Ce manuscrit de thèse est composé de trois parties dédiées aux développements technologiques nécessaires à l'étude de la polarité et des contraintes mécaniques dans les cellules épithéliales. La première partie décrit les développements technologiques et méthodologiques qui ont été réalisés en micro-fabrication et traitement de surface, acquisition et analyse d'image, et mesure des forces de traction. La deuxième partie décrit l'étude de l'organisation spatiale du système d'adhérence des cellules épithéliales. De la régulation de leur polarité à celle de leur fonction, l'architecture des cellules épithéliales est profondément liée à leur système d'adhérence. Nous avons utilisé les micropatrons adhésifs pour contrôler la géométrie de la matrice extra-cellulaire pour examiner l'effet de l'adhérence des cellules avec la matrice sur la position des zones d'adhérence intercellulaire. Nos résultats montrent que l'organisation spatiale de l'adhérence cellule-matrice joue un rôle déterminant sur celle de l'adhérence intercellulaire. Ils montrent également que cette organisation dirige ensuite la position du centrosome et l'orientation de l'ensemble de la polarité interne. Lors d'une réorganisation spatiale de l'épithélium, comme c'est le cas au cours de la transition épithélium-mésenchyme, les systèmes d'adhérence et la polarité interne subissent tous les deux de profondes modifications. Néanmoins, les cellules semblent capables de les réguler de façon indépendante selon le type de stimulus qui induit la réorganisation. La dernière partie est une analyse des paramètres physiques impliqués dans l'architecture épithéliale. En parallèle des régulations biochimiques, les contraintes mécaniques jouent également un rôle fondamental dans la régulation des processus morphogenétiques. L'association de l'ensemble de nos développements technologiques (patterning de substrat déformable, logiciel de détection et de mesure de force, contrôle du positionnement des cellules) nous a permis d'analyser précisément les propriétés mécaniques des architectures multicellulaires. Nous avons découvert que l'organisation spatiale du système adhérence était un régulateur majeur de l'intensité et de la répartition des forces intra-cellulaires. Cette observation nous a permis de proposer une modification du modèle actuel de distribution des contraintes dans un épithélium qui prend en compte l'anisotropie des forces inter-cellulaires en réponse à l'hétérogénéité de la matrice extra-cellulaire. Ce nouveau modèle physique permet de rendre compte des positions adoptées par les cellules en réponse aux différentes géométries de la matrice extra-cellulaire.

Nous étudions dans cette thèse l'influence de la protéine VASP sur la dynamique et les propriétés mécaniques des réseaux d'actine à l'origine de la motilité cellulaire. Dans une première partie, nous utilisons un système biomimétique du mouvement constitué de billes. Incubées dans un mélange minimal de protéines soutenant la polymérisation, ces billes forment un réseau d'actine appelé " comète " les propulsant vers l'avant, semblable à celui qui sous-tend la membrane du front de migration des cellules en mouvement. Grace à des formes mutantes de VASP, nous explorons la contribution à son activité des domaines qui la composent. Dans nos conditions, nous montrons également que VASP agit au travers d'un mécanisme de coopération avec le complexe Arp2/3 qui est à l'origine de la formation des réseaux d'actine. Enfin, nous étudions les modalités de recrutement de VASP par les activateurs de la famille WASP/WAVE en mutant les sites potentiels de recrutement de VASP. Dans une seconde partie, nous nous intéressons, en collaboration avec deux équipes de recherche, au rôle de VASP dans la mécanique des réseaux d'actine. Nous caractérisons en rhéologie couplée à des observations en microcopie confocale les mécanismes moléculaires de VASP dans la réorganisation de l'architecture des réseaux d'actine, en lien avec leurs propriétés mécaniques, puis, nous étudions en AFM par nano indentation l'augmentation de rigidité des réseaux d'actine formés en présence de VASP.

Les travaux du laboratoire ont montré que les filaments intermédiaires, qui forment un des trois éléments essentiels du cytosquelette, peuvent lier la tubuline sur des sites spécifiques appelés TBS (Tubulin-Binding Site). Certains peptides correspondant à ces séquences sont capables d'inhiber in vitro la polymérisation des microtubules (MT). Les travaux présentés dans cette thèse consistent à poursuivre la caractérisation structurale et fonctionnelle de ces peptides. Ainsi, il a été possible de montrer qu'un peptide issu de la vimentine, Vim-TBS.58-81, est capable de rentrer dans les cellules de glioblastome humain T98G et de se localiser au niveau nucléaire. Une fois couplé à un peptide proapoptotique agissant au niveau nucléaire, il est capable d'inhiber la prolifération de ces cellules. Un autre peptide issu de la sous-unité légère des neurofilaments, NFL-TBS.40-63, est capable de rentrer dans toutes les lignées de gliome testées jusque-là, de déstabiliser leur réseau de MT et d'inhiber leur prolifération et leur migration sans affecter les cellules saines du cerveau (astrocytes et neurones). Injecté par stéréotaxie en intra tumoral chez des rats porteurs d'un gliome F98, ce peptide ralentit la croissance de la tumeur et reste localisé dans le tissu tumoral. Une analyse structure/fonction de ce peptide a mis en évidence des structures secondaires de type feuillet β et hélice α. Après greffage à la surface de nanocapsules lipidiques (NCL), ce peptide permet également l'amélioration de leur entrée dans les cellules de gliome in vitro et in vivo. Enfin, des NCL contenant du Paclitaxel ou du Ferrociphénol et recouvertes de peptide NFL-TBS.40-63 se sont révélées plus efficaces dans l'inhibition de la croissance tumorale dans un modèle de souris porteuse d'un gliome GL261 et dans un modèle de rat porteur d'un gliome 9L respectivement. L'ensemble de ces travaux révèle de nouvelles fonctions de ciblage et de pénétration cellulaire pour des peptides issus de filaments intermédiaires.

Le gène CDKN1A a été initialement décrit comme une cible transcriptionnelle de la protéineoncosuppressive p53. Son produit, p21Cip1 (p21), supprime l'activité des kinases dépendantes descyclines et de la protéine PCNA, ce qui en fait un puissant inhibiteur du cycle et de la proliférationcellulaires. En outre, p21 est fréquemment inactivée dans les cancers épithéliaux. Or, la progressionde ces tumeurs est associée à l'altération de l'organisation tissulaire, au processus invasif et à ladissémination métastatique. Ces phénomènes résultent des modifications cytosquelettiquesconduisant à la transformation des propriétés d'adhésion et de migration cellulaires. Pourtant, le rôlede p21 dans la dynamique cytosquelettique des cellules épithéliales humaines n'a jamais été adressé.Nous montrons ici que p21 contribue à l'adhésion et la migration normale des cellules épithélialesmammaires non transformées. Nos résultats montrent également que l'inactivation de p21 provoquela suppression de l'adhésion focale et des fibres de stress. Ce phénotype est caractérisé parl'inactivation de la GTPase Rho et l'activation de la cofiline, facteur de dépolymérisation de l'actine. Enoutre, la suppression de p21 provoque une désacétylation des microtubules associée à unedéstabilisation microtubulaire globale. La réduction de l'instabilité dynamique, par inhibition de ladésacétylase HDAC6, restaure partiellement l'étalement cellulaire et l'adhésion focale altérés parl'inactivation de p21. L'ensemble de nos données démontre que la régulation de la dynamiquecytosquelettique par p21 est nécessaire au contrôle de l'adhésion des cellules épithéliales humainesnon tumorales.

La p21-activated kinase 3 (PAK3) code pour une sérine/thréonine kinase dont la mutation est responsable de retard mental non syndromique. Les kinases PAK sont activées par les GTPases Rac1 et Cdc42 et régulent la plasticité neuronale en agissant sur le cytosquelette d'actine. Afin de comprendre le rôle spécifique de PAK3 dans les processus cognitifs, nous avons étudié les mutations responsables de retard mental et caractérisé des nouveaux variants d'épissage. Ainsi, nous avons montré: 1) que PAK3 est activé préférentiellement par Cdc42 ; 2) que deux mutations suppriment totalement l'activité kinase et entraînent de fortes anomalies de morphologie des épines dendritiques de neurones d'hippocampe ; 3) qu'une autre mutation diminue fortement la liaison de la kinase à la GTPase Cdc42 et induit une forte réduction de la densité des épines. Ces résultats montrent que le module Cdc42/PAK3 joue un rôle clé dans la formation des épines dendritiques et la plasticité synaptique. Par ailleurs, nous avons identifié deux nouveaux variants d'épissage de PAK3 qui sont constitutivement actifs. Nous proposons un nouveau modèle de régulation de leur activité kinase, basé sur la formation d'hétérodimères.

Les cellules des muscles striés squelettiques sont constituées d'éléments contractiles enveloppés par un réseau membranaire. La formation et l'entretien du muscle strié squelettique impliquent la migration des précurseurs myogéniques, la fusion des myoblastes en myotubes et la mise en place des triades. Ces évènements reposent sur le remodelage des membranes et du cytosquelette d'actine des cellules musculaires. Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle de la protéine adaptatrice CKIP-1 (casein kinase 2 interacting protein-1) dans certaines étapes du développement du muscle strié squelettique. Après avoir identifié le complexe de nucléation de l'actine Arp (actin-related protein) 2/3 comme un nouvel interacteur de CKIP-1, nous avons montré que l'inhibition de l'expression de ckip-1 chez l'embryon de poisson zèbre altère la morphologie des myoblastes et empêche leur fusion du fait d'une désorganisation du cytosquelette d'actine. J'ai également montré que CKIP-1 n'est présente qu'au cours des étapes précoces de la myogenèse in vitro et in vivo chez la souris, puis elle est progressivement clivée. En outre, la modulation de l'expression de CKIP-1 provoque des défauts membranaires aussi bien in vitro qu'in vivo dans le muscle adulte de souris, suggérant que CKIP-1 est impliquée dans le remodelage des membranes. CKIP-1, par ses capacités à remodeler le cytosquelette d'actine et les membranes, pourrait intervenir dans plusieurs étapes de la vie du muscle : la migration, la fusion des myoblastes et la mise en place ou le maintien du réseau membranaire interne des cellules du muscle strié squelettique.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Les cellules exerçert des forces sur la matrice extra cellulaire sur laquelle elles adhérent impliquant une boulle de régulation biomécanique. Cependant les sous-jacents de par lesquelles les cellules sentent et transmettent les forces restent encore m^echaniemes à elucider. Dans la premiére partie nous allons comment le modulations géométrique les forces de tractions et la distributions des tensions dans le cytosquelette d'actine ainsi que localisation des adhésions focales sur une cellule unique en combinant l'utilisation de la technique de micropatterning et de microscopie à traction de force. Nous avons mesuré la force de traction cellulaire sur différentes formes géométriques mocropatterns (comme un U, flieche ou H) recouvert de protéines sur des gels mous de polyacrilamide 2D dans lequl sont intégrés des nanobilles fluorescenes. Nous avons montré que la géométrie influencait la distribution des forces de tractions localement tandis que l'aire projetée des differentes formes restait conservée (pour une celule). Puis nous avons comparé la force de traction cellulaire développée quand les cellules sont sur des motif contirees circulaire 2D avec des motifs discrets en forme de micropiliers 3D de la me^me rigidité . Nous avons aussi étudie comment les forces varies en fonction de la rigidité de la matrice extracellulaire dans les deux cas précédents une mesure quantitative a été faite sur la localisation spatiale des protéines d'adhésion sur les formes circulaires et aussi sur l'organisation de l'actine. Afin d'ovoir une compréhension systématique de la distribution des forces nous nous sommes concentré sur la localisation et l'orientation des forces sur différentes géométrics de motifs (V, T, Tripod et plus). Nous avons corrélé la distribution avec celle des dibers de stesses et la localisation des adhésions focales. Ensuite nous nous sommes intéressés la distribution des centrosome en corrélation avec la forces et l'organisation d'autres eléments internes. Nous avons égolement essayé de prédire la force de traction en utilisant un modele théorique. Pour finir, nous avons developpé une novelle méthode de micropatterning fabriqué à partir de brosses de polymeres de PNIPAM qui sont thermosensibles. La fonctionalisation de surface et l'adhésion des cellules sur la surface sont aussi décrites. Nous discutons également de la dépendance en température des propriétés du PNIPAm et de l' utilisation desbrosses de polymeres comme actuateur pour induire les détachments des cellules. Nous avons aussi regardé la distribution des fibres de stress quand la cellule est cultivée sur différent types de motif thermosensible.

La métastase des cellules cancéreuses est un processus caractérisé par un comportement de la cellule anormal. Les propriétés mécaniques particulières des cellules cancéreuses est l'une des caractéristiques pathologiques principales. Ces propriétés sont liées à leurs capacités à envahir les tissus avoisinants, à transmigrer et à proliférer vers de nouveaux sites. La progression du cancer est caractérisée par la perturbation et la réorganisation du cytosquelette d'actine ainsi que par des changements des propriétés mécaniques des cellules, probablement liés à la capacité dupliquée des cellules cancéreuses à migrer et à s'adapter à l'environnement.Les propriétés mécaniques sont essentielles pour la régulation des fonctions cellulaires comme la migration, l'adhésion, la prolifération, et la différentiation, et les anomalies sont associées aux pathologies, en particulier le cancer. Les propriétés mécaniques sont aussi dépendantes du micro-environnement de la cellule, et la rigidité des substrats modifie les propriétés mécaniques internes des cellules, ainsi que la structure du cytosquelette. Ainsi, comprendre les processus impliqués dans les variations des propriétés viscoélastiques est essentiel pour l'étude de la progression des tumeurs.La microscopie à force atomique (AFM) a prouvé être un outil fiable pour sonder les propriétés mécaniques statiques et dynamiques (sur de grande gamme de fréquence) de matériaux mous, comme les spécimens biologiques, à de petites échelles et grande résolution.Dans cette étude, nous proposons de nouveaux marqueurs du cancer basé sur une approche mécanobiologique. Les propriétés viscoélastiques de cellules cancéreuses de la vessie sont mesurées par des expériences d'indentation dynamiques par AFM. Cette méthode est validée en utilisant des gels de polyacrylamide et un modèle à fractions dérivées est proposé pour décrire le comportement mécanique de ces gels. Ensuite, le module de cisaillement complexe de trois lignées cellulaires à potentiel métastatique différent est mesuré à trois positions différentes de la cellule: le noyau, le périnoyau et la périphérie de la cellule. En utilisant des drogues d'inhibition de l'actine, les propriétés mécaniques sont corrélées à la microstructure de l'actine obtenue par microscopie confocale. Nous proposons un modèle simplifié pour décrire le comportement des modules élastiques G' et visqueux G''. Une relation entre l'invasivité des cellules cancéreuses et leur propriétés mécaniques est aussi mis en avant. En particulier, nous trouvons que le plateau élastique et la fréquence de transition (quand G'=G'') peuvent être utilisés comme marqueurs d'invasivité. Enfin, nous mesurons le module de cisaillement complexe de cellules cancéreuses adhérentes sur des environnements mécaniques et biologiques différents, et des propriétés intrigantes de la périphérie des cellules cancéreuses sont reportées. / Cancer cell metastasis is a multi-stage process characterized by cell malfunctional behavior. Some of the major pathological characteristics of cancer cells are their particular mechanical properties which are linked to their ability to invade surrounding tissues, transmigrate and proliferate at new sites. There are evidences that cancer progression is characterized by disruption and reorganization of the actin cytoskeleton as well as changes in the mechanical properties. This change is probably associated with the enhanced capability of cancer cells to migrate and adapt to changing environments.The mechanical properties are essential for the regulation of cell functions like migration, adhesion, proliferation and differentiation, and abnormalities are connected with pathologies, in particular cancer metastasis. The mechanical properties are also dependent on the micro-environment of the cell, as substrate stiffness changes cell internal mechanical properties, as well as the cytoskeleton structure. Thus, the understanding of the mechanics involved in the variation of the viscoelastic properties is crucial for the study of tumor progression.Atomic force microscopy (AFM) has proved to be a reliable tool to probe static and frequency–dependent mechanical properties of soft materials, like biological specimens, at small scale with high resolution.In this study, we propose new markers of cancer metastasis based on a cell mechanics approach. We report on the viscoelastic properties of human bladder cancer cells measured by dynamic indentation experiments using AFM. This method is first calibrated using polyacrylamide gels and a fractional model is proposed to describe the behavior of such gels. We then investigate the complex shear modulus of three different cell lines with different metastatic potential. We probe the elastic G' and viscous G'' modulus at three different locations across the cell: nucleus, perinucleus and the cell periphery. With the use of actin inhibitory drugs, we correlate mechanical properties and the actin microstructure obtained by confocal microscopy imaging. We propose a simplified power-law model to describe the behavior of the elastic and viscous moduli. We also report a relationship between the malignancy of cancer cells and their viscoelastic properties. In particular, we find that the elastic plateau modulus and the transition frequency (frequency at which G' = G'' ) can be used as markers of invasiveness. Then, we probe the complex shear modulus of cancer cells on different mechanical and biological environments and we report intriguing properties of the periphery of cancer cells.

Le gène CDKN1A a été initialement décrit comme une cible transcriptionnelle de la protéineoncosuppressive p53. Son produit, p21Cip1 (p21), supprime l’activité des kinases dépendantes descyclines et de la protéine PCNA, ce qui en fait un puissant inhibiteur du cycle et de la proliférationcellulaires. En outre, p21 est fréquemment inactivée dans les cancers épithéliaux. Or, la progressionde ces tumeurs est associée à l’altération de l’organisation tissulaire, au processus invasif et à ladissémination métastatique. Ces phénomènes résultent des modifications cytosquelettiquesconduisant à la transformation des propriétés d’adhésion et de migration cellulaires. Pourtant, le rôlede p21 dans la dynamique cytosquelettique des cellules épithéliales humaines n’a jamais été adressé.Nous montrons ici que p21 contribue à l’adhésion et la migration normale des cellules épithélialesmammaires non transformées. Nos résultats montrent également que l’inactivation de p21 provoquela suppression de l’adhésion focale et des fibres de stress. Ce phénotype est caractérisé parl’inactivation de la GTPase Rho et l’activation de la cofiline, facteur de dépolymérisation de l’actine. Enoutre, la suppression de p21 provoque une désacétylation des microtubules associée à unedéstabilisation microtubulaire globale. La réduction de l’instabilité dynamique, par inhibition de ladésacétylase HDAC6, restaure partiellement l’étalement cellulaire et l’adhésion focale altérés parl’inactivation de p21. L’ensemble de nos données démontre que la régulation de la dynamiquecytosquelettique par p21 est nécessaire au contrôle de l’adhésion des cellules épithéliales humainesnon tumorales. / CDKN1A gene was initially identified as a target of the tumor suppressor p53. The ability to inhibitcyclin-dependant kinase and PCNA activities confers to its product, p21Cip1 (p21), strong antiproliferativeproperties. Moreover, p21 is frequently inactivated in epithelial cancers. Progression ofthese malignancies is also associated with disorganized tissue architecture, invasion and metastaticdissemination. These processes involve major cytoskeletal reorganization associated withtransformation of adhesion and migration properties. Still, the role of p21 in cytoskeletal dynamics innormal epithelial cell has never been addressed. Here we show that p21 contributes to normaladhesion and migration in untransformed human mammary epithelial cells (HMEC). We alsodemonstrate that p21 inactivation in HMEC suppresses focal adhesion and stress fiber assembly. p21depletion is also associated with inactivation of Rho GTPase and activation of the F-actin severingfactor cofilin. In addition, p21 silencing provokes microtubule hypoacetylation associated withincreased dynamic instability. We find that forced microtubule stabilization by HDAC6 inhibitionpartially restore cell spreading and focal adhesion in p21-depleted cells. Collectively, our data showthat regulation of cytoskeletal dynamics by p21 is required for adhesion control in untransformedhuman epithelial cells.