Récemment, plusieurs études ont permis de mettre en évidence un lien possible entre la maturation des snoARN et celle des microARN, deux familles d’ARNnc impliquées respectivement dans la maturation d’autres ARN, tels les ARNr, et dans la régulation de l’expression des gènes. En effet, ces études ont montré que certains microARN pouvaient être issus de la maturation d’un snoARN précurseur, formant alors une nouvelle classe d’ARNnc, les sdARN (ARN dérivés de snoARN). Le manque d’informations disponibles sur les mécanismes de maturation possibles des sdARN nous a conduit à réaliser un crible double-hybride chez la levure S. cerevisiae entre différentes protéines impliquées dans la biogenèse des snoARN et des microARN. Ce crible a permis d’identifier une nouvelle interaction entre les protéines TRBP, impliquée dans la maturation du pré-microARN en microARN, et RPAP3, un protéine du complexe d’assemblage hR2TP. L’observation de cette interaction soulève plusieurs questions, telles que son implication possible dans la maturation de microARN à partir de snoARN précurseurs, ou encore sur l’implication possible de TRBP et RPAP3 dans la biogenèse des snoRNP ou des microARN, respectivement. Nous avons alors entrepris de caractériser l’interaction entre TRBP et RPAP3. Par des approches de biologie moléculaire, de biochimie et de biologie structurale, nous avons d’une part confirmé l’existence du complexe in vitro et in vivo et identifié les domaines respectifs de TRBP et de RPAP3 impliqués dans l’interaction, ainsi qu’identifié plusieurs mutations intéressantes au niveau de l’interface d’interaction. L’utilisation de ces mutants devrait nous permettre d’étudier l’effet de la perte d’interaction entre TRBP et RPAP3 sur la maturation de différents ARNnc. Enfin, nos travaux ont également permis d’observer que l’interaction entre TRBP et RPAP3 n’était pas compatible avec la formation du complexe entre TRBP et la RNase Dicer. Or, il avait été montré que l’absence de TRBP au niveau de Dicer entraînait dans certains cas la génération de microARN avec des extrémités, et donc des spécificités, altérées (iso-miRs). La formation d’un complexe entre les protéines TRBP et RPAP3 pourrait donc constituer un moyen possible de réguler la disponibilité de TRBP et, indirectement, l’activité de Dicer / Recently, several studies have described a possible link between snoRNA and microRNA maturation, two ncRNA families involved in the maturation of other RNAs, such as rRNA, and in the regulation of gene expression, respectively. Indeed, these studies have shown that some microRNAs could be maturated from a snoRNA precursor, forming a new class of ncRNAs, the sdRNAs (snoRNA-derived RNAs). The mechanism of sdRNA maturation are still poorly understood. Therefore, we have performed a two-hybrid screen in the yeast S. cerevisiae between different proteins involved in microRNAs and snoRNAs biogenesis. Interestingly, we observed a novel interaction between TRBP, involved in the maturation of microRNAs, and RPAP3, a member of the hR2TP complex. The observation of this interaction raises several questions, such as its possible involvement in the maturation of microRNAs from snoARN precursors, or on the possible involvement of TRBP or RPAP3 in snoRNP or microRNA biogenesis, respectively. Using various molecular biology and biochemical approaches, we undertook the functional and structural characterization of the TRBP/RPAP3 interaction. First, we confirmed the interaction both in vitro and in vivo and we identified the TRBP and RPAP3 domains involved in the interaction, as well as several interesting mutations in the binding interface. Using these mutants should allow us to study the effects of this mutations on the maturation of differents ncRNAs. Additionally, we showed that the interaction between TRBP and RPAP3 and between TRBP and the RNase Dicer were mutually exclusive. Interestingly, it was shown that in the absence of TRBP, Dicer processig resulted, in some cases, in the generation of microRNAs with different ends, and thus, with altered specificity(iso-miRs). The interaction between TRBP and RPAP3 could therefore also constitute a possible way to regulate the availability of TRBP, and eventually the activity of Dicer

Les mélanocytes, cellules responsables de la pigmentation de la peau et des poils, protègent les cellules des stress environnementaux, en particulier des rayonnements ultra-violets (UV) présents à la surface de la Terre. Les UV induisent des dommages moléculaires et régulent de nombreuses voies de signalisation en aval de MC1R, MAPK, PI3K, ou PKC. A court terme, les UV peuvent induire la mélanogenèse et à long terme participent à la mélanomagenèse. Dicer, protéine clef de la maturation des microARN, est régulée par différents stress. La protéine multifonctionnelle β-caténine est impliquée dans le développement des mélanocytes. Ces deux protéines participent à la régulation fine de l'expression génique. L'objectif de cette thèse est de mettre en évidence le rôle et la régulation de Dicer dans le lignage mélanocytaire dans des conditions normales et de stress (UVB). Dans une première partie, nous nous sommes intéressés au rôle de Dicer dans la pigmentation et sa régulation dans le lignage mélanocytaire. Nous avons montré, in vivo dans un modèle murin, que Dicer est nécessaire à la fois à la mise en place du lignage mélanocytaire et au fonctionnement de ce lignage chez l'adulte. L'absence de Dicer dans le lignage mélanocytaire affecte la localisation des mélanocytes de la papille dermique du follicule pileux et empêche la pigmentation du poil. In vitro, la transcription de Dicer est régulée par différentes voies, en particulier par les protéines PI3K, RSK, GSK3β et β-caténine. L'activité répressive de β-caténine sur la transcription de Dicer est dépendante de sites LEF/TCF. Dans une deuxième partie, nous nous sommes intéressés à l'implication de Dicer, en relation avec β-caténine, dans la réponse aux UVB. Nous avons mis en évidence in vivo et in vitro la relocalisation nucléaire et l'activation transcriptionnelle de β-caténine induites par les UV. Tout comme β-caténine, les UVB répriment la migration des mélanocytes in vitro. Nous avons montré in vitro que les UVB répriment l'expression de Dicer et que cette répression est dépendante de sites de fixation de facteurs de transcription, dont LEF/TCF, présents dans la région promotrice de Dicer. Une diminution de Dicer participe à la protection des mélanocytes contre les UVB. Ce travail de thèse a donc permis de montrer le rôle de Dicer dans la pigmentation adulte et de mettre en évidence des voies de régulation de l'expression de Dicer dans les mélanocytes non stressés et dans les mélanocytes soumis à un stress UVB. / Melanocytes, cells responsible for pigmentation of the skin and hair, protect cells from environmental stress, especially ultra-violet radiations (UV) present on Earth floor. UV induce molecular damages and regulate many signaling pathways downstream of MC1R, MAPK, PI3K, or PKC. In the short term, UV can increase melanogenesis and in the long term, participate in melanomagenesis. Dicer, a key protein involved in microRNA maturation, is regulated by different types of stress. The multifunctional protein β-catenin is implicated in melanocyte development. These two proteins participate in fine regulation of gene expression. The goal of this thesis is to highlight the role and regulation of Dicer in the melanocyte lineage in normal and UVB stress conditions. In the first part, we focused on the role of Dicer in pigmentation and its regulation in the melanocyte lineage. We showed that, in a mouse model in vivo, Dicer is necessary for both establishment of melanocyte lineage and proper function of this lineage in adults. The lack of Dicer in the melanocyte lineage affects localization of melanocytes in the dermal papilla of hair follicles, preventing hair pigmentation. In vitro, Dicer transcription is regulated by different pathways, including PI3K, RSK, GSK3β and β-catenin. LEF/TCF sites mediate the repressive activity of β-catenin on Dicer transcription. In the second part, we focused on the implication of Dicer, in connection with β-catenin, in the response to UVB by melanocytes. We showed the nuclear relocalization and transcriptional activation of β-catenin induced by UV both in vivo and in vitro. Like β-catenin, UVB represses melanocyte migration in vitro. We showed in vitro that UVB represses Dicer expression and that this repression is dependent on transcription factors binding sites in the Dicer promoter region including LEF/TCF. Decreased level of Dicer participates in protection of melanocytes against UVB. This thesis work allowed us to show the role of Dicer in adult pigmentation and to highlight signaling pathways implicated in Dicer expression regulation in non-stressed melanocytes and in UVB-stressed melanocytes.

Les microARNs sont une classe de petits ARNs non codants qui régulent l'expression des gènes via un mecanisme d'interference par ARN. Les microARNs humains sont produits par une série de réactions enzymatiques. En particulier, dans le cytoplasme le precurseur de miRNA (pre-miRNA) est reconnu et clivé par un complexe contenant l'enzyme RNAse III Dicer et plusieurs cofacteurs protéiques. La proteine TRBP (HIV TAR RNA binding protein) est l'un de ces cofacteurs et augmente la stabilité du complexe, influe sur la cinétique, la position du clivage et a role potentiel dans la reconnaissance du substrat et dans le transfet du produit vers le complexe RISC (RNA-induced silencing complex) effecteur de l'interference par ARN. TRBP est composé de 3 domaines de liaison aux ARN doubles brin (dsRBDs). La région d'interaction de TRBP avec les ARNs est composé des deux premiers dsRBDs liés par une région interdomaine non charactérizée. La présente étude rapporte la caractérisation biophysique in vitro de la région d'interaction avec les ARNs de TRBP dans l'état apo de TRBP ou dans l'état lié avec les deux precurseurs cytoplasmique successifs du microARN oncogène miR-155 comprenant la tige boucle pre-miR-155 et le duplex miR-155/miR-155* résultat du clivage de pre-miR-155 par Dicer. L'étude montre que la région d'intéraction de TRBP avec les ARNs est monomerique, est composée de deux dsRBDs independants en solution et que la région interdomaine de 60 résidus est flexible. Le premier dsRBD, non caractérisé précédement en solution est le siège d'un equilibre plié/déplié integral dans une grande gamme de conditions physico-chimiques. Les deux premiers dsRBDs de TRBP peuvent interagir avec un même precurseur de microARN et deux régions d'interaction de TRBP avec les ARNs peuvent interagir avec un même precuseur. La région d'interaction de TRBP avec les ARNs interagit avec pre-miR-155 et le duplex miR-155/miR-155* avec des affinités très similaires. Dans le complexe avec une région d'interaction de TRBP avec les ARN liée à pre-miR-155 ou au duplexe miR-155/miR-155*, aucune indice de contact entre les deux dsRBDs n'a été detecté et la protéine interagit avec les deux precurseurs par la même surface d'interaction. Les informations récoltées suggèrent que TRBP peut jouer un rôle avant et après le clivage des pre-miARN par Dicer, notamment dans le complexe de chargement de RISC. / MicroRNAs (miRNA) are a class of small non-coding RNAs that regulate gene expression through RNA interference (RNAi). Human miRNAs are generated via a series of enzymatic processing steps. In particular, in the cytoplasm, the precursor miRNA (pre-miRNA) is recognized and cleaved by a complex containing the RNase III enzyme Dicer and several non-catalytic accessory proteins. HIV TAR element-binding protein (TRBP) is a constituent of the Dicer complex, which augments complex stability, has effect on the cleavage kinetics and on the cleavage site and potentially functions in substrate recognition and product transfer to the RNA-induced silencing complex (RISC). TRBP is composed of three double stranded RNA binding domains (dsRBDs). The RNA binding region of TRBP is composed of the first two dsRBDs and an uncharacterized interdomain region. The present study reports the in vitro biophysical characterization of the RNA binding region of TRBP in the apo state and in the RNA bound state with the two successive cytoplasmic precursors of the oncogenic human microRNA miR-155, the hairpin pre-miR-155 and the related Dicer product miR-155/miR-155* duplex. The study shows that the RNA binding region of TRBP is monomeric and comprises two independent double-stranded RNA-binding domains connected by a 60 residues flexible linker. The first dsRBD, uncharacterized previously in solution, undergoes a full folding/unfolding equilibrium in a wide range of physico-chemical conditions. The two first dsRBDs of TRBP can interact with one microRNA precursor and two RNA binding regions can interact with one precursor molecule. The RNA-binding region of TRBP interacts with both pre-miR-155 and miR-155/miR-155* duplex with similar affinities. In the complex with one RNA binding region of TRBP bound to either pre-miR-155 or miR-155/miR-155* duplex, no evidence of contact between the two dsRBDs were observed and the protein interacts with both precursors via the same protein binding surface. The data presented here suggest that the RNA binding region of TRBP can play a role before and after processing of pre-miRNAs by Dicer, including in the RISC loading complex.

Orientador: Carmen Veríssima Ferreira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-18T21:52:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lima_SarahAzoubel_M.pdf: 2437444 bytes, checksum: 4bc2e0c3075b4a6b06b01dee15a3fb45 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A resistência à quimioterápicos é um dos principais obstáculos para a terapia do câncer. Na leucemia mielóide crônica (CML) o tratamento é frequentemente ineficiente devido à aquisição de resistência aos quimioterápicos utilizados. Dessa forma, o estudo comparativo de linhagens celulares de CML resistentes e susceptíveis a drogas é de extrema importância para o entendimento dos mecanismos moleculares da resistência e para a evolução de novos protocolos terapêuticos. Um número cada vez maior de evidências indica que os microRNAs apresentam importante papel no processo de carcinogênese e na agressividade tumoral. Nesse trabalho o principal objetivo é melhor esclarecer o papel da maquinaria de processamento de microRNAs no fénotipo MDR (multi-drug resistance), utilizando principalmente as linhagens de CML K562 (susceptível) e Lucena (fenótipo MDR). Nossos resultados revelaram que as células Lucena apresentam altos níveis da endonuclease Dicer e que os microRNAs let-7a e miR-145 são intensamente regulados em relação à K562. Além disso, a linhagem Lucena se tornou mais sensível ao quimioterápico vincristina após o silenciamento de Dicer. Experimentos com outras linhagens celulares mostraram que a resistência frente à cisplatina e doxorrubicina possui correlação significativa com os níveis de Dicer. A identificação de ligantes dessa endonuclease nas linhagens de CML ressalta a possibilidade desta enzima estar cumprindo novos papéis no fenótipo MDR. Entre os ligantes exclusivos da linhagem resistente, estão proteínas envolvidas na promoção de defesa anti-oxidante, proliferação celular e metabolismo de lipídios e hormônios esteróides. De acordo, dados de proteoma das duas linhagens enfatizam a importância do metabolismo lipídico para aquisição da resistência, bem como de um intenso remodelamento do citoesqueleto. Nossos dados reforçam o caráter complexo e multifatorial da resistência à múltiplas drogas, contribuindo para o entendimento do ação de miRNAs e de Dicer nesse processo / Abstract: Drug resistance is one of the main obstacles in cancer therapy. Frequently, the treatment of chronic myelogenous leukemia (CML) becomes inefficient due to the emergence of a resistant population of cancer cells. Therefore, comparative studies of resistant and non-resistant CML cell lines is extremely important to the understanding of molecular mechanisms involved in the acquisition of resistance and also to the evolution of new therapeutic protocols. A growing number of evidence supports an important role for microRNAs in carcinogenesis and tumoral aggressiveness. This study aims to better understand the role of microRNAs and their biosynthetic pathway in the phenotype of multi-drug resistance (MDR) of CML cells. To this purpose we worked with the leukemic cell lines K562 (non-resistant) and Lucena (MDR phenotype). The results obtained revealed that Lucena expresses high levels of Dicer endonuclease and intensely regulates microRNAs let-7a and miR-145 when compared to K562. Also, Dicer silencing in MDR cells enhanced sensitivity to the chemotherapic drug vincristine. Experiments with different cells lines showed that resistance to cisplatin and doxorubicin are correlated to Dicer expression levels. In CML cell lines, the identification of Dicer ligands points to the possibility of alternative roles for this endonuclease in the MDR phenotype. Among the newly found interactors in the resistant cell line are proteins involved in antioxidant defense, proliferation and metabolism of fatty acids and steroids. Accordingly, proteome data from K562 and Lucena cells emphasizes the importance of lipid metabolism and structural remodeling to the resistant phenotype. Overall, our data contributes to the understanding of the role played by microRNAs and Dicer in the complex and multifactorial MDR phenotype / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Durant ce travail de thèse j’ai étudié des mécanismes de contrôle de la réponse inflammatoire qui, lorsqu’ils sont dérégulés, peuvent mener à une pathologie autoimmune/autoinflammatoire sévère, la Polyarthrite Rhumatoïde (PR). J’ai essentiellement analysé deux aspects de ces mécanismes : en premier lieu, j’ai pu participer à la démonstration de l’importance de l’endonucléase DICER (impliquée dans la biogénèse des microARNs - miRs), dans le contexte de la PR, particulièrement au niveau des synoviocytes type fibroblastique (FLS), des cellules résidentes de la cavité synoviale. J’ai aussi initié une étude visant à identifier, in vivo, l’intégralité des transcrits dont l’expression est régulée par des miRs dans les FLS de patients atteints de PR. En plus de fournir une vision globale de la régulation miR-dépendante dans ces cellules, ce travail permettra aussi d’identifier des cibles de miRs d’intérêt dans la PR en s’affranchissant des prédictions bio-informatiques qui peuvent s’avérer incorrectes. Un second axe de mon projet de thèse avait pour objectif de fournir une meilleure description du dialogue intercellulaire dans la cavité articulaire. Pour cela, je me suis plus particulièrement intéressé au rôle des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDCs) dans la physiopathologie de la PR. Ainsi j’ai pu démontrer un rôle protecteur de ces cellules (initialement décrites pour leurs fonctions dans la défense antivirale), dans le contexte de l’arthrite inflammatoire dans plusieurs modèles murins. Ces travaux m’ont permis de proposer une stratégie thérapeutique innovante, basée sur le recrutement articulaire des pDCs. Cette approche, non invasive (par application topique de crème contenant 5% d’imiquimod), s’est montrée efficace aussi bien pour la réduction des symptômes cliniques de l’inflammation que pour l’amélioration des marqueurs biologiques comme l’érosion osseuse. / During my PhD, I studied the mechanisms that control inflammation which, when disturbed, can lead to a severe autoimmune/ auto inflammatory disease, rheumatoid arthritis (RA). My work was focused on the analysis of two aspects in these mechanisms: first, I participated to an analysis of the roles of the endonuclease DICER (involved in the biogenesis of microRNAs – miRs) in the pathogenesis of RA, specifically in fibroblast-like synoviocytes (FLS), which are resident cells of the synovial cavity. I also initiated a study aiming at the identification of the FLS transcriptome which is regulated by miRs in RA patients. This approach will provide an overview of the miR-dependent regulation in these cells and enable the identification of in vivo validated miR-targeted mRNAs in RA. A second axis of my thesis project aimed at providing a better description of the intercellular dialogue in the joint cavity. For this, I was particularly interested in the role of plasmacytoid dendritic cells (pDCs) in the pathophysiology of RA. I demonstrated a protective role of these cells (initially described for their functions in antiviral defense) in the context of inflammatory arthritis in several mouse models. During this work, I had the opportunity to try an innovative therapeutic strategy based on the recruitment and activation of pDCs in the joints. This noninvasive and painless approach (topical application of cream containing 5% imiquimod) was effective in reducing inflammatory clinical symptoms and also improved biological markers such as bone erosion.

Les microARN (miARN) constituent une classe de petits ARN non-codants qui jouent un rôle clé dans la régulation de l’expression des gènes au niveau post-transcriptionnel. De nombreuses études ont démontré que la surexpression de certains miARN est liée au développement de plusieurs types de cancer. C’est pour cette raison les miARN représentent une nouvelle classe de cibles thérapeutiques à haute potentielle. Dans ce contexte, l’objectif de mon travail de thèse était la découverte de nouveaux inhibiteurs de la production de miARN oncogène. Dans ce but, j’ai suivi deux approches, différentes mais complémentaires : (i) le criblage d’une petite librairie de composés et (ii) la conception et la synthèse de nouveaux conjugués en tant que ligands de précurseurs de miARN (pré-miARN). En particulier, nous avons ciblé les miARN-372 et -373 qui sont oncogènes dans plusieurs cancers, tels que le cancer gastrique. Nous avons ainsi démontré que certains des composés criblés ou synthétisés sont capables de se lier efficacement à la structure secondaire en tige-boucle de pré-miARN avec une haute affinité, conduisant à l’inhibition de la production des miARNs correspondants. Par ailleurs, nous avons montré que certains composés possèdent une activité anti-proliférative spécifique pour les cellules de cancer gastrique et que cette activité est directement liée à une diminution de la production de miARN ciblés et au rétablissement de la traduction de ARN messenger / MicroRNAs (miRs) are a class of small non-coding RNAs that act as regulators of gene expression at the post-transcriptional level. Increasing evidence has indicated that the deregulation of miR expression is linked to various human cancers and therefore, miRs represent a new class of potential drug targets. In this context, my PhD project focused on the discovery of new inhibitors of oncogenic miRs production. Toward this aim, two different but complementary approaches were followed: (i) the screening of small libraries of compounds and (ii) the design and synthesis of new classes of conjugates as binders of miRNA precursors (pre-miRs). In particular, we focused our attention on miR-372 and miR-373, two oncogenic miRs overexpressed in various cancers, such as gastric cancer. We showed that some of the screened or of the newly synthesized compounds are able to efficiently bind to stem-loop structured precursors of the targeted miRs with high affinity, thus inhibiting the production of their corresponding mature miRs at the level of Dicer cleavage. Moreover, we found compounds bearing a specific anti-proliferative activity in gastric cancer cells overexpressing targeted miRs and this activity is directly linked to a decrease in the production of oncogenic miR-372 and -373 and to the restoration of normal mRNA translation.

Dicer endoribonuclease catalyzes the maturation of microRNAs (miRNAs) from double stranded precursors. Studies conditionally inactivating Dicer in the mouse embryonic forebrain continue to shed light on the spectrum of biological processes subject to miRNA regulation. This study looked at defects of brain development following a widespread ablation of Dicer in the early forebrain. The neuroepithelial stem cells failed to specify the radial glia appropriately around the time when the first postmitotic neurons begin to be generated in the neuroepithelium. Ablation of Dicer in only a subset of radial glia was not accompanied by the early apoptosis observed in all other models of Dicer ablation in the cortex. This allowed the study of the role of miRNAs in regulating cell numbers in the cortex. The study revealed that generation of cortical cells is increased during postnatal development. Finally, the study identified a miRNA which is able to negatively regulate the development of neuronal precursor cells of the developing cortex by targeting Tbox transcription factor 2. Together the results presented in this Thesis contribute to the understanding of the roles of endogenous RNA interference in the development of the brain.

AnalysisofshortArgonauteisoformsfrommouseoocytes Abstract: Argonaute proteins carrying small RNAs form the conserved core of RNA silencing mechanisms, which repress viruses, mobile genetic elements, and genes in a sequence specific manner. The microRNA (miRNA) pathway is a dominant mammalian RNA silencing mechanism in somatic cells, which post-transcriptionally regulates large fraction of genes and thereby adjusts protein levels. miRNA-guided Argonautes inhibit translation and induce deadenylation of complementary mRNAs, ultimately resulting in their decay. In contrast to RNA interference (RNAi), which employs Argonaute slicer activity to directly cleave perfectly complementary RNAs, an effective miRNA-mediated mRNA repression requires multiple Argonaute-associated protein factors and enzymes. The miRNA pathway has been implicated in many complex biological processes ranging from organogenesis, stress-response to haematopoiesis or cancer. Surprisingly, canonical miRNAs are not essential for oocytes and early embryonic development in mice. Even the most abundant miRNAs present in mouse oocytes are unable to effectively repress target genes. However, RNAi, which shares key enzymes with the miRNA pathway, is highly active in oocytes and early embryos. The cause of miRNA inactivity in mouse oocytes remains...

Die Genexpression ist die Voraussetzung für die Proteinbiosynthese in allen Zellen. Eine schnelle und feingesteuerte Kontrolle der Genexpression, die Genregulation, ist dabei als Reaktion auf Umweltveränderungen von großer Bedeutung. Unter Zuhilfenahme von kleinen RNAs spielen die RNA-Interferenz (RNAi) und verwandte Geninaktivierungsprozesse (gene silencing pathways) eine wichtige Rolle bei der Genregulation in Eukaryoten. Die gezielte Abschaltung von Genen durch RNAi wird durch die Erzeugung von kleinen doppelsträngigen RNAs (dsRNAs) in sogenannten RNA-induced-silencing complexes (RISCs) initiiert. Es konnte gezeigt werden, dass ein minimaler H. sapiens Komplex, der RISC -loading -Komplex (RLC), bestehend aus Dicer , Ago2 und TRBP2, in der Lage ist, Vorläufer-RNAs in etwa 21-23 Nukleotid lange dsRNAs zu zerkleinern, diese in ihre Einzelstränge zu trennen, den entsprechenden Führungsstrang auf Ago2 zu laden und eine komplementäre Ziel-mRNA endonukleolytisch zu schneiden. Somit kann dieser minimale Komplex die Verarbeitung der Vorläufer-RNA in kleine dsRNAs durch Dicer mit der Beladung dieser kleinen RNA-Produkte auf Ago2 verbinden/koppeln. Innerhalb des RLC wirken Dicer und Ago2 als Endoribonukleasen, während das dsRNA-Bindungsprotein TRBP2 die Dicer-RNA Komplexe zu Ago2 rekrutiert und für die Beladung der entsprechenden kleinen RNAs in den Komplex und auf Ago2 wichtig ist. Strukturinformationen des RLCs, der Subkomplexe sowie die einzelnen RLC-Proteine sind kaum vorhanden, und über die RNA-Transfermechanismen innerhalb des RLCs ist wenig bekannt. Innerhalb dieser Arbeit wurde ein Expressions- und Reinigungssystem für die einzelnen rekombinanten Proteine etabliert. Die menschlichen Proteine Dicer und Ago2 wurden als N-terminal Hexahistidin markierte Proteine in Sf9- bzw. High Five-Insektenzellen hergestellt, und menschliches TRBP2 wurde als N-terminal GST-markiertes Protein in E. coli BL21(DE3)Star-Zellen exprimiert. Die einzelnen Proteine wurden gereinigt und der RLC präpariert. Der RLC und dessen Komponenten wurden strukturell durch makromolekulare Röntgenkristallographie und Einzelpartikel Elektronenmikroskopie untersucht. Da die Kristallisation von diesem großen und hochflexiblen Komplex während dieser Arbeit nicht möglich war, wurden die Hauptstrukturarbeiten am RLC mit Hilfe von Einzelpartikel Elektronenmikroskopie-Studien durchgeführt. So konnte eine dreidimensionale Struktur des H. sapiens RLCs mit einer Auflösung von 22,8 Å rekonstruiert werden. Diese Rekonstruktion zeigt, dass der RLC eine C- förmige Gestalt mit verschiedenen flexiblen Regionen aufweist. Ein Vergleich mit einer früheren Rekonstruktion des RLC zeigt, dass die in dieser Arbeit bestimmte Struktur des RLC (RNA-gebundener Komplex) eine offenere Konformation einnimmt. Zusätzlich lässt die erreichte höhere Auflösung die Bestimmung neuer struktureller Details, des RLC zu, so dass einzelne Domänen erkennbar sind. Um die RLC-Komponenten innerhalb der hier bestimmten RLC-Rekonstruktion zu lokalisieren, sollten Referenzdichten der Subkomplexe und von Dicer berechnet werden. Aufgrund der hohen Heterogenität der Subkomplexe und von rekombinantem Dicer, waren zuverlässige Rekonstruktionen bisher nicht möglich. Die in dieser Arbeit bestimmte Struktur des humanen RLC und weitere in der Zwischenzeit erlangte biochemische und strukturelle Ergebnisse anderer Gruppen, bedingen ein neues mögliches Modell für die RNA-Transfer–Mechanismen innerhalb des RLCs, welches diskutiert wird.  Das große human Dicer Protein enthält eine N-terminale DExD/H-Helikase Domäne, dessen Funktion noch immer unklar ist. Interessanterweise interagiert diese Domäne mit TRBP2. Mit Hilfe dieser Interaktion wird die Endonuklease-Aktivität von Dicer aktiviert. Um die Wechselwirkung zwischen Dicer und TRBP2 im Detail zu verstehen, wurden in dieser Arbeit zusätzlich zu dem vollständigen Dicer-TRBP2 Komplex, minimale Dicer-TRBP2 Komplexes für strukturelle Analysen präpariert. Ein Atommodell der Interaktionsfläche mit verschiedenen minimalen Dicer-TRBP2 Komplexen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erhalten werden. Es kann aber gezeigt werden, dass dieses Dicer-Fragment die Bindung von TRBP2 zu einzelsträniger RNA vermindert, was auf eine Rolle von TRBP2 bei der Substratwahl von Dicer schließen lässt.  H. sapiens TRBP2 besitzt drei dsRBDs, die für RNA- und Proteinbinding sowie die eigene Homodimerisierung verantwortlich sind. Im Rahmen dieser Arbeit konnte die Kristallstruktur der zweiten dsRNA-Bindungsdomäne (dsRBD2) von TRBP2 gelöst und bis zu einer Auflösung von 2.28 Å verfeinert werden. Die Domäne hat eine typische α-β-β-β-α dsRBD Faltung, wobei die α-Helices gegen eine Seite des dreisträngigen antiparallelen β-Faltblattes packen. Die asymmetrische Einheit enthält vier Moleküle der dsRBD2, die untereinander zwei verschiedene Dimerisierungstellen bilden. Durchgeführte SAXS- und MALS-Messungen zeigen allerdings, dass die dsRBD2 in Lösung als Monomer vorliegt. Die identifizierten Dimerisierungsstellen scheinen daher nur Kristallisationsartefakte zu sein. Die Ergebnisse in dieser Arbeit deuten darauf hin, dass nicht die dsRBD2 allein sondern auch die Loop-Regionen zwischen den dsRBDs von hTRBP2 für die Dimerisierung wichtig sind. Ein Vergleich dieser Struktur mit der zuvor gelösten Struktur der dsRBD2 von TRBP2 im Komplex mit einem kurzen CG-Duplex zeigt, dass RNA-induzierte strukturelle Umlagerungen im Bereich der RNA-Bindungsstellen innerhalb der Domäne möglich sind. Zusätzlich zeigt die ermittelte SAXS Struktur der dsRBD2, dass genau diese Regionen, welche für RNA-Bindungen wichtig sind, sehr flexibel sind und so die Bindung von verschiedenen RNA-Substraten erlauben.

MicroRNA (miRNA) function is required for normal animal development, in particular in stem cell and precursor populations. I hypothesize that miRNAs are similarly required for stem cell maintenance and appropriate fate commitment in the brain. To test the requirement for global microRNA production, I depleted the microRNA biosynthetic enzyme DICER in the developing mouse brain. I found that DICER loss in embryonic neural progenitor cells leads to embryonic lethality with microcephaly. By histological analysis, I found defects in both neural progenitor cell maintenance and cell differentiation. I also identified new candidate microRNAs for this phenotype by profiling miRNAs in DICER-depleted and control cells. Three microRNAs which are good candidates to modulate nervous differentiation are miR-23b, -182, and -34a. I describe the expression pattern and functional characterization of these candidates. In particular, miR-34a depletes neuron production after progenitor cell differentiation in culture, likely by modulating cell cycling and Notch pathway genes.