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La cryoconservation de tissu ovarien peut être proposée, avant traitements hautement gonadotoxiques, à des patientes afin de préserver leur fertilité. L'autogreffe de tissu ovarien est actuellement la seule méthode de réutilisation du tissu ovarien disponible, mais en cas de pathologie néoplasique, elle présente un risque de réintroduction d'éventuelles cellules malignes via le greffon. L'objectif de ce travail a été de développer une méthode pour détecter la maladie résiduelle (MRD) dans le tissu ovarien par cytométrie en flux multicouleurs (CMF) en cas de leucémie aiguë. Une technique de dissociation de cortex ovarien a été mise au point à partir de tissu ovarien de référence provenant de résections percoelioscopiques. Un modèle expérimental de détection de la MRD a été validé et consistait à ajouter des cellules de leucémie aiguë lymphoblastique (LAL) ou myéloïde (LAM) à une suspension de cellules ovariennes isolées de référence. La méthode a ensuite été utilisée pour rechercher la MRD dans le tissu ovarien cryoconservé de 11 patientes atteintes de leucémie aiguë (7 LAL et 4 LAM).Le modèle expérimental a permis de valider une sensibilité de 10"4 et une spécificité élevée tant pour les LAL que pour les LAM. Lorsqu'un marqueur moléculaire était disponible pour la recherche de la MRD, nous avons observé une bonne corrélation entre la CMF et la PCR quantitative. La détection par CMF de la MRD dans le tissu ovarien des patientes leucémiques était positive chez 3 des 11 patientes étudiées.Cette technique est essentielle pour évaluer le risque carcinologique avant de proposer la réutilisation du tissu ovarien cryoconservé par technique d'autogreffe. / Ovarian cryopreservation together with autograft of frozen/thawed ovarian tissue is a real option to preserve and restorefertility in cancer patients. However in cases of leukemia, there is a real concern regarding the presence of metastaticcells in the ovarian tissue, which could lead to the recurrence of the primary disease. The aim was to validate multicolorflow cytometry (MFC) as an original technique for minimal residual disease (MRD) detection in ovarian cortex fromacute leukemia patients.We developed an experimental model which consisted in adding serial dilutions of leukemic cells into isolated ovariancell suspensions obtained from healthy cortex. The modelization was validated for acute lymphoblastic leukemia (ALL)and acute myeloid leukemia (AML). Then the method was applied to MRD detection of leukemic cells in cryopreservedovarian cortex from 11 leukemia patients (7 ALL and 4 AML).This experimental model made it possible to obtain a high specificity and a robust sensitivity of 10~4 for MRD detectionby MFC for both types of acute leukemic cells. When a molecular marker was available, we observed a good correlationbetween CMF and quantitative PCR. Ovarian MRD was positive by MFC in one T-ALL and 2 AML patients.MRD detection in the ovarian cortex is essential to evaluate the risk of cancer reseeding before ovarian tissue autograft.

Le suivi des changements dans les populations de cellules immunitaires tels que les lymphocytes, monocytes et cellules dendritiques (DC) au cours de maladies infectieuses comme le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) chez l’homme ou son équivalent chez le singe (VIS) est crucial. Grâce aux récentes avancées technologiques en cytométrie en flux, il est maintenant possible de mesurer et d’analyser simultanément jusqu'à 14 paramètres individuels à l’échelon cellulaire. L'objectif de ce travail consiste en la mise au point de 2 panels multicouleurs de 12 anticorps permettant d'analyser simultanément les principales populations de cellules immunitaires, respectivement chez l’humain et le macaque rhésus. Au terme de ce travail, il est maintenant possible de mesurer précisément tous les principaux acteurs du système immunitaire, à savoir les lymphocytes T CD4+ et T CD8+, les lymphocytes B, les cellules NK et NKT, les sous-populations de monocytes, et toutes les sous-populations de cellules dendritiques connues à ce jour, en utilisant une approche multiparamétrique de cytométrie en flux. Ce protocole d’analyse est réalisé sur du sang total, il est rapide, il n’implique pas de technique d’isolation cellulaire, et requiert une quantité minimum de sang. De plus, l’analyse de chaque population cellulaire est plus précise grâce à une contamination minimum entre les populations séparées. L’intérêt de ce travail est d’étudier les interactions entre les différentes populations de cellules immunitaires durant l’infection par VIH chez l’homme, ou VIS chez le singe ou potentiellement d‘autres maladies, et en particulier de mieux comprendre le rôle important que les cellules dendritiques jouent dans la progression de ces maladies. / Monitoring changes in immune cell populations such as lymphocytes, monocytes and dendritic cells (DC) during infectious diseases like human immunodeficiency virus (HIV) or its counterpart in rhesus monkeys (SIV) is crucial. Thanks to recent technological advances in flow cytometry, it is now possible to measure and analyze simultaneously up to 14 individual parameters at the single cell level.The goal of this work is to develop 2 multicolor flow cytometry panels comprising of 12 antibodies, allowing measuring simultaneously the main immune cells population, respectively in humans and rhesus monkeys. After 2 years of development and optimization, we can now measure precisely all the main actors of the immune system, that is CD4+ and CD8+ T lymphocytes, B lymphocytes, NK and NKT cells, the 3 monocyte subsets, and all the dendritic cell subsets known today, by using a multicolor flow cytometry approach. This assay is done on whole blood, it is rapid to do, it does not involve a cell isolation technique, and it requires only a minimum amount of blood. Moreover, the analysis of each population is much more precise because of a minimum contamination between different cell populations. The advantage of this work is to study interactions between different cell populations of immune cells during HIV infection in humans, or SIV infection in monkeys, or potentially other diseases, and in particular to better understand the important role that dendritic cells might play in disease progression.

Cette thèse porte sur l’élaboration d’un outil de capture d’ADN permettant d’identifier une mutation génétique (SNP) grâce à la formation de sandwichs avec des particules de carboxylatex biofonctionnalisées avec des oligonucléotides couplée à une détection de la fluorescence. Le modèle biologique choisi pour ce projet est le génotypage plaquettaire et plus particulièrement la recherche du gène biallélique HPA-1. Le principal objectif de ce travail a été d’optimiser un outil de capture préalablement développé dans l’équipe (Trévisan, 2011) afin de réduire le nombre d’étapes et de simplifier la mise en oeuvre globale du test en modifiant les interactions moléculaires utilisée pour capturer l’ADN cible et en utilisant des particules fluorescentes comme élément de détection. En présence d’ADN cible, des sandwichs sont formés entre les particules fluorescentes et les particules magnétiques biofonctionnalisées. Ces sandwichs sont purifiés par séparation magnétique et la fluorescence est détectée par trois méthodes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (détection par ondes évanescentes). Dans un premier temps, les paramètres de fonctionnalisation chimique et biologique des différentes particules (magnétiques et fluorescentes) ont été déterminés et optimisés ainsi que les conditions d’hybridation pour la capture de l’ADN cible. Ensuite, la formation des sandwichs et leur détection ont été suivies par des mesures de fluorescence en utilisant trois méthodes différentes : la cytométrie en flux, l’imagerie de fluorescence et l’Evareader (capteur à ondes évanescentes). Les résultats obtenus avec les différentes méthodes de détection sont concordants et montrent que l’outil de capture d’ADN développé permet de capturer la cible synthétique (oligonucléotide) HPA-1 en réduisant le temps d’analyse de 45 min. Dans nos conditions, le test permet de discriminer l’allèle a de l’allèle b du gène HPA-1 qui ne diffère que d’un nucléotide. Le rapport des signaux de fluorescence issus du sandwich spécifique et du sandwich non spécifique est d’environ 2,5 à 3. Ce rapport devra être amélioré par la suite, en optimisant les conditions de formation des sandwichs. La prochaine étape consistera à optimiser le système de capture d’ADN développé pour gagner en spécificité et déterminer la limite de détection du test. Ce test devra également être validé avec des échantillons biologiques. A plus long terme, la fluorescence pourra être détectée par un photodétecteur miniaturisé actuellement développé à l’Université de Sherbrooke. Des études préliminaires présentées dans ce manuscrit montrent les potentialités de ce nouveau transducteur. / This thesis is about the development of a new assay to capture DNA. This assay is based on the formation of sandwiches between biofunctionnalized with oligonucleotides carboxylatex microparticles combined with fluorescence detection. It should be able to discriminate single nucleotide polymorphism (SNP). This assay is designed to be applied to platelet genotyping for the research of the gene HPA-1. The main goal of this work was to improve an assay previously developed (Trévisan, 2011) by INL and EFS Rhône-Alpes. The objectives are to reduce the number of steps and to simplify the test. To do so, the molecular interactions used in order to capture target DNA are modified and fluorescent microparticles are used for the detection. In the presence of target DNA, sandwiches are formed between both biofunctionnalized fluorescent and magnetic particles. Those sandwiches are purified through magnetic separation. Then, fluorescence is detected by three methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader (detection with an evanescent wave). First, chemical and biological parameters for the functionalization of the different particles (magnetic and fluorescent) are determined. The conditions for the capture of target DNA were optimized. Then, the formation and the detection of the sandwiches were estimated by measuring the fluorescence using three different methods: flow cytometry, fluorescence imaging and Evareader. The results obtained with the three methods are consistent. They show that the new system enables to capture synthetic target (oligonucleotide) HPA-1 with a reduction of total time analysis of 45 min. In our conditions, SNP can be discriminated for HPA-1 gene. For this discrimination, the fluorescence signal ratio about 2.5 to 3. This ratio should be improved by optimizing the conditions of sandwiches formation. Next step will consist in the optimization of the system developed to capture DNA in order to gain specificity and to determine the limit of detection. This test should also be validated with biological samples. In the long term, fluorescence could be detected by a miniaturized photodetector developed in the University of Sherbrook. Preliminary studies presented in this manuscript show the potentialities of this new transducer.

La production de nouveaux neurones, un processus appelé neurogenèse, persiste à l’âge adulte et est assurée par les cellules souches neurales (CSN) au sein de niches spécialisées telle que la zone sous-ventriculaire (ZSV). Cependant, la neurogenèse adulte diminue à la suite de diverses atteintes cérébrales et au cours du vieillissement, provoquant des déclins cognitifs pour l’heure irréversibles. A l’aide d’une méthode de cytométrie en flux développée au laboratoire, nous avons montré que le déclin progressif de la neurogenèse de la ZSV au cours du vieillissement est lié, non pas à une diminution du nombre des CSN, mais à une forte réduction de leur prolifération due, notamment, à l’allongement spécifique de la phase G1 médiée par l’augmentation du TGFβ1. Par ailleurs, nous avons isolé les CSN quiescentes et les CSN en prolifération afin de caractériser leurs propriétés cellulaires et établir leur profil d'expression génique. L’analyse comparative de ces deux populations de CSN a révélé plusieurs niveaux de régulation de la balance entre quiescence et prolifération, telles que l’intégration de signaux en provenance du microenvironnement et l’existence de programmes de transcription distincts. L’ensemble de ces résultats ouvrent des perspectives pour l’utilisation des CSN quiescentes endogènes comme cibles thérapeutiques au cours du vieillissement ou pour régénérer les tissus cérébraux lésés. / The production of new neurons, a process called neurogenesis, persists during adulthood and is ensured by neural stem cells (NSCs) that are located in specialized niches in the mammalian brain such as the subventricular zone (SVZ). However, adult neurogenesis declines dramatically following brain damage and during aging leading to irreversible cognitive deficits. Using a flow cytometry-based cell sorting strategy, we show that the progressive age-related decline in SVZ neurogenesis is not caused by a loss of NSCs but rather by a proliferation deficit of NSCs with the lengthening of their G1 phase due to increased levels of TGFβ1. We then sorted quiescent and proliferative NSCs to characterize their functional properties and define their gene expression profiles. Comparative analysis of the two populations of NSCs reveals that the balance between quiescence and proliferation is regulated at multiple levels with the integration of external signals from the microenvironment and distinct transcriptional programs. Taken together, our results open new vistas into the potential use of endogenous quiescent NSCs as therapeutic targets to increase neurogenesis in the aged brain and to participate to the regeneration of damaged brain tissue.

Tous les patients de soins intensifs reçoivent des solutés cristalloïdes. Ils sont souvent dans un état inflammatoire sévère. Parmi ces solutés cristalloïdes, le Normal Salin (NS) a des concentrations élevées en chlorure et en sodium ce qui a été associé à divers effets immuno-activateurs. Nous visons à évaluer l’effet des différents solutés sur les cellules immunitaires de sujets sains et sur un modèle d’inflammation aiguë sur sang total. Dans cette étude de type chassé-croisé, 11 sujets sains ont été recrutés pour recevoir 1L de chaque soluté. Grâce aux prélèvements sanguins pris en pré et post-infusion, nous évaluons le phénotype des leucocytes par cytométrie en flux et les cytokines plasmatiques par multiplex. Les tests ex vivo sont faits en exposant du sang total aux solutés suite à une stimulation au LPS. Notre étude suggère une diminution de l’activation des neutrophiles par le LR et le PL par rapport au NS. On constate aussi une augmentation des monocytes totaux et classiques circulants suite au NS. Le NS augmente les concentrations de la cytokine pro-inflammatoire Interleukine (IL)-17A et diminue certains facteurs anti-inflammatoires comme IL-10 et basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) par rapport aux deux autres solutés. Ex vivo, l’ajout de NS augmente l'activation des monocytes par rapport au LPS seul par rapport au LR et au PL. Le PL diminue aussi l’activation précoce des lymphocytes T. Nos résultats suggèrent que le NS a un effet plus immunoactivateur que les 2 autres solutés. Une meilleure compréhension de ces effets pourrait mener à une utilisation personnalisée des cristalloïdes pour un retour plus efficace à l’homéostasie inflammatoire. / Intensive care unit patients' inflammatory status can switch from an early pro-inflammatory to a late anti-inflammatory phase, which favors infections. They can receive different crystalloids, either Normal Saline (NS), Ringer’s Lactate (RL) or Plasma-Lyte (PL). NS has high NaCl concentrations which has been associated with inflammatory effects on immune cells. Our aim is to evaluate the impact of these three different crystalloid fluids on immune cells in healthy subjects and on a whole blood model of acute inflammation. Using our comprehensive immunomonitoring platform, we assessed the immunological phenotype of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and neutrophils in humans. 11 healthy subjects received a liter of NS, RL and PL in a randomized cross-over fashion. Blood samples were taken before and 6h later. PBMC and neutrophil phenotypes were assessed by flow cytometry and cytokine concentrations were measured by a multiplex assay. Ex vivo assays were performed by exposing whole blood to the different crystalloids following a stimulation with LPS. Study of healthy subject’s PBMCs suggested that RL and PL reduced activation of neutrophils compared to NS. Total and classical monocytes were increased with NS compared to RL and PL. RL and PL also increase plasma levels of anti-inflammatory cytokine Interleukin (IL)-10 and pro-repair cytokine basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) compared to NS, while NS increased plasma levels of the pro-inflammatory cytokine IL-17A. In whole blood assays, following LPS stimulation, NS increased monocytic activation compared to LR and PL. In T cells, PL decreased early activation. Conclusions: Our results suggest that crystalloids have different immune consequences with NS being more immune activating than RL and PL. A better understanding of their immune modulation could lead to personalization of their use according to the inflammatory status of patients to restore their immune homeostasis.

Le système immunitaire est divisé en deux réponses : innée et adaptative. Dans la réponse adaptative, les principaux acteurs sont les cellules T CD8 et CD4, dont l'activation est médiée par le complexe antigène-récepteur (TCR) et la génération de signaux intracellulaires. L'intensité du signal est contrôlée par l'affinité du ligand impliquant la kinase p56lck et la protéine adaptatrice SLP-76. Les souris dépourvues de SLP-76 sont bloquées dans leur développement thymique, ce qui rend difficile l'évaluation de l'importance de l'adaptateur, dans la fonction des cellules T périphériques. Récemment, le laboratoire Rudd a généré une souris knock-in (KI) avec une forme de SLP-76 mutée au niveau d'un seul résidu, K56, ayant des cellules T périphériques normales. Cette mutation empêche SLP-76 de se lier au complexe de pore nucléaire (CPN). L'objectif de ce mémoire est de comprendre le rôle de SLP-76, plus particulièrement du mutant K56E dans le contrôle de certains aspects de la fonction des cellules T périphériques. K56E sur un fond transgénique OT1, a montré une déficience partielle de la fonction et du métabolisme des cellules T en réponse à des ligands peptidiques d'ovalbumine de poulet, de différentes affinités. Plus précisément, les voies de la glycolyse et de la phosphorylation oxydative en ont été altérées. Dans l'ensemble, l'altération des fonctions et du métabolisme des lymphocytes T chez le mutant K56E confirme l'existence d'un lien entre le SLP-76 et le métabolisme des lymphocytes T, ce qui pourrait avoir des implications importantes dans le développement de thérapies ciblant la fonction des lymphocytes T. / The immune system is divided into two responses: innate and adaptive. In the adaptive response, the main players are CD8 and CD4 T-cells whose activation is mediated by ligation of the antigen-receptor complex (TCR) and its generation of intracellular signals. The strength of signal is controlled by the affinity of the ligand in a process that involves upstream kinases such as p56lck and downstream targets such as the adaptor protein SLP-76. Mice lacking SLP-76 are blocked in thymic development, making it difficult to assess the importance of the adaptor in peripheral T-cell function. Recently, the Rudd lab generated a knock-in (KI) mouse with a form of SLP-76 mutated at a single residue K56 which shows a normal peripheral T-cell compartment. The mutant prevents SLP-76 binding to the nuclear pore complex (NPC). The object of this dissertation is to understand role of SLP-76 and specifically the K56E mutant in the control of aspects of peripheral Tcell function. The K56E mutant on an OT1 TCR transgenic background showed a partial impairment of T-cell function and metabolism in response to chicken ovalbumin peptide ligands of different affinities. Specifically, both glycolysis and oxidative phosphorylation pathways were impaired in response to peptide ligand activation. Overall, the impairment of T-cell function and metabolism in the K56E mutant supports a link between SLP-76 and T-cell metabolism which may have important implications in the development of therapies targeting T-cell function.

Le canal calcique de type-L CaV1.2 participe au couplage excitation-contraction des cardiomyocytes. Cav1.2 est composé d’une sous-unité principale CaVα1, associée aux sous-unités auxiliaires CaVβ et CaVα2δ1. Lorsque présente à la membrane, c’est CaVα2δ1 qui est responsable de moduler la densité du courant calcique. Elle ne possède qu’un seul segment transmembranaire présent du côté C-terminal, au niveau de la protéine δ, ce qui en fait une protéine transmembranaire de type I. Certaines protéines qui appartiennent à cette famille doivent être clivées au niveau du site dit « omega », une modification post-traductionnelle nécessaire à leur fonction. Une fois clivées, ces protéines sont retenues à la membrane plasmique par une ancre glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI). Nos études en microscopie confocale montrent que la protéine sauvage est sensible à l’action de la phospholipase C qui clive de manière spécifique les groupements phosphoinositol, ce qui est compatible avec la présence d’une ancre GPI fonctionnelle. De plus, la mutation des résidus formant le site « omega » en isoleucine au niveau des sites G1060 et G1061 prévient l’adressage membranaire de CaVα2δ1 estimé par cytométrie en flux et imagerie confocale, et réduit la modulation des courants calciques mesurés par la méthode du « patch-clamp ». Les mutants G1060I et G1061I sont aussi associés à un changement dans le patron de migration de la partie C-terminale, suggérant un processus protéolytique défecteueux. Les mutations simples des glycines en alanines préservent les propriétés de la protéine mais le double mutant G1060A/G1061A réduit significativement l’expression de CaVα2δ1 à la surface de la cellule et sa modulation sur le canal CaV1.2. Ces données suggèrent fortement que le clivage requiert spécifiquement un résidu Glycine en position 1060 ou 1061 pour produire le clivage protéolytique dominant chez CaVα2δ1, et que cet ancrage GPI est essentiel à la fonction du canal. / Voltage-gated calcium channels CaV1.2 play an essential role in the regulation of cardiac excitability. Functional channels are formed by the CaVα1 subunit and the intracellular CaVβ and the extracellular CaVα2δ1 subunits. CaVα2δ1 are type I transmembrane proteins that undergo a posttranslational modification producing their association at the plasma membrane through a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. The molecular determinants required for the proteolytic cleavage of the recombinant CaVα2δ1 protein were studied using biochemical, immunocytochemical, fluorescence, and electrophysiological methods. Enzymatic treatment with a phospholipase C specific for the cleavage of phosphatidyl inositol lipids abolished the colocalisation of CaVα2δ1 with a plasma membrane marker as shown using live-cell confocal imaging. Single point mutations G1060I or G1061I in the predicted transmembrane CaVδ domain was shown to significantly reduce the cell surface fluorescence of CaVα2δ1 as characterized by two-color flow cytometry assays and confocal imaging, and to prevent the CaVα2δ1-mediated increase in the peak current density and voltage-dependent gating of CaV1.2 currents. The isoleucine mutations were also associated with a change in the migration pattern of the C-terminal fragments suggesting that proteolytic processing was altered. Single glycine to alanine mutations preserved the protein properties but the double mutant G1060A/G1061A significantly impaired cell surface expression of CaVα2δ1 and its functional regulation of CaV1.2. Altogether our data support a model where one Glycine residue at position 1060 or 1061 is required to produce the dominant proteolytic cleavage of CaVα2δ1 and further suggest that the GPI-anchored form of CaVα2δ1 is essential for channel function.

Les levures Candida sont des pathogènes opportunistes responsables d’infections graves chez les patients immunodéprimés. Au cours de ce travail, nous avons développé un modèle cellulaire in vitro pour la caractérisation multiparamétrique des phénotypes d’interaction entre les levures Candida et les macrophages et les neutrophiles, principaux effecteurs de la défense anti-Candida. Il repose sur l’utilisation de marqueurs fluorescents pour le suivi quantitatif de l’interaction en cytométrie en flux et en fluorimétrie. Ce modèle a été validé par la comparaison de l’interaction de trois espèces de levures, C. albicans, C. glabrata et C. lusitaniae, avec des macrophages murins et des neutrophiles humains. Deux stratégies principales de survie des levures à la phagocytose ont été mises en évidence : par la résistance à la phagolyse et la multiplication des levures à l’intérieur des phagocytes jusqu’à leur éclatement, ou par l’évitement de la phagocytose et la multiplication des levures à l’extérieur des phagocytes. L’interprétation des données quantitatives a été confirmée par microscopie à fluorescence et vidéo-microscopie. Afin de mieux comprendre les interactions Candida-phagocytes, nous avons mis au point des outils pour l’analyse fonctionnelle de gènes chez C. lusitaniae. Une stratégie de PCR chevauchante a été développée pour l’obtention de mutants nuls de C. lusitaniae, sans étape de clonage. C’est ainsi que le gène OLE2, codant une Δ9 désaturase d’acides gras potentiellement impliquée dans la biosynthèse de la prostaglandine PGE2, a été invalidé. Le mutant ole2Δ présentait de très nets défauts de filamentation et de reproduction sexuée. Par rapport à une souche sauvage, le mutant ole2∆ était massivement phagocyté par les macrophages, et la survie des phagocytes était plus importante, ce qui suggère un rôle important des lipides insaturés et des oxylipides dans la signalisation cellulaire au cours de l’interaction Candida-phagocytes. Dans la dernière partie de notre travail, nous avons construit une banque de 10 000 mutants de C. lusitaniae par l’intégration aléatoire d’un marqueur dans le génome. Le criblage de cette banque à travers notre modèle cellulaire d’interaction permettra d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans l’interaction avec les phagocytes afin de mieux comprendre la physiopathologie des candidoses et de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques. / Candida species are opportunistic pathogens causing severe infectious diseases in immunocompromised patients. In this work, we developed a tool for a multi-parameter characterization of the cell interactions between the yeasts Candida and both macrophages and neutrophils, which constitute the main defense against candidiasis. It relies on the labelling of each population with specific fluorescent markers, and on the use of fluorimetry and flow cytometry to assess interactions. The tool has been validated by comparing the interactions of three yeast species C. albicans, C. glabrata and C. lusitaniae, with murine macrophages and human neutrophils. We found that yeasts use two main ways for escaping phagocytosis, which has been confirmed using video-microscopy: either (1) by surviving to phagolysis and dividing into the phagosome until phagocytes burst, or (2) by avoiding phagocytosis and dividing outside phagocytes. In order to better understand the cellular and molecular mechanisms involved in Candida-phagocytes interactions, we developed new molecular tools for the functional analysis of genes in C. lusitaniae, notably a two-step cloning-free PCR-based method for the deletion of genes. This method was successfully used for the deletion of OLE2, a gene encoding a Δ9-desaturase of fatty acids, possibly implicated in prostaglandin PGE2 biosynthesis. The ole2Δ mutant exhibited strong defects in both pseudofilamention and sexual mating. During macrophages infection, ole2Δ yeast cells were massively internalized and triggered less phagocytes cell death than the wild type strain, suggesting that unsaturated fatty acids and/or oxylipids could play a role during interaction with phagocytes. Lastly, a bank of 10,000 mutants was constructed in C. lusitaniae by the random integration of a genetic marker in the genome. The screening of this bank through our tool to analyse cellular interactions will be undertaken to gain insights into understanding of the early stages of the infectious process.

Le virus Herpès simplex de type 1 (HSV-1), agent étiologique des feux sauvages, possède une structure multicouche comprenant une capside icosaédrale qui protège le génome viral d’ADN, une couche protéique très structurée appelée tégument et une enveloppe lipidique dérivant de la cellule hôte et parsemée de glycoprotéines virales. Tous ces constituants sont acquis séquentiellement à partir du noyau, du cytoplasme et du réseau trans-golgien. Cette structure multicouche confère à HSV-1 un potentiel considérable pour incorporer des protéines virales et cellulaires. Toutefois, l’ensemble des protéines qui composent ce virus n’a pas encore été élucidé. De plus, malgré son rôle critique à différentes étapes de l’infection, le tégument demeure encore mal défini et ce, tant dans sa composition que dans la séquence d’addition des protéines qui le composent. Toutes ces incertitudes quant aux mécanismes impliqués dans la morphogenèse du virus nous amènent à l’objectif de ce projet, soit la caractérisation du processus de maturation d’HSV-1. Le premier article présenté dans cette thèse et publié dans Journal of Virology s’attarde à la caractérisation protéique des virus extracellulaires matures. Grâce à l’élaboration d’un protocole d’isolation et de purification de ces virions, une étude protéomique a pu être effectuée. Celle-ci nous a permis de réaliser une cartographie de la composition globale en protéines virales des virus matures (8 protéines de la capside, 23 protéines du tégument et 13 glycoprotéines) qui a fait la page couverture de Journal of Virology. De plus, l’incorporation potentielle de 49 protéines cellulaires différentes a été révélée. Lors de cette étude protéomique, nous avons aussi relevé la présence de nouveaux composants du virion dont UL7, UL23, ICP0 et ICP4. Le deuxième article publié dans Journal of General Virology focalise sur ces protéines via une analyse biochimique afin de mieux comprendre les interactions et la dynamique du tégument. Ces résultats nous révèlent que, contrairement aux protéines ICP0 et ICP4, UL7 et UL23 peuvent être relâchées de la capside en présence de sels et que les cystéines libres jouent un rôle dans cette relâche. De plus, cet article met en évidence la présence d’ICP0 et d’ICP4 sur les capsides nucléaires suggérant une acquisition possible du tégument au noyau. La complexité du processus de morphogenèse du virus ainsi que la mise en évidence d’acquisition de protéines du tégument au noyau nous ont incités à poursuivre nos recherches sur la composition du virus à un stade précoce de son cycle viral. Les capsides C matures, prémisses des virus extracellulaires, ont donc été isolées et purifiées grâce à un protocole innovateur basé sur le tri par cytométrie en flux. L’analyse préliminaire de ces capsides par protéomique a permis d’identifier 28 protéines virales et 39 protéines cellulaires. Les données recueilles, comparées à celles obtenues avec les virus extracellulaires, suggèrent clairement un processus séquentiel d’acquisition des protéines du tégument débutant dans le noyau, site d’assemblage des capsides. Finalement, tous ces résultats contribuent à une meilleure compréhension du processus complexe de maturation d’HSV-1 via l’utilisation de techniques variées et innovatrices, telles que la protéomique et la cytométrie en flux, pouvant être appliquées à d’autres virus mais aussi permettre le développement de meilleurs traitements pour vaincre l’HSV-1. / Herpes simplex virus type 1 (HSV-1), the etiological agent of cold sores, has a multilayered structure that includes an icosahedral capsid that protects the viral DNA genome, a highly structured proteinaceous layer called tegument and a host-derived lipid envelope studded with viral glycoproteins. All these constituents are sequentially acquired from the nucleus, the cytoplasm and the trans-Golgi network. This multilayered structure confers to HSV-1 a considerable potential to incorporate viral and cellular proteins; however, all the proteins that compose this virus have not yet been elucidated. Moreover, despite its critical role at different stages of infection, the tegument is still poorly defined both in its composition and its sequence of addition of proteins. All these uncertainties about the mechanisms involved in the morphogenesis of the virus lead us to the goal of this project, which is the characterization of the maturation process of HSV-1. The first article presented in this thesis and published in Journal of Virology focuses on the protein characterization of extracellular mature virus. After developing a protocol for the isolation and purification of these virions, a proteomics study was performed. It allowed us to map the global viral protein composition of mature virions (8 capsid proteins, 23 tegument proteins and 13 glycoproteins), which made the cover page of Journal of Virology. Moreover, the potential incorporation of 49 cellular proteins was revealed. During this proteomics study, we confirmed the incorporation of novel virion components including UL7, UL23, ICP0 and ICP4. The second article published in Journal of General Virology focuses on these viral proteins by using a biochemical analysis to better understand the interactions and dynamic of the tegument. Our results revealed that, unlike ICP0 and ICP4 proteins, UL7 and UL23 can be released from the capsid in the presence of salts and that free cysteines play a role in this release. Moreover, this article highlights the presence of ICP0 and ICP4 on the nuclear capsids suggesting a potential acquisition of tegument proteins in the nucleus. The complexity of the viral morphogenesis process and the discovery of the tegument acquisition in the nucleus led us to pursue our research on the virus composition at an early stage of its viral cycle. The nuclear C capsids, precursors to the extracellular virus, were isolated and purified with an innovative protocol based on fluorescence activated cell sorting (FACS). The preliminary analysis of these capsids by proteomics allows us to identify 28 viral proteins and 39 cellular proteins. The collected data, compared to those obtained with extracellular viruses, clearly suggest a sequential process of tegument proteins acquisition starting in the nucleus, the assembly site of HSV-1 capsids. Finally, all these results contribute to a better understanding of the complex process of HSV-1 maturation by using varied and innovative techniques such as proteomic and FACS, which can be applied to other viruses and allow the development of better treatments to fight HSV-1.