L'exercice de forces est indispensable au bon fonctionnement de nombreux processus cellulaires. Chez les eucaryotes, une majorité de ces phénomènes motiles est assurée par la polymérisation et la dépolymérisation spatialement et temporellement contrôlée du cytosquelette d'actine. Le cytosquelette est composé de microfilaments d'actine qui s'associent en structures complexes aux propriétés mécaniques particulières. Au cours des dix dernières années, beaucoup d'efforts ont été menés pour comprendre la dynamique des réseaux branchés de filaments d'actine initiés par le complexe Arp2/3. En revanche, peu de choses sont connues à propos de la dynamique de formation et de désassemblage des câbles de filaments d'actine. Récemment, il fut montré que les formines représentent une famille de protéines essentielles à l'initiation de ces structures.<br />Cette thèse résume dans un premier temps le travail accompli pour comprendre le mécanisme d'action des formines à l'échelle moléculaire. La plupart des formines sont des nucléateurs processifs, c'est-à-dire qu'ils permettent la formation et l'élongation de nouveaux filaments d'actine, tout en restant liées à l'extrémité du filament qui polymérise. Nous avons montré par la technique originale de microscopie à onde évanescente que Arabidopsis Thaliana FORMIN1 représente un nouveau type de formine, qui se déplace sur le côté des filaments d'actine après les avoir formés. Depuis le côté d'un filament préexistant, FORMIN1 est capable de nucléer un autre filament, initiant la formation de câbles de filaments d'actine. Dans un deuxième temps, cette thèse s'intéresse au mécanisme moléculaire mis en jeu par l'ADF/cofiline pour accélérer la dynamique d'assemblage/désassemblage des filaments d'actine, et traite pour la première fois de la dynamique de l'actine en temps réel à l'échelle du filament individuel ou à l'intérieur de structures organisées de filaments d'actine.

La division cellulaire est un événement fondamental, indispensable au développement embryonnaire animal et à l’homéostasie des organismes adultes. Il s’agit d’un processus complexe qui doit être précisément contrôlé dans le temps et l’espace pour permettre la formation de deux cellules filles, au contenu génétique identique à celui de la cellule mère. Ceci requiert une coordination entre la ségrégation des chromosomes, opérée par les microtubules, et le clivage de la cellule, engageant une réorganisation dynamique du cytosquelette d’Actine. La modification de la forme des cellules en cours de division est en effet due au remodelage du cortex cellulaire, incluant la membrane plasmique et le réseau de filaments d’Actine sous-jacent. Bien que cette série de modifications du cortex soit indispensable au déroulement correct de la division cellulaire, les mécanismes moléculaires du contrôle l’organisation corticale en mitose restent mal caractérisés. Le PI(4,5)P2 est un phosphoinositide constituant de la membrane plasmique, notamment nécessaire à la division cellulaire. Nos travaux chez la drosophile mettent en évidence que ce phospholipide présente une distribution dynamique, homogène sur l’ensemble du cortex à l’entrée en mitose, puis se concentrant à l’équateur des cellules après la séparation des deux lots de chromosomes. Nous montrons que le PI(4,5)P2 est nécessaire au contrôle de la stabilité corticale et du fuseau mitotique, au moins en partie par son rôle favorisant l’activation de la dMoésine. La dMoésine régule l’interaction entre les filaments d’Actine et la membrane plasmique, jouant un rôle clé dans l’organisation locale du cortex des cellules en mitose et ses propriétés mécaniques. Nous montrons que l’interaction PI(4,5)P2/dMoésine participe à la contraction cellulaire à l’entrée en mitose, puis à l’élongation cellulaire caractéristique des étapes plus tardives de la division. A la fin de la mitose, nous montrons que la phosphatase pP1-87B inhibe l’activation de la dMoésine, indispensable à la relaxation du cortex des cellules en interphase. Par un crible fonctionnel systématique, nous avons recherché l’ensemble des facteurs indispensables à la production et à l’enrichissement localisé du PI(4,5)P2 au cortex mitotique. Nous montrons le rôle majeur de deux voies de biosynthèse, qui collaborent pour produire localement le PI(4,5)P2 à la membrane plasmique au cours de la mitose. Leur absence prévient l’activation et le recrutement membranaire de la dMoésine, et conduit à une instabilité corticale associée à des défauts du fuseau mitotique. Une troisième voie, nécessitant l’activité de la protéine dOcrl, contribue à l’homéostasie de ce phosphoinositide, en dégradant le PI(4,5)P2 présent sur les membranes internes de la cellule. L’inactivation de dOcrl empêche la formation normale et l’ingression du sillon de clivage. Ensemble, ces résultats identifient donc des régulateurs importants de la membrane plasmique et de son interaction avec le cytosquelette, permettant de mieux comprendre les mécanismes de la réorganisation de la forme cellulaire au cours de la mitose. / Cell division must be accurately controlled in time and space to permit the formation of two daughter cells whose genetic content is identical to that of the mother cell. This process requires successive modifications of cell shape, induced by cortical remodelling. Molecular mechanisms controlling cortical reorganization during mitosis remain partially uncharacterized. Our work in Drosophila cells demonstrates that PI(4,5)P2, a phosophoinositide of the plasma membrane, is enriched at the equatorial region at the onset of anaphase. This PI(4,5)P2 is necessary for the cortical stability of mitotic cells, and requires dMoesin activation. The dMoesin, linking actin to the plasma membrane, plays a critical role in the cortical organization of mitotic cells and in the regulation of its mechanical properties. We show that the interaction PI(4,5)P2/dMoesin participates in cellular contraction at the beginning of mitosis, then in cell elongation characteristic of subsequent steps. At the end of mitosis, the Pp1-87B phosphatase inactivates the dMoesin. By a systematic functional screen, we characterize the key role of two pathways acting in synergy to locally produce PI(4,5)P2, Skittles- and Pten-dependent, and the role of a third pathway requiring dOcrl activity to control PI(4,5)P2 homeostasis. Altogether, these results allow us to better understand the mechanisms controlling cortical remodelling and modifications of cell shape that occur during mitosis. / Doctorat réalisé en cotutelle avec le laboratoire de François Payre au Centre de Biologie du Développement à Toulouse, France (Université de Toulouse III - Paul Sabatier)

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

La thèse concerne l'étude des déformations cellulaires à travers 2 approches complémentaires, expérimentale et théorique. motivées par la mise en évidence lors de travaux antérieurs, de l'existence d'une certaine auto-organisation des schémas des déformations membranaires pour des cellules arrondies. Nous avons choisi de nous intéresser ici au cas de fibroblastes L929 qui présentent une organisation plus complexe du cytosquelette. La caractérisation expérimentale a été réalisée à partir de séquences d'images vidéomicroscopiques. Les données morphodynamiques des cellules ont été extraites des séquences par 2 méthodes : (i) une segmentation des contours et (ii) une méthode de flot optique. Les résultats montrent que les cellules présentent le plus souvent des morphologies symétriques caractérisées dynamiquement par un mouvement pulsant synchronisé et périodique. Sur le plan théorique, nous nous sommes intéressés à un modèle cytomécanique des déformations décrivant la dynamique de poly/dépolymérisation de l'actine en relation avec les interactions mécaniques entre la membrane et le cytosquelette. Les simulations montrent la capacité du modèle à générer qualitativement des états pulsants tels qu'observés. Deux extensions du modèle ont alors été proposées pour prendre en compte : (i) l'interaction cellule-cellule caractérisée par l'inhibition de l'activité protrusive et (ii) la migration cellulaire par chimiotaxie, en agissant dans les 2 cas sur les propriétés mécaniques de la membrane et du cortex. Des comportements cellulaires réalistes ont ainsi pu être simulés. Finalement, une nouvelle formulation du modèle initial a été proposée pour modéliser les longs prolongements membranaires des fibroblastes. Le travail réalisé permet en particulier de proposer la possibilité d'utiliser les paramètres morphodynamiques comme critères d'identification des phénotypes cellulaires.

Le cytosquelette de microtubule (MT) est essentiel dans de nombreux processus cellulaire. Il est notamment impliqué dans le trafic intracellulaire, la division cellulaire, la modification et le maintien de la forme de la cellule. En fonction du type cellulaire ou de son état de différenciation, les réseaux de MTs vont adopter des architectures différentes. Ces organisations sont définies par des contraintes géométriques intracellulaires et l'activité moléculaire de nombreuses protéines associées aux MTs (MAPs). Parmi ces protéines, des membres de la famille des MAP65s ont été identifiés. In vitro, elles forment des ponts entre les MTs pour les organiser en faisceaux. Le but de mon travail de thèse a été d'étudier in vitro le rôle de MAP65s dans l'auto-organisation d'un réseau de faisceaux de MTs. Dans un premier temps, j'ai mis au point un système biomimétique utilisant la technique de " micro-patterning " qui imposent une géométrie d'assemblage pour les MTs dans des limites qui se rapprochent de celles observées dans les cellules. Cette méthode permet de contrôler précisément l'assemblage des MTs à partir de zones dont les formes, la taille et la distribution des unes par rapport aux autres sont définies. Pour valider cette technique, j'ai reconstitué des réseaux qui miment des architectures cellulaires (i.e modules du fuseau mitotique). Dans un deuxième temps j'ai étudié le rôle de MAP65s dans l'auto-organisation de réseaux de faisceaux de MTs, et plus particulièrement l'étape de co-alignement entre MTs dynamiques et dispersés. J'ai montré que MAP65-1 de plante et son orthologue chez la levure, Ase1, diminuent fortement la longueur de persistance de MTs isolés ou organisés en faisceaux. Cet assouplissement leur permet de se déformer et donc de se co-aligner pour former des faisceaux lorsqu'ils se rencontrent à des angles de rencontre élevés. L'augmentation de flexibilité est du à l'interaction du domaine de liaison de MAP65-1/Ase1 avec la lattice des MTs. Ces résultats suggèrent que la diminution de la rigidité des MTs contrôle dans les cellules l'issue des évènements des rencontres entre MTs. De façon plus générale, la modulation des propriétés mécaniques des MTs par des MAPs représente un nouveau mécanisme pour réguler la plasticité des réseaux de MTs dans les cellules eucaryotes.

Les réseaux formés par les filaments d'actine jouent un rôle fondamental en mécanique cellulaire, puisqu'ils contribuent grandement à la forme des cellules, à leur capacité à migrer et à leurs propriétés mécaniques. Durant ma thèse, nous nous sommes intéressés aux propriétés mécaniques des gels d'actine branchés présents dans le lamellipode. Dans le cadre de ma thèse, nous avons développé une nouvelle technique de mesure basée sur l'attraction dipolaire entre des colloïdes magnétiques nous permettant de mesurer le module de Young de gels d'actine reconstitués à la surface des particules à l'aide de la machinerie Arp2/3. Notre technique nous permet de réaliserun très grand nombre de mesures.Les faibles barres d'erreur ainsi obtenues nous ont permis d'étudier, pour la première fois, le lien entre les propriétés microscopiques architecturales des gels et leur réponse mécanique. Nous avons observé une forte rigidification du gel avec une augmentation de la concentration en protéine nucléatrice des branches Arp2/3 et en protéine de coiffe gelsoline durant la croissance du gel, montrant ainsi un lien entre l'architecture du réseau et son élasticité. De plus, nous avons étudié le lien entre le module élastique des gels, la flexibilité des filaments et l'augmentation des contraintes internes. Ces différentes études pointent en direction d'une réponse mécanique des gels d'actine à structure dendritique d'origine enthalpique, contrairement aux gels d'actine polymérisés en solution, dont l'élasticité est d'origine entropique.

La mitochondrie fournit l'énergie nécessaire au fonctionnement cellulaire, grâce au mécanisme de phosphorylation oxydative. Cette fonction nécessite une expression coordonnée des génomes nucléaires et mitochondriaux assurée par la famille de coactivateurs transcriptionnels PGC-1 (Peroxisome proliferator-activated receptor γ Coactivator-1), sensibles aux signaux endogènes et/ou environnementaux. Une régulation plus fine de la phosphorylation oxydative par des miRNAs est maintenant soupçonnée. Afin de préciser ces différents modes de régulation dans des modèles cellulaires de carcinomes thyroïdiens, nous avons exploré la voie PRC-dépendante (PGC-related coactivator) et les miRNAs spécifiquement exprimés dans ces modèles présentant une richesse en mitochondries et des niveaux de PRC et de PGC-1α différents. Ce travail a permis de mettre en évidence miR-218 comme marqueur clé de régulation de la fonction mitochondriale. Au-delà de la régulation de l'expression génique, une fourniture énergétique adéquate nécessite également une répartition optimale des mitochondries au sein de la cellule, grâce à d'étroites connexions entre le cytosquelette et la mitochondrie. Des peptides issus de la sous-unité légère des neurofilaments, dont le NFL-TBS.40-63, sont capables d'entrer spécifiquement dans les cellules de glioblastomes humains et d'y déstabiliser le réseau microtubulaire, conduisant à la mort cellulaire par apoptose. Pour étudier l'impact de ce peptide sur le réseau de mitochondries et leurs fonctions, nous avons traité le modèle cellulaire de glioblastomes humains T98G, par différentes concentrations de NFL-TBS.40-63. Ce travail révèle une perturbation du réseau de mitochondries et une diminution de la respiration mitochondriale dans les cellules exposées. L'ensemble de ces travaux doit permettre le développement de traitements ciblés de la fonction mitochondriale.

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Talin is a multifunctional cytoskeletal protein that plays a critical role in linking the actin cytoskeleton to the integrin family of transmembrane cell adhesion receptors. Two distinct integrin binding sites have been identified in talin, one present in the globular head domain (IBS1) and involved in integrin activation, and a second (IBS2), that has been delineated to a 130 residue fragment of the talin rod domain, but whose functional role is still elusive (Tremuth et al.2004). The objective of the present study was to define the minimal structure of talin IBS2 and to investigate its functional role in the integrin-cytoskeleton connection.<p>In the first part of this study, we used a combination of three different experimental approaches to define the minimal structure of talin IBS2: 1) an in silico bioinformatics approach to analyse sequence conservation of talin IBS2, 2) an in vivo cell biology approach to study the subcellular localization of recombinant talin fragments covering IBS2 in CHOáIIbâ3 cells, and 3) an in vitro biochemical approach consisting in protein overlay, pull down and Surface Plasmon Resonance (SPR) assays, to study the direct interaction between talin IBS2 and the integrin â3 subunit. We delineated IBS2 to a single amphipathic á-helical repeat of 23 residues within the talin rod domain. We further provided evidence that a two amino acid mutation(L2094I2095/AA) was sufficient to inactivate the IBS2 site, due to a disruption of the á helix structure, as demonstrated by infrared spectroscopy. In addition, we identified 2 lysine residues (K2085, K2089) exposed on the solvent face of á helix 50, which are directly involved in the talin IBS2-integrin interaction.<p>In the second part of this study, we investigated the functional role of talin IBS2 in spreading defective talin (-/-) cells and showed that in contrast to full-length wild type talin, an IBS2 LI/AA mutant talin was unable to fully rescue the spread phenotype of these cells. These results provide the first direct evidence that IBS2 in the talin rod is essential to link integrins to the actin cytoskeleton. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Le maintien de la morphologie et la production des forces par les cellules sont possibles grâce au cytosquelette, constitué de trois types de polymères protéiques dont les microfilaments d’actine. Les filaments d’actine s’organisent en différentes architectures, dont l’assemblage et le désassemblage sont étroitement contrôlés dans le temps et l’espace. En effet, une des caractéristiques d’un filament d’actine est son vieillissement, par l’hydrolyse progressive de l’ATP au sein des sous-unités. Pour assurer un renouvellement continu de l’ actine celle-ci doit donc être recyclée. Lorsque l’assemblage et désassemblage se compensent, les architectures d’actine sont alors dans un état stationnaire dynamique, dans lequel la concentration demonomères d’actine est perpétuellement renouvelée. Le désassemblage permet également de maintenir un réservoir important d’actine monomérique polymérisable, pour répondre rapidement aux besoins cellulaires. Le lamellipode, organe moteur de la cellule, est essentiellement composé d’unfeuillet fin mais très dense d’actine dendritique ainsi que de protéines régulatrices. Une protéine essentielle dans le turnover rapide du lamellipode est l’ADF/Cofiline. Elle est responsable du désassemblage des filaments âgés par fragmentation et pardébranchement. Jusqu’à présent, les études portaient le plus souvent sur les mécanismes microscopiques, à l’échelle du filament individuel. Or, pour comprendre la dynamique des réseaux branchés notamment au cours de la motilité cellulaire, il nous faut comprendre le désassemblage collectif et macroscopique du réseau d’actine dendritique. En combinant des milieux de motilité reconstitués à partir de protéinespurifiées à une nouvelle technique de micro-structuration de surfaces, j’ai pu reconstituer in vitro des réseaux dendritiques semblables au lamellipode. Ainsi, j’ai exploré au cours de ma thèse les paramètres qui contrôlent leur désassemblage macroscopique. Il en ressort que le désassemblage des réseaux dépend de leur architecture (densité) et de leur géométrie (taille) : les réseaux denses ou étendus sont moins efficacement désassemblés et restent cohésifs plus longtemps. Des modélisations montrent que c’est la déplétion locale en ADF/Cofiline autour du réseau d’actine qui semble responsable des effets observés. De plus, les réseaux constitués de densités d’actine hétérogènes acquièrent une directionnalité, qui peut être modulée par le désassemblage sélectif par ADF/Cofiline. Parallèlement, ces études ont permis de déterminer que pour avoir un réseau à l’état dynamiquestationnaire (ou à l’équilibre), il fallait atteindre un certain ratio d’ADF/Cofiline par actine. Ce travail a permis d’aller plus loin que les études fondamentales sur la fragmentation de filaments d’actine individuels, à l’échelle microscopique, et d’établir deux nouveaux paramètres qui contrôlent le désassemblage de réseaux d’actine dendritique à l’échelle macroscopique / Cells maintain their morphology and produce forces thanks to the cytoskeleton, which is composed of three types of protein polymers, amongst which the actin microfilaments. Actin filaments assemble into diverse architectures, which assembly and disassembly is tightly controlled in space and time. Indeed, the progressive hydrolysis of ATP in the monomers causes the actin filaments to age. Thus, actin needs to be recycled. When assembly and disassembly compensate, different actin architectures are in a dynamic steady state, in which the pool of actin monomers is renewed. Disassembly of actin structures also maintains a large reservoir of polymerization-ready monomers ready to assemble when needed by the cell.The lamellipodium is the locomotory organelle of the cell, and is made of a thin yet very dense sheet of dendritic actin network, with regulatory proteins. A pivotal protein is ADF/Cofilin, which is responsible of the disassembly of old actin filaments by fragmentation and debranching. To date, there have been extensive studies about the microscopic mechanisms, but if one wants to understand cell motility, one must decipher the collective and macroscopic disassembly of the dendritic actin network.By combining motility media reconstituted from purified proteins, and a new surface micro-patterning technique, I was able to reconstitute lamellipodium-like dendritic networks in vitro. During this thesis I explored the parameters that control the macroscopic disassembly of these networks. This work shows that the disassembly of dendritic actin networks depends on their architecture (density) and geometry (size): dense or extended networks are less efficiently disassembled and remain cohesive longer. Simulations show that these effects can be explains by a local depletion of ADF/Cofilin in the volume surrounding the network. Besides, networks of heterogeneous densities acquire directionality. This steering is modulated by selective disassembly of the networks by ADF/Cofilin. In parallel, these studies established a ratio at which networks are at a dynamic steady state.This work goes further than the fundamentally important studies about fragmentation of individual actin filaments, and establishes new parameters that control the disassembly of dendritic actin at the macroscopic scale.