Lors de mes travaux de thèse je me suis intéressée à l’invasion des hépatocytes par Plasmodium. Bien que certains récepteurs cellulaires mis en jeu aient déjà été identifiés tels que CD81 et SR-B1, les facteurs parasitaires restaient à identifier. J’ai testé différents facteurs parasitaires grâce à un protocole de test d’invasion de cellules HepG2 et HepG2/CD81 par des parasites complémentés avec différentes protéines. Suite à l’identification de la protéine P36 comme déterminant du choix de la voie d’entrée dans les hépatocytes, j’ai étudié les déterminants structuraux de cette protéine nécessaires à la détermination de la voie d’entrée. Pour cela j’ai complémenté des parasites délétés pour P36 avec des protéines chimériques exprimant les domaines d’un parasite utilisant à la fois les récepteurs CD81 et SR-B1 et des domaines d’un parasites ne pouvant utiliser que la voie CD81. J’ai identifié le second domaine à 6 cystéine de P36 comme déterminant du choix de la voie d’invasion. Afin d’étudier les interactions de P36 avec d’éventuels récepteurs cellulaires, j’ai produit cette protéine en système bactérien. Les protéines ont été utilisées pour réaliser des tests d’interactions (ELISA et SPR) avec des récepteurs d’intérêt : CD81, SR-B1, CD36, LIMPII et EphA2 qui n’ont malheureusement pas permis d’identifier le ligand de P36. Des anticorps sont également en cours de production, dans le but d’une part de tester s’ils sont capables de bloquer l’invasion des hépatocytes par Plasmodium et d’autre part de localiser la protéine chez le parasite. Enfin, j’ai étudié les polymorphismes des protéines P36 de parasites infectant l’homme. / During my thesis, I was interested in the study of the hepatocyte invasion by Plasmodium. Several cellular receptors are involved, such as CD81 and SRB1, but the parasitic factors required were unknown until now. I tested different parasitic factors thanks to an invasion test of HepG2 or HepG2/CD81 cells with parasites complemented with different proteins. Following the identification of the 6 cystein protein P36 as a determinants of the entry pathway, I studied the structural determinants of this protein which are involved in the hepatocytes’ entry pathway. To this end, I complemented parasites knock-out for P36 with chimeric proteins constituted of domains of a parasite using both CD81 and SRB1, and domains from a parasite using only CD81. I showed that the second 6 cystein domain of P36 is decisive in the entry pathway choice.In order to study the P36 interactions with potential cellular receptors, I developed a production protocol of this protein in bacteria. I used the recombinant protein to test the interactions (ELISA and SPR) with potential receptors: CD81, SRB1, CD36, LIMP2, Epha2. Unfortunately, no interaction has been detected. Antibodies are in production, in order to test whether they are capable to block the hepatocyte invasion by Plasmodium. They will also be used to localize the protein in the parasite. In the end, I studied the polymorphisms of P36 in human parasites.

Au cours de ce travail de thèse, les deux approches permettant la caractérisation de nouveaux agents antileishmaniens ont été suivies : d’une part identification de molécules de synthèse originales et actives, par des méthodes de criblage, et d’autre part recherche de nouvelles cibles thérapeutiques leishmaniennes, faisant appel à des outils de biologie moléculaire, et de protéomique.Dans une première partie consacrée à l’optimisation du criblage antileishmanien de molécules de synthèse, nous avons notamment mis au point et validé une nouvelle méthode applicable aux formes promastigotes. Cette méthode reposant sur le principe de la bioluminescence, s’est avérée précise, rapide, répétable, sensible, automatisable et applicable à des isolats cliniques. Nous nous sommes également intéressés à la recherche d’une nouvelle méthode de criblage sur les formes amastigotes intracellulaires remplissant ces mêmes critères.Dans une seconde partie consacrée au lien entre la mort cellulaire programmée et les cystéines peptidases (métacaspase et Raptor) chez Leishmania, nous avons mis en évidence un lien possible entre métacaspase et autophagie chez L. infantum. De plus, nous avons identifié, in vivo, plusieurs substrats protéiques potentiels de ces peptidases : HSP70, ARN-Hélicase ATP-Dépendante et Lmjf09.1010 pour la métacaspase ; NDPKb et la protéine associée à l’ADN du kinétoplaste pour Raptor. Ces différents résultats ont permis de proposer un modèle conciliant les rôles possibles des cystéine-Peptidases métacaspase et Raptor au cours de l’autophagie et de l’apoptose chez Leishmania, rôles potentiellement dus au clivage de substrats protéiques spécifiques. / During this thesis work, two approaches affording the characterization of new antileishmanial agents were followed: on the one hand, the identification of new original antileishmanial synthetic drugs, through screening assays and on the other hand, research of new parasitic therapeutic targets by using molecular biology and proteomic tools. In the first part, dedicated to the optimization of the antileishmanial screening of synthetic compounds, we set up and validated a new bioluminescence-Based screening method for studying anti-Promastigote compounds. This method appears accurate, rapid, repeatable, sensitive and is also transposable to automats and usable on clinical isolates. In parallel, we investigated new screening protocols aiming at improving the screening in intracellular amastigotes which could meet the same criteria. In the second part focusing on the link between programmed cell death and cystein peptidases (metacaspase and Raptor) in Leishmania, our study first highlighted a possible link between metacaspase and autophagy in L. infantum. Moreover, we identified in vivo several potential subtrates for both peptidases: HSP70, ATP-Dependent RNA-Helicase and Lmjf09.1010 for the metacaspase; NDPKb and kinetoplast-DNA-Associated-Protein for Raptor. These results allowed us to propose a model reconciling the possible roles of cystein peptidases metacaspase and Raptor during autophagy and apoptosis in Leishmania, roles potentially due to the cleavage of specific proteic subtrates.

La compréhension du phénomène de stress oxydant est devenue un des enjeux majeurs de la biochimie, en particulier depuis le début des années 70. Ce déséquilibre de la balance d'oxydoréduction au sein des cellules est impliqué dans un si grand nombre de pathologies graves (dont la plupart des cancers, pour ne citer qu'eux) qu'il est devenu crucial de cerner ses origines et ses mécanismes, pour envisager une prévention et des traitements plus efficaces. Nous nous sommes intéressés aux interactions existant entre les thiols (qui sont les acteurs principaux de la lutte antioxydante) et trois agents oxydants importants : le peroxyde d'hydrogène et les radicaux hydroxyle et superoxyde. Malgré le nombre important d'études dédiées à ce sujet, les mécanismes de ces réactions n'étaient pas clairement identifiés, c'est pourquoi nous avons pensé qu'une étude théorique pourrait apporter des éclaircissements utiles. En effet, la connaissance des mécanismes de réaction permettrait d'une part de faciliter l'interprétation des données expérimentales, et d'autre part d'envisager plus efficacement d'éventuels traitements basés sur l'inhibition ou la catalyse de ces réactions. Nous avons utilisé des méthodes ab initio de chimie quantique permettant d'atteindre une précision "chimique", par exemple la méthode par interaction de configuration quadratique (QCI). Ces techniques impliquent des temps de calcul relativement longs, ce qui nous a incités à modéliser les thiols par de petites molécules comme le méthanethiol et le résidu cystéine. Les mécanismes des trois réactions étudiées ont été identifiés, et nos travaux ont démontré l'importance que peuvent avoir les effets environnementaux (comme la présence de liaisons hydrogène ou la constante diélectrique du milieu) sur les cinétiques de réaction.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La vitamine C est un antioxydant connu et elle est utilisée comme supplément alimentaire et agent de conservation. Le déshydroascorbate (DHA) est une forme oxydée de la vitamine C. Chez l'humain, la plupart du DHA formé est rapidement retransformé en vitamine C par différentes voies enzymatiques. Toutefois, la dégradation du DHA mène à la formation de produits carbonylés réactifs (C=0) qui sont à leur tour impliqués dans la formation de produits de glycation avancée (AGE), entre autres en situation de stress oxydatif ou lors du vieillissement. De plus, dans les cas d’urémie chronique, l’élimination des produits carbonylés réactifs est diminuée. Récemment, notre laboratoire a démontré qu’un produit de dégradation du DHA modifiait le groupement thiol du glutathion. Cela suggère que les produits carbonylés réactifs pourraient également modifier les thiols d'autres peptides et protéines. L’objectif de cette étude est de caractériser les changements engendrés par les produits de dégradation du DHA sur différents peptides et protéines en utilisant des méthodes de spectrométrie de masse combinée avec la chromatographie liquide. Afin de mieux comprendre les modifications engendrées par le DHA, nous avons utilisé la chaîne ? de l’insuline, qui possède un nombre limité de sites cibles potentiels. En incubant la chaîne ? de l’insuline avec le DHA, nous avons observé des adduits de 130 Da sur les cystéines ayant un thiol libre par analyse aux spectromètres de masse. Des études cinétiques montrent que la modification par le DHA est plus efficace à pH 2,0 qu’à pH 7,0, car l'association des thiols libres en disulfure est facilitée à pH neutre comparativement à pH acide. Nous avons ensuite confirmé le phénomène sur des protéines entières, plus précisément l’?-lactalbumine et la ?-lactoglobuline qui présentent une plus grande complexité que la chaîne ? de l'insuline et qui pourraient être une des cibles physiologiques du DHA. Dans l’ensemble, nos résultats indiquent que les produits carbonylés réactifs provenant de la dégradation du DHA sont capables de modifier les thiols de protéines complexes. En perspective, il serait intéressant d’identifier l'impact physiologique d'une telle modification dans l’homéostasie cellulaire, plus particulièrement dans les dérèglements dus au stress oxydatif. [symboles non conformes]

Lors de pathologies pulmonaires inflammatoires chroniques comme la mucoviscidose ou la BPCO, le déséquilibre de la balance protéases/antiprotéases aboutit à la dégradation du tissu pulmonaire et à l’inactivation des défenses antimicrobiennes. Les cathepsines à cystéine participent à l’inactivation protéolytique de peptides et protéines antimicrobiens (PAMs) pulmonaires comme le SLPI, la lactoferrine, et les β-défensines HBD-2 et -3 lors de l’emphysème ou de la mucoviscidose. Lors de cette thèse, nous avons étudié la capacité des cathepsines à cystéine B, K, L et S à hydrolyser le peptide LL-37, qui est un PAM important dans l’immunité innée pulmonaire. Seules les cathepsines K et S clivent le LL-37 et inactivent efficacement son activité antimicrobienne. A l’inverse, le LL-37 est un inhibiteur compétitif de la cathepsine L. D’autre part, l’expression pulmonaire de la cathepsine S est fortement augmentée chez les individus fumeurs atteints ou non de BPCO. La fumée de cigarette qui est une source importante de stress oxydatif induit une augmentation significative de l'expression et l'activité de la cathepsine S. Malgré un environnement oxydatif non favorable à l'activité des cathepsines, la cathepsine S parvient à hydrolyser le peptide LL-37 et pourrait ainsi augmenter le risque d’exacerbation lors de la BPCO. / During chronic inflammatory lung diseases like cystic fibrosis or COPD, proteases/antiproteases imbalance leads to pulmonary tissue degradation and compromise antimicrobial barrier. Cysteine cathepsins are involved in the proteolytic inactivation of several lung antimicrobial peptides (AMPs) such as SLPI, lactoferrin and β- defensins -2 and -3 during emphysema or cystic fibrosis. During this thesis, we studied the ability of cathepsins B, K, L and S to degrade LL-37, which is an important AMP in lung immunity. Only cathepsins K and S degrade readily LL-37 and inactivate its antimicrobial property. Conversely, LL-37 is a competitive inhibitor of cathepsin L. Beside, lung expression of human cathepsin S is significantly increased in smokers with or without COPD compared to non-smokers. Cigarette smoke that is a major source of oxidative stress significantly increases the expression and activity of cathepsin S. Despite an unfavorable oxidative environment, cathepsin S retains its proteolytic activity toward LL-37 and thus could participate to COPD exacerbation.

L'analyse des modifications post-traductionnelles (PTMs) est une des contributions les plus importantes de la protéomique aux sciences du vivant. Malgré les progrès importants des techniques séparatives et de la spectrométrie de masse, la quantification des PTMs reste un défi analytique. Le nombre limité de PTMs identifiées robustement dans une recherche, la nécessité d'enrichissement et l'estimation quantitative basée sur un seul peptide ne représentent que les difficultés les plus évidentes. De plus, la quantification des PTMs doit toujours être associée au profil d'expression de la protéine pour éviter les faux positifs.Nous avons développé de nouvelles stratégies analytiques de quantification des PTMs, en prenant en compte le niveau d'expression des protéines. Ces stratégies ont été appliquées à l'étude de l'oxydation des cystéines dans le cadre du stress oxydatif et de l'homéostasie redox.La stratégie OcSILAC est une adaptation de la technique biotin switch au marquage métabolique des cultures cellulaires et a été appliquée à un modèle de levure n'exprimant pas la thiorédoxine réductase. OcSILAC apporte des améliorations techniques importantes et une innovation dans le traitement des données. Les résultats obtenus sont en accord avec le système redox de ce modèle. OcSILAC a ensuite été adaptée au fractionnement subcellulaire pour étendre la couverture du redoxome.Une deuxième stratégie, OxiTMT, a été développée en se basant sur des tandem mass tags spécifiques de la cystéine. OxiTMT a été employée à l'étude de cellules E. Coli soumises à un traitement oxydatif. OxiTMT offre l'avantage d'une large gamme d'applications qui peut s'étendre aux tissus et aux biopsies. / The analysis of protein Post-Translational Modifications (PTMs) is probably the most important contribution that proteomics can give to life sciences. Although separative techniques and mass spectrometry have improved tremendously, the quantitative analysis of PTMs remains an analytical challenge. The limited number of PTMs that can be robustly computed in a single research, the necessity of enrichment steps and performing quantitative estimations using only one peptide, are just the most evident difficulties faced. Furthermore, PTMs quantification should always be associated to protein expression levels to avoid false positives. We have developed new analysis methods allowing the quantification of PTM changes while taking into account protein expression levels. These strategies were applied to the study of cysteine oxidation within the contexts of oxidative stress and redox homeostasis. The first strategy, OcSILAC, is a revision of the biotin switch adapted to Stable Isotope Labelling by Amino acids in Cell culture; it was applied to the study of a thioredoxin reductase silenced yeast model. OcSILAC leads to important technical improvements and data analysis innovations. The results obtained are in agreement with the extensive existing literature concerning the yeast redox system. OcSILAC was then adapted to a subcellular fractionation kit to extend the coverage of the cysteine redoxome. A second strategy called OxiTMT was developed based on cysteine specific tandem mass tags. OxiTMT was used to study E. Coli cells exposed to oxidative treatment. OxiTMT offers the advantage of a wide range of applications that can extended to the study of tissues and biopsies.

Le vieillesse conduit à une perte de masse et de fonctionnalité musculaire : la sarcopénie. Ce phénomène physiologique est reconnu comme une cause directe de fragilité et ces deux syndromes gériatriques ont été reliés à de nombreux facteurs dont le statut nutritionnel et la médication. Cependant, les interactions médication-muscle n'ont été que peu étudiées notamment au cours du vieillissement. Le médicament le plus prescrit et consommé est le paracétamol dont la détoxification hépatique nécessite un nutriment : la cystéine (Cys)[...]Sous réserve de la validité de ces résultats chez l'homme, les données obtenues indiquent qu'il serait d'intérêt de mettre en place des recommandations nutritionnelles basées sur une augmentation en Cys au cours des périodes de traitement.Ceci permettrait d'accroître le bénéfice /risque du paracétamol, qui est largement prescrit en première intention pour traiter les douleurs chroniques d'intensité faible à modérée chez les personnes âgées. / The age-related muscle mass and functionality loss, named sarcopenia is a physiological processknown as a direct cause of frailty. Both geriatrics syndromes have been correlated to various factorsas nutritional status and medication. However, the interactions between medication and muscle havenot being deeply investigated, especially in elderly. Using this model, we have highlighted a 12% loss of muscle mass in old rat under repeatedparacetamol cures. This loss was associated with paracetamol-induced sulfur amino acid disturbancesleading to altered glutathione (GSH a Cys containing tripeptide) status and circulating Cys. All together, these results emphasize that muscle mass loss induced by repeated cures withparacetamol in old rats arise from the increased protein and more specifically Cys requirements. Therelevance of these results for older persons needs to be further evaluated before considering whetherit it could be of interest to develop nutritional recommendations aimed to optimized protein intake orCys supplementation during cures with paracetamol. That could further increase the benefit/risk ratioof paracetamol which is widely prescribed for pain relief, especially in older people.

Le projet de thèse à pour but de produire et caractériser un nouvel allergène de pollen d'ambroisie. Le projet est décliné en cinq axes: production d'une forme recombinante mature et en conformation native, caractérisation structurale, étude de la fonction enzymatique, étude de l'allergenicité et l'immunogénicité et évaluation du potentiel thérapeutique. / The goal of the thesis project is to product and caracterize a novel ragweed pollen allergen.The project have five axes: production of recombinant mature and native form,structurale caracterization, study of enzymatique function, study of allergenicity and immunogenicity and evaluation of therapeutic potential.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.