Le premier traitement standard pour les tumeurs cérébrales est la résection chirurgicale. Dans cette procédure un enjeu important demeure, l'identification des berges tumorales pour assurer une résection totale et éviter le risque de récidive pour le patient. A ce jour aucune technique d'imagerie peropératoire est capable de résoudre l'infiltration tumorale du tissu sain. La norme pour le diagnostic des berges tumorales est l'analyse histologique des biopsies. Une méthode ex vivo qui requiert un à plusieurs jours pour fournir ler apport pathologique final, un lapse de temps qui peut s'avérer fatal pour le patient. La microscopie optique a récemment été développer vers une utilisation clinique peropératoire pour répondre à cet enjeu. Dans travail, la technique de microscopie à deux-photons a été préférée pouressayer de répondre à cette problématique. Cette méthode donne accès à deux contrastes d'imagerie, la génération de seconde harmonique et l’émission de fluorescence, qui peuvent être combinés à des mesures quantitatives, tel que la spectroscopie et le temps de vie de fluorescence. Combiner ces quatre modalités de détection donnera une information complète sur la structure et le métabolisme de la région observée. Pour soutenir le développement technique vers une sonde endomicroscopique visant une utilisation peropératoire, les données en résultants doivent être fiables, et se montrer d'un intérêt pour le chirurgien. Par conséquent, une base de données sur le signal d'autofluorescence des tissus a été construite et présentée dans ce manuscrit, avec des algorithmes capables de discriminer de façon fiable les régions tumorales des régions saines. Des algorithmes qui ont montré le potentiel d'être automatisé dans une configuration clinique, afin de fournir une réponse en temps-réel au chirurgien. / The first standard approach for brain tumor treatment is the surgical resection. In this protocol an important challenge remains, the identification of tumor margins to ensure a complete resection and avoid risk of tumor recurrence. Nowadays no intra-operative means of contrast are able to resolve infiltrated regions from healthy tissue. The standard for tumor margin diagnosis is the histological analysis of biopsies. An ex vivo method that requires one to several days to issue a final pathological reports, a time lapse that could be fatal to the patient. Optical microscopy have recently been developed towards an intra-operative clinical use to answer this challenge. In this work, the technique of two-photon microscopy based on the autofluorescence of tissue have been favored. This technique gives access to two imaging contrasts, the second-harmonic generation and emission of fluorescence, and can be combined to quantitative measurements, such as spectroscopy and fluorescence lifetime. The combination of these four modalities of detection will give a complete structural and metabolic information on the observed region. To support the technical development towards an endomicroscopic probe, the resulted data have to be reliable and proved to be of interest for the surgeon. Consequently, an extensive database of the autofluorescence response of brain tumor tissue have been constructed and presented in this manuscript, with algorithms able to discriminate with reliability tumoral from healthy regions. Algorithms that have shown potential to be automatized in a clinical setting, in order to give a real-time answer to the surgeons.

La fluorescence excitée à deux photons est actuellement largement utilisée pour l'imagerie de tissus biologiques, mais la faible sensibilité des fluorophores utilisés en microscopie confocale (excitation à un photon) à une excitation à deux photons (ADP) rend nécessaire la conception et la synthèse de nouveaux fluorophores spécifiques pour la microscopie de fluorescence par excitation bi-photonique (MFEB). Mon travail de thèse a ainsi porté sur l'ingénierie moléculaire (conception, synthèse et caractérisations) de nouveaux fluorophores pour la MFEB. Nous nous sommes particulièrement intéressés à des systèmes unidimensionnels (1D) de petite taille comportant des systèmes π étendus autour d'un cœur rigide (dicétopyrrolopyrrole ou DPP) et entourés de différents systèmes électro-actifs. Nous avons modifié par la suite les fluorophores précédents de manière à pouvoir les conjuguer à des molécules d'intérêt biologique, comme des protéines. Ces fluorophores bio-conjugables ont été greffés sur un peptide du virus HIV étudié au laboratoire : TAT (Trans-Activator of Transcription). L'imagerie par microscopie biphotonique a été effectuée avec succès sur des cellules HeLa. Nous nous sommes ensuite tourné vers la mise au point de nouvelles sondes multimodales pour associer la MEBP à une autre modalité d'imagerie : la résonance magnétique nucléaire et la microscopie électronique (imagerie corrélative). Pour ce faire nous avons développé des colorants fluorescents par excitation bi-photonique comportant une entité paramagnétique ou dense aux électrons (nanoparticules de magnétite, ion gadolinium III ou atomes lourds comme le platine et l'or).

Dans une première partie nous avons utilisé des techniques de<br />micromanipulations de molécules d'ADN uniques avec des pinces magnétiques<br />pour étudier la cinétique et thermodynamique de formation de boucles<br />sur l'ADN par le répresseur GalR. Nous avons également étudié les propriétés<br />de la translocase à ADN FtsK impliquée dans la ségrégation des chromosomes<br />chez E. coli. Dans une seconde partie nous avons mis en place différentes<br />expériences utilisant l'excitation biphotonique. Tout d'abord nous<br />avons construit un dispositif pour mesurer les sections efficaces d'absorption<br />à deux photons de molécules synthétisées au laboratoire.Nous avons ensuite<br />mis en place la technique de corrélation de fluctuations de fluorescence pour<br />mesurer des coefficients de diffusion et des constantes cinétiques.

La fluorescence excitée à deux photons est actuellement largement utilisée pour l’imagerie de tissus biologiques, mais la faible sensibilité des fluorophores utilisés en microscopie confocale (excitation à un photon) à une excitation à deux photons (ADP) rend nécessaire la conception et la synthèse de nouveaux fluorophores spécifiques pour la microscopie de fluorescence par excitation bi-photonique (MFEB). Mon travail de thèse a ainsi porté sur l’ingénierie moléculaire (conception, synthèse et caractérisations) de nouveaux fluorophores pour la MFEB. Nous nous sommes particulièrement intéressés à des systèmes unidimensionnels (1D) de petite taille comportant des systèmes π étendus autour d’un cœur rigide (dicétopyrrolopyrrole ou DPP) et entourés de différents systèmes électro-actifs. Nous avons modifié par la suite les fluorophores précédents de manière à pouvoir les conjuguer à des molécules d’intérêt biologique, comme des protéines. Ces fluorophores bio-conjugables ont été greffés sur un peptide du virus HIV étudié au laboratoire : TAT (Trans-Activator of Transcription). L’imagerie par microscopie biphotonique a été effectuée avec succès sur des cellules HeLa. Nous nous sommes ensuite tourné vers la mise au point de nouvelles sondes multimodales pour associer la MEBP à une autre modalité d’imagerie : la résonance magnétique nucléaire et la microscopie électronique (imagerie corrélative). Pour ce faire nous avons développé des colorants fluorescents par excitation bi-photonique comportant une entité paramagnétique ou dense aux électrons (nanoparticules de magnétite, ion gadolinium III ou atomes lourds comme le platine et l’or). / Two-photon induced fluorescence is nowadays widely used for the imaging of biological tissues. The classical fluorophores used in confocal microscopy exhibit low sensitivity to two-photon excitation for the two-photon excitation microscopy (TPEM), led the researchers towards the development of new fluorophores, specifically engineered for TPEM. This manuscript describes our work on conception, synthesis and characterizations of new one-dimensional fluorophores based on dicétopyrrolopyrrole (DPP) central core, surrounded by various electro-active systems through π conjugated systems. We also modified such fluorophores to be able to conjugate them to molecules of biological interest, such as proteins. These bio-conjugable fluorophores were grafted on a peptide of HIV virus studied in our laboratory: TAT (Trans-Activator of transcription). The imaging by TPEM was successfully performed on HeLa cells. In addition we developed new multimodal probes for the correlative light electronic microscopy and for the correlative imaging fluorescence microscopy/ Magnetic resonance imaging (MRI). Theses multimodal probes associate a fluorescent moiety based on the DPP core associated to a paramagnetic or electron dense entity (magnetite nanoparticles, gadolinium III or heavy atoms such as platinum or gold).

Les corrélations de photons sont à la base d'un certain nombre d'expériences et d'applications (spectroscopie de corrélation de photons, profilométrie haute résolution, cryptographie quantique, téléportation). L'évaluation de ces propriétés de corrélation revêt dès lors une importance toute particulière et correspond à la thématique dans laquelle s'inscrit ce travail de thèse de Doctorat. Tout d'abord, les concepts de compteur de photons par absorption à deux photons ont été (ré)évalués expérimentalement dans différents semiconducteurs et nous ont conduits à établir les bases d'un modèle quantique du comptage à deux photons. Par la suite, l'absorption à deux photons dans les semiconducteurs est appliquée dans une nouvelle technique qui permet la mesure du degré de cohérence d'ordre deux de sources optiques continues de faibles puissances (0,1 µW au minimum) avec une bande passante allant de 1,1 à 1,7 µm et une résolution de l'ordre de la femtoseconde. Expérimentalement, le montage est conceptuellement proche d'un interféromètre de Hanbury Brown et Twiss où, dans notre cas, les deux sous-faisceaux décalés dans le temps sont recombinés sur un compteur à deux photons. Grâce à la très large bande passante à deux photons, les corrélations de sources larges spectralement sont caractérisées au moyen de ce montage qui permet la mesure du degré de cohérence d'ordre deux de sources chaotiques aussi bien que d'un générateur paramétrique à la dégénérescence ou hors de la dégénérescence. Pour la première fois, le phénomène de bunching des photons issus d'un corps noir a été vérifié par une mesure directe. Pour ce qui est de la lumière paramétrique, après avoir développé une source de photons jumeaux, nous avons démontré que notre montage expérimental était à même de mesurer les coïncidences exactes des photons issus d'une même paire aussi bien que les coïncidences accidentelles entre photons de paires différentes en contrôlant les phénomènes de dispersion chromatiques à l'aide d'une paire de prismes. Enfin, deux modèles théoriques originaux de corrélation de photons jumeaux ont été développés, basées sur les approches quantique et classique, et sont en excellent accord avec l'ensemble de nos résultats expérimentaux.

En raison de leur avantage en sensibilité de surface, un grand choix de biocapteurs SPR (résonance de plasmons desurface) est disponible sur le marché tant pour la recherche scientifique que pour le médical personnalisé. Lesapplications à l'imagerie SPR sont généralement basées sur la méthode du prisme de couplage et une miniaturisation enbiopuces avec parallélisme matriciel. Ces développements se heurtent à des inconvénients de par leurs limites enrésolution spatiale et le caractère non-uniforme des régions détectées. Si plusieurs microscopes à très haute résolutionsont en cours de développement, les systèmes restent généralement complexes et onéreux.Dans cette thèse, nous avons adopté la méthode SPR pour concevoir et construire un nouveau système d'imagerie.Outre le signal de fluorescence, les phénomènes d’absorption SPR peuvent être utilisés pour imager et mieuxcomprendre les propriétés de surfaces. Dans ce but, nous avons réalisé un microscope à plasmon de surface à deuxcanaux et à polarisation radiale pouvant détecter des nanoparticules isolées. Dans le cas de nanosphères avec moléculesfluorescentes, nous avons démontré la possibilité de collecter simultanément les images de fluorescence et de diffusionélastique. Ces deux signaux complémentaires conduisent à des images bien co-localisées. Une meilleure résolution etune amélioration de la sensibilité ont été rendues possibles en utilisant un polariseur radial et un objectif à ouverturenumérique élevée, qui permettent de polariser en configuration TM l'ensemble du faisceau incident, conduisant à laformation d'un anneau circulaire sombre dans l'image réfléchie. Le signal de fluorescence est clairement amplifié deplus de 50% sous polarisation radiale par rapport à un polarisation linéaire, la polarization azimuthale, à caractèrecomplètement TE ne permettant pas le couplage aux plasmons et servant de référence neutre.Nous avons tout d’abord appliqué cette technique à la détection de nanosphères fluorescentes isolées (de 20 nm dediamètre), ce qui est susceptible de révéler des informations inaccessibles aux mesures classiques sur film épais. Enoutre, cette technique se révèle être également un moyen de compenser les intermittences par clignotementcaractéristiques de la fluorescence, lesquelles n'affectent pas le canal de diffusion élastique. Nous avons enfin étenducette technique aux objets biologiques tels que des brins d'ADN et des membranes cellulaires en milieu liquide. Cettetechnique a également été étendue à l'étude de signaux de fluorescence à deux photons (TPF) émis par des nanosphèresà base d’organo-métalliques, ainsi qu’à celle de signaux de génération de seconde harmonique (SHG) en provenance denanocristaux non-centrosymétriques. Les effets de renforcement de la fluorescence par l’effet d’un ion métalliqueainsi que les phénomènes d'extinction par des boîtes quantiques sont des sujets d’investigation fondamentale associés àces axes. / Due to the advantage of surface sensitivity, various SPR biosensors for scientific research fields or personalmedicine markets have been reported. However, especially for SPR imaging applications, the designs are usually basedon prism-coupling method and ensuing chips with array patterns. In fact, these designs entail the disadvantages of alimited spatial resolution and non uniform detection regions. Although several super-resolution microscopes have beenproposed and developed, systems are usually complicated and high-costs. In our thesis, we adopt the surface plasmonresonance technique to build a brand new imaging system. Alongside fluorescence, SPR absorption can be also beexploited towards better imaging and understanding of the surface properties.Towards this aim, we demonstrate a dual-channel radially-polarized surface plasmon microscopy (SPM) systemwith capability down to single nanoparticle detection. For nanospheres stained with fluorescent molecules, we are ableto simultaneously collect the fluorescence and elastic scattering images, these two complementary emitted signalsleading to well co-localized images. The improved resolution and higher sensitivity of our system are enabled by use ofa radial polarizer and a high numerical aperture objective, which provide TM-polarization status to the entire incidentbeam, which results in the formation of a dark circular ring in the reflected image. The fluorescence intensity is thenclearly enhanced by more than 50% under radial polarization as compared to a linear one, while azimuthal polarizationbeing fully TE is ineffective and serves as a reference.We first applied this technique to detect a single fluorescent sphere of 20 nm in diameter, which potentiallyreveals unique information as compared to other measurements on bulk films. Moreover, it also provides a way tocompensate for the blinking characteristic of the fluorescence, which does not affect the elastic scattering channel. Weare currently extending this technique to stained biological objects such as DNA strands and cell membranes in liquidenvironments. This technique has been extended to study two photon fluorescence (TPF) signals from organometallic nanospheres, as well as second harmonic generation (SHG) signals from non-centrosymmetric nanocrystals via a multiphoton confocal microscope. In relation with this research, metallic ion enhanced fluorescence and quenching effects from quantum dots are fundamental topics currently under investigation.

La microscopie STED (stimulated emission depletion ou déplétion par émission stimulée) est une des méthodes les plus répandues de microscopie de super-résolution. Dans un microscope STED, un faisceau en anneau se superpose avec le faisceau d'excitation et éteint les fluorophores en périphérie du faisceau d'excitation par émission stimulée. Au centre de l'anneau, où le faisceau STED a une intensité nulle, la fluorescence reste intacte. Cette technique nécessite un montage complexe dans lequel deux faisceaux laser, en général issus de deux sources différentes, doivent être parfaitement alignés et superposés. Dans ce travail de thèse, nous proposons deux configurations STED qui ont pour but de simplifier le montage et de réduire le coût total d'un tel système. L'idée de base dans les deux cas est d'utiliser la même source laser à la fois pour l'excitation et la déplétion par émission stimulée. Dans la première configuration, nous avons développé une source bicolore originale basée sur un laser Nd-YAG microchip. Ce laser microchip délivre simultanément des impulsions sub- ns à deux longueurs d'onde, 355 nm (excitation) et 532 nm (déplétion), qui sont générés par conversion harmonique à partir d'une émission laser Nd-YAG et offrent l'avantage d'être intrinsèquement alignées et synchronisées. Afin de trouver des colorants appropriés pour cette source particulière, nous avons développé une méthode de caractérisation et testé différents colorants Nous avons construit un microscope à partir de cette source laser et obtenu des images avec une résolution améliorée. La réduction du volume d'excitation a été confirmée par spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS). Cependant, les aberrations chromatiques des optiques utilisées limitent les performances du montage actuel. Une perspective prometteuse serait de combiner le STED à la microscopie à feuille de lumière (SPIM), plus tolérante des défauts d'achromatisme, et nous montrons les premiers résultats de cette approche. Dans la seconde configuration, les aberrations chromatiques ne sont plus un problème puisqu' une seule longueur d'onde est utilisée pour l'excitation (par absorption à deux photons) et la déplétion. En jouant sur la durée de l'impulsion (et donc la valeur de l'intensité crête), un de ces deux procédés peut être favorisé. La fluorescence est excitée à deux photons par une impulsion femtoseconde, puis est éteinte par émission stimulée à un photon avec une impulsion étirée. Nous avons utilisé une technique résolue en temps (Time-Correlated Single Photon Counting - TCSPC) pour étudier l'efficacité de déplétion du colorant DCM en solution. Les simulations numériques montrent que cette méthode peut être appliquée à la microscopie de super résolution. En fin de cette partie, nous présentons les premières images obtenues avec un microscope développé au laboratoire qui permet l'excitation à deux photons et la déplétion à un photon avec une seule longueur d'onde, ainsi que l' amélioration de la résolution observée. Dans ce travail, nous avons donc mis en place expérimentalement, pour la première fois, deux concepts destinés à simplifier en utilisant deux sources laser originales. / Stimulated emission depletion (STED) is a well-known super-resolution method. In a STED microscope, a doughnut-shaped beam is superimposed with the excitation beam and keeps the fluorophores in the periphery of the excitation spot in a dark state by stimulated emission, thus effectively improving the spatial resolution in a scanning configuration. This technique requires a complex setup since two laser beams, generally from different sources need to be perfectly aligned. In this work we propose two STED configurations that will simplify the setup and reduce the total cost of such a system. The basic idea in both cases is to use the same laser source for both excitation and stimulated emission depletion. In the first setup we have developed an original two-color source based on a microchip Nd-YAG laser. This microchip laser simultaneously delivers sub-ns pulses at two wavelengths, 355 nm (excitation) and 532 nm (depletion), which are generated by harmonic conversion from an Nd-YAG laser emission and offer the advantage of being intrinsically aligned and synchronized. Further work consisted in determining suitable dyes for this particular source. We have built a microscope setup based on this laser source and obtained images with an improved resolution. The confirmation of the reduction of the excitation volume is showed by Fluorescence Correlation Spectroscopy (FCS) measurements. However, the performance of this system is limited by chromatic aberrations. The combination of Selective Plane Illumination Microscopy (SPIM) with STED is considered. In the second setup the chromatic aberrations are no longer a problem since the same wavelength is used for two photon excitation and one photon depletion. By playing on the duration of the pulse (thus the instantaneous intensity), one of these two processes can be favored. Fluorescence was excited by two photon absorption with a femtosecond pulse, then depleted by one photon stimulated emission with a stretched pulse. We used the Time Correlated Single Photon Counting (TCSPC) method to study the depletion efficiency of DCM dye in solution and numerical simulations show that this method can be applied to super-resolved microscopy. In the end we present the preliminary images obtained with a home-built Two-photon Single wavelength STED microscope and the resolution improvement obtained. Further improvements are to be made to the custom microscope. In this work we have experimentally implemented, for the first time, two concepts meant to simplify the STED setups by using original sources.

Le monoxyde d'azote (NO•) est connu pour son rôle dans de nombreux processus biologiques et physiologiques. Il peut cependant avoir des effets antagonistes selon sa concentration dans le milieu. Le développement de sources exogènes capables de relarguer localement et quantitativement NO• est donc nécessaire pour profiter pleinement de son potentiel thérapeutique. La chimiothérapie photoactivée offre une approche intéressante qui consiste en l'irradiation de systèmes photosensibles non toxiques dans l'obscurité, mais capables de déclencher la mort cellulaire sous activation à la lumière. Cette thèse s'articule autour de trois complexes de ruthénium nitrosyle (RuNO) à ligands polypyridines, développés dans la perspective d'étudier leur comportement par excitation mono- et biphotonique. La fonctionnalisation des ligands polypyridines par des groupements riches en électrons permet d'envisager une excitation à 2 photons dans la fenêtre thérapeutique afin de traiter de manière locale des tumeurs plus profondes. Un état de l'art sur ces enjeux et cette thématique est dressé dans le premier chapitre. Dans le deuxième chapitre, une étude théorique comparative de plusieurs complexes RuNO à ligand bipyridine fonctionnalisée par des fluorènes permet de sélectionner le meilleur candidat pour la photolibération de NO•. Dans le troisième chapitre, la synthèse et la caractérisation de [Ru(terpy)(F2bpy)(NO)](PF6)3 (terpy = 2,2':6',2''-terpyridine; F2bpy = 4,4'-bis(9,9'-dibutyl-9H-fluoren-2-yl)-2,2'-bipyridine) sont décrites. Sont ensuite présentées dans le quatrième chapitre la synthèse et la caractérisation de [Ru(terpy)(MP2bpy)(NO)](PF6)3 (T0B2) et [Ru(MPterpy)(MP2bpy)(NO)](PF6)3 (T1B2), avec MP2bpy = 4,4'-bis(4-méthoxyphényl)-2,2'-bipyridine et MPterpy = 4'-(4-méthoxyphényl)-2,2':6',2''-terpyridine. Dans le cinquième chapitre, les propriétés photophysiques de [Ru(terpy)(F2bpy)(NO)](PF6)3 sous excitation à un photon et à deux photons sont étudiées, la libération de NO• est mise en évidence (détermination du rendement quantique фNO et de la section efficace σ) et le photoproduit est caractérisé. Le comportement des complexes T0B2 et T1B2 sous irradiation monophotonique est étudié dans le sixième chapitre, à travers la photolibération de NO•, la caractérisation de leur photoproduit et la détermination de фNO. / Nitric oxide (NO•) is known for its role in many biological and physiological processes. Nonetheless its effects are opposite according to the concentration in the media. The development of exogeneous sources able to release locally and quantitatively NO• is therefore necessary to fully benefit from its therapeutic potential. Photoactivated chemotherapy offers an interesting approach consisting in the irradiation of non toxic photoreactive systems in the dark, but able to trigger cell death when irradiated with light. This thesis is based on three ruthenium nitrosyl complexes (RuNO) with polypyridyl ligands, developed in view of studying their behavior under mono- and biphotonic excitation. The functionalization of polypyridyl ligands by electron-rich groups enables to consider a two-photon excitation in the therapeutic window in order to access deeper tumors locally. A state of art on those stakes and on this theme is addressed in the first chapter. In the second chapter, a comparative theoretical study of several RuNO complexes with a bipyridine ligand functionalized with fluorene enables to select the best candidate for NO• photorelease. In the third chapter, the synthesis and the characterization of [Ru(terpy)(F2bpy)(NO)](PF6)3 (terpy = 2,2':6',2''-terpyridine; F2bpy = 4,4'-bis(9,9'-dibutyl-9H-fluoren-2-yl)-2,2'-bipyridine) are detailed. In the fourth chapter are presented the synthesis and characterization of [Ru(terpy)(MP2bpy)(NO)](PF6)3 (T0B2) and [Ru(MPterpy)(MP2bpy)(NO)](PF6)3 (T1B2), with MP2bpy = 4,4'-bis(4-methoxyphenyl)-2,2'-bipyridine et MPterpy = 4'-(4-methoxyphenyl)-2,2':6',2''-terpyridine. In the fifth chapter, the photophysical properties of [Ru(terpy)(F2bpy)(NO)](PF6)3 under one-photon and two-photon excitation are studied, NO• release is demonstrated (determination of the quantum yield фNO and the cross section σ) and the photoproduct is characterized. The behavior of T0B2 and T1B2 under monophotonic irradiation is described in the sixth chapter, through the photorelease of NO•, the characterization of their photoproduct, and the determination of фNO.

L'objet de cette thèse est la construction d'un laser étalon à 778 nm pour réaliser une mesure absolue des fréquences 2S-8S/D des atomes d'hydrogène et de deutérium. Cet étalon de fréquence est une diode laser stabilisée en fréquence sur une transition à deux photons 5S-5D de l'atome de rubidium. Les performances métrologiques de ce laser étalon sont 10 fois meilleures que celles du laser He-Ne stabilisé sur l'iode. La fréquence de ce laser a été mesurée au cours de cette thèse grâce à une chaîne de multiplication de fréquence située à l'Observatoire de Paris. L'étude des caractéristiques métrologiques de la fibre optique reliant nos laboratoires a montré que le passage du faisceau du laser étalon dans celle-ci ne détériorait pas ses propriétés métrologiques. Les transitions 2S-8S/8D sont excitées dans un jet atomique par un laser titane-saphir. Plusieurs effets parasites déplacent et élargissent les raies étudiées. Pour s'affranchir de ces effets, une forme de raie théorique est ajustée sur les signaux expérimentaux. Elle tient compte en particulier de l'effet Stark linéaire sur les niveaux excités. La comparaison en fréquence du laser d'excitation et du laser étalon donne la fréquence absolue de la raie étudiée. On en déduit la valeur de la constante de Rydberg : R8 = 109 737,315 6859 (10) cm-1 Ce résultat est le plus précis à ce jour. En comparant les mesures du deutérium à celles de l'hydrogène, on détermine la valeur du déplacement de Lamb de l'état 2S du deutérium : L2S-2P = 1059,230 (9) MHz Cette mesure améliore l'incertitude sur cette valeur de plus d'un ordre de grandeur ; elle est en bon accord avec la dernière mesure de cette quantité. L'incertitude sur ces résultats approche celle des calculs d'électrodynamique quantique donnant les valeurs théoriques des niveaux d'énergie.

Les cellules épithéliales de l'intestin possèdent une membrane plasmique spécialisée, la bordure en brosse, qui est constituée de protubérances en forme de doigts appelées microvillosités. Chaque microvillosité est composée d'un faisceau de filaments d'actine et d'un réseau en hélice de molécules de myosine I de la bordure en brosse (BBMI) formant des liens entre la membrane plasmique et les filaments d'actine. Lors de l'assemblage de la bordure en brosse, il se produit des phénomènes hautement dynamiques. En particulier, le nombre et la taille des microvillosités augmentent durant la dernière étape de différenciation des entérocytes adultes, comme au cours de la phase finale de l'embryongenèse. Le renouvellement rapide des protéines membranaires et du cytosquelette dans les entérocytes matures suggère également que des processus dynamiques ont lieu pour permettre à ces cellules de conserver leur morphologie. La dynamique des microvillosités pourrait être due à la polymérisation de l'actine qui est suffisante pour assurer la propulsion des bactéries, par exemple. Alternativement, BBMI pourrait être responsable de cette dynamique, soit en générant une force comme proposé par Sheetz pour l'extension des cônes de croissance des filopodes, soit en acheminant des composants membranaires au pôle apical de la cellule. Afin d'élucider la dynamique de BBMI et de l'actine dans la bordure en brosse des entérocytes, nous avons mis au point un instrument permettant la mesure de la mobilité tridimensionnelle des protéines dans des cellules vivantes en combinant l'imagerie de cellules vivantes en microscopie à deux photons avec la technique de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching). Nos résultats montrent que BBMI et l'actine sont mobiles, mais avec une dynamique différente. De plus, nous avons montré, pour la première fois dans des cellules vivantes, que BBMI a une activité motrice dans les microvillosités.