Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Chez les cellules eucaryotes, la biosynthèse des protéines est essentielle à la vie. Pour accomplir leurs fonctions biologiques, les protéines doivent être acheminées au bon endroit dans la cellule, notamment par la voie de sécrétion. Cette voie de transport est organisée en diverses structures membranaires distinctes. La porte d'entrée des protéines sécrétées et des protéines membranaires dans la voie de sécrétion est le réticulum endoplasmique. À cet endroit, les protéines sont repliées correctement, glycosylées et forment des ponts disulfures. Par la suite, la plupart d'entre elles sont acheminées à l'appareil de Golgi par des vésicules de transport. Dans ce compartiment intracellulaire, les groupements glycosyls des glycoprotéines sont alors modifiés. Finalement, certaines protéines sont transportées à la vacuole ou à la membrane plasmique par une autre série de vésicules de transport. Chez Saccharomyces cerevisiae, la voie de sécrétion des protéines est très semblable à celle des cellules de mammifères dans sa capacité de replier les protéines, de les glycosyler et de les sécréter. Ces propriétés dépendent du bon fonctionnement de la voie de sécrétion. Nos travaux ont consisté à étudier le transport de l'invertase vers l'espace périplasmique chez Saccharomyces cerevisiae W303-lb. Des études antérieures ont démontré que W303-lb manifeste à 37 °C un ralentissement de la sécrétion de l'invertase dans l'espace périplasmique comparativement à SEY6210. Notre hypothèse de travail vise sur l'identification, par complémentation génétique, d'un gène défectueux responsable du phénotype observé chez W303-1 b. De plus, ce défaut de sécrétion est corrigé par la délétion du gène SLA 1 chez W303-1 b. Sial p est une protéine liant l'actine qui semble importante dans le transport de certaines protéines entre le réticulum endoplasmique et l'appareil de Golgi. Nous avons montré qu'un fragment d'ADN génomique du chromosome IX restaure la sécrétion de l'invertase chez W303-1 b. Ce fragment contient trois gènes (ECM37, YILJ 45C et TID3) où seul le gène YILJ 45C possède un cadre de lecture ouverte (ORF) entier. Finalement, plusieurs hypothèses ont été émises sur les effets possibles de ces gènes sur la sécrétion de l'invertase, ce qui permettra éventuellement d'élaborer de nouvelles hypothèses concernant l'organisation du système de sécrétion chez Saccharomyces cerevisiae et les liens moléculaires qui peuvent exister entre le cytosquelette et la machinerie protéique régulant le transport des protéines.

Chez Saccharomyces cerevisiae, le cytosquelette d'actine est formé de câbles d'actine et de granules corticaux. La surexpression d'ARF3 dans trois souches présentant un défaut soit dans la formation des câbles soit dans l'organisation des granules corticaux a entraîné une correction de leurs phénotypes. Ces résultats suggèrent un rôle pour Arf3p dans la formation et/ou l'organisation de ces deux structures. La mutagenèse dirigée a permis de démontrer que la myristoylation d'Arf3p est nécessaire à son activité. La localisation spécifique d'Arf3p est dépendante des protéines Bni1p, Drs2p, Gea1p et Gea2p qui ont un rôle dans l'organisation du cytosquelette d'actine. De plus, ARF3 démontre une interaction génétique avec GEA2 et la surexpression de GEA2 et de la région fonctionnelle de BNI1 corrigent le bourgeonnement aléatoire d'arf3?. Ces résultats indiquent un rôle important pour Arf3p dans l'organisation du cytosquelette d'actine ainsi qu'un lien entre cette protéine et plusieurs autres impliquées dans cette structure.

Chez la levure S. cerevisiae, plusieurs protéines participent dans l'organisation du cytosquelette d'actine. L'une d'entre elles, la profiline, est impliquée dans la polymérisation des filaments d'actine. Les cellules pfy1? ont un phénotype anormal, dont la dépolarisation des granules corticaux et l'absence de câbles d'actine visibles. L'équipe du Dr Pallotta a identifié plusieurs protéines impliquées dans un sentier de signalisation menant à cette structure. Deux de ces protéines, Gea1/2p, interagissent avec les protéines Arf. Nous avons donc étudié le rôle d'Arf3p et ainsi déterminé son implication dans la polarisation du cytosquelette d'actine. Sa surexpression dans la souche pfy1-111, un mutant thermosensible, corrige son phénotype. Il existe une interaction génétique entre PFY1 et ARF3. La mutagenèse dirigée de la protéine, sa localisation et une comparaison avec Arf6p humaine a complété l'étude. Nous pouvons conclure que Gea1/2p passent par Arf3p, au moins partiellement, afin de rétablir les phénotypes des cellules déficientes en profiline.

Les petites protéines G de la famille Rho sont des régulateurs importants de la fonction cellulaire. Elles lient les signaux extracellulaires à l'activation de diverses voies de signalisation telles que celles menant à la phagocytose, la mitogénèse, l'adhésion cellulaire, l'expression génique,... Toutefois leur fonction principale est l'assemblage et l'organisation du cytosquelette d'actine. Ces GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, actifs lorsque liés au GTP et inactifs sous la forme liée au GDP. Le but de notre thèse est d'investiguer, dans les cellules thyroïdiennes de chien en culture primaire, l'implication des protéines de la famille Rho et de l'organisation du cytosquelette d'actine dans les actions diverses que la TSH exerce, via l'AMPc, sur la morphologie, la prolifération, la différenciation et la fonction des thyrocytes de chien en culture primaire. Trois cascades conduisant à la mitogénèse coexistent dans la cellule thyroïdienne de chien: la voie de l'AMPc stimulée par la TSH ou la forskoline (activateur direct de l'adénylate cyclase), la voie des facteurs de croissance (tels que l'EGF, l'HGF) activant leur récepteur à activité tyrosine kinase et la cascade dépendante de la protéine kinase C activée par les esters de phorbol (TPA). Contrairement aux voies indépendantes de l'AMPc qui répriment l'expression des caractéristiques de différenciation, la cascade de l'AMPc stimule à la fois la prolifération, l'expression des gènes de l'état différencié et la fonction (iodation, formation d'H2O2, sécrétion hormonale). Dans la cellule thyroïdienne de chien, les agents activant les cascades dépendantes et indépendantes de l'AMPc ont des effets différents sur l'organisation du cytosquelette d'actine. La TSH/AMPc et le TPA induisent une destruction des microfilaments d'actine et un "ruffling" membranaire, tandis que les autres agents (insuline, EGF, HGF, sérum) ne modifient pas le réseau de fibres d'actine (fibres de stress) présent dans les cellules quiescentes. Parmi les protéines de la famille Rho, RhoA, Rac1 et Cdc42 sont les premières à avoir été identifiées et sont actuellement les mieux caractérisées. Nous montrons que la TSH, via l'AMPc, induit une diminution de la concentration de la forme active des protéines Rac1, Cdc42 et RhoA. En revanche, les autres agents mitogènes, tels que l'EGF et le TPA, qui activent des voies indépendantes de l'AMPc, n'affectent pas les taux de Rac1 et Cdc42 activés, mais augmentent le taux de RhoA-GTP. L'activation ou l'inactivation des protéines RhoA, Rac1 et Cdc42 est donc un nouvel élément distinguant les voies dépendantes et indépendantes de l'AMPc. Grâce à deux toxines bactériennes, la toxine B qui inactive les protéines Rho et la toxine CNF1 qui au contraire les active, nous montrons que, dans les thyrocytes, celles-ci jouent un rôle critique dans l'organisation du cytosquelette, dans la transition G1-S, dans l'expression des gènes de différenciation Tg, ThOXs, NIS et TPO, mais pas dans la génération d'H2O2. En effet, l'activité d'un ou plusieurs membres de cette famille est nécessaire à l'entrée des thyrocytes en phase S et à la phosphorylation de la protéine pRb, étape pré-requise à la transition G1-S. L'activation de ces protéines n'induit cependant pas, à elle seule, la prolifération. Nous mettons également en évidence l'existence d'un nouveau mécanisme par lequel ces protéines contrôleraient l'activité des complexes cycline D3-CDK4 indépendamment de leur assemblage. Par l'utilisation de la dihydrocytochalasine B, qui comme la toxine B via l'inactivation des Rhos, désorganise le cytosquelette, nous démontrons que l'intégrité de celui-ci n'est pas requise pour la progression des thyrocytes en phases G1 et S. L'inactivation des protéines Rho est par contre nécessaire à l'induction, par l'AMPc, de l'expression des gènes de différenciation incluant Tg, ThOXs, NIS et TPO, puisque ce processus est inhibé par la toxine CNF1. De plus, l'inactivation des Rhos par la toxine B, ainsi que le désassemblage des fibres de stress et du cytosquelette induit par la dihydrocytochalasine B, suffisent à imiter l'induction dépendante de l'AMPc de Tg et ThOXs, mais pas de NIS et TPO. La toxine B et la dihydrocytochalasine B imitent aussi l’effet de la voie TSH/AMPc sur l’accumulation de p27kip1. Enfin, nous montrons que l'augmentation de la production d'H2O2, nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes, ne requiert pas l'activité de la protéine Rac (ni des autres protéines de la famille Rho) alors que celle-ci joue un rôle déterminant dans la génération d'H2O2 dans le leucocyte.

Le cortex de la plupart des protistes ciliés contient un squelette membranaire dont le principal élément est l'épiplasme, une structure apposée à la membrane alvéolaire interne. Chez la paramécie, l'épiplasme se présente sous forme d'écailles indépendantes disposées autour de chaque appareil ciliaire ; il est composé d'une famille multigénique de protéines appelées épiplasmines. Nous avons réalisé une étude structurale de cette famille multigénique. L'analyse phylogénétique a permis de confirmer l'existence de 5 groupes d'épiplasmines divisé chacun en deux sous-groupes a et b. L'utilisation de la méthodologie HCA nous a permis de montrer que ces protéines sont modulaires et présentent un arrangement de leurs domaines structuraux. Elles peuvent ainsi être regroupées en trois classes symétriques, asymétriques et atypiques. L'analyse des régions 5'UTR des membres de cette famille multigénique montre la présence d'éléments putatifs de régulation d'expression. La comparaison des épiplasmines de la paramécie avec leurs orthologues de Tetrahymena montre une relation structurale entre les groupes 1,2,3 et 5 et les EpiT 1,2,3, et 5 respectivement suggérant l'existence d'un ancêtre commun pour l'épiplasme de Paramecium et Tetrahymena. Nous avons réalisé l'analyse fonctionnelle des épiplasmines à partir d'approche par ARN interférence et par localisation couplée à la GFP. La perturbation de l'expression des épiplasmines symétriques et asymétriques, aboutit à une réponse cellulaire commune qui se traduit par un changement de la forme cellulaire, un blocage de la cytocinèse et enfin l'apparition de formes plasmodiales. L'analyse du cortex par microscopie à fluorescence montre une altération des unités corticales qui est fonction des types structuraux des épiplasmines. Les épiplasmines se localisent de manière différentielle autour du corps basal définissant un territoire dont le modèle d'organisation est centrifuge. On définit alors des épiplasmines cinétomosales, péricinétomosales, core et enfin périphériques. Ce modèle est discuté en relation avec les phénotypes obtenus par l'analyse fonctionnelle. Il permet d'intégrer les différents niveaux de relation entre le corps basal, son territoire et l'ensemble de l'épiplasme.

Le mauvais pronostic du cancer pancréatique est en partie dû à l’acquisition extrêmement rapide de propriétés invasives et métastatiques par les cellules tumorales pancréatiques et à la faible efficacité des thérapies actuelles. Il est donc essentiel d’identifier de nouvelles cibles utiles au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos travaux impliquent directement la diminution de l'expression d'ArgBP2 dans le processus de dérivation ma ligne du pancréas. ArgBP2 est une protéine adaptatrice régulant la dynamique du cytosquelette d’actine et la transduction des signaux. Nous avons montré que l’activité anti-tumoraled’ArgBP2 in vivo est corrélée à une diminution de l’adhésion, de l’étalement et de la migration des cellules cancéreuses pancréatiques in vitro. Dans le but d’identifier les fonctions associées à son rôle anti-tumoral, nous avons recherché de nouveaux partenaires moléculaires d’ArgBP2 et mis en évidence son interaction avec les protéines WAVE (facteurfavorisant la polymérisation de l’actine), la phosphatase PTP-PEST et la protéine adaptatriceCIP4 qui elles-mêmes sont connues pour réguler le cytosquelette d’actine et la motilité cellulaire. De manière intéressante, nous avons montré que PTP-PEST est indispensable à l’inhibition de la migration cellulaire par ArgBP2. Par ailleurs, nos résultats montrentqu’ArgBP2 régule la fonction de WAVE1 en contrôlant sa phosphorylation par la kinase c-Abl et sa déphosphorylation par PTP-PEST. Nous avons en outre montré que CIP4 est aussi un partenaire de WAVE1, phosphorylé par c-Abl, et qu’elle participe à cette régulation. Enfin,nos résultats mettent en évidence un rôle essentiel de la phosphorylation et de la dimérisationd’ArgBP2 dans la régulation de ses interactions avec ses partenaires et de ses fonctions. / The poor prognosis of pancreatic cancer is partly due to the early acquisition of invasive andmetastatic properties by pancreatic tumoral cells and to the limited efficacy of actualtherapies. Thus, the identification of new targets for novel therapeutic strategies is animportant challenge. Our works directly implicate the decrease of ArgBP2 expression in thetumorigenic process of pancreatic cancer. ArgBP2 is an adaptor protein regulating actincytoskeleton dynamics and cell signaling. We found that the anti-tumoral activity of ArgBP2is correlated with the inhibition of the adhesion, spreading and migration of pancreaticcancerous cells. In order to better understand its anti-tumoral function, we searched newpartners for ArgBP2 and identified, among them, WAVE1 (a nucleation promoting factor),the phosphatase PTP-PEST and the adaptor protein CIP4, which are known to regulate actincytoskeleton and cellular motility. Interestingly, we found that PTP-PEST is necessary toArgBP2 mediated inhibition of cell migration. Additionally, we showed that ArgBP2regulates WAVE1 function by controlling its phosphorylation by c-Abl kinase and itsdephosphorylation by PTP-PEST. Moreover we found that CIP4 is also a WAVE1 interactingprotein, phosphorylated by c-Abl, and that CIP4 participates to the ArgBP2 dependent controlof WAVE1. Finally, our results highlight a primordial role of ArgBP2 phosphorylation anddimerization in the control of its interactions with its partners and in the regulation of itsfunctions

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L’hypertension artérielle (HTA) constitue l’une des maladies les plus répandues dans notre société. L’une de ses causes consiste en une rigidité de la paroi artérielle. Cette dernière est régulée par une balance entre agents vasoconstricteurs et vasodilatateurs. L’oxyde nitrique (NO) est un vasodilatateur produit par les cellules endothéliales (CE) en réponse aux stimulations biochimiques (acétylcholine, insuline,…) ou mécanique (cisaillement). Son rôle principal consiste en la relaxation des cellules musculaires lisses (CML) afin d’adapter le vaisseau sanguin aux contraintes qui lui sont imposées. Il s’avère, selon la littérature, que NO est impliqué dans le mode d’action de certains médicaments dirigés contre l’HTA. Celui qui nous intéresse dans cette étude est le Nébivolol. Dans la littérature, il a été rapporté que la production de NO et la structure du cytosquelette d’actine sont intimement liées et que le Nébivolol entraîne la production de NO par les CE. Le but de ce travail a été d’étudier l’implication des filaments d’actine du cytosquelette dans le mode d’action du Nébivolol sur les CE, puis d’évaluer son impact sur l’activité de la eNOS. Nous avons trouvé que le Nébivolol entraîne une augmentation de la production de NO via la dépolymérisation des filaments d’actine pendant la première heure de culture. Cette dépolymérisation résulte en la libération, la translocation péri-nucléaire et la phosphorylation de la eNOS par les Akt. Au-delà d’une heure d’incubation avec le Nébivolol, les monomères d’actine se repolymérisent, entraînant la déphosphorylation de la eNOS et la diminution de la production de NO. Toutefois, il semblerait que la formation des fibres de stress ne soit pas le seul mécanisme d’inhibition de la eNOS. En effet, nous avons montré que la translocation de l’enzyme dans la région péri-membranaire contribue à son inhibition à la suite de la perturbation de l’organisation des filaments d’actine. / Hypertension is one of the most widespread diseases which is caused by a rigidity of the vascular wall. The arteries rigidity is controlled by several vasoconstrictor and vasodilator agents. Nitric oxide (NO) is a vasodilator agent, produced by the endothelial cell (EC) in response to biochemical (acetylcholine, insulin,…) or mechanical (shearing) stimulations. Its main function is to induce smouth muscle cells (SMC) relaxation to adapt the blood vessel to the imposed forces. It has been shown in the literature, that NO is implicated in the target action of some drugs, as Nébivolol, which is directed against hypertension. We know according to the literature that NO production and the structure of the actin cytoskleton are linked and that Nébivolol induces NO production. The aim of this work was to study the implication of cytoskeleton actin filaments in the Nébivolol action in EC and to evaluate the eNOS involvement in the mechanism. We found that Nébivolol increased NO production via a depolymerization of actin filaments during the first hour of incubation. This depolymerization resulted in the peri-nuclear translocation and the phosphorylation of the eNOS by Akt. After the first hour of incubation with Nébivolol, actin monomers were repolymerized leading to the dephosphorylation of the eNOS and the reduction in the NO production. However, it seems that the stress fibers formation is not the only mechanism required for eNOS inhibition. In fact, we have shown that eNOS translocation in the peri-membranar area, inhibited the enzyme activity after actin filaments disruption.

Le cycle réplicatif du HIV-1 aboutit à la formation de virions qui s’assemblent dans des microdomaines spécifiques localisés à la membrane plasmique ou sur des compartiments intracellulaires particuliers, nommés VCC pour « Virus-Containing Compartments ». Selon les cas, ces virions sont ensuite relâchés par bourgeonnement ou exocytose. Ces étapes nécessitent un remodelage membranaire via le cytosquelette d’actine, ce qui est régulé par des voies de signalisation contrôlées par les RhoGTPases. Certains résultats suggèrent l’implication de ces protéines dans la biogénèse du HIV-1. Cependant, il reste à caractériser les mécanismes moléculaires spécifiquement impliqués dans la régulation cellulaire de l’assemblage viral.L’objectif de cette thèse consistait donc à identifier les RhoGTPases et les effecteurs des voies de signalisation spécifiquement requis durant la biogénèse virale. Cette étude a porté sur les GTPases Rac1, Cdc42 et RhoA car elles ont un rôle majeur dans la régulation du cytosquelette d’actine et de la dynamique membranaire. Elle a été réalisée sur les lymphocytes T (LT) Jurkat, cellules modèles pour l’infection HIV-1 où les virions s’assemblent à la membrane plasmique ; et les cellules adhérentes HeLa où les virions peuvent aussi s’assembler au niveau des VCC. Nos résultats ont révélé le rôle de la voie de signalisation Rac1-IRSp53-Wave2 dans l’assemblage de Gag à la membrane plasmique des LT Jurkat, et un rôle pour RhoA dans la régulation de l’assemblage viral suggéré au niveau des VCC. Ce travail améliore la compréhension des voies de signalisation cellulaires sollicitées lors de l’assemblage du HIV-1, en particulier dans les lymphocytes T, cibles du virus. / During the last steps of HIV-1 replication cycle, the Gag proteins come together in particular microdomains located at the plasma membrane or in some intracellular compartments, named “Virus-containing compartments”. Then, the viral particles are released by budding or exocytosis. All these steps involve membrane and actin cytoskeleton remodeling which is regulated by the RhoGTPases. In fact, some data suggest the implication of such proteins in HIV-1 biogenesis, but molecular mechanisms underlying this effect is not yet understood. During this thesis, our aim was to characterize the RhoGTPases and the effectors of cell signaling pathways which are specifically required during HIV-1 particle biogenesis. We focused our study on the GTPases Rac1, Cdc42 and RhoA because their influence on membrane and actin cytoskeleton was essential. Moreover, this work was accomplished on Jurkat T lymphocytes which are model cells to HIV-1 infection where the Gag proteins assemble at the plasma membrane, and on HeLa cells where the Gag proteins can also assemble on virus-containing compartments. Our results showed the requirement of the Rac1-IRSp53-Wave2 signaling pathway for HIV-1 Gag assembly at the plasma membrane of Jurkat T cells, and a role for RhoA GTPase in the regulation of viral particle assembly on virus-containing compartments in HeLa cells. This study improved understanding of cell signaling pathways required during the HIV-1 particle biogenesis and release, particularly in T cells which are the main host cell for HIV-1.