays showed significant inhibitory effects of gene and protein expression of CD63 in both cell lines, by qRT PCR and immunocytochemistry (ICC), respectively, however, inhibition of TSPAN was more prominent in metastatic cells. When inhibited, CD63 showed a significant decrease in proliferation of non-metastatic (*p < 0.05) and metastatic cells (**p=0.0022), as well as migration of metastatic cells (*p < 0.05). Therefore, the results point to CD63 playing a relevant role in VSCC, since its inhibition compromises the proliferation and migration capacity of tumor cells. In addition, decrease in the expression of KAI1/CD82 metastasis suppressor corroborates with other data in different types of cancers. Taken together, these TSPANs may be considered not only important prognostic factors in VSCC, but potential therapeutic targets

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:22:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosana Marques Silva Figueroa.pdf: 3807885 bytes, checksum: 3650be97bf0d582c6f9fac01fcff5ea1 (MD5) Previous issue date: 2016-02-12 / Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Paraná / The aim of this study was to determine a microwave polymerization cycle that resulted in adequate physicomechanical and biological properties for the denture base acrylic resins polymerized in water bath (Vipi Cril-VC, VIPI®) or processed by microwave energy (Vipi Wave-VW, VIPI®). The evaluated polymerization cycles were: 1) WB (water bath) = (65ºC during 90 min + boiling during 90 min), recommended cycle for the VC resin; 2) M630/25 = 10 min at 270 W + 5 min at 0 W + 10 min at 360 W, recommended cycle for VW resin; 3) M650/5 = 5 min at 650 W; 4) M550/3 = 3 min at 550 W. The following properties were evaluated: degree of conversion (n=6), cytotoxicity (n=9), porosity (n=10), water sorption and solubility (n=10), and surface roughness and color stability (n=5) after immersion in potential colorant beverages and simulated toothbrushing. Data were submitted to analysis of variance ANOVA-2 way followed by Bonferroni’s test for degree of conversion and color stability, ANOVA-2 way for porosity and cytotoxicity, ANOVA-2 way followed by HSD Tukey’s test for water sorption and solubility, and ANOVA-3 way followed by Bonferroni’s test for surface roughness (α=0.05). For VC resin, there was no significant difference among the groups for degree of conversion. For VW resin, the lowest degree of conversion values appeared in the M630/25 and M650/5 cycles (P<0.05). Degree of conversion values ranged from 66.9 to 85.9%. There was no difference between the materials and experimental groups for cytotoxicity and all conditions resulted in non-cytotoxic effects. Porosity mean values below 1.52% with no significant difference among groups for both materials were observed. Resins showed water sorption and solubility values without a significant difference. The highest water sorption (2.43%) and solubility (0.13%) values were obtained for WB and M550/3, respectively (P<0.05). After immersion in coffee, M550/3 and WB groups of VC resin showed the highest and the lowest roughness values, respectively (P<0.05). There was also an increase in roughness of M550/3 group after immersion in wine (P<0.05). For VW resin, M650/5 group presented rougher surface after immersion in coffee (P<0.05). There was no difference in color among cycles for VW resin and VC resin showed more changes (P<0.05). All medium values were classified as acceptable, exception for VW resin (M630/25 group) which presented NBS=4.88 after immersion in wine. Vipi Cril conventional resin can be polymerized in microwave without impairment to the evaluated properties. According to the obtained results, the better experimental condition was the microwave polymerization at 650 W for 5 min for Vipi Cril. / O objetivo deste estudo foi determinar um ciclo de polimerização em micro-ondas que resultasse em propriedades físico-químicas e biológicas satisfatórias para resinas acrílicas termopolimerizáveis para base de prótese processadas em banho de água (Vipi Cril-VC, VIPI®) ou por energia de micro-ondas (Vipi Wave-VW, VIPI®). Os ciclos de polimerização avaliados foram: 1) BA (banho de água) = (65ºC por 90 min + 90 min em ebulição), ciclo recomendado para a resina VC; 2) M630/25 = 10 min a 270 W + 5 min a 0 W + 10 min a 360 W, ciclo recomendado para a resina VW; 3) M650/5 = 5 min a 650 W; 4) M550/3 = 3 min a 550 W. Foram avaliadas as seguintes propriedades: grau de conversão (n=6), citotoxicidade (n=9), porosidade (n=10), sorção de água e solubilidade (n=10) e rugosidade de superfície e estabilidade de cor (n=5) após imersão em líquidos potencialmente corantes e escovação simulada. Os resultados obtidos foram submetidos à análise de variância ANOVA-2 fatores seguida pelo teste de Bonferroni para grau de conversão e estabilidade de cor, ANOVA-2 fatores para porosidade e citotoxicidade, ANOVA-2 fatores seguida pelo teste de Tukey HSD para sorção de água e solubilidade e ANOVA-3 fatores seguida pelo teste de Bonferroni para rugosidade de superfície (α=0,05). Não houve diferença significante entre os grupos para os resultados de grau de conversão da resina VC. Para a resina VW, os valores mais baixos de grau de conversão foram obtidos nos ciclos M630/25 e M650/5 (P<0,05). Os valores médios de grau de conversão foram entre 66,9% e 85,9%. Não houve diferença entre os materiais e os grupos experimentais para os resultados de citotoxicidade e todas as condições resultaram em efeitos não citotóxicos. Foram observados valores médios de porosidade inferiores a 1,52%, sem diferença significante entre os grupos para ambos os materiais. As resinas apresentaram valores de sorção de água e solubilidade sem diferença estatisticamente significante entre elas. Os valores mais altos de sorção de água (2,43%) e de solubilidade (0,13%) foram obtidos nos grupos BA e M550/3, respectivamente (P<0,05). Com a imersão em café, os grupos M550/3 e BA da resina VC apresentaram os maiores e os menores valores de rugosidade de superfície, respectivamente (P<0,05). Também houve aumento da rugosidade do grupo M550/3 após imersão no vinho tinto (P<0,05). Para a resina VW, o grupo M650/5 demonstrou superfície mais rugosa após imersão em café (P<0,05). Não houve diferença de cor entre os ciclos para a resina VW e a resina VC apresentou mais alterações (P<0,05). Todos os valores médios de estabilidade de cor foram classificados como aceitáveis, exceto para a resina VW (grupo M630/25) que apresentou NBS=4,88 após imersão em vinho tinto. A resina Vipi Cril formulada para polimerização convencional pôde ser polimerizada em micro-ondas sem prejuízo às suas propriedades avaliadas. De acordo com os resultados obtidos, a melhor condição experimental foi a polimerização da resina Vipi Cril em micro-ondas a 650 W por 5 min.

Células de mamíferos são os hospedeiros mais frequentemente utilizados para a fabricação de proteínas biofarmacêuticas e para a produção de vacinas virais, A qualidade é um elemento-chave para o estabelecimento de um processo de bioconversão eficiente. No presente trabalho utilizamos a linhagem de células BHK- 21C13(Baby Hamster Kidney) adaptadas para cultivo em suspensão. O uso de Soro Fetal Bovino (SFB) é tradicionalmente utilizado, sendo considerado um suplemento universal, pois permite o crescimento em várias linhagens de células de mamíferos; porém, uso de SFB apresenta risco de infecção por prions, variabilidade entre lotes e aumento no custo em etapa de purificação (Downstream processing). O objetivo do presente trabalho foi comparar o cultivo de células BHK-21 C13 entre dois meios suplementados com SFB e sem SFB, através do estudo cinético para cultivo em suspensão estático e agitado com frascoT, frasco spinner e biorreator, respectivamente. Os parâmetros; Xmáx e &#181;máx, não foram significativamente influenciados pelo meio de cultura em cultivo estático, em cultivo com agitação em frasco spinner e também no cultivo em biorreator. O tempo de duplicação ficou próximo para todas as condições testadas. A produtividade alcançada foi: 0,032x106 cel/mL.h-1 para o meio com SFB e 0,031 X106 cel/mL.h-1 para o meio sem SFB. Ao final do processo foi possível obter uma concentração celular em torno de 4,7x106 cel/mL, tanto para o cultivo com SFB quanto para o cultivo sem SFB. Dessa forma, o uso de meio de cultivo sem SFB não alterou os principais parâmetros cinéticos, não apresentando as desvantagens do uso do SFB. / Mammalian cells are the most frequently used hosts for the production of biopharmaceutical proteins and viral vaccines. Quality is a key element for the establishment of an efficient bioconversion process. In this work, we used the cell line Baby Hamster Kidney C13 (BHK-21 C13) adapted to suspension culture was used. Fetal Bovine Serum (FBS) is traditionally used and it is considered a universal insert due to its power to increase cell growth in this kind of animal cells. However, the utilization of FBS introduces risks of infection from prions, variability between batches and increase in cost associated to purification stages (downstream processing). This work aimed to compare the kinetic behaviors of BHK-21 C13 cells in two media supplemented with FBS and without FBS using both one static and two suspension systems, T-flask, spinner flask and bioreactor respectively. The parameters; Xmax and &#181;max were not significantly influenced by the culture medium in T- flask culture static, in spinner flask cultivation and were neither significantly influenced by growing in culture media stirred bioreactor. The doubling time was close to all conditions tested. At the end of the growth phase it was possible to obtain a nearby cell concentration of 4.7 x 106 cells / ml, both for cultivation with FBS as for FBS without cultivation. Thus, the use of culture medium without FBS did not affect the main kinetic parameters. Besides, it does not show the disadvantages of culture media using FBS.

O agregado de trióxido mineral (MTA) tem-se demonstrado aplicável em diversas situações que exigem reparação dos tecidos dentais e periapicais. Contudo, desvantagens relacionadas ao seu elevado custo, propriedades físico-químicas e dificuldade de manuseio têm limitado sua utilização. Neste sentido, um novo cimento de aluminato de cálcio e aditivos (CAC+) foi desenvolvido para superar algumas características negativas do MTA, mantendo, no entanto, suas propriedades satisfatórias. O objetivo deste estudo foi avaliar a progressão de culturas de células osteogênicas e de células indiferenciadas da polpa dental (linhagem OD-21) expostas ao CAC+, utilizando MTA como controle, ou a preparações alternativas do CAC+, com maior conteúdo de cloreto de cálcio (CaCl2) e/ou com substituição do óxido de zinco por óxido de bismuto como radiopacificador. Para isso, células osteogênicas derivadas de calvárias de ratos ou células da linhagem OD-21 foram crescidas sobre Thermanox® por 24 h e expostas, por períodos de até 14 dias, a amostras dos diferentes materiais, posicionadas sobre Transwell®. Em células osteogênicas, apesar de a proximidade com as amostras de CAC+ e MTA inibir o crescimento celular, nas áreas periféricas das lamínulas, foram observados proliferação, viabilidade celular e expressão de marcadores-chave da diferenciação osteoblástica, que precederam a mineralização da matriz extracelular. Culturas expostas ao CAC+, comparativamente ao MTA, exibiram aumentos na viabilidade celular, atividade de fosfatase alcalina e na expressão de marcadores de diferenciação, o que não se repetiu para células OD-21. Além disso, demonstrou-se que os efeitos destes cimentos sobre a osteogênese in vitro variaram de acordo com o período de exposição das culturas, sendo mais favoráveis durante sua fase proliferativa. Entre as preparações de CAC+, verificou-se que o aumento no teor de CaCl2 promoveu maior disponibilização de Ca2+ no meio de cultura, o que correspondeu a maior diferenciação celular e formação de matriz mineralizada em culturas de células osteogênicas e OD-21, e à redução de efeitos negativos da adição de óxido de bismuto sobre osteoblastos. Conclui-se que o CAC+ favorece o desenvolvimento do fenótipo osteogênico, atuando principalmente em células em estágios iniciais de diferenciação e que a adição de CaCl2, independentemente do agente radiopacificador, potencializa os efeitos benéficos sobre células osteogênicas e favorece o desenvolvimento e diferenciação de células indiferenciadas derivadas do tecido pulpar, podendo ser considerado como material alternativo ao MTA. / Mineral trioxide aggregate (MTA) has been successfully applied in endodontic procedures in which dental and periapical tissue repair are required. However, some drawbacks of MTA as high cost, physicochemical properties and difficulty in handling have limited its use. In this context, a novel calcium aluminate cement plus additives (CAC+) has been developed to overcome some negative features of MTA. The aim of this study was to evaluate the progression of either osteogenic cell cultures or undifferentiated dental pulp-derived ones (OD-21 cell line) exposed to CAC+ or to alternative formulations of CAC+ with a higher content of calcium chloride (CaCl2) and/or replacement of zinc oxide by bismuth oxide as radiopacifier agent. Rat calvaria-derived cells or OD-21 cells were grown on Thermanox® coverslips for 24 h and exposed to samples of CAC+ or MTA (control) placed on Transwell® for periods of up to 14 days. In osteogenic cell cultures, the proximity to MTA or CAC+ samples inhibited cell growth, whereas at distance it was observed cell proliferation, cell viability and expression of differentition markers prior to mineralization of the extracellular matrix. Comparatively to MTA, osteogenic cell cultures exposed to CAC+ exhibited higher cell viability, alkaline phosphatase activity and expression of key osteoblast markers, contrary to what was observed for OD-21 cells. Furthermore, it was demonstrated that the effects of these cements on in vitro osteogenesis varied according to the timing of exposure, with a more favorable impact during the proliferative phase of cultures. Among the diverse formulations of CAC+, it was found that the increase in the CaCl2 content promoted greater availability of Ca2+ in the culture medium, which corresponded to higher cell differentiation and mineralized matrix formation in osteoblastic cell cultures and OD-21 cells, while reducing the negative effects of bismuth oxide on osteoblasts. In conclusion, CAC+ supported the acquisition of the osteogenic cell phenotype, mostly for cells in early stages of differentiation. Additionaly, the increase in the CaCl2 content, regardless of the radiopacifier agent, potentiates the beneficial effects on osteogenic cells and promotes the growth and differentiation of OD-21 cells, rendering CAC+ a potential alternative material to replace MTA in endodontic procedures.

Estima-se que 170 milhões de pessoas no mundo estejam infectadas com o vírus da hepatite C (VHC), o que está altamente relacionado à ocorrência de hepatite crônica e carcinoma hepatocelular. A prevalência de esteatose hepática em doentes com hepatite C crônica é muito maior do que na população geral variando entre 40 a 75%. A associação entre a infecção pelo VHC e esteatose hepática é multifatorial. Duas formas de esteatose hepática são encontradas em pacientes com hepatite C crônica: esteatose metabólica (fatores de risco) e citopática relacionada ao genótipo 3a. Os lipídios são essenciais para o ciclo de replicação do VHC, eles podem exercer seu efeito em diferentes níveis como: grupos prostéticos em proteínas virais e/ou cofatores celulares na replicação de VHC, componentes especializados na estrutura do VHC onde ocorre a replicação ou como constituinte das partículas lipovirais. Trabalhos experimentais realizados anteriormente por nosso grupo relataram que a administração do composto natural Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) promove a inibição do desenvolvimento da esteatose, redução dos marcadores de estresse oxidativo, menor escore de inflamação, melhora nas concentrações de aminotransferases e diminuição da gordura visceral em um modelo animal de esteato-hepatite não alcoólica. A terapia padrão da hepatite C consiste em uma combinação de interferon peguilado alfa (PEG-IFN-alfa) que estimula o sistema imunológico do hospedeiro para combater a infecção e o composto antiviral ribavirina. Atualmente foram aprovados pelas agências de saúde os inibidores de protease Boceprevir, Telaprevir, Daclatasvir e Simeprevir. No entanto, sua eficiência varia entre os genótipos e as constantes mutações do vírus podem levar a resistência. A falta de uma vacina ou uma terapia definitiva faz com que diversos compostos com diferentes mecanismos de ação sejam testados como possíveis alternativas de tratamento. Tendo em vista a capacidade do YHK de reduzir a esteatose e a importância do metabolismo para a replicação do VHC, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do YHK no ciclo celular do VHC. Para isso foram utilizadas técnicas de cultura celular que permitem o estudo das diferenças fases do ciclo de replicação do VHC: entrada (VHCpp), replicação - replicons JFH1-NS3-5B e Con1, replicação e infecção- JC1-Fluc. De forma a elucidar a possibilidade de um único componente da fórmula YHK apresentar efeito sobre o VHC, foram utilizadas para comparação as substâncias ativas de seus ingredientes isoladamente: Panax pseudo ginseng - Notoginsenoside R1; Eucommia ulmoides -(±) Pinoresinol; Licorice root - Ácido Glicirrizínico. Os compostos não apresentaram efeitos na entrada, replicação e liberação de novas partículas virais. Devido à ausência de resultados bem delineados e tendo em vista os resultados das terapias anti-VHC atuais e futuras, é improvável que compostos naturais sejam utilizados ou chegarão ao desenvolvimento clínico nesta indicação / Worldwide is estimated that nearly 170 million people are infected with hepatitis C virus (HCV), highly correlated with the occurrence of chronic hepatitis and hepatocellular carcinoma. Hepatitis C patients present higher prevalence of steatosis when compared with the general population, ranging between 40% and 75%. There are two forms of steatosis in HCV infected patients: metabolic steatosis (risk factors) and cytopathic associated with genotype 3. Lipids are essential for the HCV replication cycle. It acts on different functions: as prosthetic groups into viral proteins and / or cellular cofactors in the HCV replication, as specific HCV components or as a constituent of lipovirals particles. Our group previously reported that the administration of the natural compound Yo Jyo Hen Shi Ko (YHK) inhibits steatosis development, decreases markers of oxidative stress and inflammation, improves aminotransferases concentration and decreases the visceral fat. Standard therapy for hepatitis C is a combination of pegylated interferon alpha (PEG-IFN-alfa), stimulating the host immune system to fight infection and the antiviral compound named ribavirin. Nowadays, Telaprevir, Boceprevir, Sofosbovir and Simeprevir are approved as new anti-HCV drugs; they act as protease inhibitors. Its efficiency, however, varies between genotypes, and the constant mutations of the virus can lead to resistance. The lack of vaccines, or a definitive therapy, stimulates the research of new compounds and alternative treatments. In this study, we evaluated the effect of YHK in HCV replication cycle due to the effect of YHK and the importance of lipid metabolism for HCV. For this purpose we used cell culture techniques allowing the study of different stages of HCV replication cycle: entry (HCVpp), replication - replicons JFH1 NS3-5B and Con1, also replication and infection-JC1-Fluc. We also used active compounds of its ingredients: Panax pseudo ginseng - Notoginsenoside R1; eucommia - (±) pinoresinol, Licorice root - Glycyrrhizinic Acid in order to elucidate a possible effect of a single component of the YHK formula in HCV. We could not observe any difference in HCV entry, replication and release in the presence of the four compounds. It is unlikely that natural compounds will be used or come to clinical development in this indication, due to the absence of well defined results and in view of the results of new anti-HCV therapies

Diabetes mellitus tipo 1 resulta da produção insuficiente ou da ausência de insulina, decorrente da destruição de células &#946;, por mecanismo auto-imune. O tratamento deste tipo de diabetes consiste na administração subcutânea de insulina exógena. Recentemente, foi demonstrado que o transplante de ilhotas pancreáticas é capaz de tornar o portador de diabetes tipo 1 independente de insulina exógena. Apesar do sucesso alcançado, a necessidade permanente de imunossupressão é uma das principais barreiras para que o transplante de ilhotas possa ser realizado em número maior de pacientes. Assim, o desenvolvimento de novas metodologias que evitem a rejeição do enxerto, como o macro e o microencapsulamento de ilhotas, continua sendo crucial para o estabelecimento definitivo do transplante de ilhotas como opção terapêutica no tratamento de diabetes tipo 1. Neste trabalho, foi padronizado um modelo animal para avaliar, in vivo, a funcionalidade das ilhotas pancreáticas humanas isoladas e purificadas na Unidade de Ilhotas Pancreáticas Humanas do IQUSP. Ratos NIH nude foram tornados diabéticos através de injeção de estreptozotocina para o implante de ilhotas pancreáticas humanas nuas e microencapsuladas. As ilhotas foram microencapsuladas em Biodritina, um novo heteropolissacarídeo patenteado e cedido ao nosso laboratório, tendo sido possível padronizar a produção de microcápsulas uniformes e homogêneas, com tamanho médio entre 400&#181;m e 600 &#181;m. A reversão do diabetes ocorreu em 24% dos ratos nude transplantados com ilhotas pancreáticas humanas nuas. Por outro lado, não observamos reversão do diabetes quando ilhotas encapsuladas foram implantadas, apesar do teste de atividade funcional realizado in vitro ter demonstrado que elas continuam a secretar insulina e a responder ao estímulo com glicose após o encapsulamento. Para elucidar este efeito, cápsulas vazias foram implantadas em ratos nude e em ratos imunocompetentes, os quais desenvolveram processo inflamatório acompanhado de processo fibrótico no local do implante. Estudo imuno-histoquímico está sendo realizado para esclarecer a natureza e a intensidade destes processos. / Type 1 diabetes mellitus results from insufficient or absence of insulin production, as a consequence of destruction of pancreatic &#946; cells, by an auto-imune mechanism. Treatment for this type of diabetes consists of subcutaneous administration of exogenous insulin. Recently, it has been demonstrated that pancreatic islet cell transplantation is capable of rendering type I diabetic patients independent of exogenous insulin. However, in spite of the success achieved, permanent immunosuppression is still required, being the main barrier to expand this treatment to a large number of patients. Therefore, development of new technologies, such as islet macro and microencapsulation to avoid rejection of the tissue implanted, is still crucial for definitive establishment of islet transplantation as a therapeutic alternative for type I diabetes. In the present work, an animal model was established for in vivo evaluation of the functional ability of human pancreatic islets, which were isolated and purified at the Human Pancreatic Islet Unit of the University of São Paulo Chemistry Institute. Diabetes was induced in NIH nude rats through streptozotocin injection followed by implantation of naked or microencapsulated human pancreatic islets. Biodritin, a new and patented heteropolyssaccaride was used to microencapsulate the islets. The production of uniform and homogeneous microcapsules with diameters in the range of 400&#181;m e 600 &#181;m was successfully established. Reversion of diabetes occurred in 24% of the nude rats transplanted with human pancreatic islets. On the other hand, no reversion of diabetes was observed when encapsulated islets were implanted, although their functional activity in vitro indicated that they secreted insulin and responded to glucose stimulation upon encapsulation. In order to elucidate this effect, empty capsules were implanted in nude rat and in immunocompetent rats, both of which developed an inflammatory process accompanied by a fibrotic process in the site of the implant. Immunohistochemical studies are underway to address the nature and the intensity of these inflammatory processes.

Objetivos: O objetivo desse estudo foi avaliar comparativamente o potencial osteogênico in vitro de células obtidas do ramo mandibular (RM, área doadora) e do seio maxilar enxertado com uma mistura de RM e osso bovino inorgânico (OBI), previamente à instalação de implantes de titânio (SM, sítio do seio maxilar enxertado). Material e Métodos: As células foram obtidas de três pacientes submetidos a procedimentos de aumento do soalho do seio maxilar com a proporção de 1:1 de RM e OBI (GenOx Inorg®). No momento da realização dos enxertos no seio maxilar e após 08 meses, antes da inserção dos implantes de titânio, fragmentos ósseos foram colhidos do RM e do SM, respectivamente, e submetidos à digestão enzimática com tripsina e colagenase para obtenção de células primárias. As células foram subcultivadas e crescidas sob condições osteogênicas por até 21 dias, tendo sido avaliados os seguintes parâmetros: proliferação/viabilidade celular, expressão gênica de marcadores osteoblásticos, atividade de fosfatase alcalina (ALP) e conteúdo de cálcio, por extração do vermelho de Alizarina. Culturas primárias derivadas do RM foram expostas ao GenOx Inorg® por 7 dias, quando se avaliou a atividade de ALP. Os resultados foram comparados por ANOVA two-way, seguido do teste de Tukey, ou pelo teste de Mann-Whitney. Resultados: Culturas do SM exibiram uma redução significante do potencial osteogênico se comparado ao de culturas do RM, com um aumento progressivo na proliferação celular associado a uma redução da expressão dos marcadores osteoblásticos, da atividade de ALP e do conteúdo de cálcio. A exposição do GenOx Inorg® às células primárias derivadas do RM inibiram a atividade de ALP. Conclusão: Esses resultados sugerem que o uso do GenOx Inorg® em associação a fragmentos do RM para aumento do soalho do seio maxilar inibe a diferenciação de células osteoblásticas no sítio de inserção de implantes de titânio após 8 meses de enxertia. / Objectives: This study aimed to comparatively evaluate the in vitro osteogenic potential of cells obtained from the mandibular ramus (MR, autogenous bone donor site) and from the maxillary sinus bone grafted with a mixture of anorganic bovine bone (ABB) and MR prior to titanium implant placement (MS, grafted implant site). Material and methods: Cells were obtained from three patients subjected to maxillary sinus floor augmentation with a 1:1 mixture of ABB (GenOx Inorg®) and MR. At the time of the sinus lift procedure and after 8 months, prior to implant placement, bone fragments were taken from MR and MS, respectively, and subjected to trypsin-collagenase digestion for primary cell culturing. Subcultured cells were grown under osteogenic condition for up 21 days and assayed for proliferation/viability, osteoblast marker mRNA levels, alkaline phosphatase (ALP) activity and calcium content/Alizarin red staining. ALP activity was also determined in primary explant cultures exposed to GenOx Inorg® (1:1 with MR) for 7 days. Data were compared using the two-way ANOVA followed by the Tukey test; otherwise, the Mann-Whitney test was used. Results: MS cultures exhibited a significantly lower osteogenic potential compared with MR cultures, with a progressive increase in cell proliferation together with a downregulation of osteoblast markers, reduced ALP activity and calcium content. Exposure of MR-derived primary cultures to GenOx Inorg® inhibited ALP activity. Conclusion: These results suggest that the use of GenOx Inorg® in combination with MR fragments for maxillary sinus floor augmentation inhibits the osteoblast cell differentiation at the implant site in the longterm.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert Leslivan Ubiratan de Moraes.pdf: 723767 bytes, checksum: 88adcd404b3c30cc9f22d95b44bd13b3 (MD5) Previous issue date: 2008-04-16 / The jurubeba was identified that such species was Solanum scuticum M. Nee, from which pharmacognostic and morphanatomic data were not available to Goiás. Because of that, we tried some complementary data. For the morphoanatomic evaluation of the leaves some cuts were carried out as described by Kraus and Arduin (1997). For the phytochemical trial, it was used some methodologies as described by Costa (2001). With the phytochemical screening, were identified alkaloids, flavonoids, coumarins, anthraquinones and saponins in prospecting phytochemical. Both in phytochemical trial, as in the phytochemical prospection, it was found alkaloids. Due to the biological activities of these secondary metabolites, we obtained the alkaloid fraction, using the dust of the leaves, and we got the ethanol extract. The fractions were divided by polarity and they were evaluated by thin-layer chromatography. Microbiological evaluation was carried out to verify possible contaminants. Such evaluation did not reveal the presence of microorganisms, and it was raised the possibility of antimicrobiotic activity of the raw extract in twenty three strains of bacteria and in two yeasts. According to the antimicrobial tests, the extract presented some features, as the difficult of solubility in aqueous medium, and the best dilution was achieved in dimethyl sulfoxide (DMSO) 50%. These tests also demonstrated the difficult of the solubilization of the fractions, which it will be used in the experiments of Vero cells cultures. It was verified the low antimicrobial activity of the raw hidroethanolic extract. Of all the fractions, the alkaloid fraction presented the best solubility in DMSO 0.3%. So, it was proceeded the dilution and the evaluation of the alkaloid fraction in Vero cells, and it was evaluated morphology, viability and cellular proliferation. We finally verified the citotoxicity of the alkaloid fraction in the statistical analyses, and in the vitality test carried out by Trypan blue, and also in the morphological alterations compatible to citotoxity alterations. / A espécie de jurubeba estudada no presente trabalho é Solanum scuticum M. Nee, da qual não eram disponíveis dados farmacognósticos e nem morfoanatômicos para Goiás. Para a avaliação morfoanatômica das folhas S. scuticum realizaram-se cortes à mão livre e cortes permanentes como descrito por Kraus e Arduin (1997). Para realização de triagem fitoquímica utilizou-se as metodologias descritas por Costa (2001). Com na triagem fitoquímica, foram identificados alcalóides, flavonóides cumarinas, heterosídios antraquinônicos e heterosídios saponínicos na prospecção fitoquímica. O extrato etanólico das folhas foi obtido e apartir do mesmo procedeu-se o fracionamento por diferença de polaridade, e realizaram-se avaliações dos seus componentes através de cromatografia de camada delgada. Testou-se a esterelidade da droga em pó e a possível atividade antimicrobiana do extrato bruto hidoalcoólico de S. scuticum. Tal avaliação não revelou a presença de microrganismos, sendo levantada a possível atividade antimicrobiana do extrato bruto frente a vinte e três cepas de bactérias e duas de leveduras. Os testes demonstraram também a dificuldade de solubilização das frações, as quais seriam utilizadas nos experimentos de cultura de células da linhagem Vero. Sendo averiguada baixa atividade anti-microbiana do extrato hidroalcóolico bruto. Tendo em vista as atividades biológicas do grupo dos alcalóides procedeu-se à obtenção da fração alcaloídica a partir do pó das folhas. Pelos testes antimicrobianos o extrato apresentou características de difícil solubilidade em meio aquoso, a melhor diluição para emprego do extrato foi obtida em dimetilsulfóxido (DMSO) 50%. Das frações a que possuiu melhor solubilidade em DMSO foi à alcaloídica, na concentração de 0,3%. Assim procedeu-se a diluição e a avaliação da atividade da fração alcaloídica em células da linhagem Vero, avaliando-se a morfologia, viabilidade e proliferação celular frente aos tratamentos realizados. Verificando-se atividade citotóxica da fração alcaloídica tanto nas avaliações estatísticas do teste de vitalidade por azul de Trypan, quanto nas alterações morfológicas compatíveis com alterações citotóxicas.