La maladie du sommeil ou trypanosomiase africaine humaine fait partie des maladies tropicales négligées sévissant en Afrique sub-saharienne. Elle est causée par le parasite mono-flagellé, Trypanosoma brucei, véhiculé par la mouche tsé-tsé (Glossina spp.). Le flagelle de ce parasite prend naissance au niveau du corps basal et émerge de la cellule en traversant une structure appelée poche flagellaire (FP). Cette poche est formée par l’invagination de la membrane plasmique autour de la base proximale du flagelle. Elle est essentielle à la survie du parasite, car elle constitue l’unique site d’endo- et d’exocytose de la cellule. Cette structure est maintenue autour du flagelle via un constituant du cytosquelette appelé, collier de la poche flagellaire (FPC). Ce collier décrit une structure en anneau ou en fer-à-cheval à la zone de sortie du flagelle. Le premier composant identifié au niveau du FPC est une protéine appelée BILBO1. BILBO1 est essentielle et nécessaire à la biogenèse du FPC et de la FP. Une analyse protéomique et un crible en double-hybride réalisé contre une banque génomique de T. brucei ont permis d’identifier plusieurs partenaires potentiels de BILBO1. Nous avons pu identifier et caractériser de nouvelles protéines du FPC, localisées comme BILBO1 dans une structure en anneau. Nous avons étudié leur fonction chez le parasite, en caractérisant les effets de la surexpression de ces protéines ou de leur ARN interférence sur la croissance et la morphologie cellulaire. / The Human African Trypanosomiasis is a Sub-Saharan Neglected Tropical Disease, caused by Trypanosoma brucei, a mono-flagellate protozoan transmitted by the tsetse fly (Glossina spp.). The T. brucei flagellum originates from a cytoplasmic basal body then grows, to emerge from the cell, by traversing an unusual and essential structure called the Flagellar Pocket (FP). This pocket is an invagination of the pellicular membrane at the base of the flagellum. The FP is essential for the survival of the parasite, because it is the unique site for endo- and exocytosis. The Flagellar Pocket Collar (FPC) is a cytoskeletal component of the FP, and is located at the neck of the FP where it maintains a ring/horseshoe structure at the exit site of the flagellum. The FPC contains numerous uncharacterised proteins, including the first protein identified as FPC component - BILBO1. BILBO1 is essential and required for FPC and FP biogenesis. A proteomic analysis and a private two-hybrid genomic screen experiment on T. brucei have revealed a number of potential BILBO1 partners. We found several proteins localize to the FPC like BILBO1 in a ring-like structure. We characterise these new FPC proteins and their function in the parasite. We have characterised the effects of the GFP fusion protein over-expression and RNAi on cell growth and morphology in T. brucei.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La sonoporation, associant les ultrasons (US) et les microbulles (MB) permet une délivrance localisée des molécules thérapeutiques (e.g., acides nucléiques, molécules chimio-thérapeutiques), avec une efficacité thérapeutique élevée et un faible taux de toxicité. Cependant, les mécanismes impliqués dans le transfert de ces molécules restent jusqu’alors mal connus. Les travaux présentés dans ce manuscrit de thèse ont pour objectif de mettre en évidence l’importance du contact microbulle/cellule et les forces de radiation au cours de la sonoporation et s’intéressent par ailleurs, à l’étude des mécanismes sous-jacents durant le processus de sonoporation ainsi que les conséquences cellulaires (membranaire et intracellulaire) engendrées. Ces études sont réalisées par microscopie électronique, et comparent deux lignées cellulaires U-87 MG et MDA-MB-231. Nous nous intéresserons également aux effets du sérum sur l’efficacité de la sonoporation dans la délivrance de molécules (gènes), mais aussi aux changements du cytosquelette et son implication au cours du processus de sonoporation. / Sonoporation combines ultrasound and microbubbles, and promises a local delivery of therapeutic molecules (i.e., nucleic acids, chemotherapeutic molecules) with a high therapeutic efficacy and a low toxicity level. However, the mechanisms involved in the molecules uptake remain hitherto unclear. The work presented in this thesis manuscript aims to highlighting the processes of action of sonoporation by exploring the importance of microbubble/cell contact and the radiation forces and the study of underlying mechanisms during sonoporation and the generated cellular consequences (membrane and intracellular), by electron microscopy, and by comparing two cell lines U-87 MG and MDA-MB-231. We also explore the serum effects on the efficiency of sonoporation in the delivery of molecules (genes) but also the changes in the cytoskeleton and its involvement during sonoporation.

Les cellules des muscles striés squelettiques sont constituées d'éléments contractiles enveloppés par un réseau membranaire. La formation et l'entretien du muscle strié squelettique impliquent la migration des précurseurs myogéniques, la fusion des myoblastes en myotubes et la mise en place des triades. Ces évènements reposent sur le remodelage des membranes et du cytosquelette d'actine des cellules musculaires. Au cours de ma thèse, j’ai étudié le rôle de la protéine adaptatrice CKIP-1 (casein kinase 2 interacting protein-1) dans certaines étapes du développement du muscle strié squelettique. Après avoir identifié le complexe de nucléation de l’actine Arp (actin-related protein) 2/3 comme un nouvel interacteur de CKIP-1, nous avons montré que l’inhibition de l’expression de ckip-1 chez l’embryon de poisson zèbre altère la morphologie des myoblastes et empêche leur fusion du fait d’une désorganisation du cytosquelette d’actine. J’ai également montré que CKIP-1 n’est présente qu’au cours des étapes précoces de la myogenèse in vitro et in vivo chez la souris, puis elle est progressivement clivée. En outre, la modulation de l’expression de CKIP-1 provoque des défauts membranaires aussi bien in vitro qu’in vivo dans le muscle adulte de souris, suggérant que CKIP-1 est impliquée dans le remodelage des membranes. CKIP-1, par ses capacités à remodeler le cytosquelette d’actine et les membranes, pourrait intervenir dans plusieurs étapes de la vie du muscle : la migration, la fusion des myoblastes et la mise en place ou le maintien du réseau membranaire interne des cellules du muscle strié squelettique. / Skeletal muscle cells are composed of contractile elements wrapped in a membrane network. Formation and maintenance of skeletal muscle involve muscle precursor migration, fusion and triad formation. These events rely on actin cytoskeleton and membrane remodelling in muscle cells. The aim of my thesis work was to study the role of the scaffold protein CKIP-1 (casein kinase 2 interacting protein-1) at different steps of skeletal muscle development. We identified the actin nucleation complex Arp (actin-related protein) 2/3 as a CKIP-1 new interactor and showed that Ckip-1 depletion in zebrafish embryos alters fast twitch myoblast morphology and prevents their fusion due to actin cytoskeleton disorganization. I further showed that CKIP-1 is only present during early myogenesis in vitro and in vivo in mouse, and is then cleaved. Modulation of CKIP-1 expression induces membrane defects in vitro but also in vivo in adult mouse muscle, suggesting that CKIP-1 is involved in membrane remodelling. Through its abilities to remodel actin cytoskeleton and thus membranes, CKIP-1 could be implicated in various steps of muscle life: myoblast migration, fusion, and formation or maintenance of the intracellular membrane compartments of skeletal muscle cells.

Objectifs: La cytokine TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand) suscite un intérêt majeur en thérapie anti-cancéreuse grâce à sa capacité à induire l’apoptose des cellules cancéreuses tout en épargnant les cellules saines. L’association du récepteur Fas et de l’actine via l’ezrine, une protéine de la famille ERM (Ezrin, Moesin, Radixin), régule les premières étapes de l’induction de l’apoptose par FasL. Au cours de mon projet de thèse, nous avons voulu déterminer le rôle que pouvait jouer l’ezrine au cours de l’apoptose induite par TRAIL, dans des lymphomes B ou des cellules cancéreuses adhérentes (HeLa, HCT116 et SW480). Matériel et Méthodes: Des approches biochimiques et moléculaires nous ont permis d’étudier et de déterminer l’implication de l’ezrine et sa phosphorylation dans la régulation de la mort induite par TRAIL. Résultats: Ce travail démontre que l’ezrine peut réguler de manière négative l’apoptose induite par TRAIL et FasL. Cette activité inhibitrice est régulée par la phosphorylation/déphosphorylation sur la serine 66 ainsi que sur la thréonine 353. Néanmoins cette régulation n’affecte ni la formation, ni l’activation du DISC (Death Inducing Signalling Complex). Des mutations de ces résidus par une alanine (S66A) ou un acide aspartique (Y353D) augmente sélectivement la capacité de TRAIL à induire l’apoptose. Au contraire, des mutations ponctuelles de ces résidus permettant de mimer la phosphorylation de l’ezrine sur la serine 66 (S66D) ou l’expression d’un variant non phosphorylable sur la thréonine 353 (Y353F) protègent les cellules cancéreuses de l’apoptose induite par TRAIL. De manière concordante, l’utilisation du H89, un inhibiteur de PKA, kinase responsable de la phosphorylation de la serine 66 augmente la sensibilité des cellules cancéreuses à TRAIL, alors qu’au contraire, un activateur de PKA (8bromocyclic AMP) rend ces mêmes cellules plus résistantes à TRAIL. Enfin, l’association de TRAIL et du cisplatine permet de dépasser l’inhibition de l’apoptose par l’ezrine. / Background and Aim: TRAIL has sparked a growing interest in oncology due to its ability to selectively trigger cancer cell death while sparing normal cells. The Fas/actin association through ezrin, a member of the ERM protein family, has been reported to regulate early steps of Fas-mediated apoptosis. In this project, we addressed the role of ezrin regarding TRAIL-induced cell death in B lymphoma cell lines, or adherent cancer cell lines (HeLa WT, HCT116, SW480). Methods: Molecular and biochemical approaches were employed to study the relevance of ezrin and its phosphorylation status in TRAIL signaling. Results: We found that ezrin displays a negative function towards TRAIL- and Fas-mediated apoptosis and that the ezrin-mediated TRAIL-induced cell death inhibition led to ezrin activation through phosphorylation/dephosphorylation events at serine 66 and tyrosine 353, but is mainly independent of TRAIL DISC (Death Inducing Signalling Complex) formation or activation. Mutations of these residues to alanine (S66A) or aspartic acid (Y353D) selectively enhanced TRAIL-induced cell death, whereas point mutations mimicking ezrin phosphorylation on S66 (S66D) or a nonphosphorylable variant on Y353 (Y353F) strongly protected cancer cells from apoptosis induced by TRAIL. Moreover, inhibition of the ezrin serine 66 PKA target site, using H89, increased cancer cell sensitivity to TRAIL, while treatment with 8bromocyclic AMP, a PKA activator, decreased TRAIL-induced cell death. In addition, combined TRAIL/cisplatin treatments abrogated ezrin-mediated inhibition of TRAIL-induced apoptosis.

L’interaction d’assemblées de moteurs et de filaments du cytosquelette donne naissance à des comportements actifs qui demeurent peu compris, malgré la large caractérisation de leurs molécules individuellement. En contrôlant la géométrie de polymérisation de l’actine via des micropatrons surfaciques de nucléation, nous avons observé in vitro l’émergence de battements de faisceaux de filaments parallèles d’actine en présence de myosines en solution (myosine V ou HMM II (Heavy MeroMyosine II)). La forme du battement est similaire pour les deux types de moteurs, mais avec des oscillations un ordre de grandeur plus rapides avec la myosine II qu’avec la myosine V. Dans les deux cas, une onde de déformation transverse se propage à vitesse uniforme de la base à la pointe du faisceau d’actine. Avec la polymérisation, les faisceaux d’actine s’allongent à vitesse constante : la période croît, mais la vitesse de l’onde mécanique reste inchangée. L’utilisation de myosines-GFP a révélé un pic de concentration et un recrutement localisé des myosines au sein du faisceau d’actine, avant qu’une onde de concentration ne se propage vers la pointe de concert avec l’onde mécanique de l’actine. Ces résultats présentent une nouvelle forme de couplage entre l’affinité des myosines à l’actine et la forme du faisceau d’actine. Ce travail de thèse décrit l’émergence de battements actifs imitant ceux des flagelles comme une propriété intrinsèque de l’interaction de filaments polaires et de moteurs moléculaires. Le contrôle de la structure lors du processus d’auto-organisation fournit des informations clés pour étudier les principes physiques génériques du battement flagellaire. / The emergent active behaviors of molecular motors assemblies and cytoskeletal filaments systems remain poorly understood, though individual molecules have been extensively characterized. By controlling the geometry of actin polymerization with surface micropatterns of a nucleation promoting factor, we were able to demonstrate in vitro the emergence of flagellar-like beating of bundles of parallel actin filaments in the presence of myosin motors. We worked with both myosin V and heavy-meromyosin II. The waveform of oscillation was similar for the two types of motors, but oscillations with myosin II were one order of magnitude faster than with myosin Va. In both cases, a bending wave traveled at a uniform speed from the anchored base of the actin bundle towards the tip. As polymerization occurred, the actin bundle elongated at a constant speed, resulting in an increase of the oscillation period, but the speed of the traveling bending wave remains constant. GFP-tagged myosin V revealed the presence of a myosin concentration peak within the actin bundle. Strikingly, myosin V motors were locally recruited within the actin bundle, before a concentration wave propagated towards the bundle’s tip in concert with the actin bending wave. These results revealed a novel form of coupling between the myosin affinity for actin and the actin bundle shape. Our work demonstrates that active flagellar-like beating emerges as an intrinsic property of polar bundles of filaments in interaction with molecular motors. Structural control over the self-assembly process provides key information to clarify the underlying physical principles of flagellar-like beating.

Dans les tissus, les cellules génèrent et sont soumises en permanence à des forces mécaniques. Les perturbations biochimiques à l'intérieur des cellules, ainsi que les altérations de leur environnement mécanique peuvent modifier l'équilibre physiologique et mener à des pathologies, comme le cancer. Bien que les propriétés mécaniques puissent être modifiées à l'échelle du tissus, la compréhension de la mécanique au niveau de la cellule unique demeure importante. En particulier, la différenciation, la migration des cellules immunitaires et le caractère invasif d'un cancer dépendent fortement des propriétés mécaniques des cellules uniques. Les déformations mécaniques peuvent induire un changement de la surface et du volume cellulaires. Nous nous intéressons particulièrement à la régulation du volume cellulaire chez les cellules mammifères dans le contexte de déformations à différentes échelles de temps. Jusqu'à présent, la régulation du volume dans ce contexte n'a été que très peu étudiée, en raison de la difficulté d'obtention de mesures précises, et du fait que le volume de la cellule est généralement considéré comme constant. Nous avons développé une méthode de mesure du volume cellulaire reposant sur l'exclusion de fluorescence, qui nous permet d'effectuer des mesures de volume précise au niveau de la cellule unique. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur la régulation du volume cellulaire au cours de l'étalement dynamique sur un substrat (échelle de temps : minutes). Nous avons démontré qu'il existe différents régimes de régulation du volume lors de l'étalement : les cellules réduisent, augmentent ou ne modifient pas leur volume, en fonction de l'état du cortex d'actomyosine et de la vitesse d'étalement. Nous avons constaté que les cellules s'étalant plus vite ont tendance à perdre davantage de volume. Notre hypothèse est que lors d'une extension rapide de lamellipode dépendante d'Arp2/3, l'actine tire sur la membrane et génère une tension et l'activation de transport ionique, s'accompagnant d'une perte de volume compensatoire. L'inhibition de la polymérisation de l'actine ou de sa ramification dépendante d'Arp2/3 réduit la vitesse d'étalement et ainsi la perte de volume. Nous avons ensuite montré que l'inhibition de la contractilité augmente la vitesse d'étalement et la perte de volume. Cependant, l'inhibition d'Arp2/3 dans des cellules à faible contractilité conduit à un étalement rapide sans perte de volume. En effet, l'inhibition d'Arp2/3 induit des bulles de membranes, une déformation rapide n'induirait donc pas de perte de volume car la cellule peut relâcher la tension en dépliant la membrane. Nous avons également montré que la régulation du volume en réponse à une compression mécanique rapide (échelle de temps : millisecondes) indépendante de l'adhérence dépend également de l'état du cortex d'actomyosine. Les cellules perdent jusqu'à 30% de leur volume lorsqu'elles sont confinées, car la membrane plasmique est attachée au cortex et ne peux pas être dépliée en réponse à l'augmentation de la tension. La perturbation du cortex d'actine induit le détachement de la membrane et limite la perte de volume. Enfin, nous avons montré que la réponse du volume à un choc osmotique (échelle de temps : secondes) est plus que complexe que décrite dans la littérature. Nos données indiquent qu'au niveau de la cellule unique, la réponse initiale du volume au changement de l'osmolarité extérieure n'est pas un processus passif uniforme. En utilisant la technique du choc osmotique, nous avons également confirmé que les cellules ont un large excès de membrane repliée dans des réservoirs. Nos résultats montrent que le volume et l'aire cellulaires sont couplés par l'homéostasie de la tension de surface, et, étant donné que les déformations induisent une augmentation de la tension de surface, elles conduisent à des modifications du volume et de l'aire de la cellule. / The field of biomechanics significantly progressed in the last two decades. The importance of the feedback between biochemical signaling and physical properties was revealed in many studies. Cells within tissues constantly generate and experience mechanical forces. Biochemical perturbations inside the cells as well as alterations in the mechanical environment can shift the tiny balance of normal physiological state and lead to pathologies, e.g. cancer. Although the mechanical properties of individual cells can alter when they are within the tissues, the understanding of single cell mechanics is still important. Differentiation, immune cell migration, and cancer invasion strongly depend on the mechanical properties of individual cells. Mechanical deformations can lead to a change in cell surface area and volume. We are particularly interested in single mammalian cell volume regulation in the context of deformations of different timescales. For the moment, volume regulation in this context was out from the research interest, probably due to the difficulties of accurate measurements, and cell volume often considered as a constant parameter. We developed a method for cell volume measurements based on a fluorescent exclusion that allowed us to perform precise volume measurements of individual live cells. In the present study, we mainly focused on cell volume regulation while dynamic spreading on a substrate (timescale – minutes). We demonstrated that there are different regimes for volume regulation while spreading: cells decrease, increase or do not change volume, and a type of the regime depends on the state of the actomyosin cortex and spreading speed. We obtained that faster-spreading cells tend to lose more volume. Our hypothesis is that during fast Arp2/3-driven lamellipodia extension actin pull on the membrane that generates tension and activation of ion transport and regulatory volume loss. Inhibition of actin polymerization or Arp2/3-dependent actin branching decreases spreading speed and volume loss. Next, we showed that inhibition of contractility increases spreading speed and volume loss. However, inhibition of Arp2/3 complex in cells with low contractility leads to fast spreading without volume loss. Our explanation is that inhibition of Arp2/3 induces cell blebbing and even fast deformation does not lead to volume loss as a cell can relax tension by membrane unfolding. We also showed that volume regulation in response to fast mechanical compression (timescale – milliseconds) independent of adhesion also depends on the actomyosin cortex state. Control cells lose up to 30% of volume under confinement, as the cell membrane is attached to the cortex and cannot be unfolded in response to the tension increase. Disruption of actin cortex leads to membrane detachment and prevents volume loss under confinement. Additionally, we showed that cell volume response to the osmotic shock (timescale – seconds) is more complex than it used to be known in the literature. For instance, our data indicate that at the level of individual cells initial volume response to the change of external osmolarity is not a uniform passive process. Using osmotic shock technique, we also confirmed that cells have a large excess of membrane folded in reservoirs. Taken together, our data show that cell volume and surface area are coupled through surface tension homeostasis and as deformations induce surface tension increase, they lead to change volume and surface area.

Le cytosquelette se compose de microfilaments (polymères d'actine), de microtubules (polymères de tubuline) et de filaments intermédiaires (polymères de desmine, de lamines ...). Le sepsis défini par une infection associée à une réaction inflammatoire systémique est responsable de dysfonctions myocardiques de mauvais pronostique. Cette cardiomyopathie apparait dans les premières heures du sepsis et guérit en moins de deux semaines chez les survivants. Même si certaines études démontrent l'implication d'éléments du cytosquelette dans la cardiomyopathie septique, les rôles des microfilaments et des microtubules ne sont pas clairement établis.Macrophage migration inhibitory factor (MIF) est une cytokine pro-inflammatoire sécrétée en excès dans le sepsis qui serait responsable d'un ralentissement de la récupération myocardique. Dans un premier temps, notre travail a consisté à caractériser l'implication des microtubules dans la dysfonction musculaire cardiaque induite par MIF. Dans un modèle de trabécules auriculaires droites humaines nous avons démontré que MIF induit une hyperpolymérisation des microtubules responsable d'une hyperviscosité intracellulaire, d'une dysfonction mitochondriale et d'une dysfonction contractile. Nos résultats suggèrent qu'une hyperpolymérisation des microtubules induite par MIF pourrait être responsable d'un ralentissement de la récupération myocardique à la phase tardive de la myocardiopathie septique. Dans un second temps, nous avons évalué l'implication des microfilaments dans un modèle murin de dysfonction myocardique inflammatoire induite par l'injection d'une endotoxine bactérienne, le lipopolysaccharide. Nos résultats suggèrent qu'à la phase précoce de la cardiomyopathie inflammatoire il existe une hyperpolymérisation des microfilaments responsable de dysfonctions contractile et mitochondriale.Les connaissances fondamentales acquises au cours de ce travail de thèse suggèrent une implication directe des microtubules et des microfilaments dans la physiopathologie des cardiomyopathies inflammatoires.

Les fonctions vasculaires sont régulées par diverses stimulations biochimiques ou mécaniques qui activent les différentes cellules composant les vaisseaux sanguins.Les réponses cellulaires qui en résultent peuvent impliquer une réorganisation du cytosquelette, des changements morphologiques, l'expression de protéines membranaires ou la libération de nombreux médiateurs. Tous ces événements sont susceptibles d'influencer les propriétés mécaniques des cellules. Ainsi, le but de la présente étude est de déterminer l'impact de l'activation de certains récepteurs au niveau des propriétés mécaniques des cellules, des modifications qui pourraient avoir de fortes implications au niveau vasculaire. Pour ce faire, nous avons utilisé deux approches expérimentales permettant d'évaluer des changements morphologiques et mécaniques de très faible amplitude : la microscopie à force atomique (AFM) et la résonance des plasmons de surface (SPR). Nous avons ainsi étudié les effets de l'activation des récepteurs de l'angiotensine II, la thrombine et la bradykinine sur la morphologie et les propriétés mécaniques de modèles cellulaires importants dans l'étude des fonctions vasculaires. Nous avons observé que l'activation du récepteur AT[indice inférieur 1] pour l'angiotensine II induit une réponse mécanique transitoire qui se traduit par une contraction du corps cellulaire, une augmentation du module d'élasticité de la cellule et une diminution de l'intégrité de l'épithélium. Quant à l'activation du récepteur PAR-1 pour la thrombine et du récepteur B[indice inférieur 2] pour la bradykinine, celle-ci provoque aussi une modification de la rigidité des cellules, mais de façon soutenue dans le temps. Ces deux agonistes augmentent aussi l'interaction entre la membrane et le cytosquelette, un phénomène observé par l'augmentation des forces requises pour l'étirement de la membrane cellulaire. Ainsi, la présente étude montre qu'une cellule peut subir des modifications importantes au niveau de ses propriétés mécaniques suivant son activation par différents agonistes, ce qui peut avoir des conséquences directes sur certaines fonctions physiologiques dépendantes des propriétés mécaniques des vaisseaux. En effet, ces changements observés au niveau de la cellule pourraient, entre autres, contribuer au contrôle du diamètre et de la compliance des capillaires, à l'adhésion des cellules inflammatoires ainsi que modifier la perception de stimuli mécaniques par les cellules endothéliales.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.