Les cellules exerçert des forces sur la matrice extra cellulaire sur laquelle elles adhérent impliquant une boulle de régulation biomécanique. Cependant les sous-jacents de par lesquelles les cellules sentent et transmettent les forces restent encore m^echaniemes à elucider. Dans la premiére partie nous allons comment le modulations géométrique les forces de tractions et la distributions des tensions dans le cytosquelette d'actine ainsi que localisation des adhésions focales sur une cellule unique en combinant l'utilisation de la technique de micropatterning et de microscopie à traction de force. Nous avons mesuré la force de traction cellulaire sur différentes formes géométriques mocropatterns (comme un U, flieche ou H) recouvert de protéines sur des gels mous de polyacrilamide 2D dans lequl sont intégrés des nanobilles fluorescenes. Nous avons montré que la géométrie influencait la distribution des forces de tractions localement tandis que l'aire projetée des differentes formes restait conservée (pour une celule). Puis nous avons comparé la force de traction cellulaire développée quand les cellules sont sur des motif contirees circulaire 2D avec des motifs discrets en forme de micropiliers 3D de la me^me rigidité . Nous avons aussi étudie comment les forces varies en fonction de la rigidité de la matrice extracellulaire dans les deux cas précédents une mesure quantitative a été faite sur la localisation spatiale des protéines d'adhésion sur les formes circulaires et aussi sur l'organisation de l'actine. Afin d'ovoir une compréhension systématique de la distribution des forces nous nous sommes concentré sur la localisation et l'orientation des forces sur différentes géométrics de motifs (V, T, Tripod et plus). Nous avons corrélé la distribution avec celle des dibers de stesses et la localisation des adhésions focales. Ensuite nous nous sommes intéressés la distribution des centrosome en corrélation avec la forces et l'organisation d'autres eléments internes. Nous avons égolement essayé de prédire la force de traction en utilisant un modele théorique. Pour finir, nous avons developpé une novelle méthode de micropatterning fabriqué à partir de brosses de polymeres de PNIPAM qui sont thermosensibles. La fonctionalisation de surface et l'adhésion des cellules sur la surface sont aussi décrites. Nous discutons également de la dépendance en température des propriétés du PNIPAm et de l' utilisation desbrosses de polymeres comme actuateur pour induire les détachments des cellules. Nous avons aussi regardé la distribution des fibres de stress quand la cellule est cultivée sur différent types de motif thermosensible. / It has grown a great interest among biophysicists that adherent cell senses substrate stiffness and geometry by the process of mechanotransduction. Cells exert force on the extra cellular matrix on which it is subjected to adhere by active mechanism, which involves biomechanical regulatory feedback loop. It is still unclear whether biomechanical,biochemical or geometrical stimuli dominates invivo. Underlying mechanism behind the way cell senses, redistributes and transmits force still needs to elucidate. In the first part we show how geometrical modulation influences traction force and tension distribution in the actin cytoskeleton, and also localization of focal adhesion at single cell level by combining use of Micropatterning and Traction force microscopy technique. We measure cell traction force seeded on different micropattened shapes(like U,arrow and H) coated with protein on 2D soft polyacrilamide gel embedded with nano beads. We show that geometrical cue redistributes traction force locally while projected area designed for a single cell is conserved. we compare cell traction force developed when cells are on a continuous 2D circular array pattern with discrete 3D micropillar array of same stiffness. We also have investigated how forces are varied with rigidity modulation of the extra cellular matrix in both these two cases. A quantitative measurement has been done on the spatially localized adhesion proteins on the circular dots and also actin re-organization. In the sencod part to achieve more systematic understanding of force distribution we have consider more on force localization and orientation on different patterned geometry( V, T, Tripod, Plus). We correlate force distribution with stress fiber and focal adhesion localization. Finally we look into centrosome distribution in correlation with force and other internal organization. An alternate approach has been made towards the development of thermoresponsive micropattern, made of poly(N-isopropyla crylamide) brushes, grafted at high surface density. Surface functionalization and cell attachment on the surface are bescribed. We discuss temperature-dependent swelling properties of PNIPAM and the polymerbrush as a microactuator which induces cell detachment. We also have looked into stress fiber distribution when cell is cultured on different thermoresponsive pattern geometries.

La maladie d'Alzheimer est une pathologie neurodégénérative caractérisée par une perte progressive des fonctions cognitives. Cette perte des fonctions cognitives est directement liée à une atteinte neuronale et plus particulièrement synaptique. Deux caractéristiques histopathologiques en lien avec des dérégulations protéiques sont retrouvées chez les patients atteints de la MA : les plaques séniles extracellulaires composées de peptides β-amyloïdes (Aβ) fibrillaires et la dégénérescence neurofibrillaire constituée d'agrégats intracellulaires de protéines tau hyper et anormalement phosphorylées. Les formes agrégées de ces protéines ont longtemps été considérées comme neurotoxiques, cependant, il est maintenant avéré que les formes solubles de ces protéines dérégulées étaient à l'origine de la pathologie. Les synapses excitatrices situées au niveau des épines dendritiques sont les cibles du peptide Aβ sous forme soluble et oligomèrique (Aβo). Ce dernier en altère la fonction et induit leurs pertes. Récemment, il a été montré que cette action synaptotoxique de l'Aβo est dépendante de la protéine tau. De plus, dans un autre modèle de tauopathie, la démence fronto-temporale avec syndrome parkinsonien liée au chromosome 17 (FTDP-17), la synaptotoxicité de tau s'est révélée dépendante de son état de phosphorylation. Ainsi, il émerge le concept de tau synaptique dans un contexte pathologique. Cependant, des études plus récentes ont montré que, en condition physiologique, une petite portion de tau se retrouve au niveau de la synapse. Au regard de ces nouvelles données, il est possible que tau, en plus d'être une protéine axonale, nucléaire et membranaire, soit aussi synaptique. Dans ce contexte, les travaux présentés dans cette thèse visent à étudier l'implication de la protéine tau dans la fonction synaptique et les perturbations induites par la présence d'Aβo. Ces travaux ont été effectués sur un modèle cellulaire de cultures primaires de neurones corticaux et sur tranche d'hippocampe de souris par des méthodes biochimiques et d'analyse dynamique en microscopie confocale sur cellules vivantes. Afin d'étudier l'impact d'une activation synaptique sur un système de culture neuronal, l'utilisation combinée de la bicuculline, antagoniste des récepteurs gabaergique GABAa et de 4-amino pyridine, bloqueur de canaux potassique, permet d'établir une potentialisation à long terme sur les synapses. Grâce à un protocole d'extraction permettant d'isoler le compartiment post-synaptique (fraction contenant la densité post synaptique dont le marqueur protéique PSD-95), nous avons montré que l'activation synaptique enrichit la fraction PSD en protéine tau suggérant son implication dans les phénomènes de plasticité synaptique. L'étude du cytosquelette d'actine prépondérant au niveau synaptique a révélé que l'actine filamenteuse est un partenaire de tau. Dans un contexte pathologique, l'incubation d'Aβo induit le recrutement de tau à la synapse et perturbe l'organisation du cytosquelette d'actine. Ce changement structurel du cytosquelette d'actine pourrait être à l'origine des perturbations de la plasticité et du maintien synaptique induit par Aβo. En conclusion, l'ensemble des résultats de cette thèse suggère que tau exerce une fonction physiologique au sein de la synapse impliquant une interaction avec le cytosquelette d'actine et qu'en conditions pathologiques (induites par Aβo), on observe une altération fonctionnelle du rôle de tau à la synapse qui pourrait participer aux perturbations cognitives caractéristiques de la MA. / Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a progressive loss of cognitive functions. This loss of cognitive functions is directly related to neuronal impairment, and more specifically, synaptic dysfunction. Two histopathological features found in AD patients' brains are related to protein deregulation: extracellular neuritic plaques composed of fibrillar β-amyloid peptide (Aβ) and intracellular aggregates composed of hyper-phosphorylated tau, named neurofibrillary tangles. Aggregated forms of these peptides have been considered neurotoxic, however, it is now recognized that soluble forms of these deregulated proteins are causal to the pathology. Soluble, oligomeric forms of Aβ peptide (Aβo) target excitatory synapses where they diminish synaptic function and cause loss of dendritic spines. Recently, it has been shown that the Aβo synaptotoxicity is tau-dependent. Another tauopathy, fronto-temporal dementia with Parkinsonism linked to chromosome 17 (FTDP-17), exhibits synaptotoxicity, which has proved to be dependent on the phosphorylation state of tau. Thus, emerged the concept of synaptic tau in a pathological context. Recent studies have shown that a small quantity of tau is present in synapses under physiological conditions. These new data suggest that tau is a synaptic protein, in addition to being axonal, nuclear and membrane-associated. In this context, the work presented in this thesis characterizes the involvement of tau in synaptic function and its Aβo-induced disturbances. This work was conducted using primary cortical neurons cultured from mice and hippocampus slices and employed biochemical methods and confocal live-cell imaging. To study the impact of a synaptic activation on synaptic tau, we combined bicuculline, an antagonist of GABAa receptors and 4-amino-pyridine, potassium channel blocker, to establish long-term synaptic potentiation. By isolating the post-synaptic compartment (i.e. the fraction containing the post synaptic density and its marker PSD-95), we have shown that synaptic activation induced an enrichment of tau in PSD. This suggests its involvement in synaptic plasticity. The study of the actin cytoskeleton, which is specifically enriched in dendritic spines, revealed that filamentous actin is a molecular partner of tau, which may provide a means of recruiting tau to the synapse. Turning our attention to a pathological context, exposure to Aβo induced tau recruitment to the synapse and disrupts the actin cytoskeleton organization without exogenous synaptic stimulation. This structural modification of the actin cytoskeleton could underlie the disturbance of plasticity and synaptic maintenance induced by Aβo. In conclusion, this thesis provides evidence that tau performs a physiological synaptic function that involves an interaction with the actin cytoskeleton. Further, the synaptic function of tau is altered in pathological conditions (i.e. exposure to Aβo), and may contribute to the cognitive disturbances in AD.

La migration cellulaire est une étape clé intervenant à un stade précoce de la dissémination des cellules cancéreuses dans l’organisme, et est donc responsable de la formation des métastases qui tuent environ nonante pourcent des patients atteints de cancer. De plus, ces cellules migrantes résistent à l’apoptose grâce à l’activation constitutive de voies de signalisation anti-apoptotiques, et développent donc une résistance vis-à-vis des traitements anti-cancéreux actuels qui sont généralement pro-apoptotiques. Nous avons pris pour cible ce processus de migration cellulaire dans l’espoir d’identifier des agents anti-migratoires qui permettraient de lutter contre la formation des métastases et de restaurer chez les cellules migrantes une certaine sensibilité aux traitements pro-apoptotiques.<p>Dans la première partie de notre travail, nous avons analysé les effets anti-angiogéniques et anti-migratoires des agents anti-tubuline. Nous avons confirmé que le Taxol® présentait une action anti-angiogénique à des concentrations non-cytotoxiques. Nous avons ensuite démontré que d’autres agents anti-tubuline exerçaient la même action que le Taxol®, et que cette action leur était spécifique. Nous avons montré que certains de ces agents étaient également capables de réduire la migration de lignées cellulaires tumorales, toujours à des concentrations non-cytotoxiques, et que cette action pouvait s’exercer via une affectation du cytosquelette d’actine.<p>Dans la deuxième partie du présent travail, nous avons démontré l’importance de la mise au point d’une approche pharmacologique originale permettant l’identification de composés à action anti-migratoire puisque l’outil utilisé par le U.S. National Cancer Institute pour le criblage de nouvelles molécules anti-cancéreuses ne permet pas de discerner l’activité anti-migratoire des molécules testées.<p>Enfin dans la troisième partie de ce travail, après avoir souligné la raison du choix de l’actine comme cible pour inhiber la migration cellulaire, nous avons développé une stratégie pharmacologique in vitro originale de découverte de composés anti-actine à activité anti-migratoire. Grâce à une approche divisée en plusieurs étapes, à savoir un essai de cytotoxicité, une étude de la dynamique de la polymérisation d’actine en tubes ou sur cellules entières, et des essais de migration bidimensionnelle sur cellules individuelles ou sur population cellulaire, nous avons montré d’une part que des molécules connues pour affecter le cytosquelette actinique étaient capables d’affecter la migration cellulaire, et d’autre part que la méthodologie que nous avons développée permettait bien l’identification de composés affectant l’actine et capables de réduire la migration de cellules tumorales. En conclusion, cette stratégie in vitro pourrait être utilisée dans l’identification de nouvelles molécules à activité anti-migratoire pour lutter contre le cancer.<p> / Doctorat en sciences pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’objectif du projet est de comprendre l’effet du peptide vecteur (R/W)9 sur les cellules tumorales EF, modèles du sarcome d’Ewing. En effet, ce peptide a la capacité de remodeler le cytosquelette d’actine dans ces cellules, ainsi que de réduire leur motilité et leur aptitude à croître en indépendance d’ancrage (Delaroche D. JBC 2010).La première étape de ce travail a été la caractérisation in vitro de l’interaction directe avec l’actine par cross-linking chimique et spectrométrie de masse (Clavier S. EuProt 2014). Ensuite, pour avancer dans la compréhension de l’effet du peptide (R/W)9, deux approches ont été développées.La première approche, basée sur du photocross-linking in cellulo ou in lysat, vise à identifier des partenaires intracellulaires du peptide vecteur. Pour cela, nous avons mis au point et validé biologiquement une version photoactivable du peptide (R/W)9. Puis, avant de passer sur cellules entières, nous nous sommes assurés de la faisabilité de la réaction de photocross-linking in vitro sur un système d’interaction modèle que nous avons également utilisé pour développer un logiciel capable d’interpréter les spectres MS/MS d’espèces photocross-linkées (Xlink-Identifier, Collaboration Dr Du X). Des expériences de purification d’affinité ont également été menées en immobilisant le peptide (R/W)9 sur des billes de streptavidine ensuite mises en présence de lysat cellulaire. Les protéines capturées ont été identifiées par spectrométrie de masse haut-débit. La seconde approche est de la protéomique différentielle avec un marquage SILAC et a pour objectif de mettre en évidence l’influence du peptide vecteur sur l’expression des protéines. / The aim of the project is to understand the effect of (R/W)9 cell penetrating peptide (CPP) on EF tumoral cells, an Ewing sarcoma model cell line. Actually, this peptide is able to remodel the actin cytoskeleton of these cells, to decrease their motility as well as their ability to grow without anchorage (Delaroche D. JBC 2010).The first step of this work was to characterize the in vitro interaction with actin using chemical cross-linking and mass spectrometry (Clavier S. Euprot 2014). Then, in order to get a deeper understanding of (R/W)9 peptide effect, two approaches were developed. The goal of the first approach based on in cellulo or in lysate photocross-linking is to identify (R/W)9 CPP’s partners. To do this, we designed and biologically validated a photoactivable version of (R/W)9 peptide. Then, before starting to work with living cells, we checked the feasibility of in vitro photocross-linking on a model interacting system that we also used to develop a software able to interpret MS/MS spectra of photocross-linked species. (Xlink-Identifier, Collaboration with Dr. X. Du.). Affinity purification experiments were also performed by incubating streptavidin magnetic beads bearing (R/W)9 peptide with cell lysates. Captured proteins were identified using high-throughput mass spectrometry. The second approach is differential proteomic with SILAC labelling and aims at assessing the influence of (R/W)9 CPP on proteins expression.

L’activation d’un lymphocyte T (LT) CD4+ par une cellule présentatrice d’antigène (CPA) estune étape cruciale pour la mise en place d’une réponse immune adaptatrice efficace contre unpathogène ou une cellule tumorale. Elle nécessite un contact prolongé entre les deux types cellulaires,initié par la reconnaissance, par le récepteur des LT (TCR), d’un complexe CMH-peptide spécifiqueprésenté à la surface de la CPA. Cette interaction LT-CPA induit la formation d’une zone de contactorganisée dans le temps et l’espace, appelée la synapse immunologique. La mise en place de cettestructure entraîne le remodelage des cytosquelettes d’actine et de microtubules dans les LT. Quelquesminutes après la reconnaissance de l’antigène par le TCR, l’actine se polymérise à la zone synaptiqueet le centre organisateur des microtubules (MTOC) se polarise en face de la CPA.Le but du travail de thèse présenté ici a été d’étudier le rôle de la réorganisation ducytosquelette des LT lors de la mise en place de la synapse, dans la sécrétion des cytokines et lemaintien de l’interaction permettant l’activation des LT. Nous nous sommes particulièrementintéressés au rôle de deux protéines qui régulent le remodelage du cytosquelette : la petite RhoGTPaseCdc42 et un de ses partenaires IQGAP1. Cette étude a été réalisée essentiellement dans des LT CD4+primaires humains, grâce au développement d’une approche permettant d’inhiber l’expression de cesdeux protéines par introduction de shRNAs à l’aide de vecteurs lentiviraux.Nous avons ainsi mis en évidence que le remaniement du cytosquelette d’actine à la synapseétait dépendant de Cdc42, et contrôlait : 1/ la formation d’un anneau d’actine polymérisée enpériphérie de la synapse, 2/ le recrutement et la concentration des vésicules contenant l’IFN-g aucentre de la synapse, 3/ la sécrétion de l’IFN-g dans la zone synaptique. Nous avons également montréque la protéine IQGAP1 contrôlait le remaniement de l’actine des LT à la synapse, la signalisation enaval du TCR, et la dynamique de contact entre LT et CPA.Cette étude participe à une meilleure compréhension du rôle du remodelage du cytosqueletted’actine et de sa régulation dans la mise en place de l’interaction entre LT et CPA, l’activation des LTet une de leur fonction clé : la sécrétion de lymphokines. / CD4+ T lymphocyte activation by an antigen presenting cell (APC) is a crucial step in theestablishment of an adaptive immune response against pathogens or tumor cells. It requires contactbetween the two cell types, initiated by the recognition, by the T cell receptor (TCR), of a specificpeptide-MHC complex presented by the APC. This T cell-APC interaction induces the formation of aparticular zone organized in time and space, called the immunological synapse. The establishment ofthis structure induces the remodeling of the actin and microtubule cytoskeleton in T cells. Few minutesafter antigen recognition by the TCR, actin polymerizes at the synaptic zone, and the microtubuleorganizing center (MTOC) polarizes toward the APC.The goal of the work presented here was to study the role of T cell cytoskeleton remodelingduring the establishment of the synapse, in cytokine secretion and in the maintenance of the interactionallowing T cell activation. We mainly studied the role of two proteins regulating the cytoskeleton: thesmall RhoGTPase Cdc42 and one of its partners IQGAP1. This study was performed mostly in humanprimary CD4+ T cells, thanks to the development of an approach allowing the inhibition of theexpression of these two proteins by introducing shRNAs through lentiviral vectors.Altogether, our results show that remodeling of the actin cytoskeleton at the synapse isdependent on Cdc42 and controls : 1/ the formation of a polymerized actin ring at the periphery of thesynapse, 2/ the recruitment and concentration of vesicles containing IFN-g at the center of the synapse,3/ the secretion of IFN-g in the synaptic cleft. They also show that IQGAP1 controls T cell actinremodeling at the synapse, signaling downstream the TCR, and the dynamic of interactions between Tcells and APC.This study allows a better understanding of the role of cytoskeleton remodeling and of itsregulation in the establishment of Tcell-APC interaction, the activation of T cells and one of their keyfunctions: lymphokine secretion.

Leishmania est un protozoaire parasite de l’ordre de Kinétoplastida de la famille des Trypanosomatidés, agent pathogène des leishmanioses. Au cours de cette thèse nous nous sommes intéressés à l’apoptose chez L. major. Bien que ce processus soit phénotypiquement identique à l’apoptose des mammifères, les protéines clés et les voies métaboliques impliquées restent largement inconnues. L’autophagie étant paradoxalement étroitement liée à l’apoptose, nous nous sommes également intéressés à ce processus de survie cellulaire. La première partie de ce travail a permis de décrire le phénotype autophagique et de montrer qu’apoptose et autophagie sont deux processus distincts mais également en lien étroit. Dans la deuxième partie, nous nous sommes focalisés sur la métacaspase de L. major LmjMCA. Nous avons observé un rôle de LmjMCA similaire à celui des caspases humaines au cours de l’apoptose, en lien avec son domaine catalytique. Nous avons montré que la surexpression de LmjMCA induit l’entrée en autophagie des cellules. Enfin, la troisième partie de ce travail s’est concentrée sur l’étude du cytosquelette. Nous avons ainsi pu établir un lien entre (dé)glutamylation, apoptose et autophagie. Nous avons mis en évidence que la polyglutamylation du cytosquelette, entraîne l’entrée en apoptose des cellules tandis que la déglutamylation du cytosquelette est associée au processus de survie cellulaire. Ce travail a permis de mieux caractériser les processus d’autophagie et d’apoptose chez Leishmania. Ces résultats permettent d’ouvrir des perspectives dans le développement de nouveaux outils thérapeutiques. / Leishmania is a protozoan parasite of the Kinetoplastida order and the Trypansomatid family and is the causative agent of leishmaniasis. In this thesis we focused on apoptosis in L. major. Although this process is phenotypically similar to mammal apoptosis, key proteins and metabolic pathways involved remain largely unknown. Autophagy being paradoxically closely linked to apoptosis, we were also interested in this cell survival process and its relationship with programmed cell death. The first part of this thesis has described the phenotypical changes during autophagy and shown that apoptosis and autophagy are two separate processes, but there is also a close relationship between these two mechanisms. In the second part of this thesis, we have demonstrated that LmjMCA has a role similar to the one of human caspases during apoptosis, through its catalytic domain. In addition, we have shown that LmjMCA overexpression induces autophagy entry after nutrient deprivation via its C-terminal domain.The third part of this work has focused on the study of the cytoskeleton. We could establish a link between (de)glutamylation, apoptosis and autophagy. Indeed, we have shown that cytoskeleton polyglutamylation induces cell death while cytoskeleton deglutamylation is associated with the cell survival process autophagy. This thesis allowed us to better characterize the autophagy and apoptosis processes in Leishmania and to identify the metacaspase as involved in the corresponding pathways. These results open perspectives in the development of new therapeutic tools.

Les mouvements nucléaires sont importants pour une multitude de fonctions cellulaires et sont induits par des forces produites par des protéines moteurs et le cytosquelette. Lors de la formation et régénération de myofibres, les noyaux migrent du centre à la périphérie de la cellule pour son bon fonctionnement. De plus, certaines maladies musculaires sont caractérisées par une accumulation de noyaux centraux. En utilisant une approche théorique et empirique, nous démontrons que le mouvement de noyaux vers la périphérie des myofibres est induit par des forces centripètes autour des noyaux ainsi que par des changements locaux de rigidité nucléaire. Ces forces centripètes sont générées par la contraction de myofibrilles et par leur réticulation autour des noyaux. Les changements de rigidité nucléaire relèvent d’une asymétrie de la distribution de la lamin A/C. En débutant par BIN1, gène muté dans les myopathies centro-nucléés (CNM), nous avons identifié la cascade moléculaire à l’origine du mouvement des noyaux. Nous montrons que l’Amphiphysin 2 (BIN1) est indispensable pour le recrutement de N-WASP, activateur du complexe Arp2/3 afin de promouvoir la polymérisation de l’actine. Cette cascade est nécessaire au mouvement des noyaux vers la périphérie et pour la formation de triades transversales. Cet enchainement est perturbé chez certains patients portant des mutations de BIN1 car cela affecte la bonne localisation de l’Amphiphysin 2. Bien que provenant de la même cascade, le mouvement des noyaux vers la périphérie et la formation transversale de triades sont des processus indépendants. Un complexe de Arp2/3 contenant Arpc5L avec la γ-actine organisent la desmine et donc la réticulation des myofibrilles important pour le mouvement nucléaire. En revanche, un complexe de Arp2/3 contenant Arpc5 avec la β-actine est nécessaires à la formation de triades transversales. / Nuclear movements are important for multiple cellular functions and are driven by forces originating from motor proteins and cytoskeleton. During skeletal myofiber formation or regeneration, nuclei move from the center to the periphery of the myofiber for proper muscle function. Furthermore, centrally located nuclei are found in different muscle disorders. Using theoretical and experimental approaches, we demonstrate that nuclear movement to the periphery of myofibers is mediated by centripetal forces around the nucleus in combination with local changes of nuclear stiffness. The centripetal forces are generated by myofibril contraction, cross-linking and zipping around the nucleus. Local changes of nuclear stiffness are achieved by asymmetric distribution of lamin A/C. Beginning with BIN1, gene mutated in centronuclear myopathies (CNMs); we identified the molecular cascade involved in nuclear movement to the periphery. We show that Amphipysin 2 (BIN1) is important for N-WASP recruitment which itself activates the Arp2/3 complex to induce actin polymerization. This cascade is important for nuclear movement to the periphery and transversal triad formation. This pathway is perturbed in certain patients harboring BIN1 mutations as it leads to mis-localized amphiphysin 2. Despite originating from the same pathway, peripheral nuclear movement and transversal triad formation are independent processes. An Arp2/3 complex containing Arpc5L together with γ-actin organize desmin to cross-link and zip myofibrils for nuclear movement whereas an Arp2/3 complex containing Arpc5 together with β-actin is required for transversal triad formation.

Les GTPases de la famille Rho sont les principaux régulateurs du remodelage du cytosquelette d’actine lors de la migration et l’invasion cellulaire. En particulier, deux membres de cette famille sont importants dans ce processus : les GTPases RhoA et Rac1. En effet, il existe une balance d’activité de ces GTPases, responsables respectivement de la contraction cellulaire et de la formation d’extensions cytoplasmiques, des étapes clefs de la migration. L’objectif de ce travail de thèse a été d’étudier la régulation de ces protéines dans la migration et l’invasion cellulaire. Pour cela, plusieurs stratégies ont été entreprises. Tout d’abord, une étude structure/fonction de la protéine p190RhoGAP-A (p190A), un des régulateurs majeurs de la GTPase RhoA, a été réalisée. Cette étude a permis de mettre en évidence un domaine, appelé PLS pour « protrusion localization sequence », permettant à cette protéine de se localiser au niveau des extensions membranaires appelées « replis membranaires » et « lamellipodes » où RhoA est régulée localement. D’autre part, un mutant délété de ce domaine, appelé PLSp190A, ne peux pas se localiser au niveau de ces structures et a un impact négatif sur leur formation et la migration cellulaire. De plus, l’analyse de ce mutant a révélé que le domaine PLS était impliqué dans la régulation négative de p190A. Ainsi, nous avons mis en évidence un nouveau domaine de p190A responsable de sa localisation intracellulaire et de sa fonction. La deuxième partie de ce travail de thèse a été consacrée à la mise en place d’un outil de mesure de l’activité des GTPases Rho par la technologie Alphascreen. Ce test a permis de mesurer l’activité de Rac1 in vitro et in cellulo mais a également été appliqué à un crible en vue d’identifier de nouvelles molécules régulatrices de Rac1. Ainsi, ce travail de thèse, en abordant par plusieurs angles la régulation des GTPases de la famille Rho, a permis d’apporter des informations et des outils pour la compréhension des mécanismes complexes régissant la capacité des cellules à se mouvoir dans leur environnement. / RhoGTPases are major regulators of the actin cytoskeleton during cell migration and invasion. Particularly, the two members of the RhoGTPase family, RhoA and Rac1 play important roles in these processes. Indeed, a reciprocal balance between these GTPases’activity that leads to cell contraction and cell protrusion formation, determines cell movement. The aim of this PhD thesis was to study the regulation of RhoA and Rac1 during cell migration and invasion. To this end, various strategies were undertaken.We first performed a structure/function analysis of p190RhoGAP-A (p190A), a major negative regulator of RhoA. This led to the identification of a protrusion localization sequence (“PLS”) necessary and sufficient for p190A targeting to actin-based structures. A p190A mutant deleted of the PLS domain (PLS), does not localize to ruffles and lamellipodia, where RhoA is locally regulated during cell migration. This analysis also revealed that the PLS is required for the negative regulation of p190A activity. Finally, p190APLS expression has a dominant negative effect on the formation of actin protrusions and cell migration. Thus, we identified a novel functional domain of p190A required for its proper subcellular localization and functions. The second part of this PhD thesis was focused on the design of an Alphascreen technology-based assay to study GTPases activity. This assay allowed the measurement of Rac1 activity in vitro and in cellulo. Moreover, we used this assay to screen for new regulators of Rac1 activity. In conclusion, this work provides new insights and new tools for the understanding of RhoGTPase involvement in cell migration.

Le cytosquelette représente un élément crucial dans les processus cellulaires essentiels des cellules lymphoïdes. Les différents filaments du cytosquelette et leurs modes de régulation représentent donc des cibles thérapeutiques majeures pour le développement de nouveaux composés pharmacologiques. Au cours de ce travail de thèse, nous avons mis au point une nouvelle méthode d’analyse par cytométrie en flux (CytoFRET) permettant de visualiser simultanément la dynamique de polymérisation des filaments d’actine, des microtubules et des filaments intermédiaires de vimentine dans la lignée leucémique T Jurkat. Cette méthode a été utilisée pour le criblage d’une mini-chimiothèque composée d’inhibiteurs d’enzymes impliquées dans les modifications post-traductionnelles des protéines. Nous avons ainsi identifié deux composés, le WP1130 et le b-AP15, des inhibiteurs d’enzymes de déubiquitination (DUBs), comme puissants inducteurs de la polymérisation/nucléation de l’actine. Nous avons montré que l’effet de ces inhibiteurs sur les microfilaments d’actine est consécutif à une poly-ubiquitination de la Destrine, une protéine de liaison à l’actine. Nous avons également identifié des inhibiteurs des déacétylases HDAC6 et SIRT2 comme inducteurs de la polymérisation des microtubules et de l’assemblage de la vimentine. L’effet de ces inhibiteurs a été corrélé à une acétylation directe de la tubuline mais pas de la vimentine. Ces résultats ouvrent ainsi de nouvelles perspectives à la fois fondamentale et thérapeutique sur la physiopathologie du cytosquelette des cellules lymphoïdes. / Actin, microtubules, and intermediate filaments compose three major cytoskeletal structures of vertebrate cells that are characterized by highly dynamic balances between assembly and de-assembly, underlying critical cellular processes such as mitosis, architecture and movement. Consequently, cytoskeleton dysfunctions have been implicated in several pathological situations including cell transformation and metastasis. Thus, cytoskeletal networks represent major targets for the development of novel anti-cancer and anti-metastatic therapies. However, drug development is currently limited by the availability of high-throughput screening systems allowing the simultaneous monitoring of actin, microtubules and intermediate filaments dynamics in living cells. In this work, we have developed a novel screening assay of cytoskeleton dynamics based on the simultaneous recording by flow cytometry of FRET signals produced by the variation of actin, tubulin and vimentin filaments dynamics in living cells. Our novel method was employed to screen a mini-library of drugs known for their ability to interfere with post-translationnal modifications of proteins. Interestingly, our approach revealed that compounds interfering with lysine acetylation have a dramatic impact on vimentin filaments assembly and microtubules polymerization. In addition, two inhibitors (WP1130 and b-AP15) of deubiquitinating enzymes showed increase of actin polymerization. This effect was attributed to poly-ubiquitnation of Destrin, an actin binding protein. In conclusion, our FRET multiplex flow cytometry assay represents a novel effective method for the future development of new anti-cancer therapies.

Le phéochromocytome (PCC) est une tumeur neuroendocrine rare qui se développe principalement aux dépens des cellules chromaffines de la médullo-surrénale. Dans la majorité des cas, les PCCs sont caractérisés par une hypersécrétion de catécholamines responsables de divers effets délétères chez les patients dont le principal est une hypertension (phéochromocytomes symptomatiques, PS). Cependant, il existe également une forme particulière de PCCs asymptomatiques qui sécrètent des taux physiologiques de catécholamines (phéochromocytomes incidentaux, PI). Parmi les patients porteurs de PI, certains sont hypertendus (PIH) et d’autres non (PIN). Afin de mieux caractériser les différents profils sécrétoires de PCCs (PS et PI), nous avons recherché une implication potentielle des microARNs (miRNAs). Nous avons réalisé une analyse transcriptionnelle des miRNAs exprimés dans 32 échantillons de PCCs (12 PS, 12 PIN et 8 PIH). Le miRNome a été réalisé par qRT-PCR microfluidique (Taqman Low Density Array, TLDA) pour 671 miRNAs. L’analyse statistique (Limma) des données d’expression a permis d’identifier 4 miRNAs significativement sur-exprimés (hsa-miR-7-1-3p, 7-2-3p, 26a-1-3p et 550a-3p) et 3 miRNAs sous-exprimés (497-3p, 32-5p, 190b-5p) dans les tumeurs PIN par rapport aux PS. Pour identifier les cibles potentielles des miRNAs, de nombreux logiciels de prédictions bioinformatiques sont disponibles en ligne mais les résultats qu’ils génèrent sont très divergents. Afin de contourner ce problème nous avons développé miRabel, un nouvel outil de prédiction des cibles potentielles des miRNAs et des fonctions biologiques qui leurs sont associées. Le principe général consiste à agréger les résultats de 3 autres algorithmes de prédiction sélectionnés pour leur complémentarité. Au final, les analyses des courbes ROC (Receiver Operating Characteristic), de la précision et du Recall ont montré que cet outil est plus efficace i) que les algorithmes qu’il agrège et ii) que d’autres logiciels de prédictions couramment utilisés tels que miRWalk, MBSTAR et TargetScan. Une analyse d'enrichissement (Modular Enrichment Analysis ou MEA, Genecodis3) des cibles prédites pour les miRNAs différentiellement exprimés a révélé qu’ils peuvent moduler significativement l’activité de quelques dizaines de voies de signalisation dont celles du cytosquelette d’actine et des SNAREs (impliquées dans le transport vésiculaire). En se basant sur l’expression des miRNAs, leurs énergies d’hybridation avec leurs cibles ainsi que leurs effets physiologiques potentiels, les ARNm des gènes PAK3, MLCP, MLCK (cytosquelette d’actine), SNAP25 et STX1A (SNAREs) ont été retenus pour la suite de l’étude. Les essais luciférases ont mis en évidence une interaction entre la totalité de l’extrémité 3’UTR des ARNm de MLCK et miR-32, STX1A et miR-550a-3p, SNAP25 et miR-7-1-3p ainsi que miR-550a-3p. Les autres interactions testées se sont révélées négatives. Les analyses par RT-qPCR ont montré une diminution significative du niveau d’ARNm de MLCK et de STX1A suite à la transfection de miR-32-5p et miR-550a-3p respectivement. Concernant SNAP25, un effet inhibiteur de miR-550a-3p / 7-1-3p est observé. Cet effet a été confirmé au niveau protéique pour STX1A et SNAP25. / Pheochromocytomas (PCC) are rare neuroendocrine tumors which arise from chromaffin cells of the adrenal medulla. In most cases, PCCs are characterized by a hypersecretion of catecholamines, which is responsible for most of deleterious effects in the patients with hypertension being the main symptom (symptomatic pheochromocytomas, SP). However, some PCCs are asymptomatic and secrete physiological levels of catecholamines (Incidental Pheochromocytomas, IP). Among patients with an IP, some are hypertensive (HIP) and other are strictly normotensive (NIP). In order to better understand the different secretory profiles of PCCs (SP and IP), we investigated the potential role of microRNAs (miRNAs) in this process. We started by identifying differentially expressed miRNAs between 12 SP, 12 NIP and 8 SP. The miRNome was done by microfluidic qRT-PCR (Taqman Low Density Array, TLDA) for 671 miRNAs. Statistical analysis (Limma) of the expression results identified 4 miRNAs significantly over-expressed (hsa-miR-7-1-3p, 7-2-3p, 26a-1-3p et 550a-3p) and 3 under-expressed (497-3p, 32-5p, 190b-5p) in NIP tumors when compared to SP. To identify potential miRNAs’ targets, numerous bioinformatic prediction methods are available but their results are quite divergent. To circumvent this issue, we developed miRabel, a new miRNAs’ targets prediction tool and their associated biological functions. MiRabel aggregated the results of 3 other prediction algorithms selected for their features complementarity. The analysis of ROC, precision and recall curves showed that this tool is more efficient i) than the aggregated prediction methods and ii) than other recent or widely used tools such as miRWalk, MBSTAR and TargetScan. A Modular Enrichment Analysis (MEA, Genecodis3) of the miRNAs’ predicted targets revealed that they could potentially regulate the activity of a few pathways of which the actin cytoskeleton and the SNAREs (involved in vesicular transport). PAK3, MLCP, MLCK (Actin cytoskeleton), SNAP25 and STX1A (SNAREs) were selected to be experimentally validated based on miRNA’s expression, hybridization energy and potential physiological impact. Experimental validations of the selected interactions are achieved by luciferase gene reporter, RT-qPCR assays and western-blots following the transfection of studied miRNAs. Luciferase assays showed a direct interaction between the whole 3’UTR of MLCK mRNA and miR-32-5p, STX1A and miR-550a-3p, SNAP25 and miR-7-1-3p as well as miR-550a-3p. The other tested interactions came out to be negative. A significant decrease of MLCK mRNA and STX1A were observed by RT-qPCR analysis after transfecting miR-32-5p and miR-550a-3p respectively. As for SNAP25, the inhibitory effect of miR550a-3p/7-1-3p could be observed. This effect was confirmed at the protein level by western-blots for STX1A and SNAP25. We then evaluated the physiological effect of miR-550a-3p/7-1-3p on the regulated secretion of PC12 rat PCC cells. This was achieved using a nano-luciferase fused to growth hormone 1 (GH1). Once stimulated (59 mM potassium and 2 mM barium), miR-550a-3p over-expression decreased the secretory capacity of PC12 cells while miR-7-1-3p could not. This project represents the first study aiming to understand the regulation of the catecholamine secretion pathway by miRNAs in the pathophysiological context of PCC patients. Eventually, the characterization of this miRNA’s network should improve patient care in the field of hypersecreting neuroendocrine tumors.