[ES] La tesis doctoral titulada «Nanomotores Janus platino-sílice mesoporosa como plataforma para la entrega de fármacos en aplicaciones biomédicas» se centra en el desarrollo de una nanopartícula multifuncional autopropulsada (nanomotor). El nanomotor se basa en una nanopartícula Janus integrada por una nanopartícula de platino (Pt) y una nanopartícula mesoporosa de sílice (MSN) y es capaz de propulsarse y liberar fármacos de forma controlada. La cara de Pt es responsable del movimiento mediante la catálisis de H2O2 en O2, mientras que, la cara de MSN es responsable de la entrega de la carga ante el reconocimiento de estímulos específicos. El objetivo del trabajo es emplear la fuerza motriz de los nanomotores para difundir a través de barreras biológicas (BB), favoreciendo la entrega de fármacos en localizaciones diana de difícil acceso. En concreto, la zona interna de las biopelículas bacterianas y los tumores sólidos, que en ambos casos está protegida por una matriz extracelular (ECM) prácticamente impenetrable. El nanomotor Janus Pt-MSN se sintetiza de forma toposelectiva mediante la técnica de emulsión de Pickering. En primer lugar, se carga con una molécula modelo y se funcionaliza con una puerta molecular sensible a estímulos redox, unida a la superficie de la cara de MSN mediante enlaces disulfuro. Los resultados confirman la estructura del nanomotor (tipo «muñeco de nieve») y su doble funcionalidad: difusión incrementada en respuesta a H2O2 y salida selectiva de la carga en respuesta a una especie redox (glutatión). En segundo lugar, el nanomotor se carga con el antiséptico clorhexidina y sus poros se bloquean con una nanoválvula sensible al pH, formada por un complejo de inclusión establecido entre grupos benzimidazol y ¿-ciclodextrinas unidas a la proteasa ficina. La puerta molecular es capaz de hidrolizar los componentes de la ECM e inducir la liberación de la carga a pH ácido, rasgo característico de la zona interna de las biopelículas. Los experimentos realizados prueban que la triple funcionalidad sinérgica del nanomotor resulta en la eliminación de los microorganismos de las biopelículas endodónticas. A continuación, se propone un nanomotor propulsado por glucosa, ya que existe una urgente necesidad de emplear combustibles biocompatibles y biodisponibles para evitar efectos nocivos en los pacientes. Para ello, se une la enzima glucosa oxidasa a la cara mesoporosa del nanomotor mediante enlaces amida. La enzima desempeña una doble función. Por una parte, constituye el primer elemento de la cascada que induce el movimiento, al catalizar la transformación enzimática de glucosa en H2O2. Finalmente, el H2O2 es descompuesto por la cara de Pt propulsando al nanomotor. Por otra parte, actúa como puerta molecular sensible a proteasas, induciendo la liberación del fármaco doxorrubicina en los lisosomas. Los resultados obtenidos evidencian la habilidad del nanomotor para eliminar las células cancerosas de los tumores sólidos. Las conclusiones de esta tesis doctoral se resumen en que se ha logrado materializar un nanomotor muy versátil con 2 ventajas prominentes: (i) amplia área catalítica capaz de inducir una difusión incrementada y (ii) amplia área susceptible de ser funcionalizada con puertas moleculares. Además, se ha demostrado la capacidad de los nanomotores para atravesar BB, logrando un efecto terapéutico en infecciones endodónticas y cáncer. También se ha probado que el efecto es mayor que el causado por los componentes de los nanomotores independientemente y por nanopartículas control privadas de alguno de sus elementos. Esperamos que estos datos contribuyan al desarrollo de nuevas estrategias o a la mejora de las ya existentes para solventar el reto de la entrega de agentes terapéuticos en áreas enfermas inaccesibles, un problema clínico sin solución en la actualidad. / [CA] La tesi doctoral titulada «Nanomotors Janus platí-sílice mesoporosa com a plataforma per a l'alliberament de fàrmacs en aplicacions biomèdiques» se centra en el desenvolupament d'una nanopartícula multifuncional autopropulsada (nanomotor). El nanomotor es basa en una nanopartícula Janus integrada per una nanopartícula de platí (Pt) i una nanopartícula mesoporosa de sílice (MSN) i és capaç de propulsar-se i alliberar fàrmacs de manera controlada. La cara de Pt és responsable del moviment mitjançant la catàlisi de H2O2 a O2, mentre que la cara de MSN és responsable de l'alliberament de la càrrega davant el reconeixement d'estímuls específics. L'objectiu del treball és fer servir la força motriu dels nanomotors per difondre a través de barreres biològiques (BB), afavorint l'alliberament de fàrmacs en localitzacions diana de difícil accés. En concret, la zona interna de les biopel·lícules bacterianes i els tumors sòlids, que en tots dos casos està protegida per una matriu extracel·lular (ECM) pràcticament impenetrable. El nanomotor Janus Pt-MSN se sintetitza de forma toposelectiva mitjançant la tècnica d'emulsió de Pickering. En primer lloc, es carrega amb una molècula model i es funcionalitza amb una porta molecular sensible a estímuls redox, unida a la superfície de la cara de MSN mitjançant enllaços disulfurs. Els resultats confirmen l'estructura del nanomotor (tipus ninot de neu) i la seva doble funcionalitat: difusió incrementada en resposta a H2O2 i sortida selectiva de la càrrega en resposta a una espècie redox (glutatió). En segon lloc, el nanomotor es carrega amb clorhexidina i els seus porus es bloquegen amb una nanovàlvula sensible al pH, formada per un complex d'inclusió establert entre grups benzimidazol i beta ciclodextrines unides a la proteasa ficina. La porta molecular és capaç d'hidrolitzar els components de l'ECM i induir l'alliberament de la càrrega a pH àcid, un tret característic de la zona interna de les biopel·lícules. Els experiments realitzats proven que la triple funcionalitat sinèrgica del nanomotor resulta en l'eliminació dels microorganismes de les biopel·lícules endodòntiques. A continuació, es proposa un nanomotor propulsat per glucosa, ja que hi ha una necessitat urgent d'emprar combustibles biocompatibles i biodisponibles, per a evitar efectes nocius als pacients. Per fer-ho, s'uneix l'enzim glucosa oxidasa a la cara mesoporosa del nanomotor mitjançant enllaços amida. L'enzim exerceix una doble funció. D'una banda, constitueix el primer element de la cascada que indueix el moviment, en catalitzar la transformació enzimàtica de glucosa a H2O2. Finalment, l'H2O2 és descompost per la cara de Pt propulsant el nanomotor. D'altra banda, actua com a porta molecular sensible a proteases, induint l'alliberament del fàrmac doxorrubicina als lisosomes. Els resultats obtinguts evidencien l'habilitat del nanomotor per eliminar les cèl·lules canceroses dels tumors sòlids. Les conclusions d"aquesta tesi doctoral es resumen en que s"ha aconseguit materialitzar un nanomotor molt versàtil amb 2 avantatges prominents: (i) àmplia àrea catalítica capaç d"induir una difusió incrementada i (ii) àmplia àrea susceptible de ser funcionalitzada amb portes moleculars. A més, s'ha demostrat la capacitat dels nanomotors per travessar BB, aconseguint un efecte terapèutic en infeccions endodòntiques i càncer. També s'ha provat que l'efecte és més gran que el causat pels components dels nanomotors independentment i per nanopartícules control privades d'algun dels elements. Esperem que aquestes dades contribueixin al desenvolupament de noves estratègies o a la millora de les ja existents per resoldre el repte de l'alliberament d'agents terapèutics en àrees malaltes inaccessibles, un problema clínic sense solució actualment. / [EN] The PhD thesis entitled "Platinum-mesoporous silica Janus nanomotors as a platform for drug delivery in biomedical applications" focuses on the development of a multifunctional self-propelled nanoparticle (nanomotor). The nanomotor is based on a Janus nanoparticle composed of a platinum nanoparticle (Pt) and a mesoporous silica nanoparticle (MSN) and can propel itself and release drugs in a controlled manner. The Pt face is responsible for the movement by catalyzing H2O2 into O2, whereas the MSN face is responsible for the delivery of cargo upon recognition of specific stimuli. The objective is to employ the driving force of nanomotors to diffuse through biological barriers (BB), favoring drug delivery to hard-to-reach target sites, such as the inner zone of bacterial biofilms and solid tumors, which in both cases is protected by an extracellular matrix (ECM). The Janus Pt-MSN nanomotor is synthesized toposelectively using the Pickering emulsion technique. It is first loaded with a model molecule and functionalized with a redox-stimuli-sensitive molecular gate, attached to the MSN face surface via disulfide bonds. The results confirm the structure of the nanomotor ("snowman" type) and its dual functionality: increased diffusion in response to H2O2 and selective cargo delivery in response to glutathione. Second, the nanomotor is loaded with chlorhexidine and its pores are blocked by a pH-sensitive nanovalve formed by an inclusion complex established between benzimidazole and ¿-cyclodextrins bound to ficin protease. The molecular gate is able to hydrolyze ECM components and induce cargo release at acidic pH, a characteristic feature of the inner zone of biofilms. The experiments performed prove that the triple synergistic functionality of the nanomotor results in the elimination of microorganisms from endodontic biofilms. Next, a glucose-powered nanomotor is proposed, as there is an urgent need to employ biocompatible and bioavailable fuels. For this purpose, the enzyme glucose oxidase is attached to the mesoporous face of the nanomotor via amide bonds. The enzyme plays a dual role. On the one hand, it constitutes the first element of the movement-inducing cascade by catalyzing the enzymatic transformation of glucose into H2O2. Finally, H2O2 is decomposed by the Pt face propelling the nanomotor. Moreover, it acts as a protease-sensitive molecular gate, inducing the release of the drug doxorubicin into lysosomes. The results obtained evidence the ability of the nanomotor to kill cancer cells in solid tumors. The conclusions of this doctoral thesis are that a very versatile nanomotor has been materialized with 2 prominent advantages: (i) large catalytic area capable of inducing increased diffusion and (ii) large area susceptible to be functionalized with molecular gates. In addition, the ability of nanomotors to pass through BB has been demonstrated, achieving a therapeutic effect on endodontic infections and cancer. It has also been proven that the effect is greater than that caused by the components of the nanomotors independently and by control nanoparticles deprived of some of their elements. We hope that these data will contribute to the development of new strategies or the improvement of existing ones to solve the challenge of delivering therapeutic agents to inaccessible diseased areas, a clinical problem with no solution at present. / Escudero Noguera, A. (2024). Nanomotores Janus de platino y sílice mesoporosa como plataforma para la entrega de fármacos en aplicaciones biomédicas [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/205396

[ES] El envejecimiento poblacional y su progresión, es un hecho que debe ser abordado para el bienestar sanitario y social futuro, especialmente de las personas mayores, y por extensión, de toda la sociedad. En este sentido, la fragilidad, entendida como el declive progresivo en los sistemas fisiológicos relacionados con la edad, juega un papel clave. El estudio de la fragilidad mediante el Índice Frágil-VIG, permite abordar a los pacientes en la práctica clínica de una manera multidimensional, estableciendo un diagnóstico situacional. La presente tesis se compone de dos partes diferenciadas. Se realiza un análisis no paramétrico mediante el método Kaplan-Meier de las variables sociodemográficas y clínicas, para determinar los factores pronósticos de fragilidad según el Índice Frágil-VIG, de fragilidad según el Short Physical Performance Battery, de dependencia para las actividades básicas de la vida diaria, y de mortalidad. Posteriormente se procede a realizar análisis multivariantes mediante el modelo de regresión de Cox. Para el desarrollo de los modelos, se sigue la estrategia sugerida por Collett. Previamente, se realiza la validación del Índice Frágil-VIG respecto al Short Physical Performance Battery. Respecto al análisis no paramétrico, fueron factores pronósticos de fragilidad según el Índice Frágil-VIG el estado civil, el nivel de cronicidad y el número de convivientes; factores pronósticos de fragilidad según el Short Physical Performance Battery el nivel de cronicidad y el Índice Frágil-VIG; factores pronósticos de dependencia para las actividades básicas de la vida diaria el estado civil, la fragilidad según el Índice Frágil-VIG y el nivel de cronicidad; y factores pronósticos de mortalidad fueron la dependencia para las actividades básicas de la vida diaria, la fragilidad según el Índice Frágil-VIG, el nivel de estudios, el estado civil, el nivel de cronicidad y el sexo. En el análisis multivariante, las variables incluidas en los modelos de fragilidad según el Índice Frágil-VIG y la dependencia para las actividades básicas de la vida diaria, fueron el estado civil, el nivel de cronicidad y el sexo. En el modelo multivariante de fragilidad según el Short Physical Performance Battery fueron significativas las variables nivel de cronicidad y el número de convivientes. Y finalmente, en el modelo multivariante de mortalidad, resultaron significativas las variables nivel de estudios, el sexo y la fragilidad según el Índice Frágil-VIG. El Índice Frágil-VIG presentó una adecuada validez convergente y discriminativa respecto al Short Physical Performance Battery. Un 20% de las personas difirieron en el diagnóstico de fragilidad entre ambas herramientas, presentando perfiles diferentes. La validación del Índice Frágil-VIG ha fortalecido el uso del mismo para el desarrollo de los modelos. Los grupos de riesgo desarrollados pueden ayudar a establecer estrategias de salud diferenciadas, tanto a nivel individual en la consulta como a nivel poblacional. Con el objetivo de facilitar su implementación en la práctica clínica diaria, se han desarrollado nomogramas que permiten visualizar fácilmente con el objetivo de poder disponer de manera gráfica una herramienta aplicable en la consulta. / [CA] L'envelliment poblacional i la seua progressió, és un fet que ha de ser abordat per al benestar sanitari i social futur, especialment de les persones majors, i per extensió, de tota la societat. En este sentit, la fragilitat, entesa com el declivi progressiu en els sistemes fisiològics relacionats amb l'edat, juga un paper clau. L'estudi de la fragilitat mitjançant l'Índex Fràgil-VIG, permet abordar als pacients en la pràctica clínica d'una manera multidimensional, establint un diagnòstic situacional. La present tesi es compon de dues parts diferenciades. Es realitza una anàlisi no paramètric mitjançant el mètode Kaplan-Meier de les variables sociodemogràfiques i clíniques, per a determinar els factors pronòstics de fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG, de fragilitat segons el Short Physical Performance Battery, de dependència per a les activitats bàsiques de la vida diària, i de mortalitat. Posteriorment es procedix a realitzar anàlisi multivariants mitjançant el model de regressió de Cox. Per al desenvolupament dels models, se seguix l'estratègia suggerida per Collett. Prèviament, es realitza la validació de l'Índex Fràgil-VIG respecte al Short Physical Performance Battery. Respecte a l'anàlisi no paramètric, van ser factors pronòstics de fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG l'estat civil, el nivell de cronicitat i el nombre de convivents; factors pronòstics de fragilitat segons el Short Physical Performance Battery el nivell de cronicitat i la fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG; factors pronòstics de dependència per a les activitats bàsiques de la vida diària l'estat civil, la fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG i el nivell de cronicitat; i factors pronòstics de mortalitat van ser la dependència per a les activitats bàsiques de la vida diària, la fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG, el nivell d'estudis, l'estat civil, el nivell de cronicitat i el sexe. En l'anàlisi multivariant, les variables incloses en els models de fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG i la dependència per a les activitats bàsiques de la vida diària, van ser l'estat civil, el nivell de cronicitat i el sexe. En el model multivariant de fragilitat segons el Short Physical Performance Battery van ser significatives les variables nivell de cronicitat i el nombre de convivents. I finalment, en el model multivariant de mortalitat, van resultar significatives les variables nivell d'estudis, el sexe i la fragilitat segons l'Índex Fràgil-VIG. L'Índex Fràgil-VIG va presentar una adequada validesa convergent i discriminativa respecte al Short Physical Performance Battery. Un 20% de les persones van diferir en el diagnòstic de fragilitat entre totes dues eines, presentant perfils diferents. La validació de l'Índex Fràgil-VIG ha enfortit l'ús del mateix per al desenvolupament dels models. Els grups de risc desenvolupats poden ajudar a establir estratègies de salut diferenciades, tant a nivell individual en la consulta com a nivell poblacional. Amb l'objectiu de facilitar la seua implementació en la pràctica clínica diària, s'han desenvolupat nomogrames que permeten visualitzar fàcilment amb l'objectiu de poder disposar de manera gràfica una eina aplicable en la consulta. / [EN] Population aging and its progression is a fact that must be addressed for the future health and social well-being, especially of the elder people, and by extension, of society as a whole. In this sense, frailty, understood as the progressive decline in physiological systems related to age, plays a remarkable role. The study of frailty using the Frail Index-VIG allows patients to be approached in clinical practice with a multidimensional view, thus establishing a situational diagnosis. This thesis is composed of two different parts. A non-parametric analysis is carried out using the Kaplan-Meier method of the sociodemographic and clinical variables to determine the prognostic factors of frailty according to the Frail-VIG Index, frailty according to the Short Physical Performance Battery, dependency for basic activities of the daily life, and mortality. Subsequently, multivariate analysis were performed using the Cox regression model. For the development of the models, we follow the strategy suggested by Collett. Previously, validation of the Frail-VIG Index is carried out regarding the Short Physical Performance Battery. Regarding the non-parametric analysis, marital status, chronicity level and number of cohabitants, were prognostic factors for frailty according to the Frail-VIG Index; chronicity level and frailty according to the Frail-VIG Index were prognostic factors for frailty according to the Short Physical Performance Battery; prognostic factors for dependency in basic activities of daily living were marital status, frailty according to the Frail-VIG Index and chronicity level; and mortality prognostic factors were dependency for basic activities of daily living, frailty according to the Frail-VIG Index, educational level, marital status, chronicity level and sex. In the multivariate analysis, the variables included in the frailty models using the Frail-VIG Index and dependency for basic activities of daily living were marital status, chronicity level and sex. In the multivariate model of frailty according to the Short Physical Performance Battery, the variables chronicity level and number of cohabitants were significant. And finally, in the multivariate mortality model, the variables level of education, sex and frailty according to the Frail-VIG Index were significant. The Frail Index-VIG presented adequate convergent and discriminative validity compared to the Short Physical Performance Battery. 20% of participants differed in the diagnosis of frailty between both tools, by presenting different profiles. The validation of the Frail-VIG Index has firmed up its use for the development of models. The risk groups might help to establish differentiated health strategies, both at the individual level in the clinical practice and at the population level. In order to facilitate the clinical practice, we developed nomograms that allow an easy visualization of the different risks. / Camacho Torregrosa, S. (2024). Modelización matemática de la fragilidad valorada mediante el Índice Frágil-VIG y el SPPB, de la dependencia para las actividades básicas de la vida diaria y de la mortalidad en población general de 70 años o más. Validación del Índice Frágil-VIG respecto al SPPB [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/205710

[ES] Los ultrasonidos se han empleado desde los años 90 para el tratamiento de múltiples patologías gracias a su carácter no invasivo y no ionizante, desde el tratamiento localizado del cáncer hasta terapias neurológicas. La focalización de estas ondas de presión y la conformación del haz ha sido un problema que desde varias perspectivas se ha intentado abordar, con el uso de lentes focalizadoras, transductores focalizados y los más sofisticados sistemas phased-array compuestos por múltiples transductores con control electrónico de amplitud y fase. Estos sistemas presentan varios inconvenientes, como el escaso control del haz que ofrecen los transductores focalizados, con un foco fijo y sin control de las posibles distorsiones del campo que puede introducir el medio, o el elevado coste derivado de la compleja electrónica de los sistemas phased-arrays, aunque proporcionan un mejor control del foco y compensación de aberraciones. La revolucionaria idea de los hologramas acústicos como elementos pasivos impresos con tecnología 3D llegó como una alternativa de bajo coste a los previos sistemas. En primer lugar se describió su uso en medios homogéneos para generar las más diversas imágenes acústicas, pero pronto se empezó a estudiar su viabilidad para focalizar haces de ultrasonidos en el interior del cerebro, resultando ser muy útiles en la corrección de las aberraciones que el cráneo introduce en el frente de ondas. Las lentes holográficas son capaces de codificar tanto el campo que se desea generar como las distorsiones de fase que puede introducir el medio en el que se propagan los ultrasonidos. En esta tesis se estudia el diseño de hologramas acústicos y su aplicación en el ámbito biomédico. La tesis puede ser dividida en tres grandes partes: una primera en la cual se describen nuevos métodos para el diseño de lentes holográficas, una segunda en la que se emplean los hologramas ultrasónicos para generación de hipertermia, y una tercera en la que se estudia su uso para terapias transcraneales. En la primera parte de la tesis se investiga el diseño de lentes holográficas para transductores con geometría esférica como alternativa a las lentes planas ya descritas previamente. Además, se estudia un nuevo método para codificar el campo acústico en las lentes de forma que se mejore la imagen producida por ellas, ajustándose más a la deseada. En la segunda parte se estudia cómo es el patrón térmico que genera el campo acústico producido por una lente holográfica cuando se aplica sobre un material con absorción acústica y cómo afecta la difusión térmica a éste. Esta difusión tiene como efecto que el patrón térmico con el tiempo no se parezca al acústico, y que las lentes deban tener en cuenta este proceso en su diseño para aplicaciones térmicas, especialmente si se desean regiones uniformes de calentamiento. Se demuestra cómo la hipertermia generada por ultrasonidos es más dañina en esferoides de células tumorales que la hipertermia tradicional. En la tercera parte se demuestra la viabilidad de los hologramas ultrasónicos para tratamientos neurológicos, aplicados desde la ventana temporal para reducir el eventual calentamiento del hueso que se produce. Además, se estudia en experimentos ex-vivo el campo acústico producido por lentes holográficas a través de un cráneo de macaco, aplicando técnicas de proyección holográfica para obtener aún más información de estas medidas y se diseña un sistema para aplicar estos hologramas en experimentos in-vivo con macacos y comprobar la viabilidad de la apertura de la barrera hematoencefálica de forma localizada. Esta tesis se enfoca a un mejor diseño y entendimiento de las emergentes lentes holográficas, así como a estudiar su validez en aplicaciones biomédicas de gran interés como son la hipertermia, la neuromodulación y la apertura de la barrera hematoencefálica para la administración de fármacos en el cerebro. / [CA] Els ultrasons s'han emprat des dels anys 90 per al tractament de múltiples patologies gràcies al seu caràcter no invasiu i no ionitzant, des del tractament localitzat del càncer fins a teràpies neurològiques. La focalització d'estes ones de pressió i la conformació del feix acústic ha sigut un problema que des de diverses perspectives s'ha intentat abordar, amb l'ús de lents focalizadores, transductors focalitzats i els més sofisticats sistemes phased-array compostos per múltiples transductors amb control individual d'amplitud i fase. Estos sistemes presenten diversos inconvenients, com l'escàs control del feix que ofereixen els transductors focalitzats, amb un focus fix i sense control de les possibles distorsions del camp que pot introduir el medi, o l'elevat cost derivat de la complexa electrònica dels sistemes phased-array, encara que proporcionen un millor control del focus i compensació d'aberracions. La revolucionària idea dels hologrames acústics com a elements passius impresos amb tecnologia 3D va arribar com una alternativa de baix cost als previs sistemes. En primer lloc es va descriure el seu ús en medis homogenis per a generar les més diverses imatges acústiques, però prompte es va començar a estudiar la seua viabilitat per a focalitzar feixos d'ultrasons a l'interior del cervell, resultant ser molt útils en la correcció de les aberracions que el crani introduïx en el front d'ones. Les lents hologràfiques són capaces de codificar tant el camp que es desitja generar com les distorsions de fase que pot introduir el medi en el qual es propaguen els ultrasons. En esta tesi s'estudia el disseny d'hologrames acústics i la seua aplicació en l'àmbit biomèdic. La tesi pot ser dividida en tres grans parts: una primera en la qual se descriuen nous mètodes per al disseny de lents hologràfiques, una segona en la qual s'empren els hologrames ultrasònics per a generació d'hipertèrmia i una tercera en la qual s'estudia el seu ús per a teràpies transcranials. En la primera part de la tesi s'investiga el disseny de lents hologràfiques per a transductors amb geometria esfèrica com a alternativa a les lents planes ja descrites prèviament. A més, s'estudia un nou mètode per a codificar el camp acústic en les lents de manera que es millore la imatge produïda per elles, ajustant-se més a la desitjada. En la segona part s'estudia com és el patró tèrmic que genera el camp acústic produït per una lent hologràfica quan s'aplica sobre un material absorbent i com afecta la difusió tèrmica a aquest. Esta difusió té com a efecte que el patró tèrmic amb el temps no se semble a l'acústic, i les lents hagen de tindre en compte aquest procés en el seu disseny per a aplicacions tèrmiques, especialment si es desitgen regions uniformes de calfament. Es demostra com la hipertèrmia generada per ultrasons és més nociva en esferoides tumorals que la hipertèrmia tradicional. En la tercera part es demostra la viabilitat dels hologrames ultrasònics per a tractaments neurològics, aplicats des de la finestra temporal per a reduir el calfament de l'os que es produïx. A més, s'estudia en experiments ex-vivo el camp acústic produït per lents hologràfiques a través d'un crani de macaco, aplicant tècniques de projecció hologràfica per a obtindre encara més informació d'estes mesures i es dissenya un sistema per a aplicar estos hologrames en experiments in-vivo amb macacos i comprovar la viabilitat de l'obertura de la barrera hematoencefàlica de forma localitzada. Esta tesi s'enfoca a un millor disseny i enteniment de les emergents lents hologràfiques, així com en l'estudi de la seua validesa en aplicacions biomèdiques de gran interès com són la hipertèrmia, la neuromodulació i l'obertura de la barrera hematoencefàlica per a l'administració de fàrmacs en el cervell. / [EN] Ultrasound has been used since the 1990s for the treatment of multiple pathologies thanks to its non-invasive and non-ionising nature, from localised cancer treatment to neurological therapies. The focusing of these pressure waves and beam shaping has been a problem that has been tackled from various perspectives, with the use of focusing lenses, focused transducers and the more sophisticated phased-array systems composed of multiple transducers with electronic amplitude and phase control. These systems have several drawbacks, such as the poor beam control offered by focused transducers, with a fixed focus and no control of possible field distortions introduced by the medium, or the high cost due to the complex electronics of phased-array systems, although they provide better focus control and aberration compensation. The revolutionary idea of acoustic holograms as passive 3D printed elements came as a low-cost alternative to these previous systems. They were first described to be used in homogeneous media to generate a wide range of acoustic images, but their feasibility for focusing ultrasound beams inside the brain was soon studied and proved to be very useful in correcting the aberrations that the skull introduces into the wavefront. Holographic lenses are capable of encoding both the field to be generated and the phase distortions that may be introduced by the medium in which the ultrasound propagates. This thesis studies the design of acoustic holograms and their application in the biomedical field. The thesis can be divided into three main parts: a first one in which new methods for the design of holographic lenses are described, a second one in which ultrasonic holograms are used for hyperthermia generation, and a third one in which their use for transcranial therapies is studied. The first part of the thesis investigates the design of holographic lenses for transducers with spherical geometry as an alternative to the previously described flat lenses. In addition, a new method is studied to encode the acoustic field in the lenses in order to improve the image produced by them, adjusting it more closely to the desired image. The second part studies the thermal pattern generated by the acoustic field produced by a holographic lens when it is applied to an absorbing material and how thermal diffusion affects it. This diffusion has the effect that the thermal pattern over time does not resemble the acoustic pattern, and lenses must take this process into account in their design for thermal applications, especially if uniform regions of heating are desired. The method is tested on multiple tumour spheroids, and results show that ultrasound-mediated hyperthermia is shown to be more damaging to tumour cell spheroids than traditional hyperthermia. The third part demonstrates the feasibility of ultrasonic holograms for neural treatments, applied from the temporal window to reduce the bone heating that occurs. In addition, the acoustic field produced by holographic lenses through a macaque skull is studied in ex-vivo experiments, applying holographic projection techniques to obtain even more information from these experiments. A system is designed to apply these holograms in in-vivo experiments with macaques to test the feasibility of opening the blood-brain barrier in a localized manner. This thesis focuses on a better design and understanding of the emerging holographic lenses, as well as on studying their validity in biomedical applications of great interest such as hyperthermia, neuromodulation and the opening of the blood-brain barrier for drug delivery to the brain. / Andrés Bautista, D. (2024). Acoustic Holograms for Hyperthermia and Transcranial Ultrasound [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/205788

[ES] El sistema nervioso forma una red de circuitos neuronales esenciales para la locomoción. El sistema nervioso central (cerebro y médula espinal) transmite información a los músculos. Mientras el sistema nervioso periférico puede regenerarse, el central tiene una capacidad regenerativa limitada. Por ello, las lesiones en el sistema nervioso central son críticas y a menudo carecen de cura. Una de ellas es la lesión de la médula espinal, una condición devastadora sin tratamiento eficaz. Una lesión interrumpe la entrada supraespinal en la médula espinal, conduciendo a disfunción locomotora debajo de la lesión. La relación alterada entre excitación e inhibición, con un aumento en la inhibición y la limitada regeneración de los tractos neuronales afectados, limitan la función locomotora. Como resultado, puede ocurrir parálisis completa incluso en pacientes con lesiones incompletas. Esta tesis doctoral define una terapia combinada para tratar la lesión de la médula espinal. Hipotetizamos que, para ayudar a la regeneración de los tractos, un trasplante neuronal periférico (ganglios de la raíz dorsal, DRG) que retiene la capacidad de regeneración puede ser efectivo. Para alterar la inhibición y mejorar la supervivencia del trasplante, se empleó la sobreexpresión del canal de sodio bacteriano, NaChBac. Finalmente, para mejorar la regeneración axonal, utilizamos medicamentos que modulan el citoesqueleto. En el Capítulo 1, validamos nuestra hipótesis con estudios in vitro. Observamos el efecto de Epothilone B y Blebbistatin en la longitud de las neuritas in vitro. Mientras Blebbistatin aumenta la longitud de las neuritas, la combinación con Epothilone la disminuye. Luego, describimos el efecto de NaChBac en los DRG y las células Neuro-2A. En las DRG, NaChBac aumenta la actividad y secreción de factores neurotróficos, promoviendo la señalización pro-supervivencia y anti-apoptótica en las Neuro-2A. Finalmente, describimos cómo la expresión de NaChBac y Blebbistatin mejora la longitud de las neuritas in vitro. En el Capítulo 2, evaluamos la supervivencia y eficacia del trasplante de DRG con el tracto corticoespinal, el más importante en la locomoción, en un estudio in vivo. Encontramos una adecuada integración del trasplante en el tejido huésped. La expresión de NaChBac aumenta la supervivencia de las células trasplantadas y mejora la preservación del tracto corticoespinal. En el Capítulo 3, evaluamos el tratamiento combinado en un escenario de lesión crónica y severa. La combinación del trasplante que expresa NaChBac y Blebbistatin limita la recuperación funcional, mientras que el trasplante que expresa NaChBac mejora significativamente la función locomotora en ratones. Los animales trasplantados con DRGs que expresan NaChBac tenían un aumento de fibras neuronales positivas para tubulina, con mayor preservación de mielina, aunque las fibras descendentes serotonérgicas y corticoespinales no mostraron cambios significativos entre los grupos. El trasplante de DRGs que expresan NaChBac aumentó significativamente el input excitatorio neto, determinado por el aumento de contactos de VGLUT2 y la disminución de VGAT en los somas de las neuronas inmediatamente caudales a las lesiones. Esta tesis sugiere que el trasplante de DRGs que expresan NaChBac rescata parte de la función motora perdida, manteniendo la actividad neuronal excitatoria caudal a la zona lesionada, destacando la relevancia del mantenimiento de la actividad neuronal como estrategia terapéutica para el rescate funcional de lesiones medulares severas. / [CA] El sistema nerviós forma una xarxa organitzada de circuits neuronals que són essencials per la locomoció. El sistema nerviós central (cervell i la medul·la espinal) rep i transmet informació de manera eficaç que és transmesa pel sistema nerviós perifèric als músculs, que comporta a moviment. El sistema nerviós perifèric té capacitat de regeneració, però el central té limitacions. Per això, les lesions en el sistema nerviós central sovint manquen de cura. Una d'elles és la lesió de la medul·la espinal, una condició debilitant que manca d'una cura eficaç. Una lesió resulta en una interrupció de l'entrada supraespinal en la medul·la espinal i conduïx a una disfunció locomotora. La relació alterada entre excitació i inhibició, un augment en la inhibició, juntament amb la capacitat limitada de regeneració endògena, limiten encara més la funció locomotora. Com a resultat, la paràlisi completa pot ocórrer fins i tot en pacients amb lesions anatòmicament incompletes. En esta tesi, ens centrem en estes idees principals per a definir una teràpia combinada. Hipotetizamos que, per a ajudar a la capacitat limitada de regeneració dels tractes, un trasplantament neuronal perifèric (ganglis de l'arrel dorsal, DRG) que reté la capacitat intrínseca de regeneració pot ser efectiva. Per a alterar la inhibició, millorar la supervivència i integració del trasplantament en els circuits, es va a emprar la sobreexpresió del canal de sodi, NaChBac. Finalment, per a dirigir i millorar la regeneració axonal, utilitzem medicaments que modulen el citoesquelet per a millorar la longitud axonal. Esta tesi estudia els efectes d'esta estratègia combinada. En el Capítol 1, estudiem l'efecte sinèrgic dels medicaments que modulen el citoesquelet Epothilone B i Blebbistatin en la longitud de les neurites in vitro i observem que el tractament individual amb Blebbistatin augmenta la longitud dels neurites, la combinació amb Epothilone conduïx a una morfologia del con de creixement alterada que resulta en disminució de la longitud dels neurites. Després, descrivim l'efecte de l'expressió de NaChBac en els DRG i les cèl·lules Neuro-2A. En les DRG, l'expressió de NaChBac conduïx a un augment en l'activitat intrínseca i la secreció de factors neurotrófics, promovent la senyalització pro-supervivència i la senyalització anti-apoptótic en les cèl·lules Neuro-2A. Finalment, descrivim com l'efecte combinat de l'expressió de NaChBac i Blebbistatin millora la longitud dels neurites. En el Capítol 2, avaluem la supervivència i interacció del trasplantament de DRG amb el tracte corticoespinal. Trobem una integració i supervivència adequada del trasplantament. A més, vam mostrar que l'expressió de NaChBac augmenta la supervivència del nombre total de cèl·lules trasplantades, així com millora la preservació del tracte corticoespinal després de la lesió. En el Capítol 3, avaluem l'efecte del tractament combinat en una lesió crònica i severa. Vam demostrar que la combinació del trasplantament que expressa NaChBac i Blebbistatin limita la recuperació funcional, mentres que el trasplantament que expressa NaChBac millora significativament la funció locomotora en ratolins. Per tant, descrivim que els animals trasplantats amb DRGs que expressen NaChBac tenien un augment en la fibra neuronal positiva per a tubulina i la preservació de la mielina, mentres que les fibres descendents serotonérgics i corticoespinales van romandre sense alteració. Trobem que el trasplantament de DRGs que expressen NaChBac va augmentar l'entrada neuronal excitatoria, com es va observar per l'augment en el nombre de contactes de VGLUT2 i la disminució en els contactes de VGAT cabals a les lesions. Així, la tesi suggereix que el trasplantament de DRGs amb NaChBac rescata la funció motora en lesions de la medul·la espinal en retindre una activitat de relé neuronal excitatoria cabal a les lesions en un model sever de lesió i destaca la importància del manteniment de l'activitat com a teràpia efectiva. / [EN] The nervous system forms specialized neuronal circuitry and organization that are essential for locomotion. The central nervous system (brain, spinal cord) receives and relays information, delivered by the peripheral nervous system to muscles to achieve locomotion. It is known that the peripheral nervous system retains its ability to regenerate, the central nervous system has little to no regenerative capacity in adult stages. Therefore, injuries to the central nervous system are critical and lack cure. One such is spinal cord injury; a debilitating condition that lacks an effective treatment. An injury results in severing of supraspinal input into the spinal cord, leading to locomotor dysfunction beneath the injury. Altered excitation inhibition ratio after an injury, increase in inhibition and limited endogenous regeneration capacity of the affected neuronal tracts limit locomotor function. As a result, complete paralysis may occur in patients with anatomically incomplete injuries. In this thesis, we focus on these points to devise a combinatory approach as an effective treatment strategy. We hypothesized that to aid the limited regeneration capacity of the tracts, a peripheral neuronal transplant (dorsal root ganglia, DRG) which retains the intrinsic ability to regenerate can be effective. To overcome inhibition, improve survival and integration of the transplant into circuits, the overexpression of NaChBac sodium channel was employed. Finally, to target and improve the axonal regeneration of endogenous and transplanted cells, we use cytoskeleton modulating drugs to enhance axonal length. This thesis studies the effects of this combinatory approach to treat spinal cord injury. In Chapter 1, we study the synergistic effect of cytoskeleton modulating drugs Epothilone B and Blebbistatin on neurite length and find that individual treatment with Blebbistatin increases neurite length, combination with Epothilone leads to an altered splayed morphology of the growth cone and decreased neurite length. Next, we describe the effect of NaChBac expression in DRGs and Neuro-2A cells. In DRGs, NaChBac expression leads to an increase in intrinsic activity and secretion of neurotrophic factors, promoting pro-survival signaling and anti-apoptotic signaling in Neuro-2A cells. Finally, we describe the combinatory effect of NaChBac expression and Blebbistatin further improves neurite length in vitro. In Chapter 2, we evaluate the survival, efficacy, and interaction of the DRG transplant with the corticospinal tract, the most important tract involved in locomotion in a short-term in vivo study. We report a satisfactory integration and survival of the transplant. We also show that NaChBac expression increases the survival of the total number of transplanted cells, as well as improves preservation of the corticospinal tract after the injury. In Chapter 3, we study the effect of the combinatory treatment in a chronic, severe injury scenario. We find that the combination of the transplant expressing NaChBac and Blebbistatin limits functional recovery, while that of transplant expressing NaChBac significantly improved locomotor function in mice. Therefore, focusing on this, we report that animals transplanted with NaChBac-expressing DRGs had increased tubulin-positive neuronal fiber and myelin preservation, while serotonergic and corticospinal descending fibers remained unaffected. We found that transplantation of NaChBac-expressing DRGs increased the neuronal excitatory input, seen by increased number of VGLUT2 contacts and decrease in VGAT contacts immediately caudal to the injuries. Together, the work in this thesis suggests that the transplantation of NaChBac-expressing dissociated DRGs rescues significant motor function by retaining an excitatory neuronal relay activity immediately caudal to injuries in a severe injury model and highlights the importance of maintenance of activity as an effective therapy for spinal cord injury. / Hingorani Jai Prakash, S. (2024). Genetically modified peripheral neurons transplant aided activity maintenance and secretome modulation: a novel strategy for spinal cord injury treatment [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/206738

Tesis por compendio / [ES] El campo de la computación afectiva es un área que ha surgido con gran impulso y está en constante evolución. Este campo logra integrar psicofisiología, informática, ingeniería biomédica e inteligencia artificial, desarrollando sistemas capaces de inducir y reconocer emociones de manera automática. Su enfoque principal es el estudio del comportamiento humano a través de las emociones, las cuales desempeñan un papel fundamental en acciones como la interacción social, la toma de decisiones o la memoria. Recientemente, los avances tecnológicos han posibilitado el desarrollo de sistemas inteligentes humano-máquina que antes no eran factibles. Elementos como la realidad virtual y los modelos generativos de inteligencia artificial están adquiriendo un papel relevante en el campo de la computación afectiva. La combinación de estas tecnologías puede dar lugar a experimentaciones mucho más realistas que, junto con el reconocimiento automático de respuestas fisiológicas, podrían constituir una metodología robusta para evocar e identificar estados emocionales en entornos de dinámicas sociales. Esta tesis se centra en la evocación y reconocimiento de emociones en realidad virtual mediante la creación del primer humano virtual, basado en un modelo de lenguaje generativo, que permite mantener conversaciones a tiempo real con un humano. Se han medido diversas señales fisiológicas y desarrollado herramientas de procesamiento de señales para monitorizar las respuestas de manera automática. A partir de esto, se ha evaluado y validado no solo la evocación y reconocimiento de emociones mediante aprendizaje automático, sino también el reconocimiento de sujetos con síntomas depresivos. El trabajo desarrollado en esta tesis presenta contribuciones relevantes, tanto para el campo de la computación afectiva, como para otras áreas afines como el procesamiento de señales y las interacciones humano-máquina. Las herramientas desarrolladas junto con modelos novedosos de la inteligencia artificial consiguen realizar una experimentación, en entornos de dinámicas sociales humanas, nunca antes diseñada. Los resultados muestran como este trabajo es capaz de modelizar información tan relevante como emociones y síntomas depresivos de la persona con la que se habla. Campos como la psicología, medicina o educación pueden utilizar muchas de las herramientas desarrolladas en esta tesis con tal de aportar más información en la toma de decisiones o en la interacción social. / [CA] El camp de la computació afectiva és un àmbit que ha sorgit amb gran impuls i està en constant evolució. Aquest camp aconsegueix integrar psicofisiologia, informàtica, enginyeria biomèdica i intel·ligència artificial, desenvolupant sistemes capaços d'induir i reconèixer emocions de manera automàtica. El seu enfocament principal és l'estudi del comportament humà a través de les emocions, les quals juguen un paper fonamental en accions com la interacció social, la presa de decisions o la memòria. Recentment, els avanços tecnològics han possibilitat el desenvolupament de sistemes intel·ligents humà-màquina que abans no eren factibles. Elements com la realitat virtual i els models generatius d'intel·ligència artificial estan adquirint un paper rellevant en el camp de la computació afectiva. La combinació d'aquestes tecnologies pot donar lloc a experimentacions molt més realistes que, juntament amb el reconeixement automàtic de respostes fisiològiques, podrien constituir una metodologia robusta per evocar i identificar estats emocionals en entorns de dinàmiques socials. Aquesta tesi es centra en la evocació i reconeixement d'emocions en realitat virtual mitjançant la creació del primer humà virtual, basat en un model de llenguatge generatiu, que permet mantenir converses en temps real amb un humà. S'han mesurat diverses senyals fisiològiques i desenvolupat eines de processament de senyals per monitoritzar les respostes de manera automàtica. A partir d'això, s'ha avaluat i validat no només la evocació i reconeixement d'emocions mitjançant aprenentatge automàtic, sinó també el reconeixement de subjectes amb símptomes depressius. El treball desenvolupat en aquesta tesi presenta contribucions rellevants, tant per al camp de la computació afectiva com per a altres àrees afins com el processament de senyals i les interaccions humà-màquina. Les eines desenvolupades juntament amb models innovadors d'intel·ligència artificial aconsegueixen realitzar una experimentació en entorns de dinàmiques socials humanes que mai abans s'havia dissenyat. Els resultats mostren com aquest treball és capaç de modelitzar informació tan rellevant com emocions i símptomes depressius de la persona amb la qual es parla. Àrees com la psicologia, la medicina o l'educació poden utilitzar moltes de les eines desenvolupades en aquesta tesi per a proporcionar més informació en la presa de decisions o en la interacció social. / [EN] The field of affective computing is an area that has emerged with great momentum and is constantly evolving. This field integrates psychophysiology, computer science, biomedical engineering, and artificial intelligence, developing systems capable of inducing and recognizing emotions automatically. Its main focus is the study of human behavior through emotions, which play a fundamental role in actions such as social interaction, decision-making, or memory. Recently, technological advances have made possible the development of human-machine intelligent systems that were previously unattainable. Elements such as virtual reality and generative models of artificial intelligence are becoming increasingly relevant in the field of affective computing. The combination of these technologies could lead to much more realistic experiments that, along with automatic recognition of physiological responses, could constitute a robust methodology for evoking and identifying emotional states in social dynamic environments. This thesis focuses on the elicitation and recognition of emotions in virtual reality through the creation of the first virtual human, based on a generative language model, capable of engaging real-time conversations with a human. Various physiological signals have been measured, and signal processing tools have been developed to monitor responses automatically. Based on this, the elicitation and recognition of emotions through machine learning have been evaluated and validated, as well as the recognition of subjects with depressive symptoms. The work developed in this thesis presents relevant contributions, not only to the field of affective computing but also, to related areas such as signal processing and human-machine interactions. The tools developed, along with innovative artificial intelligence models, enable experimentation in human social dynamics environments that have never been designed before. The results demonstrate how this work is capable of modeling such relevant information as emotions and depressive symptoms of the person being interacted with. Fields such as psychology, medicine, or education can utilize many of the tools developed in this thesis to provide more information in decision-making or social interaction processes. / Llanes Jurado, J. (2024). Affective computing framework for social emotion elicitation and recognition using artificial intelligence [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/207112 / Compendio

[ES] Los sistemas CRISPR-Cas se basan en un mecanismo del sistema inmune adaptativo que se encuentra en bacterias y arqueas. Funcionan utilizando endonucleasas guiadas por ARN (proteínas Cas) para localizar y reconocer secuencias específicas de ácidos nucleicos. Los sistemas CRISPR-Cas son revolucionarios en el campo de la ingeniería genética, permitiendo la edición específica del genoma, ensayos de regulación genética y, desarrolladas en los últimos años, aplicaciones de diagnóstico. Los métodos de detección de ácidos nucleicos son la técnica de diagnóstico de referencia en la clínica debido a su alta sensibilidad y especificidad. Sin embargo, de cara al futuro, debemos desarrollar métodos versátiles de detección de virus que permitan diagnósticos rápidos y fiables, que superen las limitaciones de las técnicas actuales y puedan usarse fácilmente fuera del laboratorio para aplicaciones en puntos de atención (POC). Los sistemas CRISPR-Cas se han reconvertido en herramientas de diagnóstico de ácidos nucleicos gracias a la capacidad de algunas proteínas Cas de realizar cortes colaterales no específicos al reconocer su diana. Nuestro objetivo es ampliar el conjunto de herramientas de diagnóstico CRISPR-Cas mediante el desarrollo de una nueva estrategia de detección de ácidos nucleicos basada en CRISPR-Cas9, cuyo modo de acción se basa en el desplazamiento de hebra en lugar de en la catálisis colateral. Demostramos que los amplicones de ADN del SARS-CoV-2 generados a partir de muestras de pacientes pueden detectarse con CRISPR-Cas9. También demostramos la capacidad de realizar la detección simultánea de diferentes amplicones de ADN con la misma nucleasa, ya sea para identificar diferentes regiones de SARS-CoV-2 o diferentes virus respiratorios. Para avanzar hacia aplicaciones POC, acoplamos el paso de preamplificación isotérmica con oligos biotinilados para producir amplicones marcados. Cuando se combina con CRISPR-Cas9 y sondas marcadas con FAM, esto permite la visualización colorimétrica de la detección mediante ensayos de flujo lateral (LFA) en tiras disponibles en el mercado. La lectura colorimétrica permite la interpretación de los resultados a simple vista, superando la necesidad de un fluorímetro. Detectamos con éxito SARS-CoV-2 a partir de muestras de pacientes en la configuración LFA, y cuando se combinó con RT-RPA multiplexado, se logró la detección de dos regiones distintas del virus en una sola prueba. Además, la ausencia de actividad colateral en nuestra metodología permite el procesamiento de secuencias posteriores adicionales. Por lo tanto, también pretendemos explorar la capacidad de integración de señales de nuestro método de detección basado en CRISPR-Cas9. Demostramos que diseños de circuitos lógicos de ADN pueden procesar diferentes señales de SARS-CoV-2 detectadas por los complejos CRISPR. También nos propusimos mejorar nuestro sistema CRISPR-Cas9 para detectar tanto proteínas como ácidos nucleicos. Nos propusimos diseñar un ARN guía condicional que respondiera a la presencia de la proteína spike del SARS-CoV-2. Para ello, insertamos un aptámero en el ARN guía para bloquear la actividad de Cas9 en ausencia de la proteína. En presencia de la proteína spike, la interacción aptámero-proteína hace que el motivo de bloqueo sufra un cambio conformacional, liberando el ARN guía y activando Cas9. Aunque logramos con éxito el escenario de bloqueo utilizando las secuencias reguladoras, es necesario seguir trabajando para identificar una secuencia que pueda inducir el cambio conformacional específico necesario para restaurar la actividad de Cas9 en presencia de la proteína spike. En conjunto, esta plataforma de diagnóstico CRISPR-Cas9 permite una detección multiplexada en un solo tubo, complementando los métodos existentes basados en CRISPR, y ofreciendo un sistema extensible para aplicaciones en diagnóstico en el punto de atención y biocomputación. / [CA] Els sistemes CRISPR-Cas es basen en un mecanisme del sistema immunitari adaptatiu que es troba en bacteris i arqueus. Funcionen utilitzant endonucleases guiades per ARN (proteïnes Cas) per tal de dirigir-se i reconéixer seqüències específiques d'àcids nucleics. Els sistemes CRISPR-Cas siguen revolucionaris en el camp de l'enginyeria genètica, permetent l'edició específica del genoma, assajos de regulació gènica i, desenvolupades en els darrers anys, aplicacions de diagnòstic. Els mètodes de detecció d'àcids nucleics són la tècnica de diagnòstic de referència a la clínica degut a la seua alta sensibilitat i especificitat. No obstant, de cara al futur, hem de desenvolupar mètodes versàtils de detecció de virus que permeten diagnòstics ràpids i fiables, que superen les limitacions de les tècniques actuals i puguen utilitzar-se fàcilment fora del laboratori per a aplicacions en punts d'atenció (POC). Els sistemes CRISPR-Cas han estat reorientats com a eines de diagnòstic d'àcids nucleics, fet possible per la capacitat d'algunes proteïnes Cas de realitzar un tall col·lateral no específic en reconèixer un objectiu. El nostre objectiu és ampliar el conjunt d'eines de diagnòstic CRISPR-Cas desenvolupant una nova estratègia de detecció d'àcids nucleics basada en CRISPR-Cas9, el mode d'acció del qual es basa en el desplaçament de cadena en lloc de la catàlisi col·lateral. Mostrem que es poden detectar amplicons de DNA de SARS-CoV-2 generats a partir de mostres de pacients amb CRISPR-Cas9. També demostrem la capacitat de realitzar la detecció simultània de diferents amplicons de DNA amb la mateixa nucleasa, ja siga per identificar diferents regions de SARS-CoV-2 o diferents virus respiratoris. Per avançar cap a aplicacions de punt d'atenció (POC), vam combinar el pas de preamplificació isotèrmica amb oligos biotinilats per produir amplicons etiquetats. Quan es combinen amb l'orientació CRISPR-Cas9 i sondes etiquetades amb FAM, això permet la visualització colorimètrica de la detecció mitjançant assajos de flux lateral (LFA) en tires comercials disponibles. La lectura colorimètrica permet la interpretació dels resultats a simple vista, superant la necessitat d'un fluorímetre. Vam detectar amb èxit el SARS-CoV-2 a partir de mostres de pacients en el sistema LFA, i quan es va combinar amb RT-RPA multiplexada, es va aconseguir la detecció de dues regions diferents del virus en una sola prova. A més, l'absència d'activitat col·lateral en la nostra metodologia permet el processament de seqüències addicionals. Per tant, també ens proposem explorar la capacitat d'integració de senyals del nostre mètode de detecció basat en CRISPR-Cas9. Demostrem que els circuits lògics d'ADN dissenyats poden processar diferents senyals de SARS-CoV-2 detectats pels complexos CRISPR. També vam intentar millorar el nostre sistema CRISPR-Cas9 per detectar tant proteïnes com àcids nucleics. Ens vam proposar dissenyar un ARN guia condicional que respon a la presència de la proteïna spike del SARS-CoV-2. Per aconseguir-ho, vam inserir una seqüència d'aptàmer dins de l'ARN guia per bloquejar l'activitat de Cas9 en absència de la proteïna. En presència de la proteïna spike, la interacció aptàmer-proteïna fa que el motiu de bloqueig experimente un canvi conformacional, alliberant l'ARN guia i activant Cas9. Tot i que vam aconseguir amb èxit el bloqueig utilitzant les seqüències reguladores, es necessita més treball per identificar una seqüència que puga induir el canvi conformacional específic necessari per restaurar l'activitat de Cas9 en presència de la proteïna spike. Col·lectivament, aquesta plataforma de diagnòstic CRISPR-Cas9 permet una detecció multiplexada en un sol tub, complementant els mètodes existents basats en CRISPR i oferint un sistema extensible per a aplicacions en diagnòstics de punt d'atenció i biocomputació. / [EN] CRISPR-Cas systems are based on an adaptive immune system mechanism found in bacteria and archaea. They function using RNA-guided endonucleases (Cas proteins), to target and recognize specific nucleic acid sequences. CRISPR-Cas systems are revolutionary in the field of genetic engineering, enabling specific genome editing, gene regulation assays and, developed in recent years, diagnostic applications. Nucleic acid detection methods are the gold-standard diagnostic technique in the clinic due to their high sensitivity and specificity. However, going forward, we must develop versatile virus detection methods that enable fast and reliable diagnostics and that can overcome the limitations of the current techniques and can be easily used outside the laboratory for point-of-care (POC) applications. CRISPR-Cas systems have been repurposed as nucleic acid diagnostic tools made possible by the ability of some Cas proteins to perform non-specific collateral cleavage upon target recognition. We aim to expand the CRISPR-Cas diagnostic toolkit by developing a novel nucleic acid detection strategy based on CRISPR-Cas9, whose mode of action relies on strand displacement rather than on collateral catalysis. We show that SARS-CoV-2 DNA amplicons generated from patient samples can be detected with CRISPR-Cas9. We also demonstrate the ability to perform simultaneous detection of different DNA amplicons with the same nuclease, either to identify different SARS-CoV-2 regions or different respiratory viruses. To advance toward POC applications, we coupled the isothermal preamplification step with biotinylated oligos to produce labelled amplicons. When combined with CRISPR-Cas9 targeting and FAM-labelled probes, this allows for colorimetric visualization of detection using lateral flow assays (LFA) on commercially available strips. The colorimetric readout enables interpretation of the results with the naked eye, surpassing the need for a fluorimeter. We successfully detected SARS-CoV-2 from patient samples in the LFA setup, and when combined with multiplexed RT-RPA, the detection of two distinct regions of the virus was achieved in a single test. Furthermore, the absence of collateral activity in our methodology allows for the processing of additional downstream sequences. Therefore, we also aim to explore the signal integration capability of our CRISPR-Cas9-based detection method. We demonstrate that engineered DNA logic circuits can process different SARS-CoV-2 signals detected by the CRISPR complexes. We also aimed to enhance our CRISPR-Cas9 system to sense both proteins and nucleic acids. We aimed to engineer a conditional guide RNA that responds to the presence of the SARS-CoV-2 spike protein. To achieve this, we inserted an aptamer sequence within the guide RNA to block Cas9 activity in the absence of the protein. Upon the presence of the spike protein, aptamer-protein interaction makes the blocking motif undergo a conformational change, releasing the guide RNA and activating Cas9. While we successfully achieved the blocking scenario using the regulatory sequences, further work is needed to identify a sequence that can induce the specific conformational change required to restore Cas9 activity upon spike protein presence. Collectively, this CRISPR-Cas9 diagnostic platform allows a multiplexed detection in a single tube, complementing the existing CRISPR-based methods, and offering an extensible system for applications in point-of-care diagnostics and biocomputing. / This work was supported by a predoctoral fellowship from the Spanish Ministry of Science and Innovation (PRE2019-088531). / Márquez Costa, R. (2024). Engineering of CRISPR-Cas9-Based Systems for Diagnostics and Biocomputing [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/210634

De El Concierto de San Ovidio au Concert de Saint-Ovide: Analyse contextuelle et textuelle de la pièce d'Antonio Buero Vallejo Alors que le théâtre de la péninsule ibérique, réputé pour ses auteurs du Siècle d'or, ne fait plus l'unanimité auprès des foules depuis l'avènement de la dictature franquiste, un auteur, Antonio Buero Vallejo, une pièce, Historia de una escalera, et une date, 1949, s'imposent en sauveurs. Est alors amorcée ce que les spécialistes de la littérature hispanique appellent la ± rénovation théâtrale¿ de la scène espagnole. Alors que le théâtre qui se fait majoritairement durant la période dictatoriale est un théâtre qualifié ± d'évasion ¿, ayant pour but de faire oublier la dure réalité sociale et politique aux spectateurs, les pièces que propose Buero Vallejo abordent des thématiques difficiles et souvent bannies par la censure mise en place par le régime totalitaire. Les deux premIers chapitres de ce travail explorent les méandres de la dictature franquiste en proposant une contextualisation sociohistorique et littéraire de l'Espagne de la première moitié du XXe siècle. Ils représentent ce que nous appelons ± l'analyse contextuelle de l'oeuvre ¿. Nous y expliquons les changements sociaux, politiques et littéraires qu'implique la mise en place d'un tel régime, mais aussi la façon dont les pièces de Antonio Buero Vallejo réussirent à passer au travers des mailles du filet de la censure. Le troisième chapitre du mémoire se concentre exclusivement, quant à lui, sur l'analyse théâtrologique de la pièce à l'étude El concierto de San Ovidio, et ce, à partir d'une méthodologie croisée inspirée des écrits de Philippe Hamon, Luis Thenon, Anne Ubersfeld et Louise Vigeant, ainsi qu'à l'aide de diverses études portant sur l'univers dramatique de Buero Vallejo. 11 ± Est-ce qu'un art réel et sincère pouvait donc exister là où il ne s'élevait pas de la vie comme l'expression d'une communauté libre, mais était au service de puissances opposées au libre développement de la communauté, et par conséquent devait être transplanté arbitrairement de contrées étrangères ? Non. ¿ Richard Wagner L'art et la révolution

[ES] Esta tesis analiza el tipo de violencia sistémica que el neoliberalismo implementa hoy en las relaciones sociales de producción posfordistas y que se extiende, más allá del ámbito laboral, a todos los ámbitos de la vida del individuo, poniendo el acento en los efectos psicológicos de esta violencia, interiorizada como optimización personal y libre autorrealización. A partir de aquí, indaga en la inserción del ecosistema del arte en esas nuevas relaciones de producción caracterizadas por el imperativo de creatividad y de autorrealización personal. La apropiación (por parte de la lógica mercantilista neoliberal) del concepto de creatividad propio de la tradición artística y sus consecuencias -la flexibilidad y la precariedad-, así como la manera como impactan en particular en la vida cotidiana del artista y en su producción, en medio de la instrumentalización del arte contemporáneo y de sus formas de legitimación por parte de un nuevo capitalismo emocional, constituyen el foco fundamental de la investigación. A modo de interpretación subjetiva del análisis llevado a cabo en esta investigación, se presenta una práctica artística propia que, bajo el título de Un ejercicio de violencia, se expuso en el IVAM entre octubre de 2021 y febrero de 2022. / [CA] Aquesta tesi analitza el tipus de violència sistèmica que el neoliberalisme implementa hui en les relacions socials de producció postfordistes i que s'estén, més enllà de l'àmbit laboral, a tots els àmbits de la vida de l'individu, posant l'accent en els efectes psicològics d'aquesta violència, interioritzada com a optimització personal i lliure autorealització. A partir d'ací, indaga en la inserció de l'ecosistema de l'art en eixes noves relacions de producció caracteritzades per l'imperatiu de creativitat i d'autorealització personal. L'apropiació (per part de la lògica mercantilista neoliberal) del concepte de creativitat propi de la tradició artística i les seues conseqüències -la flexibilitat i la precarietat-, així com la manera com impacten en particular en la vida quotidiana de l'artista i en la seua producció, enmig de la instrumentalització de l'art contemporani i de les seues formes de legitimació per part d'un nou capitalisme emocional, constitueixen el focus fonamental de la investigació. A mode d'interpretació subjectiva de l'anàlisi duta a terme en aquesta investigació, es presenta una pràctica artística pròpia que, sota el títol d'Un exercici de violència, es va exposar en l'IVAM entre octubre de 2021 i febrer de 2022. / [EN] This thesis analyses the type of systemic violence that neoliberalism implements today in post-Fordist social relations of production and that extends, beyond the labour sphere, to all areas of the individual's life, emphasizing the psychological effects of this violence, internalized as personal optimization and free self-realization. From here, he investigates the insertion of the art ecosystem in these new relations of production characterized by the imperative of creativity and personal selfrealization. The appropriation (by neoliberal mercantilist logic) of the concept of creativity inherent to the artistic tradition and its consequences -flexibility and precariousness- as well as the way in which they impact in particular on the artist's everyday life and production, amidst the instrumentalization of contemporary art and its forms of legitimization by a new emotional capitalism, constitute the fundamental focus of the research. By way of a subjective interpretation of the analysis carried out in this research, an artistic practice of my own is presented which, under the title Un ejercicio de violencia, was exhibited at IVAM between October 2021 and February 2022. / Ros Lluch, G. (2024). La violencia sistémica en los tiempos del capitalismo emocional: el caso del artista contemporáneo [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/211321

[ES] La tesis doctoral titulada "NMR-based metabolomics for the identification of biomarkers of disease" explora el potencial de la metabolómica mediante espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN) para la identificación de biomarcadores de enfermedades, permitiendo un diagnóstico temprano y no invasivo, así como el seguimiento de pacientes. El estudio se centra en cuatro enfermedades: Alzheimer, glaucoma, aterosclerosis y vulnerabilidad de placa, y fibrosis pulmonar tras neumonía por COVID-19. En la introducción, se describe el proceso de análisis metabolómico para la identificación de biomarcadores y las principales plataformas y herramientas estadísticas utilizadas en el análisis mediante RMN. Se destacan las características fisiopatológicas de las enfermedades estudiadas, las formas actuales de diagnóstico y la necesidad de nuevos marcadores. El primer capítulo aborda la identificación de biomarcadores para el Alzheimer y la progresión de deterioro cognitivo leve (MCI) a Alzheimer mediante análisis de suero. Se desarrollaron modelos de clasificación que discriminaron entre Alzheimer, MCI y controles sanos. La investigación encontró que ciertos metabolitos, como lisina, piruvato y colina, presentan concentraciones distintas según la evolución del MCI. El segundo capítulo estudia las diferencias metabolómicas entre MCI y controles mediante análisis de plasma, combinando RMN y marcadores de peroxidación lipídica detectados con UPLC-MS/MS. La combinación de ambas técnicas mejoró la identificación de biomarcadores, destacando metabolitos como isoleucina, valina y glutamato. El tercer capítulo analiza lágrimas de pacientes con glaucoma primario de ángulo abierto (POAG) para identificar biomarcadores en un medio mínimamente invasivo. Se identificaron metabolitos como taurina, glicina y glucosa como potenciales biomarcadores. En el cuarto capítulo se estudian placas de ateroma y suero de pacientes con estenosis de carótida para identificar biomarcadores de vulnerabilidad de placa. En placa, se identificaron mio-inositol y glutamato como potenciales biomarcadores. En suero, se destacaron treonina, histamina y ácidos grasos insaturados. El quinto capítulo se enfoca en pacientes que desarrollaron fibrosis pulmonar tras neumonía por COVID-19, identificando biomarcadores en suero que permiten predecir la fibrosis, destacando glucosa, valina y ácidos grasos. Finalmente, se presenta la discusión y las conclusiones generales, subrayando la relevancia de la metabolómica mediante RMN para identificar biomarcadores tempranos y no invasivos, lo que podría cubrir una necesidad crítica en la medicina actual. / [CA] La tesi doctoral titulada "Metabolòmica basada en RMN per a la identificació de biomarcadors de malaltia" explora el potencial de la metabolòmica mitjançant espectroscòpia de ressonància magnètica nuclear (RMN) per a la identificació de biomarcadors de malalties, permetent un diagnòstic precoç i no invasiu, així com el seguiment de pacients. L'estudi se centra en quatre malalties: Alzheimer, glaucoma, aterosclerosi i vulnerabilitat de placa, i fibrosi pulmonar després de pneumònia per COVID-19. A la introducció, es descriu el procés d'anàlisi metabolòmic per a la identificació de biomarcadors i les principals plataformes i eines estadístiques utilitzades en l'anàlisi mitjançant RMN. Es destaquen les característiques fisiopatològiques de les malalties estudiades, les formes actuals de diagnòstic i la necessitat de nous marcadors. El primer capítol tracta sobre la identificació de biomarcadors per a l'Alzheimer i la progressió de deteriorament cognitiu lleu (MCI) a Alzheimer mitjançant anàlisi de sèrum. Es van desenvolupar models de classificació que van discriminar entre Alzheimer, MCI i controls sans. La investigació va trobar que certs metabòlits, com lisina, piruvat i colina, presenten concentracions diferents segons l'evolució del MCI. El segon capítol estudia les diferències metabolòmiques entre MCI i controls mitjançant anàlisi de plasma, combinant RMN i marcadors de peroxidació lipídica detectats amb UPLC-MS/MS. La combinació d'ambdues tècniques va millorar la identificació de biomarcadors, destacant metabòlits com isoleucina, valina i glutamat. El tercer capítol analitza llàgrimes de pacients amb glaucoma primari d'angle obert (POAG) per a identificar biomarcadors en un medi mínimament invasiu. Es van identificar metabòlits com taurina, glicina i glucosa com a potencials biomarcadors. En el quart capítol s'estudien plaques d'ateroma i sèrum de pacients amb estenosi de caròtida per a identificar biomarcadors de vulnerabilitat de placa. En placa, es van identificar mio-inositol i glutamat com a potencials biomarcadors. En sèrum, es van destacar treonina, histamina i àcids grassos insaturats. El cinqué capítol se centra en pacients que van desenvolupar fibrosi pulmonar després de pneumònia per COVID-19, identificant biomarcadors en sèrum que permeten predir la fibrosi, destacant glucosa, valina i àcids grassos. Finalment, es presenten les conclusions generals, subratllant la rellevància de la metabolòmica mitjançant RMN per a identificar biomarcadors precoços i no invasius, la qual cosa podria cobrir una necessitat crítica en la medicina actual. / [EN] The doctoral thesis titled "NMR-based metabolomics for the identification of biomarkers of disease" explores the potential of metabolomics through nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy for the identification of disease biomarkers, enabling early and non-invasive diagnosis, as well as patient monitoring. The study focuses on four diseases: Alzheimer's, glaucoma, atherosclerosis and plaque vulnerability, and pulmonary fibrosis after COVID-19 pneumonia. The introduction describes the metabolomic analysis process for biomarker identification and the main platforms and statistical tools used in NMR-based analysis. The study highlights the pathophysiological characteristics of the diseases studied, current diagnostic methods, and the need for new biomarkers. The first chapter addresses the identification of biomarkers for Alzheimer's disease and the progression of mild cognitive impairment (MCI) to Alzheimer's using serum analysis. Classification models were developed to distinguish between Alzheimer's, MCI, and healthy controls. The research found that certain metabolites, such as lysine, pyruvate, and choline, show different concentrations depending on the evolution of MCI. The second chapter studies metabolomic differences between MCI and controls using plasma analysis, combining NMR and lipid peroxidation markers detected by UPLC-MS/MS. The combination of both techniques improved biomarker identification, highlighting metabolites such as isoleucine, valine, and glutamate. The third chapter analyzes tears from patients with primary open-angle glaucoma (POAG) to identify biomarkers in a minimally invasive medium. Metabolites such as taurine, glycine, and glucose were identified as potential biomarkers. In the fourth chapter, atheroma plaques and serum from patients with carotid stenosis were studied to identify biomarkers of plaque vulnerability. In plaques, myo-inositol and glutamate were identified as potential biomarkers. In serum, threonine, histamine, and unsaturated fatty acids were highlighted. The fifth chapter focuses on patients who developed pulmonary fibrosis after COVID-19 pneumonia, identifying serum biomarkers that can predict fibrosis, with glucose, valine, and fatty acids being prominent. Finally, the general discussion and conclusions are presented, emphasizing the relevance of NMR-based metabolomics in identifying early and non-invasive biomarkers, potentially addressing a critical need in modern medicine. / Botello Marabotto, MD. (2024). NMR-Based Metabolomics for the Identification of Biomarkers of Disease [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/211472

Femicides are not a new phenomenon. Marches involving thousands of people all around the Latin American continent to fight them, however, is. Ni Una Menos - Not one woman less - is the slogan that also mobilized Bolivians to mass-based protests in November 2016.This thesis investigates the counterpublic of #NiUnaMenosBolivia for the purpose of understanding its discursively articulated identities. A multidisciplinary discourse theoretical analysis combines Ernesto Laclau and Chantal Mouffe’s discourse theory with Nancy Fraser’s contributions to the struggle over needs of counterpublics to examine textual, photographic and ethnographic data.Two levels of identities of #NiUnaMenos are extracted from the investigation: Internal agonistic identities pinpoint at the friction between the representors and the represented identities of the counterpublic. A collective identity evolves in the context of the struggle for justice, freedom and dignity through the construction of an antagonistic “Others” who are held responsible for femicidal violence.This study builds a bridge between feminist activism and academic discourse for feminist studies of the region. It further develops and exemplifies a methodological toolkit for a theoretically based discourse analysis on contemporary women’s movements.