Les étapes précoces du cycle réplicatif du VIH-1 sont assistées par des cofacteurs cellulaires dont la nature et la fonction restent mal connues. Nos travaux ont caractérisé la contribution de la protéine kinase dépendante de l'AMP cyclique (PKA), dans la cellule cible ou incorporée dans la particule virale VIH-1, dans les étapes post-entrée du cycle réplicatif. Les virus dépourvus d'activité PKA se caractérisent par un défaut de la synthèse de l'ADN proviral. En absence de Nef, la perte d'activité PKA associée aux particules VIH-1 induit une baisse plus modérée du pouvoir infectieux. En outre, le contournement des voies d'entrée classiques, par l'utilisation de particules pseudotypées, rend l'infectiosité indépendante de l'activité PKA. L'action de PKA s'exercerait donc au sein de la particule VIH-1 assemblée et impliquerait à la fois la protéine Nef et les voies de transport des complexes de transcription inverse au cours des étapes post-entrée. De plus, l'inhibition de l'activité PKA dans les cellules cibles entraîne également un défaut de synthèse de l'ADN proviral. Nos résultats indiquent que PKA agit comme un cofacteur de la transcription inverse. / The nature and function of cellular factors involved in post-entry steps of the HIV-1 life cycle are still poorly understood. We highlighted the role of cAMP-dependent protein kinase (PKA) in the early step of viral cycle, either as a host cellular protein in infected cells or as an incorporated protein into HIV-1 particles. PKA-deficient viruses failed to synthesize proviral DNA. In the absence of Nef, the loss of PKA activity associated to HIV-1 particles induces a minor diminution of infectiousness. Accordingly, VSV-G pseudotyped viruses, that use alternate entry pathway, exhibit full infectivity regardless of PKA deficiency. PKA action could therefore take place in the assembled HIV-1 particles, implying Nef protein and intracellular pathways of reverse transcription complexes. Moreover, the inhibition of PKA activity in target cells engenders a defective proviral DNA synthesis. Taken together, our data suggest that PKA may act as a cofactor required for HIV-1 reverse transcription.

La souris "dystoniamusculorum" (Dstdt-j) résulte d'une mutation spontanée autosomale récessive d'un gène codant pour la dystonine, protéine du cytosquelette qui s'exprime normalement dans les neurones sensitifs du système nerveux périphérique, mais aussi dans de nombreuses structures du système nerveux central. Elle est caractérisée par une dégénérescence des fibres nerveuses affectant principalement les voies afférentes sensitives du système nerveux périphérique et les afférences secondaires cérébelleuses et thalamiques. Des troubles posturaux et une sévère ataxie apparaissent avec les dégénérescences. Une altération des muscles squelettiques est associée. Afin d'étudier l'incidence des troubles du transport axonal sur l'activité métabolique de la fibre nerveuse et l'impact de la dégénérescence sensitive sur les fonctions motrices, une analyse histopathologique et biochimique comparative du système nerveux central et des muscles squelettiques est effectuée sur des souris de souche B6C3Fea /a-Dstdt-j, âgées de 42 à 54 jours réparties un groupe de souris homozygotes Dstdt-j et un groupe contrôle, formé de souris homozygotes normales et hétérozygotes. En plus des dégénérescences afférentes périphériques, l'étude histopathologique montre des altérations centrales au niveau de centres segmentaires et de différentes structures du système extra-pyramidal comme le cervelet, le noyau rouge et les noyaux du pont. Une évaluation quantitative de l'activité métabolique régionale par marquage histochimique de la cytochrome oxydase (enzyme du complexe IV de la phosphorylation oxydative) est effectuée sur l'ensemble de l'encéphale et de la moelle épinière cervicale. Elle met en évidence une hyperactivité métabolique des voies de la proprioception inconsciente, affectant principalement les structures du tronc cérébral et du cervelet, et plus spécifiquement des structures motrices impliquées dans l'équilibre, le tonus musculaire et les réflexes posturaux. Une étude de l'innervation cholinergique est effectuée par marquage histochimique de l'acétylcholinestérase (AChE). Des augmentations importantes de l'activité AChE sont observées dans les structures cibles du noyau cholinergique tegmental pontique, à savoir le thalamus servant à l'activation corticale, le striatum et certains noyaux mésencéphaliques connectés au striatum, impliqués dans le contrôle des mouvements. Des altérations structuro-fonctionnelles des trois muscles observés (langue, muscle masséter et flexordigitorumsuperficialis) illustrent un tableau clinique d'hypotonicité et d'hypoactivité musculaire. Une dégénérescence partielle des fibres musculaires semble indiquer que ces modifications sont conséquentes de la lésion nerveuse plutôt que d'une atteinte intrinsèque des fibres musculaires. La présente étude sert à comprendre la physiopathologie 1) des neuropathies sensitives humaines présentant des atteintes similaires comme l'ataxie de Friedreich, ou la forme infantile de l'ataxie spino-cérébélleuse, 2) de déafférentations trigéminales pouvant survenir par compressions iatrogènes lors d'actes chirurgicaux / The "dystoniamusculorum" (Dstdt-J) mouse is the result of a recessive autosomal mutation of the dystonin (dst) gene responsible for the expression of a protein of the cytoskeleton, normally present in sensory peripheral neurons and numerous central nervous structures. The mutation is characterised by primary degeneration of peripheral afferent fibers followed by degenerative processes in secondary cerebellar and thalamic afferents. Postural reflex dysfunction and a severe ataxia occurat the same time as peripheral neurodegenerative processes. To study the impact of axonal transport alteration on neuronal activity as well as sensory degeneration on motorfunctions, histopathatological and biochemical studies have were performed on brain and skeletal muscles of B6C3Fea /a-Dstdt-j mice displayed in two groups, homozygotes Dstdt-J and controls. In addition to sensory defects, histopathological evaluation showed central alterations affecting the segmentar nuclei and motor control regions, such as cerebellum, red nucleus, and pontine nuclei. Regional metabolism assessed by cytochrome oxidase histochemistry showed hypermetabolic activity in cerebellum and motor regions of the brain stem involved in equilibrium, muscle tonicity, and postural reflexes. Brain cholinergic innervation was performed by histochemical labelling of acetylcholinesterase (AChE) activity. Enzymatic hyperactivity was observed in target structures of the cholinergic pedunculo-pontine tegmental nucleus, the thalamus, and the basal ganglia. The morphological and functional alterations observed in the three skeletal muscles (masseteric, flexor digitorum superficialis and tongue) were characterized by muscle hypotonicity and hypoactivity. A partial muscular fiber degeneration was observed, probably as a result of sensory denervation rather than an intrinsic defect of muscle fibers. Several sensory neuropathies (Friedreich's ataxia or infant-onset spinocerebellar ataxia) have similar clinicopathological features. The present studies are of interest in understanding the physiopathology of these lesions. They can also contribute in the study of the pathological effects of trigeminal deafferentation induced by compression

Les cellules épithéliales sont des cellules polarisées qui forment l’un des types cellulaires le plus abondant dans le corps humain. Leur polarité apico-basale (A/B) est établie et maintenue par la ségrégation asymétrique de protéines adaptatrices hautement conservées. Cette polarité est essentielle pour de nombreuses fonctions cellulaires clés comme l’adhésion (jonctions intercellulaires) ou la signalisation et la prolifération par la localisation et la concentration des complexes de signalisation. Durant la cancérogénèse, un grand nombre de ces processus est dérégulé aboutissant à la sur-prolifération, la migration et/ou l’invasion des cellules cancéreuses. Une meilleure compréhension des mécanismes à l’origine de ces processus est indispensable pour trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement du cancer. Dans l’équipe, nous sommes particulièrement intéressés par les protéines adaptatrices à domaines PDZ (domaine de liaison protéine-protéine). De par leur structure modulaire et la diversité de leurs partenaires, ces protéines adaptatrices sont impliquées dans la régulation de très nombreuses fonctions et fournissent des plateformes où différents processus peuvent être intégrés. Durant mon doctorat, j’ai étudié deux protéines adaptatrices dans le système animal modèle Drosophila melanogaster, Bbg et Magi, impliquées dans deux processus cellulaires essentiels : la dynamique des jonctions et la prolifération. Grâce aux molécules d’adhésion, les cellules non seulement restent cohésives dans un tissu, mais c’est aussi à ce niveau qu’elles peuvent obtenir une information concernant la densité cellulaire d'un tissu. Cette information est alors relayée au cytosquelette d’actine via des protéines adaptatrices spécialisées dans le but de réguler la prolifération et la voie Hippo. Cependant, le contrôle de la voie de signalisation Hippo par certaines protéines adaptatrices et par le cytosquelette d’actine n'est que partiellement compris à ce jour. Dans le laboratoire, nous étudions notamment le rôle d'une nouvelle protéine adaptatrice apicale nommée Big Bang (Bbg) dans le disque d’aile de la drosophile. Nous nous sommes intéressés à Bbg car c’est une cible de la voie Notch chez la drosophile et son homologue humain PDZD2 (pour PDZ domain-containing 2 protein) est sur-exprimé dans plusieurs cancers (sein et prostate).Mes résultats montrent que Bbg est un nouveau régulateur du cytosquelette d’actine et de la voie Hippo. Une étude détaillée de la fonction de Bbg et de ses partenaires permet de mieux comprendre les relations existantes entre dynamique de l’actine et prolifération. Bbg induit une accumulation d’actine filamenteuse en augmentant l’activité d’Enabled et la phosphorylation de Myosin Light Chain (MLC). Cette régulation résulte en une augmentation de l’activité de Yorkie, effecteur final de la voie Hippo, pour soutenir la prolifération cellulaire.La régulation des jonctions adhérentes est une étape cruciale lors de l’évolution d'une tumeur solide. Malgré les récentes avancées dans le domaine, de nombreux aspects clés de la dynamique des jonctions restent peu caractérisés.Dans le laboratoire, nous recherchons de nouveaux régulateurs de jonctions et grâce au modèle de remodelage des AJs lors du développement de l’œil de pupe de drosophile. Nous avons identifié Magi en tant que protéine adaptatrice recrutant le complexe formé de RASSF8 et ASPP. Magi régule le recrutement de Bazooka à la membrane, le dépôt d’E-Cadhérine et des Caténines et finalement le remodelage des jonctions pendant la morphogénèse. J’ai identifié Echinoid, une protéine de type immunoglobuline impliquée dans l’adhésion cellulaire et la régulation de la voie Hippo, comme un nouveau partenaire responsable du recrutement de Magi aux futures zones de jonctions. / Epithelial cells are polarised cells that form one of the most abundant cell types in the human body. Their apico-basal (A/B) polarity is established and maintained by the asymmetric segregation of highly conserved scaffold proteins. Proper A/B polarity is critical for many key cellular functions such as intercellular junctions and therefore adhesion, or signalling and proliferation by localising and concentrating signalling complexes. During carcinogenesis, many of these processes are mis-regulated leading to the over-proliferation, migration and/or invasion of cancer cells. A better understanding of the mechanisms underlying these processes is really needed to find new therapeutic targets in cancer treatment.In the team, we are particularly interested in scaffold proteins with PDZ domains (protein-protein interaction domains). Due to their modular structure, the high number of interactions they engage in, and the variety of their binding partners, these scaffold proteins are implicated in the regulation of many key cellular functions and processes. During my PhD, I have studied two scaffold proteins in the Drosophila melanogaster animal model, Bbg and Magi, which are involved in two important cell processes: adherens junctions (AJs) dynamic and cell proliferation.Through adhesion molecules, epithelial cells not only remain cohesive, but can also sense cellular density in a tissue and relay this information through dedicated scaffolds to the actin cytoskeleton to ultimately regulate the Hippo pathway and proliferation. However, many aspects of the control of Hippo signalling by apical scaffolds and the actin cytoskeleton are still poorly understood. In the laboratory, we are interested in the study of a new conserved apical scaffold, Big Bang (Bbg). Bbg is a new and quite unknown protein expressed in a variety of Drosophila epithelia, and appears as a potential Notch target in Drosophila. Its’ human homolog called PDZD2 (PDZ domain-containing 2 protein) has been shown to be over-expressed in several types of cancers (breast and prostate cancers).My results show that Bbg is a new regulator of the actin cytoskeleton and of the Hippo pathway in Drosophila. A detailed study of Bbg function and of its associated partners have helped to better understand the intricate relationships between actin dynamics and proliferation. My results suggest that Bbg promotes accumulation of filamentous actin (F-Actin) through the increase of the activity of Enabled (Ena) and the phosphorylation of the molecular motor Myosin Light Chain (MLC). This regulation leads to the increase of Yorkie activity, the final effector of the Hippo pathway, to promote cell proliferation.The regulation of adhesion, and in particular of Adherens Junctions (AJs), is a critical step during the evolution of solid tumours. A better understanding of how these structures are regulated will provide valuable insights into different phases of the disease. Despite the recent advances, many key aspects of AJ dynamics remain poorly understood. In the laboratory, we are interested in the identification of new AJs regulators. Using the remodelling of AJs during the development of the Drosophila pupal eye as a model, we have identified Magi as a scaffold recruiting a complex formed by RASSF8 and ASPP, regulating Bazooka membrane recruitment, E-Cadherin and catenins deposition, and ultimately AJs remodelling during morphogenesis. I uncovered Echinoid, an immunoglobulin-like protein involved in cell adhesion and in Hippo pathway regulation, as a new binding partner responsible for the recruitment of Magi at future AJ sites.

Le cytosquelette bactérien des homologues d’actine (protéines de la famille MreB) joue un rôle majeur dans la morphogénèse cellulaire. Des homologues de MreB sont retrouvés chez la plupart des espèces bactériennes non sphériques, où ils sont essentiels pour la viabilité cellulaire. Les bactéries à Gram-positif ont généralement plusieurs isoformes. L’organisme modèle Bacillus subtilis en possède trois : MreB, Mbl et MreBH, tous trois impliqués dans la détermination de la forme de la cellule. Le postulat actuel est une organisation, des complexes de synthèse du peptidoglycane, le long des parois latérales par les filaments hélicoïdaux des MreB-like. Cependant, les mécanismes moléculaires et les protéines effectrices impliqués dans cette fonction ne sont pas encore élucidés. Par analogie avec les rôles de l’actine eucaryote, des implications dans d’autres processus cellulaires cruciaux et la présence de partenaires protéiques sont également attendus pour les actines procaryotes. Afin d’explorer les rôles des protéines MreB chez B. subtilis nous avons généré, par des criblages génomiques double hybride chez la levure, un réseau d’interaction protéine-protéine centré sur MreB, Mbl et MreBH. Une vérification systématique et drastique de toutes les interactions obtenues lors des criblages a été réalisée afin d’éliminer les faux positifs. Les interactions identifiées révèlent des liens entre les protéines MreB-like et seize protéines issues de catégories fonctionnelles variées ou de fonction inconnue. Une étude exploratoire a été menée pour huit des protéines partenaires par des approches in silico et in vivo et nous a permis de sélectionner une seule interaction à caractériser plus en détail. Nous nous sommes principalement intéressés à l’interaction physique et directe entre MreB et DapL, une protéine essentielle vraisemblablement impliquée dans la voie de biosynthèse des précurseurs du peptidoglycane, par analogie à DapE d’E. coli. La caractérisation approfondie de DapL a confirmé son essentialité dans la synthèse du peptidoglycane. Bien que l’interaction MreB-DapL ait été confirmée biochimiquement, son rôle biologique exact n’a pas été élucidé. Cependant, nous avons mis en évidence d’autres interactions entre MreB et DapG, LysA et MurE, des enzymes également impliquées dans les étapes précoces de la synthèse du peptidoglycane. L’existence de telles interactions renforce le rôle du cytosquelette MreB de B. subtilis dans l’orchestration des machineries de synthèse de la paroi cellulaire. / Bacterial actin homologues (MreB proteins) play a major role in cell morphogenesis in non-spherical bacteria. The prevailing model postulates that helical, membrane-associated MreB-like filaments organize elongation-specific peptidoglycan-synthesizing complexes along the sidewalls. However, the mechanistic details, as well as the effector proteins of MreBs morphogenetic function, remain to be elucidated. MreB proteins are also involved in DNA segregation, cell polarity, cell motility and, by analogy to eukaryotic actins, possibly in other functions that require the targeting and accurate positioning of proteins and molecular complexes in the cell. Gram-positive bacteria usually have more than one MreB isoform. Our model organism, Bacillus subtilis, has three called MreB, Mbl and MreBH. To explore the roles of the MreB cytoskeleton in B. subtilis, we used genome-wide yeast two-hybrid screens to identify proteins that physically associate with MreB, Mbl and MreBH. Stringent specificity assays were systematically performed to remove false positives and confirm the specificity of all potential interactions identified in the screens. A protein-protein interaction network centered on the three MreBs was generated which includes 16 protein partners. This interaction network provides insights into the links of MreB proteins with proteins belonging to several functional categories as well as proteins of unknown function. An exploratory study was conducted in silico and in vivo for 8 of the partner proteins identified in the network and allowed us to select one interaction for a more in-depth analysis. We next focused in the physical interaction between MreB and DapL, an essential protein presumably involved in the early steps of peptidoglycan biosynthesis. The characterization of DapL confirmed its essential role in cell wall synthesis. The MreB-DapL interaction was confirmed biochemically and we showed that MreB also associates with other proteins involved in the synthesis of the PG precursors (DapG, LysA and MurE). Together, these results suggest that B. subtilis MreB orchestrates the PG biosynthetic cytosolic machineries to achieve and maintain its rod shape.

La perte auditive est le trouble sensoriel le plus commun avec 40 % des personnes de plus de 65 ans affectées, entraînant, chez ces patients une dégradation de leur qualité de vie et un isolement sociale. Les principales causes sont le vieillissement ou l'exposition au bruit, mais les mutations génétiques sont aussi à l'origine de déficits auditifs. Parmi ces surdités, le Syndrome de Chudley McCullough (CMCS) est une maladie rare caractérisée par une surdité sévère et précoce associée à des anomalies cérébrales (Chudley et al., 1997). Récemment, des mutations du gène GPSM2 (G protein signaling modulator 2) ont été décrites comme étant responsables de cette pathologie sans que l'on en connaisse les mécanismes (Walsh et al., 2010). A l'aide d'un modèle d'étude murin de cette pathologie, nous avons identifié les bases moléculaires de la pathologie ainsi qu’une nouvelle fonction moléculaire pour Gpsm2 sur la modulation du cytosquelette d’actine. La perturbation de cette fonction affect à la fois la maturation des cellules auditives et la croissance des jeunes neurones, pouvant expliquer les surdités et l’hypoplasie du corps calleux décrits chez ces patients (Mauriac et al., 2017). De plus, nous avons identifié les partenaires de Gpsm2, les protéines Gαi, comme indispensables à la fonction auditive (Beer-Hammer et al., 2018). Au niveau moléculaire, nous avons découvert une nouvelle interaction de Gpsm2 avec une protéine essentielle à la maturation des cellules auditives et impliquées dans les surdités de type Usher, la Whirlin.Par conséquent, notre étude a permis de clarifier l’étiologie du CMCS et de montrer que sa complexité et son aspect multisyndromique sont dus au rôle multifonctionnel du complexe Gpsm2/G⍺i non seulement sur la dynamique de la tubuline dans des cellules en prolifération et en post-mitotiques (Ezan et al., 2013), mais aussi sur la dynamique d’actine (Mauriac et al., 2017). / Hearing loss is the most common sensory disorder, affecting 40% of people over 65 years old, leading for these patients, to the deterioration of their quality of life and to their social isolation. The main causes are aging or exposure to noise. However, many genes can also cause deafness. Among these deafnesses, the Chudley McCullough Syndrome (CMCS) is a rare disease characterized by severe and early deafness associated with brain abnormalities (Chudley et al., 1997). Recently, mutations in the GPSM2 (G protein signaling modulator 2) gene were found to be causative of this pathology, but the molecular basis were unknown (Walsh et al., 2010). Using a murine model of this pathology, we identified the molecular basis of this pathology as well as a new molecular function for Gpsm2 on the modulation of actin cytoskeleton. The disruption of this function leads to defect of the maturation of auditory hair cells and the reduction of the outgrowth of young neurons which may explain the deafness and the hypoplasia of the corpus callosum described in these patients (Mauriac et al., 2017). In addition, we identified partners of Gpsm2, Gαi proteins, as essential for auditory function (Beer-Hammer et al., 2018). At the molecular level, we have discovered a new interaction of Gpsm2 with a protein essential for the maturation of auditory cells and involved in Usher type deafness, Whirlin.Therefore, our study clarified the etiology of CMCS and show that the complexity and multisyndromic aspect of this pathology is due to the multifunctional role of the complex Gpsm2/G⍺i not only on tubulin dynamics in proliferating cells and post-mitotic cells (Ezan et al., 2013), but also on actin dynamics (Mauriac et al., 2017).

Durant mon travail de thèse, j'ai étudié le rôle central de l'ADF/cofiline, une protéine qui se lie au cytosquelette d'actine, décore spécifiquement les parties ‘âgées' des filaments d'actine, diminue localement par un facteur 5 la rigidité du filament et provoque la fragmentation du filament à l'interface entre les sections nues et décorées. Dans ma première étude (Suarez et al., Current Biology, 2011), j'ai utilisé la microscopie à onde évanescente et une ADF/cofiline fluorescente pour démontrer que l'ADF/cofiline est un marqueur de l'état nucléotidique (ATP, ADP-Pi ou ADP) des sous-unités d'un filament d'actine en cours de polymérisation. De plus, l'ADF/cofiline, en accélérant la dissociation du phosphate inorganique (Pi), limite la taille du cap ATP/ADP-Pi du filament d'actine, sans toutefois le réduire à une taille zéro. Des analyses statistiques sur filaments isolés établissent une corrélation parfaite entre la densité de fixation de l'ADF/cofiline et son efficacité de fragmentation. Paradoxalement, l'efficacité de fragmentation est maximale pour une densité d'ADF/cofiline de 0.5. Ceci est confirmé par des analyses supplémentaires qui montrent que les sites de fragmentation du filament coïncident avec la position des frontières entre zones décorées et zones nues. Les conséquences de ce dernier résultat paradoxal sont l'objet de ma seconde étude (McCullough et al., 2011, Biophysical Journal). En combinant différentes sources d'ADF/cofilines (vertébré et levure) et d'actines (vertébré et levure), nous montrons, sur les quatre couples actine-ADF/cofiline possibles, qu'il existe une très forte corrélation entre (1) l'efficacité de fragmentation (qui dépend de la combinaison entre actine et ADF/cofiline) et (2) la déformation du filament, mesurée à la frontière entre zone décorée et zone nue. Au cours de ma troisième étude (Reymann et al., Molecular Biology of the Cell, 2011), nous montrons que le mécanisme de fragmentation ADF/cofiline-dépendant, établi à l'échelle d'un filament isolé, peut s'appliquer aussi à l'échelle d'une comète d'actine qui comporte un réseau complexe de filaments. Mon travail de thèse a montré que le mode d'action de l'ADF/cofiline se situe à l'intersection entre mécanismes microscopiques et macroscopiques, d'une part, et entre chimie et physique, d'autre part. Les caractéristiques microscopiques des interactions de cette protéine avec un filament d'actine isolé sont fondamentales pour expliquer des évènements macroscopiques, comme la fragmentation de filaments ou de structures complexes. D'autre part, nous avons montré comment les propriétés chimiques de l'ADF/cofiline modifient les propriétés physiques locales du filament et conduisent à la fragmentation. L'ADF/cofiline a un rôle central pour l'intégration de mécanismes physico-chimiques, à l'échelle microscopique, afin d'assurer un comportement cohérent à l'échelle de la cellule. / During my thesis, I have studied the pivotal role of ADF/cofilin, a protein that binds to the actin cytoskeleton, specifically decorates ‘old' actin filament parts, decreases by a factor of 5 the local filament rigidity and triggers filament fragmentation at boundaries between decorated and non-decorated filament sections. In my first study (Suarez et al., Current Biology, 2011), I have used evanescent wave microscopy and labeled ADF/cofilin to demonstrate that ADF/cofilin is a marker of the nucleotide state (i.e. ATP, ADP-Pi or ADP) associated with the actin sub-units in actively polymerizing filaments. In addition, because ADF/cofilin accelerates inorganic phosphate (Pi) release, the size of the ATP/ADP-Pi cap is diminished, although it cannot be reduced to zero. Fragmentation events frequency, determined from a thorough analysis of a population of single filaments decorated with labeled ADF/cofilin, is perfectly correlated with the binding density of ADF/cofilin on filaments. However, the maximal severing efficiency is obtained for half ADF/cofilin density. This paradoxical result is confirmed by analysis showing that severing sites are mainly associated with boundaries between decorated and bare actin filament sections. In consequence, in a second paper (McCullough et al., Biophysical Journal, 2011), I have took part in the study of actin filament deformation in relation with severing efficiency. Using different ADF/cofilin (vertebrate and yeast) and actin (vertebrate and yeast), we have shown that filament deformation at the boundary between bare and ADF/cofilin-decorated filament sections (which depends on the ADF/cofilin/actin combination) and severing are highly correlated. During my third study, (Reymann et al., Molecular Biology of the Cell, 2011), we established that stochastic dynamics, discovered at the molecular level for single filaments (or bundles of them), is also relevant to describe the macroscopic fragmentation of a comet tail consisting of hundreds of thousands filaments. I have shown that ADF/cofilin activity is at the crossroad between macroscopic and microscopic systems, on one hand, and physics and chemistry, on the other hand. The characteristics of microscopic interactions of ADF/cofilin with a single filament are fundamental to understand the macroscopic dynamics of a fragmenting comet. In addition, we have established how the binding of ADF/cofilin (chemistry) controls the mechanical properties of the filament (physics) before fragmentation. ADF/cofilin is essential in the integration of physical and chemical mechanisms at the microscopic level, to ensure consistent behavior at the cell scale.

Les microtubules jouent un rôle central dans l'organisation et la vie cellulaire. L'assemblage des microtubules présente des comportements non linéaires et mal compris comme l'instabilité dynamique. Nous avons voulu déterminer les paramètres limitant la réaction d'assemblage des microtubules, puis isoler des effecteurs de cette réaction. Des études cinétiques ont été réalisées dans des conditions expérimentales simples où tous les paramètres de la réaction ont été mesurés. D'après nos résultats, la nucléation des microtubules se produirait en deux étapes : formation rapide et irréversible d'oligomères de tubuline puis assemblage de ces oligomères en microtubules. La vitesse d'élongation des microtubules est indépendante de la concentration en tubuline-GTP : cette vitesse d'élongation est sans doute limitée par les propriétés structurales des microtubules. Enfin, le désassemblage des microtubules se produirait par catastrophes et serait stimulé par des oligomères de tubuline se formant au cours de la réaction. Dans une seconde partie, nous avons produit des oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules par pontage covalent modéré des microtubules. Ces oligomères sont constitués par assemblage latéral de 10 dimères de tubuline et s'agrègent par quatre pour former un microtubule. Les microtubules formés dans nos conditions en présence d'oligomères de nucléation ne désassemblent pas spontanément : ces conditions permettront de rechercher des facteurs de catastrophe. Enfin, nous avons développé une procédure chromatographique pour isoler des protéines liant la tubuline. Les partenaires de la tubuline sont isolés à l'état natif et se prêtent à des tests fonctionnels. L'utilisation des techniques de cartographie peptidique a permis d'identifier les protéines par spectrométrie de masse. Nous avons ainsi isolé des protéines connues pour contrôler la dynamique des microtubules, mais d'autres, inconnues restent à étudier.

L'objet de cette thèse est l'étude de l'implication des filaments intermédiaires (cytosquelette) dans une fonction mécanique, et plus particulièrement, dans la fonction de mécanotransduction s'exerçant via un mécanisme de réorganisation de la structure du réseau en réponse aux changements mécaniques extracellulaires. Cette problématique est appréhendée selon deux optiques complémentaires, l'une déductive et l'autre inductive. La première traite de la caractérisation structurale des réseaux cytosquelettiques par des méthodes d'analyse d'images. La caractérisation de l'architecture des réseaux cytosquelettiques se définit comme une représentation simplifiée des réseaux suivie d'une quantification de leur architecture. Cette méthodologie, développée pour spécifier l'architecture de réseaux d'objets curvilignes, se compose de trois approches découlant d'une observation hiérarchisée des réseaux. Elle est utilisée, pour caractériser d'une part la variabilité intracellulaire de l'architecture des réseaux cytosquelettiques, et d'autre part les variations architecturales des réseaux cytosquelettiques de cellules exposées à des conditions mécaniques différentes. La seconde présente un modèle intégro-différentiel d'édification du réseau de cytokératine, s'appuyant sur l'hypothèse selon laquelle l'organisation structurale d'un réseau spécifique de cytosquelette dépend de sa fonction biologique. Ce modèle a été conçu dans le but de valider l'hypothèse, émise et observée lors de l'étape de caractérisation, d'implication des réseaux de filaments intermédiaires dans la mécanotransduction par variations architecturales. Du modèle mathématique d'organisation structurale du réseau de cytokératine d'une cellule épithéliale induite par les contraintes mécaniques est dérivé un modèle de simulation tridimensionnel. Ce modèle de simulation permet d'obtenir des exemples d'architecture de réseau de cytokératine pour des contraintes mécaniques données.

Les cellules de Schwann sont responsables de la myélinisation du système nerveuxpériphérique. C'est un phénomène complexe et finement régulé. En effet, des altérationsde l'expression touchant les protéines de la myéline périphérique (P0 et PMP22)peuvent provoquer des pathologies comme la Charcot‐Marie‐Tooth. Par ailleurs, lescellules de Schwann subissent d'importantes modifications de leur cytosquelette aucours du processus de myélinisation.Nous avons identifié la voie Wnt/β‐caténine comme directement impliquées dansla régulation de l'expression des gènes de la myéline P0 et PMP22 à la fois in vitro maiségalement in vivo. De plus, nous avons initié la démonstration de l'implication de la voieWnt non canonique au cours de ce même processus. Par ailleurs, nous avons montré queles ligands Wnts aussi bien canoniques que non canoniques pouvaient provoquerl'allongement des extensions des cellules de Schwann. Le chlorure de lithium est uninhibiteur de la GSK3β, mimant l'activation de la voie Wnt/β‐caténine. Il provoque unimportant allongement des cellules de Schwann accompagné de profonds remaniementsde l'architecture interne. Par la suite nous nous sommes intéressés aux effets d'unelésion sur la remyélinisation. La voie Wnt/β‐caténine est réactivée par une lésion in vitrotandis que le lithium accélère la récupération fonctionnelle du battement des vibrissesde souris après pincement du nerf facial, améliore les structures de la gaine de myélineet induit l'expression des gènes de la myéline in vivo.ConclusionNotre travail a mis en évidence le rôle majeur des voies Wnt canoniques et noncanoniques dans la régulation de l'expression de gènes de la myéline et dans lecytosquelette des cellules de Schwann.

Le cytosquelette bactérien des homologues d'actine (protéines de la famille MreB) joue un rôle majeur dans la morphogénèse cellulaire. Des homologues de MreB sont retrouvés chez la plupart des espèces bactériennes non sphériques, où ils sont essentiels pour la viabilité cellulaire. Les bactéries à Gram-positif ont généralement plusieurs isoformes. L'organisme modèle Bacillus subtilis en possède trois : MreB, Mbl et MreBH, tous trois impliqués dans la détermination de la forme de la cellule. Le postulat actuel est une organisation, des complexes de synthèse du peptidoglycane, le long des parois latérales par les filaments hélicoïdaux des MreB-like. Cependant, les mécanismes moléculaires et les protéines effectrices impliqués dans cette fonction ne sont pas encore élucidés. Par analogie avec les rôles de l'actine eucaryote, des implications dans d'autres processus cellulaires cruciaux et la présence de partenaires protéiques sont également attendus pour les actines procaryotes. Afin d'explorer les rôles des protéines MreB chez B. subtilis nous avons généré, par des criblages génomiques double hybride chez la levure, un réseau d'interaction protéine-protéine centré sur MreB, Mbl et MreBH. Une vérification systématique et drastique de toutes les interactions obtenues lors des criblages a été réalisée afin d'éliminer les faux positifs. Les interactions identifiées révèlent des liens entre les protéines MreB-like et seize protéines issues de catégories fonctionnelles variées ou de fonction inconnue. Une étude exploratoire a été menée pour huit des protéines partenaires par des approches in silico et in vivo et nous a permis de sélectionner une seule interaction à caractériser plus en détail. Nous nous sommes principalement intéressés à l'interaction physique et directe entre MreB et DapL, une protéine essentielle vraisemblablement impliquée dans la voie de biosynthèse des précurseurs du peptidoglycane, par analogie à DapE d'E. coli. La caractérisation approfondie de DapL a confirmé son essentialité dans la synthèse du peptidoglycane. Bien que l'interaction MreB-DapL ait été confirmée biochimiquement, son rôle biologique exact n'a pas été élucidé. Cependant, nous avons mis en évidence d'autres interactions entre MreB et DapG, LysA et MurE, des enzymes également impliquées dans les étapes précoces de la synthèse du peptidoglycane. L'existence de telles interactions renforce le rôle du cytosquelette MreB de B. subtilis dans l'orchestration des machineries de synthèse de la paroi cellulaire.