L'exploration génétique de la déficience intellectuelle (DI) a été révolutionnée par l'amélioration des technologies de séquençage depuis ces dernières années avec la caractérisation du spectre mutationnel des gènes impliqués dans la DI, ainsi que l'identification de nouveaux gènes associés. Dans notre étude, nous avons utilisé la technique d'analyse sur microréseau d'ADN (Hybridation Génomique Comparative ou CGH-array) à haute résolution, puis celle du séquençage haut débit pour rechercher une altération à l'origine de la DI inexpliquée. Le syndrome d'Aicardi est une maladie neurodéveloppementale rare et sporadique, caractérisée par la triade: spasmes infantiles, agénésie du corps calleux, et lacunes choriorétiniennes. Ce syndrome est décrit exclusivement chez les filles avec l'hypothèse la plus probable d'une mutation dominante liée au chromosome X. Nous avons d'abord analysé les ADN de 22 patientes atteintes du syndrome d'Aicardi par CGH-array, à l'aide d'un microréseau d'oligonucléotides haute résolution (1M) spécifique du chromosome X, sans identifier de remaniements ou CNV pouvant être impliqués dans la maladie. Un premier séquençage haut débit de l'exome du chromosome X, a été effectué sur l'ADN d'un trio (patiente et parents) et deux autres patientes présentant des signes typiques du syndrome d'Aicardi. Les résultats ont révélé 59 mutations dans 51 gènes. Il s'agit de 13 variants hérités de la mère, 8 hérités du père, de 36 faux positifs, et 2 SNP. Un deuxième séquençage haut débit, sur l'exome complet, a ensuite été réalisé, à partir de l'ADN de cinq trios (patientes et parents). Nous présentons et commentons les différentes stratégies d'analyses utilisées à la recherche d'un gène candidat. Les résultats obtenus pour les SNP soulignent les difficultés rencontrées en terme de profondeur du séquençage générant de nombreux contrôles et les difficultés d'alignement des séquences ne rendant pas performant l'analyse des indels. Parallèlement, dans notre cohorte de patients du centre de référence maladies rares, la CGH-array a identifié des altérations intragéniques du gène IL1RAPL1 dont deux duplications originales et une délétion. Nous analysons les corrélations génotype - phénotype au regard des données de la littérature avec notamment la variabilité d'expression clinique. Deux délétions intragéniques et une duplication intragénique du gène MBD5, survenue de novo ont été aussi détectées chez des patients atteints de DI. Cette duplication conduit à des transcrits aberrants avec codon stop prématuré. Le gène MBD5 a été séquencé sur une cohorte de 78 patients phénotypiquement sélectionnés révélant une mutation nonsens de novo détecté chez un garçon associé avec un phénotype sévère. Nos travaux témoignent des avantages de ces stratégies d'analyse pangénomiques, dont l'analyse sur microréseau, mais souligne aussi la complexité, les limites en terme d'interprétation des résultats, tout particulièrement pour le séquençage de nouvelle génération / The genetic exploration of intellectual disability (ID) has been revolutionized with the improvement in sequencing technologies during last decade with characterization of mutational spectrum of genes involved in ID as well as to identify new genes associated with it. In this study we used high resolution (comparative genomic hybridization array) CGH-array and high throughput sequencing technique to find the genetic cause in patients with unexplained ID. Aicardi syndrome is a rare sporadic neurodevelopmental syndrome, characterized by classic triad of agenesis of corpus callosum, chorioretinal lacunes and infantile spasms. This syndrome is exclusively present in females with plausible hypothesis of X linked dominant mutation. We first tested DNA of 22 patients diagnosed with Aicardi syndrome by using a high resolution oligonucleotide CGH-array 1M specifically designed for X-chromosome without identifying any pathogenic CNV or deleterious rearrangements involved in the disease. High throughput sequencing for exome of X chromosome was carried out in one trio (patient-parents) and two patients with typical Aicardi syndrome diagnosis. Sequencing results detected 59 mutations in 51 genes. 13 mutations were inherited from mother, 8 inherited from father, 36 false positive and 2 were SNP?s. Second approach was based on High throughput sequencing for complete exome of five trios (patient-parents) DNA. We presented and commented different strategies for data analysis in search of a candidate gene. These results highlighted difficulties in terms of depth and alignment of sequencing reads which generated various false positive SNP?s and indels. In second cohort from reference centre of rare diseases CGH-array has identified two intragenic rearrangements of IL1RAPL1 gene: two unique duplications and one deletion. We analyze genotype-phenotype correlations with cases described in literature which emphasizes the clinical variability of expression in these patients. Two de novo intragenic deletions and a de novo intragenic duplication were detected in MBD5 gene in patients with ID. The de novo duplication of MBD5 resulted in an aberrant transcripts leading to a premature termination codon. A selected cohort of 78 patients were sequenced for MBD5 gene which revealed a de novo nonsense mutation in a male patient associated with a much more damaging phenotype. This study highlighted the advantages of pangenomic analysis by CGH-array and at the same time it identified the complexity and limitations in interpretation of results particularly for High throughput sequencing

De nombreux gènes impliqués dans la déficience intellectuelle (DI) restent encore à découvrir. Une des voies permettant l'identification de ces nouveaux gènes est la caractérisation de micro-réarrangements chromosomiques chez des patients atteints de DI. L'hybridation génomique comparative sur microréseau permet de détecter des déséquilibres génomiques de très petite taille touchant un ou quelques gènes. Les conséquences moléculaires de ces microdélétions ou microduplications sont différentes en fonction de la position du gène par rapport à leurs bornes. Nous avons ainsi montré l'implication du gène MBD5 dans le syndrome microdélétionnel 2q23.1 et la DI grâce à la caractérisation de trois délétions partielles, une duplication partielle et la première mutation non sens décrite dans ce gène. Nous avons également décrit chez des patients avec DI sévère un nouveau syndrome associé aux délétions de la région 4q21 et deux gènes candidats : PRKG2 et RASGEF1B. Ce syndrome est associé à un phénotype clinique reconnaissable, marqué surtout par un retard de croissance majeur et un retard psychomoteur sévère prédominant sur le langage. Par ailleurs nous avons étudié chez des garçons avec DI, deux duplications situées en Xq24q25 affectant le gène GRIA3. La première touche partiellement le gène, la seconde est situé en amont du gène et est responsable d'un effet de position. Pour finir nous avons étudié une famille consanguine dans laquelle ségrége une duplication 8p22 touchant partiellement le gène TUSC3 impliqué dans la DI de transmission autosomique récessive / A lot of intellectual disability (ID) genes have to be discovered. One of the approaches to identify new ID genes is to characterize chromosomal aberrations in affected patients. Array-CGH (Comparative Genomic Hybridization) made it possible to detect small CNV (Copy Number Variations) affecting only one or a few genes. Molecular outcomes of these microdeletions and microduplications are different depending on the position of the gene relative to the breakpoints. We have thus shown the involvement of MBD5 gene in the 2q23.1 microdeletion syndrome and in ID with the characterization of three partial deletions, a partial duplication and the first nonsense mutation described in this gene. We have also described in patients with severe ID a new syndrome associated with 4q21 deletions involving two candidate genes: PRKG2 and RASGEF1B. This syndrome is associated with a recognizable clinical phenotype with marked growth restriction, severe psychomotor delay and absent or severely delayed speech. In addition, we have studied two Xq24q25 duplications affecting GRIA3 gene in boys with ID. The first one affects partially the gene, the second one is located upstream of the gene and is responsible for a position effect. Finally we have studied a consanguineous family with a 8p22 duplication affecting partially TUSC3 gene which is involved in autosomal recessive ID

La Déficience Intellectuelle liée au chromosome X (X-LID), anciennement appelée RMLX (retard mental lié au chromosome X) est une pathologie fréquente (3 % de la population) et handicapante. Cette déficience se manifeste par la réduction de la capacité à comprendre les informations nouvelles ou complexes, des difficultés d’acquisition de nouvelles compétences et l’échec dans la gestion de sa vie en toute autonomie ; celle-ci est souvent accompagnée par un dysmorphisme corporel. Cette pathologie s’installe dès l’enfance (avant l'âge de 18 ans) et a des répercussions sur le développement de l’individu (QI<70). La pathogénie de la déficience intellectuelle reste obscure et dans 50 % des cas, la cause n’est pas connue. Dix pour-cent (10 %) des cas de la déficience intellectuelle seraient liés à des gènes localisés sur le chromosome X, avec une mutation transmise par les mères et affectant principalement les garçons. Parmi les 931 gènes du chromosome X, seulement 114 gènes ont été identifiés comme gènes de déficience intellectuelle. Le dernier (le gène SSR4) fut caractérisé en mars 2014. À l’heure des technologies du séquençage de haut débit, le laboratoire de génétique moléculaire de l’hôpital Necker de Paris s'est doté d’une plateforme d’identification de mutation génétique humaine par séquençage à haut débit permettant le diagnostic des maladies rares. L’objectif de mon travail de thèse était d’appliquer l’approche du séquençage à très haut débit (technique SOLiD) dans l’identification de nouveaux gènes de la déficience intellectuelle liée au chromosome X chez des familles ayant des garçons atteints de déficience intellectuelle non-syndromique, d’identifier les mutations des gènes qui sont déjà connus et d’en discuter la corrélation génotype-phénotype. L’approche que j’ai utilisée dans cette étude est le diagnostic génétique par séquençage à haut débit de l’exome du chromosome X de vingt sujets appartenant à dix familles (X-LID) françaises. La procédure consiste à capturer l’exome du chromosome X des patients atteints, à l’enrichir par la technologie Rain-Dance, puis à le séquencer dans notre plateforme avec un séquenceur à haut débit de la technologie SOLiD5500 afin d’analyser les résultats et pour ne retenir que les nouvelles mutations et commenter leur pouvoir pathogène. Cette étude a mis en évidence de nouvelles mutations dans 21 gènes, dont neuf gènes ne sont pas encore décrits parmi les gènes X-LID et a révélé l’importance de l’hétérogénéité génétique tout en relevant la possibilité de l’effet des charges mutationnelles et le rôle gènes modificateurs. Certaines nouvelles mutations, nous les avons identifiées dans des gènes connus pour leur implication dans la déficience intellectuelle et les avons publiées durant les études doctorales. Pour confirmer la causalité des nouveaux gènes ayant muté chez les familles atteintes, des études fonctionnelles supplémentaires in vivo doivent être appliquées tout en suivant les publications sur le même sujet afin de comparer avec des cas similaires. / X linked Intellectual deficiency (X - LID); formerly X-LMR (X Linked Mental Retardation) is a common pathology (3 % of the population). Intellectual Deficiency (ID) is the most frequent cause of serious handicap in children and young adults. Defining features of ID include an overall intelligence quotient (IQ) of less than 70 together with associated functional deficits in adaptive behavior (such as daily living, social and communication skills), which manifest before18 years of age. ID pathogenesis remains obscure and 50% of cases have no known cause. Ten percent of the intellectual intellectual deficiency would be related to genes located on the X chromosome, and subsequently inherited by affected boys. Among the 931 genes of the X chromosome, only 114 genes have been identified as X-LID genes. The last (SSR4 gene) was characterized in March 2014. At the time of the Next Generation Sequencing (NGS), the laboratory of molecular genetics of Necker hospital in Paris is equipped with a platform for the identification of human genetic mutation by high-throughput sequencing for the diagnosis of rare diseases. The objective of my thesis work was to seek new genes for X linked intellectual deficiency in families with non-syndromes cognitive disorder affected boys and to identify mutations in the genes that are already known and to discuss the genotype, phenotype correlation. The approach that I have used in this study is genetic diagnosis by high-throughput sequencing of chromosome X exomes of 20 subjects belonging to ten X-LID French families. The procedure is to capture and enrich the exome of the X chromosome of patients, then to sequence it in our platform with a high throughput sequencer of SOLid technology then analyze the results and retain that new mutations to discuss their pathogenity. This study has highlighted new mutations in 21 genes, including nine that are not yet described among the X-LID genes. Some new mutations, we identified in genes known through their involvement in cognitive impairment were published during my doctoral studies. To confirm causality of new genes that were found mutated in families, additional studies in vivo must be applied while following the literature to make comparisons with similar cases.

L'évolution croissante de l'obésité n'épargne pas les adolescents présentant une déficience intellectuelle. Nos travaux reposent sur le principe d'une " recherche- action " avec pour but l'amélioration de la prise en charge des personnes en situation de handicap mental. Réalisées dans 5 instituts médico-éducatifs, notre première étude montre que plus de 40% des adolescents déficients intellectuels présentent un excès de masse grasse. Plus de 30% des adolescents rapportent un faible niveau d'activité physique et seule la moitié pratiquerait suffisamment d'activité physique pour lutter contre le développement de l'obésité. De plus, les adolescents les plus actifs présentent moins de risques de développer un excès de masse grasse. Leur faible niveau de condition physique observé est un facteur de risque élevé pour la santé. Pour ces jeunes présentant un handicap mental, cela constitue un " sur-handicap " qui peut accentuer la restriction de participation sociale et altérer la qualité de vie. Etre actif au quotidien permettrait de limiter les risques pour la santé, notamment de limiter le développement de l'obésité. De ce fait, un programme d'Activité Physique Adaptée a été proposé aux jeunes repérés en situation de sur-adiposité. Celui-ci a permis d'augmenter les temps de pratique d'activité physique et de stabiliser l'évolution du poids, tout en diminuant la masse grasse et le tour de taille. L'approche interdisciplinaire de cette recherche nous a permis de considérer l'évolution du concept de soi chez ce public spécifique et de constater qu'il n'était pas altéré par cette prise en charge visant le contrôle du poids.

L'analyse chromosomique sur puce ADN (ACPA) tend à devenir le principal examen diagnostique dans la déficience intellectuelle (DI). Parmi les techniques d'ACPA, les puces SNP ont l'intérêt de pouvoir détecter les pertes d'hétérozygotie, et par conséquent d'identifier les isodisomies uniparentales (iUPD) et les zones d'identité liées à la consanguinité. Nous avons étudié une cohorte de 1 187 patients atteints de DI, dans un cadre diagnostique, sur puces SNP. Nous avons réalisé, par cette étude, 145 diagnostics (12%) dont 2 iUPD et 6 délétions n'incluant qu'un seul gène. De plus, nous avons détecté 639 CNV rares non décrits chez des sujets contrôles et incluant des séquences codantes, ce qui nous a permis d'identifier 11 gènes candidats dans la DI : CAMTA1, SP3, CNTNAP4, NUDT12, STXBP6, DOCK8, DOCK10, SMARCA2, NYAP2, ATAD3A et ATAD3B. Nous avons tenté de valider l'implication de ces gènes par séquençage, mais n'avons trouvé de seconde mutation pour aucun d'entre eux. Toutefois, des réarrangements de CAMTA1 ont été retrouvés dans 2 autres familles avec un phénotype homogène (DI et ataxie congénitale) ce qui nous a permis d'affirmer qu'il s'agit d'un gène de DI. Par ailleurs, l'homozygosity mapping, réalisé avec puces SNP, a identifié, par séquençage whole exome, une mutation non-sens homozygote du gène BUD13 dans une famille de DI syndromique. Enfin, de façon fortuite, nous avons caractérisé en ACPA une translocation familiale entraînant une disruption d'un gène d'ataxie spino-cérébelleuse, ATXN10, ce qui a permis de mieux comprendre la physiopathologie de cette maladie. Au total, notre étude démontre l'intérêt des puces SNP dans la DI, d'une part en diagnostic et d'autre part pour l'identification de nouveaux gènes responsables de DI.

Dans la littérature actuelle, il existe peu d'études portant sur l'évolution des adultes présentant un Trouble du Spectre Autistique (TSA) associé à une Déficience Intellectuelle (DI). Toutefois, de manière générale, les données disponibles suggèrent que se sont les personnes les plus déficientes qui connaissent les changements les moins significatifs.Cette étude exploratoire et rétrospective concerne 7 sujets atteints d'autisme associé à une DI sévère. Sont retracés sur une période de trente ans leurs parcours de vie, leurs évolutions cliniques, leurs niveaux d'adaptation au quotidien, et ceci depuis l'âge de leurs 20 ans. Le recueil de données a été réalisé sur la base d'études des dossiers médico-éducatifs ainsi qu'à partir d'entretiens semi structurés menés auprès du personnel encadrant. Bien que nous n'ayons pas pu mettre en évidence de changement significatif concernant les profils cliniques, comportementaux et adaptatifs de ces sujets, certains d'entre eux ont connu des évolutions qualitatives comme une diminution de l'intensité de la symptomatologie ou de l'importance des troubles du comportement. Les résultats ont été discutés à la lumière des travaux actuels et critiqués au regard des limites méthodologiques. Des propositions de recherches sont formulées : suivi de la population actuelle ; mise en place d'un plan longitudinal prospectif concernant une cohorte représentative de personnes adultes autistes avec DI sur une longue période ; proposition de protocoles spécifiques d'apprentissage avec évaluation des effets de ce type de prise en charge.

LIMK1 et LIMK2 sont des sérines/thréonine kinases capables de phosphoryler et d’inactiver la cofiline, un facteur de dépolymérisation de l’actine. Elles sont régulées négativement par la neurofibromine, responsable de la neurofibromatose de type 1, et pourraient être impliquées à la fois dans les aspects tumoraux et cognitifs de cette maladie par leur rôle dans la dynamique de l’actine. Nous avons étudié l’isoforme LIMK2‐1 de LIMK2, spécifique des hominidés et précédemment associée à la déficience intellectuelle. Cette isoforme possède un domaine kinase tronqué et un domaine inhibiteur de la phosphatase 1 (PP1i) en C‐terminal. Nos résultats montrent, d’une part, que LIMK2‐1 existe sous forme de protéine et qu’elle est exprimée dans le système nerveux central chez l’homme, en particulier au cours du neurodéveloppement. D’autre part, il apparaît que cette isoforme favorise la polymérisation de l’actine. Cette action semble indépendant de l’activité kinase puisque LIMK2‐1 ne phosphoryle pas la cofiline. Nous avons également montré que le domaine PP1i interagissait spécifiquement avec la phosphatase 1 et des résultats complémentaires suggèrent un rôle de ce domaine dans l’inhibition de la dépolymérisation de l’actine. Ces données mettent en évidence un mécanisme moléculaire nouveau pour une protéine de la famille des LIMK et soulignent l’intérêt d’étudier ces protéines afin de mieux comprendre leur implication dans les troubles cognitifs et dans la neurofibromatose de type 1. / LIMK1 and LIMK2 are serine/threonine kinases that phosphorylate and subsequently inactivate cofilin, an actin-depolymerizing factor. Neurofibromin, the protein responsible for neurofibromatosis type 1, negatively regulates these proteins that may be involved in tumoral and cognitive aspects of the disease through their role in actin dynamics. We studied LIMK2-1, a hominidae-specific isoform previously involved in intellectual disability. This isoform possesses a truncated kinase domain and a protein phosphatase 1 inhibitory (PP1i) domain at its C-terminal extremity. Our results showed that LIMK2-1 exists at a protein level and that it is expressed in human central nervous system, especially during neurodevelopment. Moreover, LIMK2-1 promotes actin polymerization independently from a kinase activity, since this isoform does not phosphorylate cofiline. We also highlighted an interaction between the PP1i domain and protein phosphatase 1 and complementary results suggest a role of this domain in the inhibition of actin depolymerization. These data highlight a new molecular mechanism for a LIMK protein and emphasize the interest of studying these proteins to understand their involvement in cognitive disorders and in neurofibromatosis type 1.

La déficience intellectuelle (DI) touche 1 à 3% de la population générale avec un excès de sujets de sexe masculin. Cette affection est caractérisée par une extrême hétérogénéité clinique et génétique rendant son élucidation complexe. La révolution technologique des outils permettant l’analyse du génome intervenue depuis les années 2000 avec l’analyse chromosomique sur microréseau et singulièrement depuis 2010 avec les applications du séquençage à haut débit a considérablement facilité l’identification de nouveaux gènes. Nous avons tiré avantage de ce phénomène pour identifier trois affections neurologiques à caractère familial Nous avons procédé selon une méthodologie structurée pour conduire, grâce à la mise en place d’un réseau de collaborations, à la découverte ou à la confirmation de l’existence de nouvelles formes de DI. 1.Séquençage de l'exome couplé à la recherche de variations du nombre de copies 2. Mise à jour d’une altération de séquence génique potentiellement causale retrouvée chez le cas index et chez les autres sujets atteints de la famille 3.Extension des résultats à d’autres familles par la constitution d’une cohorte de réplication 4.Élaboration d’une série d’études fonctionnelles venant conforter l’hypothèse de causalité par la création d’un modèle animal et/ou la réalisation d’études biochimiques spécifiquesL’application de cette méthodologie nous a permis de conduire à terme trois projets : L’individualisation d’une forme syndromique de DI récessive autosomique associée à une malformation du rachis cervical et liée aux mutations bi-alléliques de CDK10. La caractérisation d’une encéphalopathie récessive autosomique létale associée à une hypertonie sévère et à une arthrogrypose distale liée aux mutations bi-alléliques d’ATAD1. L’implication de FRMPD4 dans une nouvelle forme de DI non syndromique liée à l’X / Intellectual disability (ID) impacts 1 to 3% of the general population with an excess of affected males. This condition is characterized by an extreme clinical and genetic heterogeneity making the deciphering of its causes more complex. The technological revolution that took place in the study of the genome over the last two decades has provided a useful tool for identification of new genetic entities. This is particularly true for chromosomal micro-array analysis since early 2000s and for next generation sequencing since 2011. We took advantage of this by identifying the molecular basis of three singular conditions. We applied a structured methodology and created a network of collaborations to define or confirm these new ID syndromes. 1. Whole exome sequencing alongside with array-CGH 2.Identification of a candidate gene sequence alteration in the index case and other affected patients of the family 3.Constitution and study of a replication cohort 4.Biochemical studies and/or animal models in order to support the assumption of causalityBased on this research strategy, we were able to complete the following projects : Discovery of a syndromic form of autosomal recessive ID associated with cervical spine defects due to bi-allelic CDK10 mutations. Identification of an ATAD1-related profound and lethal autosomal recessive encephalopathy with stiffness and distal arthrogryposis. Characterization of a FRMPD4-related X-linked non-syndromic ID

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Les variations du nombre de copies (CNVs) incluent les délétions et les duplications de régions chromosomiques d’une taille variant de 50 pb à plusieurs Mb. Depuis 2005, les études d’association pangénomiques (GWAS) ont permis d’associer certains larges CNVs à des maladies syndromiques associées à la déficience intellectuelle incluant les syndromes de DiGeorge, Williams, Angelman, etc. En fonction de la densité génique de la région d’intérêt et de la variabilité des phénotypes associés, l’étude de la physiopathologie des syndromes peut être extrêmement complexe. La modélisation murine offre de nombreux avantages pour l’identification des gènes candidats et la compréhension des mécanismes moléculaires associés à ces pathologies.Les travaux présentés dans ce manuscrit consistent en la caractérisation des modèles murins pour cinq maladies syndromiques associées aux CNVs : la monosomie 21 partielle ainsi que les réarrangements des régions 16p11.1 et 17q21.31. Les caractérisations anatomiques, métaboliques et comportementales des animaux nous ont permis d’évaluer un grand nombre de paramètres associés à la symptomatique humaine. Nous avons également réalisé des analyses électrophysiologiques et transcriptomiques en ciblant nos investigations sur l’hippocampe, structure cérébrale qui joue un rôle central dans les processus de mémoire et d’apprentissage. Ce projet de recherche s’inscrit dans une perspective plus large qui est l’identification des gènes candidats pour les phénotypes observés et le développement de premières stratégies thérapeutiques pouvant potentiellement aboutir à l’amélioration des capacités cognitives des patients. / Copy number variations (CNVs) include deletions and duplications of chromosomal regions ranging in size from 50bp to several Mb. Since 2005, genome-wide association studies (GWAS) have associated some large CNVs to syndromic diseases linked to intellectual disability including DiGeorge, Williams, Angelman syndroms, etc. Depending on the gene density of the region of interest and the variability of symptoms, the study of the pathophysiology of syndromes can be extremely complex. Mouse modeling show many advantages for the identification of candidate genes and the understanding of molecular mechanisms associated with these diseases.The work presented in this manuscript consists of the characterization of mouse models of five syndromic diseases associated with CNVs: partial monosomy 21 and rearrangements of 16p11.2 and 17q21.31 regions. Anatomical, metabolic and behavioral characterizations of animals allowed us to evaluate a broad number of parameters associated with human phenotypes. We also performed electrophysiological and transcriptomic analysis focusing our investigation on the hippocampus which has a major role in learning and memory processes. This project is part of a wider perspective which is the identification of candidate genes for the different phenotypes we observe in the mouse and the development of first treatment strategies which can potentially lead to the improvement of cognitive capacity of patients.