Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-06-22. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:19:02Z : No. of bitstreams: 1 000848356.pdf: 1331001 bytes, checksum: d6e3659c184a0dc66b218b791f493b49 (MD5) / A malária é a endemia de maior impacto na Saúde Pública de países tropicais, devido à alta morbidade e mortalidade. Considerando a malária como uma zoonose, nos quais primatas podem funcionar como reservatórios de espécies de Plasmodium que podem infectar seres humanos nos levam a realizar estudos de malária em primatas com inquestionável relevância. Sabendo-se que geralmente a distribuição da malária humana e de primatas segue a mesma distribuição dos anofelinos, mosquitos vetores, neste trabalho investigaram-se a presença de Plasmodium spp. em primatas neotropicais e em anofelinos na Ilha de São Luís, Estado do Maranhão, Brasil. Colheram-se amostras de sangue de primatas neotropicais do CETAS-São Luís (n=141) e de vida livre (n=20) da Reserva Particular Sítio Aguahy, município de São José de Ribamar. Mosquitos anofelinos foram capturados nesta mesma reserva (n=380) e no Sítio Mangalho (n=36), localizado na Área de Proteção Ambiental do Maracanã, município de São Luís, totalizando em 54 ―pools‖. As amostras de sangue de primatas foram submetidas a testes morfológicos, sorológicos (RIFI e ELISA-teste) e moleculares (qPCR e PCR convencional) para identificação de Plasmodium. Os ―pools‖ de mosquitos foram ensaiados por testes moleculares para identificação de Plasmodium. Cinco primatas tiveram lâminas positivas (3,10%) com observação de formas trofozoíticas. Na RIFI quatro amostras de soro de primatas sororreagiram frente ao antígeno de P. malariae. Amplificaram para Plasmodium sp. na qPCR 34,16% (55/161) das amostras de primatas. Na PCR convencional 30,43% (49/161) foram positivas, sendo 47 (47/49) para P. brasilianum/P. malariae e 2 (2/49) para P. simium/P. vivax. Foram sequenciadas quatro amostras de DNA de primatas, que apresentaram identidade com P. malariae (n=2),com Plasmodium ZOOBH (n=1) e com P. falciparum (n=1). Três ―pools‖ de anofelinos foram positivos para Plasmodium na... / Malaria is a disease of greater impact on Public Health in tropical countries because of the high morbidity and mortality. Considering malaria as a zoonosis in which primates can act as reservoirs of species of Plasmodium that can infect humans lead us to conduct malaria studies in primates with unquestionable relevance. It is generally know that the distribution of human and primate malaria following the same distribution of Anopheles mosquitoes vectors, in this study we investigated the presence of Plasmodium spp. in neotropical primates and Anopheles in São Luís Island, Maranhão State, Brazil. Samples were blood neotropical primates CETAS-São Luís (n = 141) and wild life (n = 20) Private Reserve Sítio Aguahy, São José de Ribamar. Anopheles mosquitoes were captured in the same reserve (n = 380) and Mangalho site (n = 36), located in the Environmental Protection Area of the Maracanã, São Luís, totaling 54 pools. The primate blood samples were subjected to morphological, serological (IFA and ELISA-test) and molecular (qPCR and conventional PCR) to identify Plasmodium. The pools of mosquitoes were assayed by testing for molecular identification of Plasmodium. Five primates had positive slides (3.10%) with observation trofozoíticas forms. In IFA four primate serum samples sororreagiram against the antigen of P. malariae. Amplified Plasmodium sp. qPCR at 34.16% (55/161) of samples of primates. In conventional PCR 30.43% (49/161) were positive, 47 (47/49) for P. brasilianum/P. malariae and 2 (2/49) to P.simium/P. vivax. Were sequenced DNA samples from four primates which showed identity with P. malariae (n = 2), Plasmodium ZOOBH (n = 1) and P. falciparum (n = 1). Three pools of Anopheles were positive for Plasmodium in qPCR (3/54) and conventional PCR. The sequencing samples showed identity to P. falciparum (n = 1), P. vivax (n = 1) and Plasmodium ZOOBH (EF090276). Due to the continued and increasing encroachment to forests by ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-23Bitstream added on 2014-06-13T20:54:00Z : No. of bitstreams: 1 alves_rt_me_sjrp.pdf: 897690 bytes, checksum: aa55c71d900e132e94af0abefd5cf6fa (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Clicar acesso eletrônico abaixo. / Click electronic access below.

Sabe-se que o refluxo crônico pode induzir lesão mucosa, estimular a proliferação de células e promover tumorigênese no esôfago distal. Ainda não é sabido por que apenas uma parcela dos pacientes com refluxo esofágico progrediram para uma metaplasia intestinal (Esôfago de Barrett) e adenocarcinoma. O estresse oxidativo parece exercer um papel importante nessa progressão . Assim sendo, examinamos o padrão de expressão da enzima Heme Oxigenase-1 (HO-1), enzima indutora do estresse oxidativo, em peças de esôfago obtidos de um estudo experimental com ratos que avaliou o papel do refluxo gástrico e duodenoesofágico na carcinogênese esofágica. Métodos: Uma amostra de três (3) peças de esôfago de cada grupo de ratos submetidos a tratamentos diferentes tiveram a expressão da enzima Heme Oxigenase-1 avaliada através de imunohistoquímica. Os ratos foram divididos nos seguintes grupos: (1) cardioplastia para induzir refluxo predominantemente gástrico, (2) anastomose esofagoduodenal para induzir refluxo duodenal, (3) sem tratamento, (4) cardioplastia+dietilnitrosamina (DEN), (5) anastomose esofagoduodenal +DEN, (6) DEN. Resultados: Não houve desenvolvimento de câncer ou metaplasia intestinal nos animais que não foram expostos ao refluxo de conteúdo duodenal. A expressão de HO-1 foi observada apenas em ratos submetidos à anastomose esofagoduodenal (Grupos 2 e 5) e a análise da média de intensidade de fluorescência demonstrou uma diferença significante de expressão de HO-1 (4,8 e 4,6 vezes respectivamente) comparando-se ao controle (Grupo 3) (p<0,05). O alvo principal para expressão da HO-1 foram as células inflamatórias dentro do tumor ou em áreas subepiteleiais. Os ratos expostos ao refluxo gástrico não desenvolveram tumores ou expressaram a HO-1. Conclusões: A esofagite de refluxo induzida por refluxo esofágico com conteúdo duodenal provocou estresse oxidativo considerável e pode desempenhar um papel importante na carcinogênese esofágica. O refluxo gástrico não foi suficiente para induzir estresse oxidativo neste modelo experimental.

Dispepsia funcional e hipolactasia primária do tipo adulto (HPTA) são duas condições altamente prevalentes na prática clínica. Ambas podem coexistir ou até mesmo serem confundidas devido à sobreposição de alguns dos seus sintomas, principalmente a sensação de distensão abdominal. No entanto, a literatura é escassa em relação a estudos que tenham avaliado a associação entre a dispepsia funcional e a HPTA. O presente trabalho tem o objetivo investigar a associação entre a HPTA e a dispepsia funcional, através da análise molecular da HPTA em pacientes dispépticos funcionais e controles assintomáticos. Pacientes dispépticos funcionais (conforme os critérios de Roma III) e voluntários assintomáticos foram convidados para participar do estudo. Indivíduos com genótipo CC do polimorfismo de nucleotídeo único -13910C/T eram considerados portadores de HPTA. Os sintomas dispépticos (dor em abdômen superior, náuseas, vômitos, sensação de distensão abdominal e saciedade precoce) foram avaliados através de um questionário validado (Porto Alegre Dyspeptic Symptoms Questionnaire). Foram incluídos 408 indivíduos no estudo (197 dispépticos funcionais e 211 controles). HPTA foi identificada em 88 (44,7%) dispépticos funcionais e 107 controles (50,7%) (P=0,468). No grupo dos dispépticos funcionais, os escores dos sintomas dispépticos foram comparados entre os pacientes classificados como portadores de HPTA e aqueles classificados como “não portadores de HPTA”. Foi observado maior escore da sensação de distensão abdominal em dispépticos funcionais com HPTA do que em dispépticos sem HPTA (P=0,014). Não foram observadas diferenças entre os grupos em relação aos escores dos demais sintomas. Em conclusão, a ausência de diferença na frequência de HPTA entre todos os dispépticos funcionais e o grupo de indivíduos assintomáticos indica que não há uma associação entre a HPTA e a dispepsia funcional como um todo. No entanto, o maior escore da sensação de distensão abdominal entre os dispépticos funcionais com HPTA sugere um papel da HPTA em uma parcela dos pacientes com dispepsia funcional. / Functional dyspepsia and Adult Type Hypolactasia (ATH) are frequent conditions that may coexist or even be confounded. There may be some overlap between their symptoms, especially abdominal bloating. Studies on this association are scarce. The aim of the study is to investigate the association between functional dyspepsia and ATH, through molecular analysis of ATH in functional dyspeptics and asymptomatic individuals. Patients with functional dyspepsia according to Rome III criteria and volunteers for blood donation were invited to participate in the study. A CC genotype por -13910C/T SNP was diagnostic of ATH. Five symptoms of functional dyspepsia (upper abdominal pain, nausea, vomiting, abdominal bloating and early satiety) were evaluated using a validated questionnaire (Porto Alegre Dyspeptic Symptoms Questionnaire). A total of 408 subjects were included in the study (197 functional dyspeptics and 211 controls). Eighty-eight dyspeptic patients (44.7%) had ATH, compared to 107 individuals (50.7%) in the control group (P=0.468). In the group of dyspeptic patients, mean scores of symptoms were compared between those classified as ATH and non-ATH. Dyspeptic patients with ATH had higher scores for abdominal bloating, compared to non-ATH patients (P=0.014). The scores of the other dyspeptic symptoms were not statistically different between those two groups. In conclusion, the similar frequency of ATH in patients with functional dyspepsia and asymptomatic individuals indicate an absence of association between functional dyspepsia and ATH. However, our data of higher bloating scores among functional dyspeptics with ATH suggest a possible role of ATH in a subset of patients with functional dyspepsia.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Núcleo de Medicina Tropical, Progragama de Pós-graduação em Medicina Tropical, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-01-04T13:40:56Z No. of bitstreams: 1 2012_VivianeMedeirosSilva.pdf: 8808644 bytes, checksum: 9d9dc0f5cdac4641c66122653211e830 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-02-04T12:53:57Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_VivianeMedeirosSilva.pdf: 8808644 bytes, checksum: 9d9dc0f5cdac4641c66122653211e830 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-02-04T12:53:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_VivianeMedeirosSilva.pdf: 8808644 bytes, checksum: 9d9dc0f5cdac4641c66122653211e830 (MD5) / No Brasil, a leishmaniose visceral canina (LVC) é causada pelo parasito Leishmania chagasi, (sin. L. infantum). Considera-se que a principal via de transmissão da LV é por meio da picada de flebotomíneos infectados. Entretanto, formas alternativas têm sido investigadas e a picada ou ingestão de carrapatos infectados poderia ter relevância epidemiológica. A presença de L. chagasi em Rhipicephalus sanguineus poderia explicar a transmissão do parasito na população canina em locais onde há baixa frequência de flebotomíneos. O objetivo deste trabalho foi detectar a presença de Leishmania spp. em R. sanguineus coletados em cães naturalmente infectados no Distrito Federal. O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Faculdade de Medicina da Universidade de Brasília. Os carrapatos foram obtidos de uma amostra de conveniência composta por 48 cães entregues por seus donos à Diretoria de Vigilância Ambiental da Secretaria de Saúde do Distrito Federal com diagnóstico suspeito ou confirmado de LVC, por meio de testes sorológicos, ou cães recolhidos por ocasião da realização do inquérito rotineiro do programa de controle de LVC no DF. Foi coletado sangue venoso dos 48 cães para avaliação sorológica da infecção por Leishmania spp por meio das técnicas imunoenzimática e imunofluorescência indireta, ambas com antígeno bruto de L. major; do teste imunocromatográfico rápido de duplo percurso com antígeno recombinante K28 e aplicação da técnica de PCR para amplificação de alvos de DNA gênero-específicos. Após a identificação dos espécimes de R. sanguineus, os carrapatos foram armazenados em pools de até 10 espécimes, separando-os em grupos de machos, fêmeas e ninfas. Os carrapatos foram dissecados para retirar o intestino e glândulas salivares para extração de DNA e posterior amplificação da região conservada de 120pb de kDNA e 234pb do gene hsp70 de Leishmania spp. por meio da PCR e para cultura em meio NNN modificado. Os produtos amplificados de kDNA foram ainda submetidos à digestão com as endonucleases Hae III e BstUI e ao sequenciamento genético para identificação das espécie do parasito. Foram realizados esfregaços em lâminas coradas com Giemsa para observação direta de formas de Leishmania spp. A positividade das técnicas sorológicas aplicadas ao sangue canino foi de 66,6% pelo ELISA, destes, 81,2% pela RIFI e 56,2% do total pelo DPP, e ainda, 70,8% dos cães apresentaram pelo menos um dos três testes com resultados reagentes ou positivos. Foram coletados 130 espécimes de R. sanguineus dos 27 cães que se apresentaram ectoparasitados. Houve sucesso no isolamento em cultura de Leishmania spp. de cinco pools de glândulas salivares e intestinos de carrapatos coletados em quatro cães. O sequenciamento do kDNA amplificado pela PCR a partir destas amostras demonstrou homologia com sequências de Leishmania spp. Os produtos amplificados de kDNA a partir de amostra sanguínea de um dos cães apresentou homologia com sequência de L. braziliensis, no entanto, a homologia do material amplificado a partir dos carrapatos coletados desse cão foi com uma sequência de L. infantum. A cultura analisada por eletroforese de isoenzimas foi identificada como L. infantum. A infecção por Leishmania nos cães, dos quais foram coletados os pools de carrapatos positivos na cultura, foi confirmada pela PCR. A lâmina do pool de machos de um dos cães foi a única a apresentar formas flageladas de tripanossomatídeos, cuja identificação não foi possível pela morfometria. Os resultados obtidos indicam que R. sanguineus que se alimentam naturalmente em cães naturalmente infectados por L. infantum apresentam DNA do parasito no intestino e glândulas salivares, confirmam a presença de L. infantum viável nestes ectoparasitos,e a possibilidade de isolar L. infantum em meio de cultura. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / In Brazil, canine visceral leishmaniasis (CVL) is caused by the parasite Leishmania chagasi (syn. L. infantum). It is considered that the principal route of transmission of the VL is through the bite of infected sand flies. However, alternative methods have been investigated and bites or ingestion of infected ticks could have epidemiological relevance. The presence of L. chagasi in Rhipicephalus sanguineus could explain the transmission of the parasite in the canine population in areas where there are low frequency of sand flies. The objective of this study was to detect the presence of Leishmania spp. in R. sanguineus collected from dogs naturally infected in the District Federal. The project was approved by the Ethics Committee on Animal Use of the UNB Faculty of Medicine. Ticks were obtained from a convenience sample consisting of 48 dogs delivered by their owners to the Environmental Surveillance Directory of Health Department of the District Federal with suspected or confirmed diagnosis of CVL, through tests, or dogs collected during the day routine investigation of the control program LVC in DF. Venous blood was collected from 48 dogs for serologic evaluation of infection by Leishmania spp. by means of ELISA and indirect immunofluorescence techniques, both with crude antigen of L. major, the immunochromatographic dual path assays with recombinant K28 and amplification of genus specific DNA targets by PCR. After identification of specimens of R. sanguineus ticks were stored in pools of up to 10 specimens, separating them into groups of males, females and nymphs. Ticks were dissected to remove the gut and salivary glands for DNA extraction and subsequent amplification of 120pb of the conserved region of kDNA and 234pb of the hsp70 gene of Leishmania spp. by PCR. Ticks sample were also cultured in modified NNN culture medium. The amplified products of kDNA were further subjected to digestion with restriction endonucleases Hae III and BstUI and gene sequencing to identify the parasite species. Smears were prepared on slides stained with Giemsa for observation of Leishmania spp. forms. The positivity of serological techniques applied to canine blood was 66.6% by ELISA. Among positive samples, 81.2% were also positive by IFA and 56.2% by DPP, then, 70.8% of dogs had at least one of the three tests with positive results. We collected 130 specimens of R. sanguineus of the 27 dogs that had ectoparasites. Isolation of Leishmania spp. was successfull in five pools of salivary glands and intestines of ticks collected from four dogs. Sequencing kDNA amplified by PCR from these samples revealed homology with sequences of Leishmania spp. The amplified products of kDNA in a blood sample from one of the dogs showed sequence homology to L. braziliensis, however, the amplified material from ticks collected from this dog had homology with L. infantum sequence. The isolate analyzed by mulilocus enzyme electrophoresis was identified as L. infantum. The Leishmania infection in dogs where we collected the pools of ticks which had successful parasite isolation in culture was confirmed by PCR. The smear of the pool of male ticks collected from one dog was the only positive for flagellated trypanosomatidae whose identification was not possible by morphometry. Our results indicate that R. sanguineus feeding naturally in dogs naturally infected by L. infantum had parasite DNA present in the intestine and salivary glands, confirm the presence of viable L. infantum in these ectoparasites, and the possibility of isolation of L. infantum in culture medium.

Sabe-se que o refluxo crônico pode induzir lesão mucosa, estimular a proliferação de células e promover tumorigênese no esôfago distal. Ainda não é sabido por que apenas uma parcela dos pacientes com refluxo esofágico progrediram para uma metaplasia intestinal (Esôfago de Barrett) e adenocarcinoma. O estresse oxidativo parece exercer um papel importante nessa progressão . Assim sendo, examinamos o padrão de expressão da enzima Heme Oxigenase-1 (HO-1), enzima indutora do estresse oxidativo, em peças de esôfago obtidos de um estudo experimental com ratos que avaliou o papel do refluxo gástrico e duodenoesofágico na carcinogênese esofágica. Métodos: Uma amostra de três (3) peças de esôfago de cada grupo de ratos submetidos a tratamentos diferentes tiveram a expressão da enzima Heme Oxigenase-1 avaliada através de imunohistoquímica. Os ratos foram divididos nos seguintes grupos: (1) cardioplastia para induzir refluxo predominantemente gástrico, (2) anastomose esofagoduodenal para induzir refluxo duodenal, (3) sem tratamento, (4) cardioplastia+dietilnitrosamina (DEN), (5) anastomose esofagoduodenal +DEN, (6) DEN. Resultados: Não houve desenvolvimento de câncer ou metaplasia intestinal nos animais que não foram expostos ao refluxo de conteúdo duodenal. A expressão de HO-1 foi observada apenas em ratos submetidos à anastomose esofagoduodenal (Grupos 2 e 5) e a análise da média de intensidade de fluorescência demonstrou uma diferença significante de expressão de HO-1 (4,8 e 4,6 vezes respectivamente) comparando-se ao controle (Grupo 3) (p<0,05). O alvo principal para expressão da HO-1 foram as células inflamatórias dentro do tumor ou em áreas subepiteleiais. Os ratos expostos ao refluxo gástrico não desenvolveram tumores ou expressaram a HO-1. Conclusões: A esofagite de refluxo induzida por refluxo esofágico com conteúdo duodenal provocou estresse oxidativo considerável e pode desempenhar um papel importante na carcinogênese esofágica. O refluxo gástrico não foi suficiente para induzir estresse oxidativo neste modelo experimental.

Piscicultura de água doce consiste na maior produção da aquicultura mundial e o cultivo de peixes tem crescido, devido a investimento, desenvolvimento de tecnologias e à contínua expansão de espécies cultivadas. Esse aumento gerou novas possibilidades de transmissão de vírus aquáticos, fatores limitantes à produção da aquicultura. Dentre as centenas de vírus conhecidos de peixes, um dos principais, que atualmente é de preocupação internacional, é o vírus da Viremia Primaveril da Carpa (SVCV), devido a sua importância socioeconômica considerando os países afetados e o comércio internacional de animais aquáticos e seus derivados, com base na saúde e medidas preventivas. SVC é uma doença aguda causada por um rhabdovírus do gênero Vesiculovirus, que é um vírus de ácido ribonucleico (RNA) fita simples linear de aproximadamente 11 quilobases (kb) com polaridade negativa e envelopado. Diversos ensaios diagnósticos podem ser utilizados para detectar SVCV, porém, consomem tempo e não são adaptados para diagnóstico a campo. A prevenção da disseminação do vírus é crucial; portanto, maior entendimento do vírus e de sua transmissão é necessário. No presente estudo, a padronização de uma RT-nestedPCR foi realizada, cujo limite de detecção foi de 8,62 × 10-2 cópias/reação, observado após o spiking de tecidos de peixes com diluições seriadas de um controle positivo sintético. O ensaio foi aplicado a 150 amostras teciduais provenientes de 146 peixes distintos. As amostras consistiam de fragmentos de fígado, rim e baço e foram submetidas à transcrição reversa (RT), seguida pela reação em cadeia de polimerase (PCR), em configuração nested. Duas (2) amostras foram positivas para o gene G de SVCV pela RT-nestedPCR e a identidade dos produtos obtidos foi confirmada por sequenciamento direto utilizando-se o método de Sanger. Na reconstrução filogenética, as sequências obtidas formaram clado único, separado dos demais genogrupos e mesmo de sequências derivadas de outros vesiculovírus encontrados no Brasil. Esses resultados determinam a primeira detecção e caracterização moleculares de SVCV no Brasil por RT-nestedPCR e sequenciamento nucleotídico, indicando a necessidade de adoção de medidas de biosseguridade mais restritivas na produção pesqueira nacional. / Fresh-water fish farming forms the largest portion of the world aquaculture production, and the harvest of these warm-water fish is increasing, due to investment, improvement of technologies and continued expansion of cultivated species. This increase has rendered new possibilities for the transmission of aquatic viruses, which remain limiting factors for aquaculture production. Among the hundreds of known viruses of fish, one of the main viruses that are currently of international concern is the Spring Viremia of Carp virus (SVCV) due to its socio-economic importance regarding affected countries and international trade of aquatic animals and their products, on the basis of health control and preventive measures. SVC is an acute disease, caused by a rhabdovirus, belonging to the Vesiculovirus genus, and is an enveloped virus, with a linear single-strained negative-sense ribonucleic acid (RNA) of approximately 11 kilobases (kb). Several diagnostic assays are available for the detection of SVCV, but they are time-consuming and not well adapted for field diagnosis. Prevention of spreading of the virus is crucial; therefore, more understanding of the virus and its transmission is required. In this study, standardization of a RT-nestedPCR was performed, and its detection limit was of 8.62 × 10-2 copies/reaction, observed after spiking fish tissue with serial dilutions of a synthetic positive control. The assay was applied to 150 tissue samples from 146 different fish. Samples consisted of liver, kidney and spleen fragments, and underwent reverse transcription (RT) followed by the polymerase chain reaction (PCR) of a nested configuration. Two (2) tissue samples were found positive for the G gene of SVCV by RT-nestedPCR and the identity of products was confirmed by direct sequencing using the Sanger method. By phylogenetic reconstruction, the obtained sequences formed a unique clade, separating them from the other known genogroups, and even from sequences derived from other vesiculoviruses found in Brazil. These results represent the first molecular detection and characterization of SVCV in Brazil by RT-nestedPCR and nucleotide sequencing, indicating the need to adopt more stringent biosecurity measures in national fish farming production.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-11T14:40:30Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2597471 bytes, checksum: d356a04cdee8348ea7e9d4ca548e8b79 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-11T14:40:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2597471 bytes, checksum: d356a04cdee8348ea7e9d4ca548e8b79 (MD5) Previous issue date: 2015-02-26 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A associação de Aphelenchoides besseyi a sementes de gramíneas forrageiras tem implicações quarentenárias que limitam a sua comercialização para muitos dos países importadores das sementes brasileiras. Como várias outras espécies de Aphelenchoides sem importância econômica são relatadas em associação a sementes de forrageiras, é imprescindível a identificação precisa de A. besseyi. Deste modo, realizaram-se as caracterizações morfológica, morfométrica e molecular de populações de A. besseyi associadas a sementes de forrageiras cultivadas no Brasil, comparando-as com populações de A. besseyi provenientes da Costa Rica, Espanha e Japão. Primers e sondas específicos foram desenhados, a partir da região LSU rDNA, e testados usando PCR em tempo real. A caracterização das regiões SSU, LSU e COI comprovaram a ocorrência de uma espécie geneticamente distante de A. besseyi associada às sementes de forrageiras no Brasil. De acordo com as análises filogenéticas das regiões SSU e COI, esta outra espécie, trata-se de A. fujianensis. Foi possível desenvolver e usar os ensaios diagnósticos para a detecção de A. besseyi e A. fujianensis. Com o uso dos primers/sonda específicos foi possível detectar o DNA alvo extraído a partir de um único nematoide. Ainda, foram identificadas duas sequências distintas na região LSU em uma população de A. besseyi, constituindo o primeiro relato da ocorrência de variabilidade intraindividual na região LSU do rDNA nesta espécie. Em adição, a alta identidade de uma destas sequências à A. fujianensis reforçou a proximidade filogenética destas espécies e a necessidade de uma extensiva investigação para se estimar a frequência deste fenômeno. / The association Aphelenchoides besseyi gramineous forage seed has quarantine implications that limit their marketing for many of the importing countries of these seeds. As many other Aphelenchoides species with no economic importance are reported in association with forage seeds, it is essential an accurate identification of A. besseyi. Thus, morphological, morphometric and molecular characterizations was undertaken using A. besseyi populations associated with gramineous forage seeds grown in Brazil, comparing to populations of A. besseyi from Costa Rica, Spain and Japan. Specific primers and probes were designed from LSU rRNA gene, and tested using real time PCR assays. The characterization of SSU, LSU, and COI proved the occurrence of a species genetically distinct from A. besseyi associated with gramineous forage seeds in Brazil. According to the phylogenetic analyzes of SSU and COI regions, this species is A. fujianensis. It was possible to develop diagnostic assays and use them to detect A. besseyi and A. fujianensis. The primers and probes were able to detect the DNA target extracted from a single nematode. Furthermore, two different sequences were identified in the LSU gene in one of A. besseyi populations studied, constituting the first report of intra-individual variation in LSU rDNA for this species. In addition, the high identity of one of these sequences with A. fujianensis reinforced the phylogenetic proximity of these species and the need for extensive research to estimate the frequency of this phenomenon.

Orientador: Aureo Evangelista Santana / Resumo: A hemoplasmose dos suínos, causada pelo Mycoplasma suis, caracteriza-se como doença geograficamente cosmopolita, atinge animais de diversas faixas etárias, frequentemente associada à anemia hemolítica moderada a grave e predispõe os animais a imunossupressão, infertilidade, diminuição do ganho de peso, aumento de natimortos, abortos e retorno ao cio, ou seja, impacta diretamente as granjas de suínos e leva a imensuráveis perdas econômicas. Do ponto de vista epidemiológico, animais assintomáticos são considerados como foco da hemoplasmose por serem portadores e apresentarem melhora clínica sem a eliminação do parasita e alguns autores reportam a micoplasmose hemotrófica como uma enfermidade de potencial zoonótico. A prevalência nos rebanhos brasileiros é discutível, especialmente por que o diagnóstico tradicional pela observação do M. suis no esfregaço sanguíneo tem baixa sensibilidade. Objetivou-se com o presente trabalho caracterizar a taxa de prevalência e correlacionar a quantidade do Mycoplasma suis quantificado por qPCR com alterações nos parâmetros hematológicos em suínos em diferentes fases de criação de granjas tecnificadas de ciclo completo do Estado de São Paulo. Foram avaliadas 20 diferentes granjas suinícolas de ciclo completa situadas em território paulista, foram coletadas 501 amostras de sangue total em EDTA-K2 para análise molecular de qPCR para Mycoplasma suis e realização de hemograma e pesquisa de hemoparasitas em esfregaço sanguíneo. No primeiro capítulo r... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Porcine hemoplasmosis caused by Mycoplasma suis, is characterized as a geographically cosmopolitan disease. It affects animals of various age groups, often associated with moderate to severe hemolytic anemia and predisposes the animals to immunosuppression, infertility, decreased weight gain, increased stillbirths, miscarriages and return to heat, that is, directly impacts pig farms and leads to immeasurable economic losses. From an epidemiological point of view, asymptomatic animals are considered as the focus of hemoplasmosis because they are carriers and present clinical improvement without the elimination of the parasite and some authors report hemotrophic mycoplasmosis as a zoonotic potential disease. The prevalence in Brazilian herds is debatable, especially since the traditional diagnosis by observing M suis in the blood smear has low sensitivity. The objective of this study was to characterize the prevalence rate and correlate the quantity of Mycoplasma suis quantified by qPCR with changes in hematological parameters in pigs in different phases of rearing of full-cycle farms in the State of São Paulo. Twenty different complete cycle swine farms located in the state of São Paulo were evaluated, 501 whole blood samples were collected in EDTA-K2 for molecular analysis of qPCR for Mycoplasma suis and blood count and blood smear hemoparasites. In the first chapter there was a literature review on Mycoplasma suis, the pathobiology of the agent as well as clinical signs in a... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

[ES] Las distrofias hereditarias de la retina (DHR) son un conjunto de trastornos caracterizados por la muerte, generalmente, progresiva de fotorreceptores y células del epitelio pigmentario retiniano. Las DHR afectan a más de 2 millones de personas en el mundo, produciendo una pérdida parcial y, en muchos casos, total de la visión, para la cual no existe ningún tratamiento que revierta o frene la progresión de la enfermedad. Se caracterizan por una elevada heterogeneidad clínica y genética, identificándose hasta la fecha mutaciones en más de 250 genes responsable de algún tipo de DHR. Esta tesis doctoral se ha centrado en el diagnóstico genético de 208 pacientes afectados de DHR no sindrómica (DHR-NS), mediante secuenciación masiva dirigida a un panel de 117 genes y cinco regiones intrónicas profundas en las que previamente se habían descrito mutaciones. Las variantes identificadas en los pacientes se priorizaron de acuerdo a la mínima frecuencia alélica y se clasificaron según los criterios de la guía del American College of Medical Genetics and Genomics. Las variantes de número de copias identificadas mediante la secuenciación del panel se validaron utilizando multiplex ligation-dependent probe amplification o array genómico. A todos los pacientes se les realizó un estudio oftalmológico, más o menos exhaustivo, incluyendo pruebas electrofisiológicas. Además, se realizaron ensayos in vitro con minigenes para comprobar la repercusión de ciertas variantes sobre el procesamiento del ARNm. Para ello, se empleó el plásmido pSPL3 en el que se introdujo la mutación a estudio, la transformación se realizó en bacterias E. coli electrocompetentes y la transfección en células HEK-293. Mediante la secuenciación del panel de genes, se obtuvo una tasa diagnóstica del 60%. Las mutaciones en los pacientes resueltos se distribuyeron en 30 genes diferentes, de las cuales 38 se describen por primera vez en este trabajo. Los genes mutados con mayor frecuencia en estos pacientes fueron ABCA4, USH2A, RPGR y PRPH2. Adicionalmente, se identificaron ocho variantes de número de copias en los genes EYS, ABCA4, PRPF31, MERTK, CRB1 y ROM1, demostrando el enorme potencial de estas tecnologías. En total, se reclasificaron el 10% de las familias estudiadas y se observó variabilidad fenotípica intra e inter familiar en pacientes con mutaciones en C1QTNF5, CERKL y PROM1. Además, destacamos que el 50% de las mujeres heterocigotas para RPGR y sintomáticas presentaron retinosis pigmentaria (RP) con asimetría interocular. Asimismo, se identificó un caso con posible digenismo entre los genes CNGA1 y CNGB1, y la duplicación completa de ROM1 en dos familias no relacionadas diagnosticadas de RP. Por otra parte, se han identificado seis familias con mutaciones en dos genes que potencialmente ambos podrían ser la causa de la DHR. En el ensayo funcional mediante minigenes, se observó que seis de las variantes analizadas presentaron un splicing aberrante. Los resultados de esta tesis destacan la utilidad clínica de la secuenciación masiva dirigida para las DHR-NS y la importancia de un examen oftalmológico completo que nos permita establecer nuevas asociaciones genotipo-fenotipo y ampliar el conocimiento de este grupo de enfermedades. Identificar la causa de la enfermedad es esencial para mejorar el manejo del paciente, realizar un asesoramiento genético preciso y beneficiarse de los futuros tratamientos y ensayosclínicos basados en terapia génica. / [CA] Les distròfies hereditàries de la retina (DHR) són un conjunt de trastorns caracteritzats per la mort, generalment, progressiva de fotoreceptors i cèl¿lules de l'epiteli pigmentari retiniano. Les DHR afecten més de 2 milions de persones al món, produint una pèrdua parcial i, en molts casos, total de la visió, per la qual no hi ha cap tractament que revertisca o frene la progressió de la malaltia. Es caracteritzen per una elevada heterogeneïtat clínica i genètica, identificant-se fins a la data mutacions en més de 250 gens responsable d'algun tipus de DHR. Esta tesi doctoral s'ha centrat en el diagnòstic genètic de 208 pacients afectats de DHR no sindròmica (DHR-NS), per mitjà de seqüenciació massiva dirigida a un panell de 117 gens i cinc regions intròniques profundes en les que prèviament s'havien descrit mutacions. Les variants identificades en els pacients es van prioritzar d'acord a la mínima freqüència allèlica i es van classificar segons els criteris de la guia de l'American College of Medical Genetics and Genomics. Les variants de nombre de còpies identificades per mitjà de la seqüenciació del panell es van validar utilitzant multiplex ligation-dependent probe amplification o array genòmic. A tots els pacients se'ls va realitzar un estudi oftalmològic, més o menys exhaustiu, incloent proves electrofisiològiques. A més, es van realitzar assajos in vitro amb minigens per comprovar la repercussió de certes variants sobre el processament de l'ARNm. Per a això, es va emprar el plasmidi pSPL3 en què es va introduir la mutació a estudi, la transformació es va realitzar en bacteris E. coli electrocompetentes i la transfecció en cèl-lules HEK-293. Per mitjà de la seqüenciació del panell de gens, es va obtindre una taxa diagnòstica del 60%. Les mutacions en els pacients resolts es van distribuir en 30 gens diferents, de les quals 38 es descriuen per primera vegada en este treball. Els gens mutats amb major freqüència en estos pacients van ser ABCA4, USH2A, RPGR i PRPH2. Addicionalment, es van identificar huit variants de nombre de còpies en els gens EYS, ABCA4, PRPF31, MERTK, CRB1 i ROM1, demostrant l'enorme potencial d'estes tecnologies. En total, es van reclassificar el 10% de les famílies estudiades i es va observar variabilitat fenotípica intra i inter familiar en pacients amb mutacions en C1QTNF5, CERKL i PROM1. A més, destaquem que el 50% de les dones heterozigotes per RPGR i simptomàtiques van presentar retinosi pigmentària (RP) amb asimetria interocular. Així mateix, es va identificar un cas amb possible digenismo entre els gens CNGA1 i CNGB1, i la duplicació completa de ROM1 en dues famílies no relacionades diagnosticades de RP. D'altra banda, s'han identificat sis famílies amb mutacions en dos gens que potencialment ambdós podrien ser la causa de la DHR. En l'assaig funcional per mitjà de minigens, es va observar que sis de les variants analitzades van presentar un splicing aberrant. Els resultats d'esta tesi destaquen la utilitat clínica de la seqüenciació massiva dirigida per a les DHR-NS i la importància d'un examen oftalmològic complet que ens permeta establir noves associacions genotip-fenotip i ampliar el coneixement d'este grup de malalties. Identificar la causa de la malaltia és essencial per millorar el maneig del pacient, realitzar un assessorament genètic precís i beneficiar-se dels tractaments basats en teràpia gènica. / [EN] Inherited retinal dystrophies (IRD) are a group of disorders generally characterized by the progressive death of photoreceptors and retinal pigment epithelial cells. IRD affect more than 2 million people in the world, producing a partial and, in many cases, total loss of vision, for which there is no treatment that reverses or slows the progression of the disease. They are characterized by a high clinical and genetic heterogeneity, identifying mutations in more than 250 genes responsible for some type of IRD to date. This doctoral thesis has focused on the genetic diagnosis of 208 patients affected by non-syndromic IRD (NS-IRD), through targeted genomic sequencing focuses on a panel of 117 genes and five deep intronic regions in which mutations have previously been identified. The identified variants in patients are prioritized according to the minimum allelic frequency and are classified according to the criteria of the American College of Medical Genetics and Genomics guide. The copy number variants identified by panel sequencing were validated using multiplex ligation-dependent probe amplification or genomic array. All patients underwent an ophthalmological study, more or less comprehensive, including electrophysiological tests. In addition, in vitro assays with minigenes were performed to verify the impact of certain variants on mRNA processing. To do this, pSPL3 plasmid in which the mutation was introduced was used, the transformation was performed in electrocompetent E. coli bacteria and transfection in HEK-293 cells. By the panel sequencing, a diagnostic rate of 60% was obtained. The mutations in the resolved patients were distributed in 30 different genes, of which 38 were described for the first time in this work. The most frequently mutated genes in these patients were ABCA4, USH2A, RPGR and PRPH2. In addition, eight copy number variants were identified in the genes EYS, ABCA4, PRPF31, MERTK, CRB1 and ROM1, that demonstrated the enormous potential of these technologies. In total, 10% of the families studied were reclassified and intra and inter-family phenotypic variability was detected in patients with mutations in C1QTNF5, CERKL and PROM1. In addition, we highlight that 50% of the symptomatic and heterozygous RPGR women showed retinitis pigmentosa (RP) with interocular asymmetry. Likewise, we identified a case with possible digenism between the CNGA1 and CNGB1 genes, and the complete duplication of ROM1 in two unrelated families diagnosed with RP. On the other hand, six families have been identified with mutations in two genes that could potentially be the cause of IRD. Functional assays by minigenes showed that six of the studied variants affected splicing. The results of this thesis highlight the clinical utility of targeted genomic sequencing in IRD and the importance of a complete ophthalmological examination that allows us to establish new genotype-phenotype associations and expand the knowledge of this group of diseases. Identifying the cause of the disease is essential to improve patient management, to perform an accurate genetic counseling and to take advantage of treatments based on gene therapy. / Rodríguez Muñoz, A. (2020). High-throughput strategies for molecular diagnosis of nonsyndromic inherited retinal dystrophies [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/139095