Les microtubules sont des filaments protéiques dynamiques, essentiels au bon fonctionnement de la plupart des cellules eucaryotes. L’organisation de ce réseau de fibres constitue un enjeu majeur pour la cellule, puisque c’est de cette organisation que découle une grande partie de ses fonctions. Dans les cellules animales, la protéine EB1 (End Binding-1) est impliquée dans la polarisation du réseau de microtubules. Arabidopsis thaliana possède trois gènes orthologues bien conservés, mais dont les fonctions sont encore mal connues, alors même que l’orientation et l’organisation du réseau de microtubule sont critiques pour le développement des plantes. En particulier, dans les cellules en élongation, le réseau cortical de microtubules est perpendiculaire à l’axe de croissance et permet, en participant à la synthèse de la paroi, de restreindre la croissance en épaisseur au profit d’un allongement. Les microtubules corticaux ne sont pas isolés les uns des autres, ils s’associent latéralement pour former des faisceaux, ajoutant ainsi un niveau de complexité, et donc de régulation, à l’architecture du réseau microtubulaire chez Arabidopsis thaliana. La formation et la maintenance du réseau de faisceaux parallèles de microtubules constituent l’objet principal de ce travail de thèse. Chez Arabidopsis thaliana, EB1 est impliquée, à l’échelle macroscopique, dans la croissance directionnelle des racines. Toutefois, les fonctions subcellulaires de la protéine étaient peu connues au début de nos investigations. Tout d’abord, notre étude a permis de montrer que le réseau cortical de microtubules est désorganisé chez des plantes mutantes dépourvues de protéine EB1 cytoplasmique. De plus, la combinaison de la microscopie super-résolue STED et d’une procédure d’analyse d’image que nous avons élaborée au laboratoire, a mis en évidence une diminution significative du nombre de microtubules par faisceau en absence de EB1. Nous avons également observé une hypersensibilité des racines mutantes à la dureté du milieu, confirmant des données publiées précédemment. Pris dans leur ensemble, ces résultats suggèrent : (1) l’importance de l’organisation du réseau cortical de microtubules dans la réponse de la racine au toucher ; (2) une probable interdépendance entre organisation du réseau et formation des faisceaux. Ensuite, afin de confirmer le probable lien fonctionnel entre la formation des faisceaux de microtubules et organisation globale du réseau microtubulaire cortical, nous avons étudié des plantes mutantes pour MAP65-1, une protéine déjà décrite pour sa capacité à former des faisceaux in vitro. Nos premiers résultats, tendent à confirmer cette fonction de MAP65-1 in vivo et révèle, pour la première fois, une implication significative de cette protéine dans l’arrangement parallèle des microtubules corticaux. Si ce résultat ne met pas en évidence la relation de cause à effet qui relie ces deux phénomènes, il confirme toutefois l’existence d’un lien entre les deux niveaux de régulation. Enfin, dans le but de mieux comprendre les mécanismes permettant aux protéines EB1 et MAP65-1 de former des faisceaux de microtubules, nous avons entamé une analyse de leurs propriétés intrinsèques in vitro, en système purifié. Les premiers résultats, très préliminaires, indique un effet stimulateur de EB1 sur la capacité de MAP65-1 à former des faisceaux de microtubules. Cette thèse a contribué à la compréhension des mécanismes qui régissent l’organisation du réseau de microtubules corticaux chez Arabidopsis thaliana, incluant la formation des faisceaux de microtubules et le rôle joué par EB1 et MAP65-1 dans ce contexte. Elle confirme également l’implication du réseau de microtubules dans le contrôle de la croissance racinaire et suggère fortement sa participation à la réponse aux contraintes mécaniques. / Microtubules are essential dynamic filaments of most eukaryotic cells. Microtubule network organization is tightly controlled within cells since most of microtubule functions come from their spatial arrangement. In animal cells, EB1 (End Binding-1 protein) is well known as a major regulator of microtubule network polarization. Though well conserved throughout evolution, Arabidopsis thaliana possesses three EB1 orthologous genes with unclear functions, while microtubule network orientation and organization are critical for plant development. During plant cell expansion, cortical microtubules are organized as parallel fibers that are perpendicular to the elongation axis. This particular organization is thought to promote cell elongation rather than thickening by controlling cell wall synthesis. Cortical microtubule are not isolated from each other, they are laterally associated within bundles, bringing an additional level of complexity, and therefore of regulation, to the microtubule network in plants. Microtubule bundles formation and maintenance are the main interest of this PhD-thesis work. In plants, EB1 proteins had already been involved in directional root growth, but their subcellular functions remained unclear. Our study revealed first that the cortical microtubule network is disorganized in plants lacking cytoplasmic-EB1 protein. Moreover, using super-resolution microscopy combined with an original image processing, we showed that the average number of microtubules per bundle is significantly reduced in the absence of EB1. In addition, EB1-defective roots display a hypersensitivity to medium hardness as mentioned elsewhere before. Altogether, our data suggest: (1) an involvement of the microtubule network in root response to touch; (2) a possible relationship between microtubule-network organization and bundle formation. Then, in order to confirm the functional link between bundle formation and network organization, we tackle the study of MAP65-1 mutant plants. MAP65-1 is a protein well described for its ability to make microtubule bundles in vitro. Our investigations confirmed this function for MAP65-1 in vivo and reveal its involvement in cortical microtubule network organization. Although this result does not reveal any causal connection between both phenomena, it highlights the link between the two levels of complexity that are bundle formation and spatial arrangement of microtubules. Finally, to get insight into the molecular mechanisms allowing EB1 and MAP65-1 to make microtubule bundles, we developed in vitro experiments using purified components. Preliminary results indicate that EB1 stimulates MAP65-1 ability to make bundles, but this remains to be further investigated. Hence, this thesis work contributed to decipher the mechanisms governing microtubule network organization in Arabidopsis thaliana. In particular, it revealed the involvement of EB1 proteins and MAP65-1 in this task. This work further confirmed the role of microtubules in root growth and strongly suggested their involvement in the response to mechanical sensing.

Le modèle cellulaire de magnétostimulation (MTS) développé dans l'équipe a permis d'obtenir des résultats préliminaires sur les essais de perméabilité endothéliale ainsi que sur les reconstructions et modélisation des fibres d'actine. Les premiers résultats en Magnétocytométrie (MTC) montrent une augmentation de rigidité cellulaire suite à une stimulation mécanique du tapis cellulaire. Les images confocales ont permis de mettre en évidence une restructuration des filaments d'actine dans les cellules endothéliales microvasculaires pulmonaires (HPMEC) soumises au stress mécanique, ainsi qu'une relocalisation des VE-Cadhérines nécessaires aux jonctions intercellulaires. Ces deux résultats concordent avec l'apparition de 'gaps' ou trous inter cellulaires qui permettent d'expliquer l'augmentation de perméabilité mesurée entre les cellules soumises au stress mécanique et la situation contrôle. Des difficultés techniques retardent le travail et l'obtention de résultats en nombre important. Par exemple l'emploi de certaines techniques de marquages difficilement compatibles avec certains supports de culture. Cela empêche dans certains cas la confirmation visuelle de résultats obtenus par MTC. La viabilité cellulaire lors des expérimentation ne permet pas d’allonger les temps d’étude d’une même population cellulaire, ce qui limite certains résultats. Les premiers résultats sont à compéter par une étude plus approfondie des niveaux d'expression de facteurs pro-inflammatoires ainsi que des voies de signalisation et de régulation des VE-Cadhérines et des intégrines AlphaV-Beta3. L’effet de différentes molécules utilisées en clinique devrait être étudié sur le modèle de stress mécanique. / The cellular model of magnétostimulation ( MTS) developed in the team allowed to obtain preliminary results(profits) on the tries(essays) of endothéliale permeability as well as on the reconstructions and the modelling of the fibers of actine. The first results(profits) in Magnétocytométrie ( MTC) show an increase of cellular rigidity further to a mechanical stimulation of the cellular carpet(mat). The confocal images allowed to highlight a restructuring of the strands of actine in cells(units) microvascular lung endothéliales ( HPMEC) subjected(submitted) to the mechanical stress, as well as a relocation of the VE-Cadhérines necessary for the intercellular junctions. These two results(profits) suit to the appearance of ' gaps ' or holes inter cellular which allow to explain the increase.

Les cellules multiciliées (MCC) possèdent à leur surface apicale des centaines de cils mobiles générant un flux directionnel liquidien nécessaire par exemple pour le nettoyage des voies respiratoires. La fabrication de ces cils (multiciliogénèse) requiert une séquence d’évènements cellulaires dont un arrêt du cycle cellulaire, une réorganisation du réseau apical d’actine, une multiplication massive des centrioles suivie de leur migration au pôle apicale et de leur maturation en corps basal, à partir desquels les cils s’allongent.Mon laboratoire d’accueil a mis en évidence le rôle conservé de la famille de microARN miR-34/449 dans le contrôle de la multiciliogénèse en inhibant la voie de signalisation Notch ainsi qu’en induisant un arrêt du cycle. Au cours de ma thèse, j’ai mis en évidence un nouveau niveau de régulation de ces microARN par lequel ils contrôlent la réorganisation apicale du cytosquelette d’actine, en modulant l’expression et l’activité de certaines petites GTPases. Par ailleurs, j’ai identifié et caractérisé des séquences variantes des miR-34/449 canoniques, appelées isomiR. Tandis que ces isomiR partagent des fonctions semblables à celles de leurs homologues canoniques, ils apportent également une complémentarité d’action en modulant des transcrits cibles spécifiques. Enfin, le dernier axe de mon travail a permis d’identifier le rôle de la voie de signalisation BMP dans la multiciliogénèse ainsi que d’élucider certains des mécanismes moléculaires par lesquels elle contrôle ce phénomène. L’ensemble de nos découvertes offre une opportunité inédite pour développer des stratégies thérapeutiques dans le traitement de maladies associées à des désordres ciliaires / Vertebrate multiciliated cells (MCC) project hundreds of motile cilia at their apical surface which coordinately beat to generate a directional fluid flow necessary for many biological functions including airway cleansing. Biogenesis of multiple cilia (multiciliogenesis) follows different key cellular steps corresponding to a cell cycle arrest, a massive multiplication of centrioles which then migrate to the apical surface to form basal bodies, from which cilia elongate. In 2011, my host laboratory evidenced that the miR-34/449 family of microRNAs control vertebrate multiciliogenesis by inducing the cell cycle arrest and by repressing the Notch pathway. My thesis work has revealed a new role of miR-34/449 by demonstrating that they modulate expression and activity of small GTPases to drive the apical reorganization of the actin network, a prerequisite for basal body anchoring. Besides, I have identified and characterized variant sequences of canonical miR-34/449 family, named isomiRs. Whereas these isomiRs share common biological functions with canonical miR-34/449 miRNAs, they may also contribute to a complementary effect by targeting specific transcripts. Finally, the last part of my work has contributed to the identification of the conserved role of the BMP pathway in the control of multiciliogenesis. I have evidenced some molecular mechanisms by which the BMP signal controls this phenomenon. Importantly, I demonstrated that BMP inhibition promotes regeneration of tracheal MCC in vivo in an asthmatic mouse model. Overall, our findings offer an unprecedented opportunity to develop novel therapeutic strategies to treat diseases associated with ciliary disorders

La forme du noyau peut varier significativement au cours du développement ou lors de processus pathologiques en raison des forces mécaniques émanant du microenvironnement ou générées par le cytosquelette. L’impact de la morphologie nucléaire sur la machinerie transcriptionnelle n’est cependant pas connu. En utilisant plusieurs approches afin de manipuler la morphologie nucléaire, nous avons observé que des changements de forme de l’enveloppe nucléaire régulent l’activité de AP1 et TEAD. Nous avons montré que l’aplatissement du noyau augmente la phosphorylation de c-Jun et la translocation de YAP, conduisant à une augmentation de la transcription des gènes cibles de AP1 et TEAD. Nous avons également observé que l’aplatissement du noyau se produit au cours du cycle cellulaire et favorise la prolifération via l’activation de TEAD et AP1 qui stimulent la progression de la phase G1 à la phase S. / .The shape of the cell nucleus can vary considerably during developmental and pathological processes as a consequence of the mechanical forces emanating from the microenvironment or generated by the cytoskeleton. However the impact of nuclear morphology on the transcriptional machinery is not known. Using a combination of tools to manipulate the nuclear morphology, we observed that changes in nuclear shape regulate the activity of AP1 and TEAD. We showed that nuclear flattening increases c-Jun phosphorylation and YAP nuclear translocation, leading to transcriptional induction of AP1 and TEAD-target genes. Surprisingly, we found that nuclear compression is necessary and sufficient to mediate c-Jun and YAP activation in response to cell- generated contractility or cell spreading. We additionally observed that nuclear flattening occurs during the cell cycle and promotes proliferation via TEAD and AP1- dependent G1 to S progression.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2009-2010 / L'accumulation anormale de neurofilaments est une caractéristique pathologique de nombreuses maladies neurodegeneratives telles que la sclérose latérale amyotrophique (SLA), la neuropathie à axones géants (NAG) et la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT). L'étude des animaux transgéniques surexprimant ou déficients pour les sous-unités des neurofilaments a mis en évidence que les agrégats axonaux de neurofilaments semblaient plus toxiques que les périkariaux pour les neurones moteurs. Des mutations ont récemment été découvertes dans le gène codant pour la gigaxonine et le gène codant pour la sous-unité légère des neurofilaments (NEFL), respectivement associés à la NAG et la CMT, deux maladies caractérisées par la présence d'axones géants. Nous avons tiré profit de ces découvertes pour générer deux nouveaux modèles de souris transgéniques. Nous avons dans un premier temps généré un modèle souris déficiente pour la gigaxonine. Les souris GanAex1:Aex1 montrent des niveaux protéiques élevés de filaments intermédiaires dans le système nerveux central ainsi que l'agrégation d'a-intemexine et de NF-H dans le cortex cérébral, sans toutefois développer de phénotype apparent ou d'axones géants. Néanmoins une faible dénervation ainsi qu'une atrophie des muscles inférieurs a été observée parallèlement à une perte d'axones moteurs. Dans un deuxième temps, nous avons créé un modèle de souris double transgénique dans lequel l'expression du mutant hNF-Lf228 peut être contrôlée par un système tet-off grâce à l'administration de doxycycline. Les souris hNF-L^tTa montrent une posture anormale des membres inférieurs dès l'âge de 6 mois. Ce phénotype est associé à une dénervation périphérique ainsi qu'une morphologie musculaire anormale, et une diminution du transport anterograde des mitochondries. L'abolition de l'expression de hNF-LP22S grâce au traitement à la doxycycline a réussi à améliorer de façon considérable le phénotype CMT des souris double transgéniques. L'étude de ces modèles transgéniques a mis évidence que de faibles changements dans le réseau de neurofilaments provoquent une dénervation périphérique ainsi qu'une perturbation du transport axonal. Le phénotype locomoteur ainsi que la dénervation sont même réversibles dans le cas des souris hNF-L^tTa. Abolir l'expression de mutant NEFL ou le neutraliser pourrait donc s'avérer une thérapie efficace.

Les mécanismes moléculaires d'assemblage et de bourgeonnement des virus tels que le VIH-1 dans les cellules infectées sont encore relativement mal connus. Toutefois, il semble établi que la multimérisation de la protéine Gag s'effectue à la membrane plasmique et que le bourgeonnement des particules virales a lieu au niveau de zones enrichies en tétraspanines. Ces protéines transmembranaires forment un réseau d'interactions protéiques à la surface de la cellule et s'organisent en microdomaines différents des radeaux lipidiques, bien qu'enrichis en cholestérol.En utilisant la technique de suivi de molécules uniques fluorescentes sur des cellules HeLa exprimant la protéine Gag, l'objectif de mon travail de thèse était d'abord de déterminer l'influence de l'assemblage et le bourgeonnement de pseudoparticules virales sur la dynamique et la répartition membranaires des tétraspanines CD9 et CD81. Nos résultats renforcent l'émergence d'un nouveau concept, selon lequel les composants cellulaires et viraux, plutôt que de se regrouper au niveau de plateformes membranaires préexistantes, s'organisent en structures de taille croissante où les tétraspanines sont peu à peu concentrées avec leurs partenaires pour former une architecture propice à l'assemblage et la sortie du VIH-1.Par ailleurs, nous avons montré que CD81 était plus confiné et moins dynamique que CD9 et avons donc étudié les mécanismes moléculaires expliquant cette différence de comportement membranaire. L'utilisation du pistage en molécule unique couplé à des marquages d'ensemble, l'emploi de protéines chimériques et de drogues spécifiques ont permis de révéler que la dynamique membranaire de CD81 est restreinte par le réseau d'actine, via l'ezrine, mais implique aussi EWI-2 et CD9P-1, deux partenaires membranaires de CD9 et de CD81. Enfin, cette étude montre que cette interaction avec le cytosquelette est impliquée dans le recrutement de CD81 et indirectement de CD9, lors de l'assemblage du VIH. / Molecular mechanisms of assembly and budding of HIV-1 particles in infected cells are still a matter of debate. However it is now well established that Gag assembly occurs at the plasma membrane and that budding involves tetraspanin-enriched areas. Tetraspanins are transmembrane proteins that form a network of protein interaction at the cell surface organized into microdomains enriched in cholesterol but distinct from rafts.Using single molecule tracking of fluorescent markers with Gag-expressing HeLa cells, the aim my PhD thesis was first to determine the influence of Gag assembly and budding of pseudo particles on the dynamics and partitioning of the tetraspanins CD9 and CD81 at the plasma membrane. Our results support an emerging concept that cellular and viral components, instead of clustering at preexisting microdomains or platforms, direct the organization of growing structures where tetraspanins are more and more concentrated with their partners, in order to form a membrane scaffold that helps HIV-1 assembly and egress.In a second work, we showed that CD81 is more confined and less dynamic than CD9, and tried to clarify the molecular mechanisms involved in this differential behavior at the plasma membrane. Single molecule tracking, in addition to ensemble labeling experiments, CD9/CD81 chimeric proteins, as well as specific drugs, demonstrated that CD81 membrane dynamics is restricted by the actin network through ezrin proteins, but also implicates EWI-2 and CD9P-1, primary partners of CD9 and CD81. Finally, this study reveals that this interaction with the cytoskeleton is in part responsible of the recruitment of CD81 and indirectly of CD9 during HIV-1 assembly.